Oncologie

Produites par l'élevage du laboratoire pour alimenter d'autres protocoles en "utilisation continue", 2 614 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Toutes subissent, au sevrage à quatre semaines, une biopsie du bout de la queue sous anesthésie générale gazeuse pour vérifier leur génotype par PCR, avec une douleur de courte durée au réveil. 2 280 d'entre elles restent en vie, réparties entre le renouvellement des lignées et les expérimentations à venir, les 334 autres étant tuées. Ces lignées portent des gènes humains codant des anticorps pathogènes responsables de maladies de dépôt d'immunoglobulines, et le porteur justifie l'effectif par le fait qu'il couvre l'ensemble de ses lignées sur cinq ans, sans avancer de calcul.

Objectifs

Notre laboratoire développe depuis de nombreuses années des modèles murins transgéniques permettant l'étude d'un groupe de pathologies, les maladies de dépôt d'immunoglobulines monoclonales, qui viennent gravement compliquer certaines maladies hématologiques tel que le myélome multiple. Le pronostic vital des patients est souvent très péjoratif. En lien les médecins en milieu hospitalier, nous avons développé des modèles murins qui surexpriment tout ou parties des anticorps humains pathogènes responsables de ces maladies. Le but de ces modèles est d'étudier les mécanismes physiopathologiques de développement de ces maladies, d'étudier la toxicité de ces immunoglobulines pour les organes touchés et de développer et tester des thérapies innovantes lors d'essais pré-cliniques. La présence de modèles animaux permet de valider ou non le bénéfice de la molécule et de potentiellement la proposer à terme aux patients. Toutes ces études nécessitent donc l'utilisation de différents modèles murins dont le génotype doit être vérifié afin de s'assurer que les animaux présentent bien les caractéristiques attendues. La technique de génotypage décrite dans cet APAFIS consiste en la biopsie d'un bout de queue de la souris afin de contrôler le génotype de l'animal par PCR.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de maintenir les différentes lignées de souris génétiquement modifiées permettant de mener à bien les projets de recherche sur les maladies de dépôts d'immunoglobulines monoclonales. Ces modèles murins sont génétiquement modifié afin d'intègrer une modification génétique précise au sein d'un organisme complet. La modification génétique par l'apport d'un gène humain codant pour une protéine pathogène permet d'analyser et de comprendre la physiopathologie de ces maladies de depôts.

Procédures

Le prélèvement d'un bout de queue nécessaire pour le génotypage sera effectué sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de bout de queue sous anesthésie entrainent une douleur de courte durée aprés le reveil de l'animal. Aucune nuisance ou effet indésirable lié à leur génotype n'est attendu sur les animaux.

Devenir

Sur la totalité des animaux générés, nous attendons 100% de génotypes d'intérêts. Une partie de ces animaux sera maintenue dans la zone d'élevage pour le renouvellement et le maintien de nos lignées, et l'autre partie sera utilisée dans le cadre d'expérimentations (utilisation continue).

Remplacement

les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la physiopathogie des maladies de dépôts qui peut varier par le nombre et la localisation des atteintes d’organes, et ne permettent pas non plus de reproduire l’incidence d’une défaillance d’organe sur un autre organe ou l’organisme dans son entier. D’autre part, les approches thérapeutiques que nous souhaitons tester ont principalement pour objectif de cibler les dépôts d’immunoglobulines et de vérifier les réponses organes. Des modèles murins pour certaines maladies de dépôts ont déjà été développé et ont permis d’atteindre les objectifs précédemment évoqués.

Réduction

Notre laboratoire possède une grande expérience dans l’élevage des lignées murines destinées à la recherche ce qui permet d’anticiper le nombre d’animaux reproducteurs nécessaires au maintien de chaque lignée ainsi que le nombre de portées nécessaires pour obtenir un nombre suffisant d’animaux pour effectuer les diverses expériences. Ce projet comprend un grand nombre d'animaux car il décrit l'ensemble des lignées de souris élevées par notre équipe pour une durée de 5 ans. Le nombre d'animaux produits est réduit au minimum afin d'être suffisant pour maintenir la lignée et effectuer les expérimentations ultérieures tout en évitant de produire des animaux inutilement.

Raffinement

La procédure sera réalisée de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux : les prélèvements de tissus seront tous réalisés sous anesthésie générale gazeuse et par du personnel qualifié maitrisant ces gestes. Les animaux sont maintenus sous surveillance jusqu’à leur réveil. L'observation régulière des animaux et le suivi de leur comportement permettra d’avoir un contrôle sur leur état de santé et tout animal présentant des signes de souffrance sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

Ce type de pathologie, avec en particulier une atteinte rénale, a déjà été reproduit de nombreuses fois avec succés chez la souris. Dans ce projet, les animaux seront mis en reproduction à partir de l’âge de 8 semaines, âge auquel mâles et femelles sont sexuellement matures et jusqu’à l’âge de 20 semaines car les animaux plus âgés (en particulier les femelles) commencent à présenter des difficultés à se reproduire. Le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage, c’est-à-dire à l’âge de 4 semaines.

