Oncologie

Des injections quotidiennes pendant cinq semaines, une tumeur greffée et jusqu'à deux séances d'imagerie par semaine : 4 170 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur décrit des tumeurs pouvant comprimer les tissus voisins, se nécroser ou s'ulcérer. La question posée est de savoir si neutraliser un régulateur de l'autophagie renforce l'effet des immunothérapies anticancéreuses. Le choix de la souris tient à l'habitude et à la commodité, le porteur indiquant que les laboratoires en utilisent principalement, que c'est l'animal de laboratoire le plus couramment employé et que l'équipe en a la pratique.

Objectifs

L’autophagie est un processus naturel qui permet aux cellules de se débarrasser de leurs parties abîmées, comme les organites ou les protéines endommagées. En recyclant ces éléments, les cellules peuvent mieux s’adapter aux situations de stress. Ce mécanisme est important car il aide les cellules à se réparer et à se protéger. Des recherches récentes ont montré que l’autophagie joue un rôle crucial dans le soutien du système immunitaire pour combattre les tumeurs. Bien que nous ne comprenions pas encore complètement comment cela fonctionne, il semble que l’autophagie puisse influencer l’efficacité des traitements de l’immunothérapie contre le cancer. Par conséquent, explorer comment cibler ce processus dans le contexte des tumeurs pourrait améliorer l’efficacité de ces traitements. Certains régulateurs de l’autophagie, présents à l’intérieur des cellules, participent à des fonctions comme le métabolisme des graisses. Mais ils peuvent aussi agir à l’extérieur des cellules, étant libérés par divers organes tels que le foie, les graisses, le cœur, les reins et les muscles. Des études ont montré que bloquer ces régulateurs extracellulaires active l’autophagie dans plusieurs modèles de souris, notamment dans le foie et le cœur. Ce projet a pour but d’évaluer si la neutralisation de certains régulateurs de l’autophagie, qui circulent à l’extérieur des cellules, peut améliorer l’efficacité des traitements anticancéreux. Nous cherchons également à comprendre comment cette neutralisation influence les réponses immunitaires, notamment la capacité du système immunitaire à se souvenir et à réagir de manière plus efficace face aux cellules cancéreuses. Enfin, nous souhaitons explorer le rôle de ces régulateurs dans le syndrome de Li-Fraumeni (SLF), une maladie héréditaire rare qui augmente le risque de développer plusieurs types de cancers dès le plus jeune âge.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer revêt une importance cruciale tant en France qu'à l'échelle mondiale. Tout d'abord, le cancer demeure l'une des principales causes de morbidité et de mortalité, constituant un défi majeur pour les systèmes de santé. Les données épidémiologiques montrent une augmentation de l'incidence de ces cancers, avec des variations significatives selon les régions et les populations, influencées par des facteurs génétiques, environnementaux et de mode de vie. L'immunothérapie, une approche anticancéreuse largement discutée au cours des quinze dernières années, produit des résultats remarquables chez les patients réceptifs. Cependant, entre 50 et 80 pour cent des individus ne manifestent pas de réponse positive à ces traitements. En somme, trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques est impératif pour répondre efficacement à ce défi de santé mondial et offrir de l'espoir à ceux qui luttent contre cette maladie dévastatrice. Cette étude permettra de déterminer si la neutralisation de la protéine impliquée dans l’autophagie pourrait être proposée comme une nouvelle stratégie thérapeutique anticancéreuse.

Procédures

Les souris seront partiellement rasées au niveau du dos (quelques secondes). Les souris de ce projet recevront une injection de cellules afin de provoquer le développement d'une tumeur. Une partie des souris recevra une seconde injection pour tester le système immunitaire. Les injections seront réalisées pendant que les souris seront endormies avec un anesthésiant léger, afin de minimiser leur stress et leur inconfort. Les traitements anticancéreux seront ensuite administrés quotidiennement pendant une période maximale de 5 semaines, par des injections qui seront faites rapidement et sans provoquer de douleur ou de symptômes majeurs. La taille des tumeurs sera mesurée régulièrement, au moins deux fois par semaine, avec un instrument précis, sans perturber les souris plus d'une minute à chaque mesure. Pour suivre l'évolution des tumeurs, certaines d’entre elles seront surveillées par une méthode d’imagerie spéciale, deux fois par semaine. Ce suivi par imagerie ne durera pas plus de 10 minutes par animal. Dans certains cas, les souris recevront seulement deux injections de traitements, qui seront effectuées rapidement et ne provoqueront pas de symptômes gênants. Enfin, certaines injections seront réalisées dans une veine de la queue de l'animal, toujours sous anesthésie légère, pour garantir leur confort.

Impact sur les animaux

Certains animaux de ce projet recevront une injection de cellules tumorales, ce qui peut provoquer une légère douleur de courte durée au site d'injection. Aucun autre effet indésirable n’est attendu, à part ceux liés à la croissance de la tumeur elle-même. Les tumeurs en développement peuvent comprimer les tissus environnants, entraînant un certain inconfort. Selon le type de cellules injectées, les tumeurs peuvent également présenter des complications telles que des nécroses ou des ulcérations. Toutes les souris recevront des injections régulières au niveau de l'abdomen, ce qui peut entraîner un stress dû à la manipulation et une douleur passagère au point d'injection. Certaines souris subiront également des injections dans une veine de la queue. L'utilisation d'anesthésiant peut parfois réduire la capacité des animaux à réguler leur température corporelle et peut entraîner un risque pour leur fonction cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques, car cela est nécessaire pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'impératif d'utiliser des animaux vivants découle de l'incapacité actuelle à reproduire in vitro ou ex vivo la complexité des effets des traitements anti-cancéreux sur la tumeur, les tissus environnants, les facteurs solubles et le système immunitaire. Les réponses immunitaires ne peuvent être pleinement comprises que dans le contexte d'un organisme vivant. Les modèles animaux reproduisent mieux la complexité du microenvironnement tumoral, y compris les interactions entre les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires et les vaisseaux sanguins.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 4170 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Une surveillance régulière permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, tels que les yeux mi-clos, ou des comportements anormaux, ce qui permettra une intervention rapide pour adresser tout problème de bien-être. Des points limites précoces et adaptés à chaque type d'expérience seront établis pour garantir que la douleur et la souffrance des animaux soient minimisées autant que possible. La réaction au site d'injection sera régulièrement évaluée pour détecter tout signe d'inflammation ou d'infection, avec des interventions vétérinaires prêtes en cas de complication comme l’utilisation d’antiseptique (Chlorhexidine). De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les mâles qui montreront des signes d'agressivité seront isolés pour prévenir les blessures et le stress causés par les combats. Des ajustements seront faits en temps réel pour améliorer les conditions de vie des animaux ou modifier les protocoles de traitement.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les laboratoires utilisent principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. -La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé. -La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Injectées dans la cavité abdominale avec un mélange de polluants perfluorés, 90 truites d'environ deux ans subissent deux prélèvements de mucus, deux pesées et un test comportemental mené sans anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit pourtant que les interventions n'impliquent que des "stress légers", et s'appuie sur des études antérieures n'ayant relevé aucune mortalité pour justifier les concentrations retenues. La mise à mort sert à prélever le foie et à y doser des marqueurs de stress, afin de vérifier si le mucus pourrait un jour remplacer ces prélèvements.

Objectifs

Les substances per- et polyfluoroalkylées, également connues sous le nom de PFAS, sont une large famille de plus de 4 000 composés chimiques. Ces substances sont nommées polluants éternels en raison de leur persistance dans l’environnement dû à leur faible dégradation dans l'environnement. Ces composés sont utilisés pour largement utilisés dans l’industrie ; ils rentrent par exemple dans la composition du téflon, des mousse anti-incendie, des revêtements imperméables, le fart pour le ski, les produits antitaches…. Ces substances sont largement rependues à l’échelle mondiale en raison de leur utilisation variée, ainsi tous les milieux peuvent être concernés par des contaminations : l’eau, l’air, les sols, et la chaîne alimentaire. Depuis, 2023 certaines de ces substances sont classés « cancérogène pour les humains » pour le PFOA (acide perfluorooctanoïque) et « peut-être cancérogène pour les humains » pour le PFOS (sulfonate de perfluorooctane ) par Centre international de recherche sur le cancer. De plus, des concentrations plus élevées ont été retrouvé pour des poissons sauvages avec des concentrations supérieures à la teneur maximale de 450 μg/kg de poids frais. De précédentes études relatent une toxicité pour les organismes aquatiques, sur les systèmes endocrinien et immunitaire, sur la reproduction et le comportement. Néanmoins, il n’existe à notre connaissance pas d’études portant sur l’impact de ces substances sur les protéines de l’immunité et du stress chez les poissons. Un salminidé est choisi pour ce projet car elle présente de multiples intérêts : patrimonial, socio-économique et comme sentinelle de la qualité des rivières. De plus, de poisson est largement présent dans les rivières et est largement péchés et consommés. Ainsi, l’objectif sera de tester des marqueurs de l’activité immunitaire et de stress afin d’observer les potentiels effets néfastes de ces substances. Le prélèvement de mucus apparait comme un bon candidat pour un marqueur moins invasif, en de précédentes études montrent que les prélèvements successifs de mucus n'ont aucun effet sur la réponse immunitaire ni sur la structure de la peau du poisson.Ces connaissances et mise au point sur le mucus pourront alors avoir des répercutions opérationnelles afin de proposer des stratégies de surveillance de la qualité des rivières moins invasives.

Bénéfices attendus

Ainsi, l’objectif sera d’observer les potentiels effets néfastes de ces substances per- et polyfluoroalkylées sur des marqueurs immunitaires et de stress.

Procédures

Pour l'ensemble des interventions les animaux seront sous anesthésies. Les interventions de ce projet n'impliquent que des stress légers : la premiére intervention (T0) sur le poissons fera l'ojet d'une pesée puis le prélévement de mucus et une injections intrapéritonéale. Une seconde intervention sur le poisson à 7 jours (T7) fera l'objet d'une pesée et d'un prélévement de mucus. Une troisiéme intervention sur les animaux aura lieu pour une étude de comportement à 9 jours (T9) , lors de cette derniére les poissons ne seront pas anesthésiés.

Impact sur les animaux

Les procédures de ce projet n'impliquent qu'un stress modéré du aux manipulations. Un stress pourra également survenir lors des étape de pesée qui auront lieu 2 fois lors l'expérimentation à T0 et T7 , du prélèvement de mucus qui auront lieu 2 fois lors de l'expérimentation à T0 et T7 , lors de l’injection intrapéritonéal qui aura lieu 1 fois lors de l'expérimentation à T0 ainsi que lors de l'analyse comportmental qui aura lieu 1 fois lors de cette expérimentation T9. Pour cela les poissons seront anesthésiés afin de minimiser les nuisances pour les étapes d'injection intrapéritonéla, de pesée et de prélévement de mucus. Le prélévement de mucus est réalisés sour anesthésie afin de minimiser le stress. Cette opération à une durée inférieure à 1minutes par poissons. Le prélèvement de mucus ne devrait pas engendrer de stress ou de nuisance, en effet de précédente étude montrent que les prélèvements successifs de mucus n'ont aucun effet sur la réponse immunitaire (activité bactéricide) ni sur la structure de la peau du poisson . L’injection intrapéritonéal à une durée infériure à 30s par poissons. Les analyses de comportements qui seront rélisées 1 fois durant l'expérimentations (T9 le surlendemain de la premiére injection). Cette analyse peut engendrer du stress en raison du transfert des poissons entre les aquariums. Pour ces analyses les poissons sont seront placées par lot de 5 dans des aquariums de 200L et seront acclimatées durant 20 minutes puis filmées durant 15 minutes. L’eau de l’aquarium sera la même que celle des conditions d’hébergements (pompage -51m) afin de garantir la même oxygénation et la même température.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis. De plus, afin d’éviter le développement d’effet néfastes à long terme les individus sont mis à mort. Suite à leur mise à morts des prélèvements de tissus, foie permettront de réaliser des dosages classiques de marqueur de stress pour tester si la réponse dans le mucus est pertinente et permet de remplacer ces prélèvements classiques.