Plongés cinq jours dans des cultures de cyanobactéries du genre Microcystis, 360 poissons médakas adultes ne subissent aucune autre intervention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Tous seront tués en fin d'exposition pour prélever leurs organes, seule voie d'accès selon le porteur aux compartiments biologiques étudiés. L'objectif porte sur l'effet des métabolites produits par ces bactéries sur le microbiote des poissons et, par ricochet, sur leur santé, un sujet que le porteur qualifie de "vierge". Il indique que les doses employées n'atteignent pas celles qui entraînent une souffrance "visible" au niveau morphologique ou du comportement, sans préciser ni les signes surveillés ni la fréquence des observations, alors qu'il attend par ailleurs un inconfort digestif et hépatique.

Objectifs

Les altérations des milieux aquatiques par les proliférations de cyanobactéries sont susceptibles de modifier le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Les préjudices associés à ces efflorescences comprennent : des perturbations de la chaîne trophique, une diminution de la pénétration de la lumière dans l’eau, une diminution de l’oxygène dissous disponible, mais également la production de métabolites secondaires potentiellement bio-actifs et parfois toxiques pour certains organismes qui y sont exposés. En effet, de nombreux genres de cyanobactéries sont susceptibles de produire et/ou de relarguer dans le milieu aquatique des molécules aux propriétés éminemment, ou potentiellement, bio-actives, délétères, voire toxiques. Si les effets toxicologiques (sensu stricto) de ces microorganismes et de leurs métabolites sont connus sur certaines cellules ou tissus de vertébrés, notamment chez certains poissons, on ignore leur impact sur la communauté microbienne associée et les répercussions sur la santé de l’organisme hôte. Des travaux menés ces dernières années ont montré que le microbiote, localisé à l’interface entre un organisme et le milieu extérieur, peut jouer un rôle important dans la physiologie de l’hôte, mais aussi dans de nombreux paramètres biologiques chez les Vertébrés, parmi lesquels la résistance aux pathogènes. Le présent projet propose d’étudier l’effet de l’exposition à des doses représentatives des conditions environnementales de divers efflorescences de cyanobactéries sur le poisson modèle en écotoxicologie aquatique, le médaka. A ce jour, peu d’études se sont ainsi efforcées de caractériser la réponse des poissons à différentes compositions d’efflorescences de cyanobactéries au niveau de l’holobionte (organisme hôte + microbiotes) et de tâcher ainsi de prendre en compte la réponse au niveau des différents compartiments biologiques et des différents organes.

Bénéfices attendus

Cette étude constituera un prérequis indispensable au développement de ce sujet encore vierge. La caractérisation du microbiote de poissons n’en est en effet qu’à ses débuts et dévoile déjà une large diversité microbienne inattendue. Les interactions entre hôte, son microbiote associé et l’environnement sont peu explorées, encore moins dans le cadre de stress écotoxicologiques, et pourraient s’avérer informatives de processus biologiques méconnus. A terme ces travaux permettront de mieux appréhender les conséquences (éco)toxicologiques des efflorescences de cyanobactéries et de la production de métabolites bio-actifs associés.

Procédures

Mis à part la balnéation avec les biomasses de cyanobactéries qui aura lieu pendant les 5 jours de l’expérimentation, aucune intervention ne sera réalisée sur les animaux.

Impact sur les animaux

Les poissons seront exposés 5 jours par balnéation à différentes doses environnementale de cultures de souches de cyanobactéries. Certains métabolites produits par les cyanobactéries pourraient induire des effets physiologiques occasionnant un inconfort alimentaire pour les poissons (digestif, hépatique). Les doses n’atteignent pas les doses toxicologiques entrainant de la souffrance visible au niveau morphologique ou du comportement.

Devenir

Les poissons seront euthanasiés en fin de procédures et leurs organes prélevés pour analyses. Seuls les prélèvements tissulaires post-mortem permettent d’avoir accès aux différents compartiments biologiques qui seront ici investigués.

Remplacement

Seul ce type d’analyse intégrée portant sur des organismes entiers permet de générer une compréhension fine des processus écotoxicologiques qui en oeuvre chez ces modèles biologiques complexes (organismes + microbiote associé).