Remplacement

Le modèle animal n'est pas remplaçable par un modèle in vitro car il nécessite une étude dans un système intégré (différents tissus fondamentaux, différents organes et notamment système inflammatoire...). En effet, une etude précédente ne montre pas d'augmentation de la mortalité pour les concentrations des mélanges testés lors de ce projet , mais montre des différences de bioaccumulation de ces molécules.

Réduction

Les analyses statistiques envisagées seront des analyses de variances . L’effectif totale est de 90 individus afin de s’assurer un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). 15 individus par conditions = 15 *6 conditions. Ce nombre a été choisi sur la base d'études antérieures afin de réduire la variabilité individuelle observée. Des études antérieures portant sur des expositions individuelles aux PFOS n'ont révélé aucune mortalité au cours du mois d'exposition.

Raffinement

Les animaux seront visités au minimum quotidiennement durant la semaine et une fois durant les weekends. De plus, dans chaque bassin, des tiges flottantes (jeux) , des plantes en plastiques et des caches seront installées pour permettre aux truites de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience. La détermination précose de nos point limites permettront réduire la souffrance et le stress . Afin de minimiser les nuisances, les animaux seront anesthésiés avant les procédures, d’injections, de récoltes du mucus et de pesée.

Choix des espèces

Les salmonidés ont un fort attrait économique grâce à l’activité de pêche de loisir et de son intérêt économique avec une production aquacole de 700 tonnes en France et de 19432 tonnes au niveau mondial . De plus, la truite est une espèce dont cycle de vie est maitrisé au sein de par notre organisme. Contrairement à d'autres modèles de poissons utilisés en laboratoire, comme le poisson-zèbre, les études sur la truite sont facilement extrapolables à d'autres espèces de poissons présentant un intérêt écologique. Les truites choisies pour cette expérimentation seront âgées d’environs 2 ans et pèseront environ 110 g afin d’assurer un prélèvement de mucus suffisant et de la non maturité sexuelle des individus.

6 176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, jusqu'à deux injections dans le sinus rétro-orbitaire, quatre injections intrapéritonéales, trois gavages hormonaux, deux prélèvements sanguins et une irradiation de six minutes et cinquante-quatre secondes. Le porteur décrit des tumeurs pouvant entraîner des difficultés respiratoires, des ulcérations, des nécroses, des automutilations et l'isolement des animaux, celles dont le système immunitaire est absent y étant plus exposées. Les retombées annoncées, mieux choisir les traitements et repérer les patients qui répondent aux immunothérapies, sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution d'un "organisme entier" au cours du développement des cancers.

Objectifs

Les points de contrôle immunitaires sont des protéines qui interagissent avec les cellules du système immunitaire, appelées lymphocytes T, pour réguler leur activité une fois qu'une infection est éliminée. Cependant, dans le cas d’un cancer, les cellules tumorales utilisent ces protéines pour bloquer l’action des lymphocytes T, ce qui leur permet d’échapper au système immunitaire. Pour contrer cela, des médicaments appelés « inhibiteurs de points de contrôle immunitaires » ont été développés. Ils réactivent les lymphocytes T pour qu'ils attaquent les cellules cancéreuses. Ces traitements ont révolutionné le traitement de certains cancers, comme le mélanome avancé. Cependant, beaucoup de patients ne répondent pas à ces traitements ou rechutent dans les cinq ans. Il est donc crucial de mieux comprendre comment les voies cellulaires et moléculaires sont mises en place lors de traitements et de trouver des moyens de prédire qui va y répondre. La protéine Eomes, présente dans les lymphocytes T, joue un rôle important dans la lutte contre les tumeurs, mais on ne sait pas encore clairement comment elle influence la réponse à ces traitements. Les premières recherches montrent que plus il y a d'Eomes, meilleure est la réponse contre le cancer. Ce projet vise à comprendre comment Eomes agit sur l'efficacité des traitements contre le cancer, en utilisant des modèles de cancer chez la souris. Cela permettra de savoir si les lymphocytes T possédant Eomes sont les cibles principales des inhibiteurs des points de contrôle immunitaires.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors du traitement par les inhibiteurs des points de contrôle immunitaires permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale et ainsi de comprendre pourquoi certains patients sont réfractaires aux thérapies actuellement utilisées. À terme, cette étude aura donc pour but de mieux sélectionner les traitements, d’augmenter l’efficacité des traitements déjà existants, et potentiellement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les gestes invasifs seront réalisés sous inhalation d'isoflurane (2% + mélange air/oxygène). Une attention particulière sera portée au suivi par des personnes formées et compétentes. Les injections en sous cutanée ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau de la veine caudale durent 5 minutes et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau du sinus retro-orbital durent 1 minute et sont réalisées 2 fois avec un jour d’intervalle entre les deux injections. Les prélèvements de sang en sous-mandibulaire durent 1 minute par souris et sont réalisées 2 fois avec 3 semaines d’intervalle entre les deux prélèvements. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées 4 fois avec 2 jours d’intervalle entre chaque injection. L’administration par gavage d’un traitement hormonal a une durée de 2 minutes par souris et sera réalisée 3 fois par souris. L’irradiation a une durée de 6 minutes et 54 secondes et est réalisé une seule fois.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux murins induits dans ce projet vont engendrer le développement de tumeurs pouvant entraîner des difficultés de déplacements. Un défaut d’alimentation et/ou de boisson et une perte de poids de l’animal peuvent apparaître. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal comme des difficultés respiratoires ou une augmentation du rythme respiratoire ainsi qu’une altération de la température corporelle. Des troubles comportementaux pourraient survenir tels que des auto-mutilations,des défauts de toilettage et de nidification ainsi que l’isolement. L’état général des souris pourrait être altéré. Les tumeurs peuvent également présenter des ulcérations ou des infections. Lors de la régression tumorale favorisée par l’action des combinaisons d’immunothérapies, des nécroses peuvent être visibles sans saignements ni rougeurs. L’absence de système immunitaire chez certaines souris du projet les rendent plus sensibles au développement et à la progression tumorale ainsi qu’aux ulcérations, infections et invaginations de la tumeur.