Réduction

Notre expérience dans ce type de travaux nous a permis de raffiner le design expérimental au niveau du temps d’exposition qui passe ici de 28 jours à seulement 5 jours. Par ailleurs, nos travaux mettront en oeuvre une approche de comparaison de la variance des différents paramètres biologiques ici renseignés (composition bactérienne et métabolique) afin d’estimer à la fois les variabilités biologiques et expérimentales. Nos expérimentations seront réalisées à des concentrations environnementales (en teneurs en cyanobactéries) et avec des effectifs nécessaires et minimums pour être en mesure de démontrer l’occurrence d’effets moléculaires d’un nombre réduit d’organismes.

Raffinement

Nos travaux sont développés dans le contexte de la caractérisation de biomarqueurs précoces (et également plus sensibles) de stress au niveau du microbiome et du métabolome (ensemble des métabolites retrouvés dans un échantillon biologique, et sa concentration) des poissons Médaka. En en accord avec le principe de raffinement de la règle des 3R pour l’expérimentation animale, les expérimentations seront menées à des concentrations en cyanobactéries produisant des cocktails bio-actifs proches de la concentration minimale induisant les premiers effets détectables toxicologique, afin de limiter les potentiels effets toxicologiques. Durant toute l’expérimentation, les organismes seront maintenus en groupe dans des conditions d’élevages standards, correspondants aux critères de raffinement préconisés par l’Organismes de Coopération et de Développement Economique pour l’élevage et l’expérimentation sur cet organisme.

Choix des espèces

Oryzias latipes : Espèce modèle aquatique vertébrée couramment utilisée en expérimentation scientifique pour des travaux de développement, d’écologie ou d’écotoxicologie avec différents types de contaminants environnementaux Jeunes adultes (entre 3 et 5 mois), afin de pouvoir aisément les sexer et d’éviter qu’ils ne présentent les altérations cellulaires qui commencent à apparaître après l’âge de 6 mois chez cette espèce.

Six rémiges coupées au ras de la peau, quatre prélèvements sanguins à la veine alaire, une anesthésie par injection intramusculaire pour passer au scanner : 333 poulets de chair reproducteurs, mâles et femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. L'objectif déclaré est d'évaluer si la reproduction au sol, sans cage, améliore ou dégrade le bien-être et la santé des reproducteurs, sur trois lignées de vitesse de croissance différente. Les femelles destinées à la radiographie sont mises à jeun, enfermées en caisses, transportées en véhicule sur un kilomètre, pesées, puis anesthésiées, le porteur reconnaissant qu'un accident anesthésique reste possible, apnée prolongée ou arrêt cardiaque. Sur les 333 individus, 273 seront ensuite "disponibles à la vente" comme animaux vivants, les 60 autres étant tués.

Objectifs

En sélection, les lignées de volailles sont, pour une partie de leur vie, hébergées en cage. La reproduction en cage permet un suivi individuel de la ponte, mais surtout une reproduction par insémination artificielle qui limite la consanguinité en contrôlant les couples reproducteurs et de connaître le pedigree de la descendance à chaque génération. Aujourd’hui, nous cherchons à concevoir un élevage sans cage, plus en lien avec les demandes sociétales de bien-être animal. Si la reproduction au sol ouvre la possibilité d’exprimer des comportements naturels positifs (activité, bain de poussière,…), l’effet global sur le bien-être des animaux doit être mieux évalué. Des interactions sociales agressives entre adultes au sol peuvent s’accompagner d’une baisse du bien-être du troupeau, avec l’apparition de picage, de comportements violents voire de cannibalisme. D’autre part, ce mode d’élevage des reproducteurs pourrait avoir un effet sur la santé des mâles comme des femelles. Le but du projet est d’estimer les conséquences d’une reproduction au sol sur le comportement et la santé des reproducteurs, ainsi que sur la diversité génétique des descendants, en utilisant trois lignées génétiques de poulets de chair, variant sur la vitesse de croissance et les caractéristiques métaboliques. Ce projet, en collaboration avec deux unités expérimentales, évaluera comment une reproduction au sol impacte le bien-être et la santé des animaux reproducteurs, et si cet impact varie entre lignées aux caractéristiques distinctes. Le projet implique des prises de sang sur les animaux pour évaluer (i) le taux d’hormones indicatrices de comportements agressifs et du niveau de stress des animaux et (ii) la variation des paramètres immunitaires en fonction du milieu de vie ainsi que des prélèvements de plumes. Les femelles subiront également une anesthésie pour pouvoir évaluer leur santé osseuse de façon peu invasive (CT scan).