Devenir

Les animaux qui ont développé des tumeurs seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les cellules purifiées à partir des organes prélevés (moelle osseuse ou tumeurs, ganglions drainants la tumeur et rate). Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité des immunothérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n'est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne sont pas capables de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers. Ces études in vitro ne reproduisent pas l'ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l'obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte toute la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.

Réduction

L’ensemble des expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux grâce à des études préliminaires qui nous ont permis de maîtriser ces modèles murins. Les résultats actuels ont permis de valider que des lots de 10 souris par génotype selon les paramètres à évaluer permettent d'acquérir des données fiables. La stratégie d’expérimentation sera une étude longitudinale. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Un test statistique sera utilisé pour les expériences du projet. Dans ce projet, nous utilisons un modèle de mélanome murin dans lequel les cellules cancéreuses émettent de la lumière. Par imagerie, nous sommes capables de visualiser la progression tumorale et les métastases au cours du temps et ce de manière non invasive en ré-utilisant les mêmes animaux. Par ailleurs, dans ce projet, nous injecterons simultanément des cellules immunitaires (Lymphocytes T) compétentes et déficientes pour une protéine d’intérêt dans une seule et même souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux dès l’initiation des modèles de cancers. Ainsi, l’expérimentateur impliqué dans le projet observera le comportement et mesurera le poids des animaux tous les deux jours à compter de l'initiation des modèles de cancers jusqu'à la fin de l'expérimentation. Toutes modifications de la prise de nourriture/boisson, de la posture, des déplacements, de la sociabilité et de la nidification seront observées. En cas de déshydratation et de perte de poids inférieur au seuil défini dans les points limites, de la nourriture et de l’eau sous forme de gel seront ajoutés. Les comportements d’agressivité seront également surveillés et du coton sera ajouté. Suite à l’induction des modèles tumoraux, des nécroses inflammatoires avec apparition d'une invagination au centre de la tumeur, de petits saignements et de rougeurs sur le pourtour de la tumeur peuvent se développer et seront nettoyées avec de la Vétédine. Pour diminuer la souffrance et la douleur liée aux procédures expérimentales et au développement de cancers, un traitement analgésique en locale (lidocaïne) sera administré aux souris au niveau de ces nécroses inflammatoires. Par ailleurs, des grilles d’expressions faciales des souris mises à disposition dans l’animalerie sont consultées pour détecter la douleur, la détresse ou la souffrance des animaux. De manière concomitante, des points limites ont été définis en concertation avec les zootechniciens pour détecter une dégradation trop importante de la santé et du bien-être des animaux et arrêter l’expérimentation. Pour éviter la mort à cause d’une éventuelle infection des souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, ces souris seront hébergées en portoir ventilé, manipulées sous hotte avec port de gants, masque, combinaison, surchaussures et charlotte. Certains actes seront réalisés sous anesthésie générale et/ou sous anesthésie locale suivies d’un réveil des animaux sur tapis chauffant. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes sociaux harmonieux dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux.

Choix des espèces

Les modèles de l’espèce animale Mus musculus sont à la base de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire et ont permis ces dernières années d’importantes avancées thérapeutiques dans ce domaine. En effet, ces modèles sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et chez la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules tumorales aux traitements. Par exemple, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour les molécules d’intérêt Eomes (délétion dans les lymphocytes T). Aucune autre espèce animale avec ces caractéristiques génotypiques pour ces protéines n’est disponible. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. L’ensemble des expériences du projet sera réalisé sur des jeunes adultes soit des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise tumorale.

3 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon leur groupe, elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans une veine ou entre les côtes, avec dans ce dernier cas une plaie cutanée qui se forme nécessairement, ou onze injections hebdomadaires d'un agent cancérigène, puis jusqu'à quatorze injections de traitement sur quarante jours et deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie. Le porteur indique que les tumeurs en développement peuvent comprimer les tissus voisins et provoquer des douleurs et un inconfort important. Il affirme que les réponses immunitaires ne peuvent être comprises que dans un organisme vivant, et rappelle que 50 à 80 % des patients ne répondent pas de façon satisfaisante à l'immunothérapie actuelle.

Objectifs

Les cancers du poumon représentent la principale cause de décès par cancer chez les hommes en France, et leur origine complexe est influencée par une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux. Cette interaction crée des variations dans la susceptibilité au cancer du poumon parmi les individus. Les traitements de première ligne contre ce type de cancer incluent la chirurgie, la radiothérapie et divers traitements médicamenteux tels que la chimiothérapie, les thérapies ciblées et l'immunothérapie, qui peuvent être utilisés seuls ou en combinaison. L'autophagie, un processus cellulaire essentiel pour l'élimination des composants endommagés et le recyclage des nutriments, joue un rôle clé dans la réponse au stress cellulaire. Des recherches récentes ont mis en évidence son influence sur l'immunité antitumorale, notamment dans le cadre de l'immunothérapie. Bien que le lien entre autophagie et immunothérapie ne soit pas encore totalement élucidé, des données croissantes suggèrent que l'autophagie pourrait moduler la réponse tumorale à ces traitements. Par conséquent, cibler l'autophagie et ses modulateurs au sein du microenvironnement tumoral est considéré comme une stratégie prometteuse pour améliorer les résultats de l'immunothérapie contre le cancer. Dans ce projet, nous visons à évaluer l'impact de la modulation de l'autophagie sur l'efficacité des traitements anticancéreux dans des modèles de cancer du poumon, en neutralisant une protéine clé impliquée dans ce processus. Nous cherchons également à comprendre comment cette neutralisation influence les réponses immunitaires et la formation de la mémoire immunitaire dans le contexte du cancer.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer du poumon est d'une importance cruciale, tant en France qu'à l'échelle mondiale. Ce cancer, qui est l'un des plus courants en France, affecte un nombre croissant de personnes, incluant désormais de plus en plus de femmes. L'immunothérapie, explorée intensivement au cours des quinze dernières années, a montré des résultats prometteurs chez certains patients. Cependant, une grande proportion de patients, entre 50 et 80 pourcents ne répondent pas de manière satisfaisante à ces traitements. Il est donc essentiel de développer des options thérapeutiques supplémentaires, notamment des traitements administrés avant (néoadjuvants) ou après (adjuvants) la chirurgie, pour améliorer la prise en charge à long terme des patients. En résumé, l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques est impérative pour relever ce défi de santé publique et offrir un espoir tangible aux personnes touchées par cette maladie. Cette étude a pour objectif d'évaluer si la neutralisation d'une protéine impliquée dans le métabolisme cellulaire pourrait constituer une nouvelle approche thérapeutique contre le cancer du poumon. Il est également pertinent de noter que ce cancer touche environ 400 000 nouvelles personnes chaque année en Europe.

Procédures

Dans ce projet, les souris subiront diverses interventions en fonction de leur groupe expérimental : Pour les souris avec un fond génétique particulier, en plus des différentes interventions, elles recevront 5 injections consécutives d’un agent chimique pour induire la déplétion de la protéine. Chaque injection dure quelques secondes et sera administrée une fois par jour pendant 5 jours, 21 jours avant l’induction tumorale. Pour un groupe expérimental, les souris recevront d'abord une injection intraveineuse de cellules tumorales. Cette procédure prend quelques secondes à quelques minutes par souris, effectuée sous contention. Ensuite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, qui dureront quelques secondes chacune. Jusqu’à 14 injections seront administrées, à raison de 2 injections par semaine sur une période maximale de 40 jours. Certaines souris seront anesthésiées pour le suivi de la croissance tumorale par imagerie bioluminescente, chaque session durant environ 10 minutes et réalisée 2 fois par semaine pour suivre l’évolution des tumeurs. Pour un autre groupe, les souris recevront une injection intercostale de cellules tumorales, une procédure d'environ 15 minutes incluant l’analgésie, l'anesthésie, et le réveil. Ensuite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, qui dureront quelques secondes chacune, jusqu’à 14 injections réparties sur 40 jours. Un suivi par imagerie bioluminescente sera effectué, chaque session durant environ 10 minutes, 2 fois par semaine pour surveiller la progression tumorale. Pour un troisième groupe, les souris recevront des injections intrapéritonéales d’un un agent cancérigène, qui dureront quelques secondes chacune. Ces injections seront administrées une fois par semaine pendant 11 semaines pour induire des tumeurs. Par la suite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, jusqu’à 14 injections au total, réparties sur une période de 40 jours.

Impact sur les animaux

Certains animaux de ce projet recevront des injections de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intercostale. Ces injections, qu'elles soient intraveineuses, intercostales ou sous-cutanées, peuvent provoquer une légère douleur temporaire au site d'injection. Dans le cas des injections intercostales, une plaie cutanée se forme nécessairement, ce qui peut entraîner une douleur et un risque accru d'infection. Les injections intraveineuses, quant à elles, peuvent également causer une irritation locale et un stress pour l'animal. L'administration d'un agent chimique pour induire un cancer peut provoquer des effets secondaires tels que perte de poids, diminution de l'appétit, et léthargie. Ces symptômes peuvent être plus prononcés juste après l'injection, bien qu'ils tendent à se dissiper en quelques minutes. Les tumeurs en développement peuvent exercer une pression sur les tissus environnants, provoquant des douleurs et un inconfort important. De plus, les tumeurs peuvent induire des perturbations physiologiques et métaboliques, telles que des inflammations, des désordres de la fonction organique, et une altération générale de l'état de santé des animaux. Les injections intrapéritonéales (au niveau de l'abdomen) peuvent induire un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur immédiate et transitoire au point d'injection. L'anesthésie utilisée pour certaines procédures peut réduire la capacité de l'animal à réguler sa température corporelle et peut entraîner un risque cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques afin de répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'impératif d'utiliser des animaux vivants découle de l'incapacité actuelle à reproduire in vitro ou ex vivo la complexité des effets des traitements anti-cancéreux sur la tumeur, les tissus environnants, les facteurs solubles et le système immunitaire. Les réponses immunitaires ne peuvent être pleinement comprises que dans le contexte d'un organisme vivant. Les modèles animaux reproduisent mieux la complexité du microenvironnement tumoral, y compris les interactions entre les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires et les vaisseaux sanguins.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 3880 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu sera enrichi à l’aide de coton de nidification). Une surveillance régulière permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, tels que les yeux mi-clos, ou des comportements anormaux, afin de permettre une intervention rapide pour traiter tout problème de bien-être. Des points limites précoces et adaptés à chaque type d'expérience seront établis pour garantir que la douleur et la souffrance des animaux soient minimisées autant que possible. Par exemple, la perte de poids, l'apparition de signes cliniques sévères (comme une altération de l'état général ou des difficultés respiratoires), ou une augmentation rapide de la taille des tumeurs au-delà d'un seuil défini entraîneront une intervention immédiate. La réaction au site d'injection sera régulièrement évaluée pour détecter tout signe d'inflammation ou d'infection, avec des interventions vétérinaires prêtes en cas de complication comme l’utilisation d’antiseptique. Les animaux présentant des signes de douleur recevront des analgésiques adaptés à leur état spécifique. En cas de problèmes empêchant les souris de se nourrir normalement, un gel alimentaire sera ajouté directement dans la cage. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les mâles qui montreront des signes d'agressivité seront placés en hébergement individuel pour prévenir les blessures et le stress causés par les combats. Des ajustements seront faits en temps réel pour améliorer les conditions de vie des animaux ou modifier les protocoles de traitement si nécessaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques : - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé, ce qui permet de bénéficier d'une vaste expertise en termes d’élevage, de techniques d’expérimentation animale, ainsi que du suivi microbiologique et vétérinaire. - Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les différentes lignées utilisées dans cette procédure ne présenteront pas de phénotypes dommageables et seront immunocompétentes.

Rasées sous anesthésie puis greffées sous la peau avec des cellules de cancer du pancréas, 180 souris subissent, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, treize à dix-sept injections de médicaments anticancéreux et d'anticorps, plus quatorze mesures de leur tumeur au pied à coulisse. Toutes sont tuées pour prélever tumeurs, rates et ganglions lymphatiques. L'objectif déclaré est de trouver la meilleure dose et la meilleure voie d'administration d'un composé, en vue d'un essai clinique chez des patients atteints d'un cancer du pancréas. Le RNT ne nomme ni ce composé, ni la protéine tumorale qu'il cible, ni l'immunothérapie à laquelle il est associé.

Objectifs

Le cancer du pancréas touche près de 500.000 personnes chaque année, et est la 4e cause de décès par cancer dans le monde. Récemment, une nouvelle catégorie de médicaments ciblant une protéine tumorale, a été mise au point. Nous souhaitons évaluer dans ce projet, les meilleures modalités d’administration (voie d’injection, dose et durée) d’un de ces composés, et son effet synergique avec une immunothérapie, dans un modèle de cancer du pancréas chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier la meilleure modalité d’administration d’un nouveau médicament anti-cancéreux et ainsi fournir un rationnel pour la mise en place d’un essai clinique chez les patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

- Rasage du flanc des souris sous anesthésie gazeuse (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – injections intrapéritonéales et sous-cutanées de médicaments anti-cancéreux et d’anticorps (13 à 17 x 5 secondes/souris) ; mesure des tumeurs au pied à coulisse (20 secondes souris x 14 mesures au maximum).

Impact sur les animaux

Les volumes tumoraux sont mesurés 2 fois par semaine, et le poids est évalué 3 fois pas semaine. Ceci nécessite une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. Possible douleur légère ou gène autour de la tumeur et autour des sites d’injection des médicaments.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter l’effet des médicaments non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro confirmant l’effet anti-tumoral du médicament d’intérêt. Néanmoins, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal pour évaluer l’effet des divers protocoles d’injection sur la pousse tumorale, ainsi que la synergie entre ces traitements et l’immunothérapie. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation chez la souris est justifié par l’utilisation d’un modèle de cancer du pancréas, le plus utilisé dans la littérature car reflétant la pathologie humaine de façon fidèle, notamment concernant le rôle des cellules immunitaires. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules de glioblastome sous la peau, puis jusqu'à six injections de virus tueurs de tumeurs, certaines subissant avant chaque injection une irradiation par faisceau de protons, soit jusqu'à 82 minutes d'anesthésie cumulées sur quatre à quatorze semaines. Les tumeurs et les rates sont prélevées après la mise à mort pour analyser l'activation des cellules immunitaires. Le porteur indique que la greffe, le développement de la tumeur et l'imagerie n'induisent pas de douleur et conclut qu'une analgésie n'est donc pas "nécessaire", tout en prévoyant de mettre à mort les souris dont les tumeurs se nécrosent ou qui perdent plus de 20 % de leur poids.

Objectifs

L'objectif majeur de ce projet est d'étudier in vivo l'effet immunostimulant et anticancéreux contre le glioblastome, un cancer du cerveau actuellement incurable, de traitements associant dans une première phase, une radiothérapie (faisceau de protons) suivie d'une infection par un virus tueur de tumeurs (MVMp), puis par une deuxième phase, 2 jours plus tard, associant à nouveau une radiothérapie (faisceau de protons) suivie elle aussi d'une infection, mais cette fois, par un autre virus tueur de tumeurs à savoir une souche vaccinale du virus de la rougeole. Dans notre projet, l'irradiation ionisante est appliquée juste avant que les tumeurs soient infectées par un virus oncolytique (MVMp ou souche vaccinale du virus de la rougeole). Cette procédure est utilisée parce que nos résultats montrent que l'irradiation ionisante de cellules murines de glioblastome (GL261) avant leur infection par MVMp, permet d'augmenter la réplication lytique de de ce virus et qu'elle permet également, in vivo, d'augmenter l'action anticancéreuse de la souche vaccinale (Schwarz/Moraten) du virus de la rougeole, sans que l'on sache actuellement quels sont exactement les mécanismes impliqués dans ces phénomènes.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de découvrir et valider une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement du glioblastome. La souche vaccinale du virus de la rougeole et le parvovirus de rat H-1PV (un cousin très proche en séquence et en comportement antitumoral, de MVMp) ont déjà fait l'objet de plusieurs études cliniques qui ont démontré le potentiel prometteur de ces deux agents contre certains cancers tel que le glioblastome. Elles ont toutefois également révélé que l'action immunostimulante et anticancéreuse de ces agents infectieux n'était pas encore assez puissante pour qu'ils puissent représenter une alternative crédible et efficace pour lutter contre des cancers tels que le glioblastome ou l'adénocarcinome pancréatique, dont le pronostic reste actuellement, malgré de nombreux progrès réalisés ces dernières années dans différents types de traitements, très sombre.

Procédures

Tous les les animaux seront soumis à 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales (100 µl) ce qui correspond à une anesthésie de 5 min sous isoflurane 2%. Certains subiront en plus 6 injections de 2 min chacune d'une solution de 10 à 100 µl de PBS ou de virus oncolityque (MVMp ou Souche Schwarz/Moraten du virus de la rougeole). Ceci correspond à une anesthésie de 5 min/injection donc à 6 x 5 = 30 min d'anesthésie. Ainsi, chaque animal subira entre 5 et 35 min d'anesthésies sur une période allant de 4 à 14 semaines, en fonction de la procédure et des groupes considérés. Certains animaux subiront préalablement à chacune de leurs 6 injections, une irradiation par faisceau de protons d'une durée maximale de 3 min (6 Gy). Etant donné que l'irradiation de leur tumeur sera immédiatement suivie par une injection, nous proposons d'attribuer 12 min d'anesthésie à ce type de protocole. Ceci correspond donc pour ces animaux a un total de 6 x 12 min d'anesthésie= 72 min. Etant donné qu'une anesthésie sera également nécessaire pour les mettre tous à mort (5 min) et que certains subiront une deuxième greffe (injection) de cellules tumorales, nous pouvons affirmer que les animaux de notre étude subiront entre 10 et 82 min d'anesthésie sur une période allant de 4 à 14 semaines d'étude.

Impact sur les animaux

Nous suivrons par des mesures et observations réalisées 2 fois/semaine, le poids des animaux et analyserons leur comportement (toilette, mobilité, etc...) et l'évolution de la taille des tumeurs. Une baisse au-delà de 20% du poids de l'animal après soustraction du poids des tumeurs (1g/cm3) ou l'apparition de signes d'affaiblissement, de perte de mobilité avant atteinte du point limite, de nécrose des tumeurs, nous conduirons à chaque fois à mettre à mort, sous anesthésie à l'isoflurane 2 %, ces animaux. Il est à noter que les doses de radiation appliquées sur les tumeurs ne devraient pas induire d'effets indésirables sur la durée de l'étude.

Devenir

mise à mort car prélèvement post-mortem des tumeurs et des rates pour des études in vitro sur l'activation de cellules immunitaires.

Remplacement

Notre approche scientifique et les objectifs que nous nous sommes fixés ne nous permettent pas hélas de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, le recrutement sur une periode de plusieurs semaines de cellules immunitaires au sein d'un glioblastome par des traitements d'immunothérapie, basés sur l'utilisation d'une radiothérapie et/ou d'infections par des virus oncolytiques (MVMp et/ou souche vaccinale du virus de la rougeole), n'est envisageable que chez un animal vivant. Notre étude cherchant à caractériser au niveau immunitaire, l'impact de ces traitement sur une tumeur sous-cutanée, il nous est impossible de travailler dans un autre modèle que celui de l'animal vivant.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux à étudier, le projet sera réalisé étape par étape et les données obtenues à l'étape précédente conditionneront toujours la mise en oeuvre de l'étape suivante sur les animaux. Une approche statistique a permis de déterminer le nombre d'animaux necessaire pour réaliser l'étude.

Raffinement

En dehors des périodes d’examen les animaux sont manipulés régulièrement afin de minimiser le stress induit par la manipulation et la présence du personnel du laboratoire. Les animaux sont placés à plusieurs par cage et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les interactions sociales et une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite la thermorégulation de l’animal ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. Le protocole expérimental prend en compte un éventuel impact sur la souffrance animale. Les animaux sont observés quotidiennement, pesés 2 fois par semaine. Les injections de cellules et les séances d'imagerie sont réalisées sous anesthésie. L'injection de cellules en sous cutané, le développement de la tumeur et l'imagerie TEP n'induisent pas de douleur. De ce fait, une analgésie n'est donc pas nécessaire.Les données issues de ces observations ( perte de poids, apparence générale, comportement alimentaire, apparition de zones nécrotiques sur les tumeurs) sont reportées dans une grille de score afin de déceler tout signe précoce de mal être et de mettre en place une surveillance. Si l'état général atteint un point limite dont les critères ont été établis préalablement, celui-ci sera immédiatement mis à mort. En fin de protocole, tous les animaux sontmis à mort pour permettre un prélèvement des tumeurs et des anlyses ex vivo. Les doses d'irradiation ionisante délivrées lors des séances d'irradiation n'induisent normalement pas de douleur ni de rougeur cutanées. Toutefois, en raison des anesthésies répétées, les animaux seront observés quotidiennement notamment pour controler le poids et l'apparition de rougeur au niveau du site d'irradiation. En cas d'apparition de rougeur, de la biafine sera appliquée sur la zone.

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé depuis de nombreuses années dans le domaine de la recherche préclinique en cancérologie. Il est à noter également que les cellules GL261, un modèle de glioblastome, sont syngéniques des souris C57BL/6 et sont souvent employées in vivo comme modèle de glioblastome. Pour toutes ces raisons il nous parait impossible de réaliser de telles expériences sur des modèles in vitro ou ex-vivo. La souris C57BL/6 est de ce fait le modèle le plus adapté à notre projet. Les animaux seront greffés à un âge de 10 semaines, âge optimal pour la prise tumorale d'après notre expérience. C'est aussi un stade auquel le système immunitaire et les mécanismes physiologiques sont potentiellement matures.

Des cellules de gliome sont injectées dans le tronc cérébral de souriceaux âgés de deux jours, puis la tumeur qui s'y développe est suivie sous anesthésie trois fois par semaine, vingt minutes à chaque fois. 1 000 souris fortement immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées pour que leurs tumeurs soient prélevées et analysées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste des associations de deux molécules contre un cancer pédiatrique du tronc cérébral aujourd'hui incurable. Le porteur affirme que les nuisances ont un effet limité parce que les souris sont manipulées sous anesthésie générale, et confie l'estimation de la souffrance au personnel de l'animalerie sans décrire de grille de score.

Objectifs

Ces travaux de recherche vise à étudier le gliome du tronc cérébral, un cancer pédiatrique toujours incurable. Aucun des traitements actuels ne prolonge la vie des enfants atteint de ce gliome. Dans ce contexte, il est nécessaire de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques mais aussi d’optimiser celles développées récemment afin que le traitement soit le plus efficace possible. Récemment, nos études sur les lignées cellulaires ont mis en évidence l’intérêt de plusieurs nouvelles combinaisons de deux composés chimiques et de nouvelles combinaisons sont en cours de développement. Certains aspects de nos projets vise aussi à optimiser l’efficacité de certaines combinaisons médicamenteuses. Des analyses moléculaires et de tissus seront réalisées sur les tumeurs après prélèvement afin d’apprécier l’action de chacune des deux produits et de la combinaison sur les cellules cancéreuses et sur certains gènes dans un contexte in vivo.

Bénéfices attendus

Démontrer que l’association de deux nouveaux médicaments bloque la formation de tumeur chez la souris. Etudier l’effet des deux composés, seuls ou en association, au niveau moléculaire et sur les tissus tumoraux.

Procédures

Injection sous anesthésie de cellules dans le tronc cérébral (une fois, 5 minutes ). Suivi du poids et du développement tumoral sous anesthésie (3 fois par semaine, 20 minutes)

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certaines conditions du projet, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette nouvelle thérapie. Les nuisances attendues sont la manipulation des cages et des souris lors des expériences, un léger stress thermique dû à l'anesthésie qui est pris en charge par l'utilisation d’un tapis chauffant et une douleur due à l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille. Comme les souris sont manipulées sous anesthésie générale, toutes ces nuisances ont un effet limité sur les animaux.

Devenir

Les 1000 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des approches cellulaires, moléculaires et des analyses de tissus.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris ayant un système immunitaire à capacité limitée). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Nous utiliserons des mâles comme des femelles. Nos résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés en tenant compte du nombre d’animaux par lot qui est de 10.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids en papier crépon. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera euthanasié sans attendre.

Choix des espèces

1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs se développent chez elles après induction d'un transgène, avec douleurs et lésions attendues, 60 souris subissant quatre prélèvements sanguins par ponction rétro-mandibulaire sur deux mois et 30 une administration intraveineuse. Le porteur annonce comme retombée d'ouvrir "une nouvelle voie d'exploration pour d'éventuelles thérapies", quand l'objectif immédiat est de montrer qu'une enzyme mutagène favorise l'apparition de tumeurs chez l'animal vivant. Il justifie le recours à la souris par le "besoin" d'observer la tumorigénicité dans le cadre d'un "organisme entier", malgré les modèles in vitro dont il dispose.

Objectifs

Une source importante de mutations observées dans les génomes de nombreux types de tumeurs est liée à certaines enzymes. L’objectif de ce projet est dans un premier temps de montrer que certaines enzymes (A3A) peuvent-être impliquées dans la survenue de cancers in vivo. Nous disposons de données obtenues en culture montrant que l’enzyme A3A peut muter des gènes impliqués dans la carcinogenèse. Ce projet nous permettra de montrer directement au sein de l’animal l’implication de A3A et d’autres molécules dans la survenue des cancers ou dans un début de pathologie tissulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence l’activité mutagène de A3A in vivo. Nous espérons montrer également que d’autres molécules pourront contrecarrer l’effet mutagène de A3A chez l’animal. Le but du projet est d’améliorer la connaissance des mécanismes de tumorigénèse et l’implication de A3A dans ce processus. Ceci ouvrirait une nouvelle voie d’exploration pour d’éventuelles thérapies.

Procédures

Prélèvements sanguins de sang veineux par ponction dans la veine rétro-mandibulaire (sur 60 souris), quelques secondes par prélèvements ; et 4 prélèvements quinzomadaires/souris (pendant 2 mois) ; un antibiotique sera ajouté dans l’eau de boisson des souris. Administration intraveineuse,1 unique administration par souris (sur 30 souris) ; durée de l’acte : quelques secondes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sur les animaux seront principalement la douleur et les lésions dues à la genèse des tumeurs. L’apparition des tumeurs suite à l’expression du transgène par l’administration de l’inducteur est liée à une douleur en principe de sévérité modérée, qui peut comporter une diminution d’activité seulement de quelques jours et une diminution de poids ne pas dépassant 20% si pas d’atteinte de points limites. Etant donné les caractéristiques de l’étude, nous évaluerons mieux la condition des animaux par la grille de Body Condition Score (BCS) (plus fiable et a adaptée pour ce type d’étude que le Body Weight (BW) due à l’ éventuelle apparition de tumeurs qui peut fausser ce dernier paramètre) A son tour, les prélèvements sanguins rétromandibulaires ou l’administration de substances via la veine de la queue peut induire une douleur et un inconfort léger de courte durée liés à l’introduction de l’aiguille.

Devenir

Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront mises à mort pour analyse tout au long de chaque procédure à des points définis ou en fonction de l’état des souris (signes cliniques de détresse/souffrance suite à survenue de tumeurs). En tout cas à la fin des procédures toutes les souris restantes seront mises à mort et les organes cibles prélevés pour analyse.

Remplacement

Malgré disposer de quelque modèle in vitro, le recours à la souris pour ce projet se justifie par le besoin d’avoir accès aux effets de tumorigénicité en présence des transgènes d’intérêt dans le cadre de l’organisme entier (affectation différents organes, circulation des exosomes par voie sanguine)

Réduction

Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire est basé sur notre expérience préalable et corroboré par l’avis des biostatisticiens pour être surs d’utiliser le nombre minimum d’animaux nécessaire, avec le maximum d’information par animal, afin d’attendre l’objectif fixé avec des résultats fiables. Quand cela sera possible, les animaux seront leur propres témoins (i.e. point a 21 jours). Pour la production d’exosomes à utiliser dans la deuxième procédure, nous utiliserons du sang de certains animaux de la première procédure. Nous utilisons males et femelles afin de réduire le nombre d’individus en considérant qu’il ne devrait pas y avoir un biais de sexe quant à la formation tumorale

Raffinement

Nous suivrons quotidiennement les animaux sous traitement avec l’antibiotique ainsi que leurs contrôles. Nous serons particulièrement attentifs à tous les signes de détresse susceptibles de survenir afin de réduire/éliminer la souffrance des animaux, les signes cliniques externes (prostration, poils hérissés, jaunissement, corps dur à la palpation, perte de poids). Les animaux seront mis à mort quand cela sera nécessaire en fonction de leur état et en suivant des grilles d’observation de souffrance et les points limites spécifiques et précoces définis (évaluation du Body Condition Score (BCS) problèmes posturaux prolongés, corps dur à la palpation abdominale pouvant être associé à une tumoration/hepatomégalie). En cas de souffrance et avant la mise à mort au plus tard au bout de 24h après confirmation des signes cliniques externes, nous aurons recours au besoin de la nourriture humidifiée / gel hydrique, la réhydratation sous-cutanée ou le chauffage des animaux si hypothermie associée.

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui montre 90% d’homologie avec le génome humain, d’où l’intérêt majeur en recherche fondamentale et création de modèles pour des maladies humaines. Les souris utilisées seront des souris adultes de 2-6 mois car l’étude d’apparition de tumeurs porte sur les adultes et est longue.