Bénéfices attendus

Ce projet est un approfondissement pour soutenir une modification de nos pratiques pour accompagner la transition vers un mode alternatif d’élevage en sélection. A court terme, il permettra l’évaluation des pratiques prenant en compte : les effets positifs ou négatifs d’un élevage au sol sur le bien-être et la santé des animaux reproducteurs. Au niveau scientifique, ce projet permettra une meilleure connaissance des interactions entre environnement d’élevage (cage vs sol) et génétique (croissance lente, intermédiaire ou rapide) sur les performances de reproduction et le comportement des animaux.

Procédures

Les animaux, d’élevage en cage ou d’expérimentation au sol, seront soumis à 4 prélèvements sanguins maximum à l’âge adulte, séparés d’au moins 3 semaines entre eux. La technique de prélèvement de sang à la veine alaire ne dure que quelques secondes. Les animaux subiront également un prélèvement de plumes par découpe des rémiges. Nous couperons les plumes une première fois, avant le début de la reproduction, pour s’assurer que les plumes prélevées ont bien poussé pendant la période d’intérêt. Nous préleverons ensuite, six semaines plus tard environ, en coupant 6 rémiges au ras de la peau. Les femelles subiront une anesthésie générale par injection musculaire à l’âge adulte (entre 35 et 41 semaines d’âge) pour une radiographie.

Impact sur les animaux

Les animaux d’élevage en cage ou d’expérimentation au sol, seront soumis à 4 prélèvements sanguins à l’âge adulte. Les prélèvements sanguins à l’âge adulte entrainent un risque de douleur légère de courte durée, un léger risque d’hématome et un potentiel stress de contention. La découpe des plumes peut également entrainer une douleur de courte durée. L’injection de l’anesthésique pour les poules peut être douloureuse (intramusculaire). Un accident anesthésique est également possible (apnée prolongée, arrêt cardiaque).

Devenir

Tous les animaux n’ayant subi qu’une procédure légère seront disponibles à la vente (animaux vivants).

Remplacement

Pour évaluer les possibilités de reproduction au sol des poulets de chair et connaître leur impact sur le bien-être, le modèle le plus adapté est le poulet de chair lui-même. Le comportement des individus ne peut être observé que sur un animal entier. Aucune méthode substitutive ne permet de reproduire la richesse des comportements reproducteurs et de leur impact sur la santé et la diversité génétique.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires pour ce projet a été évalué d'après (i) les résultats d’une première expérimentation (ii) des publications scientifiques, et (iii) des simulations de précision de l'estimation des paramètres physiologiques et génétiques, qui sont les éléments de base de la construction des schémas de sélection. Les effectifs les plus faibles sont pour les mâles. De nombreux caractères seront testés, dont plusieurs ont déjà montré des différences significatives à moins de 20 individus. D’autre part, des prélèvements multiples, permettront de renforcer la puissance des effets observés entre traitements en utilisant moins d’animaux. Les femelles seront, elles, au nombre de 20 par traitement, et des femelles non prélevées seront également présentes pour respecter un sexe ratio de 1 mâle pour 3 femelles en cages et 1 pour 4.4 femelles au sol pour garantir leur bien-être. Les animaux au sol permettront de tester trois traitements différents : au sol en sexes séparés (sans reproduction) et au sol en reproduction libre, pour réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Le calme et une contention soignée pendant la prise de sang seront mis en œuvre. Par ailleurs, les animaux voués à l’expérimentation de la reproduction au sol seront élevés sur copeaux, en groupe, et auront accès à l’aliment selon les schémas de rationnement. Un panel d’enrichissements du milieu sera disponible : plateformes de perchage, cachettes, nids, et distribution de nourriture aléatoire dans la litière. En plus des bienfaits habituels des enrichissements, ces derniers seront cruciaux pour limiter l’agressivité entre les animaux, que ce soit les comportements harceleurs des mâles envers les femelles (cachettes), l’agressivité entre mâles, ou la compétition pour la nourriture (distribution dans la litière favorisant le grattage). Le transport des animaux entre les deux plateformes, à 1km l’une de l’autre, sera organisé ainsi : - Avant le premier repas: mise en caisses des poules qui passeront au CT le matin, elles sont à jeun et sont mises dans des caisses numérotées et adaptées à leur taille et poids (maxi 3 ou 4 poules). - Elles sont transportées en véhicule agréé (transport d’animaux) puis déposées dans le local d’attente chauffé si besoin. - Elles sont pesées individuellement pour définir la dose d’anesthésiant à injecter. - Quatre heures après la mise à jeun les poules commencent à être anesthèsiées, passer au CT scan, et sont remises en caisses - Une heure après l’anesthésie, les poules sont retransportées et remises dans leur condition d’élevage habituelle. Si elles paraissent encore endormies, elles sont isolées jusqu’à réveil complet. - Si la procédure prend plusieurs jours, les poules scannées sont marquées individuellement pour être sur qu’elles ne sont pas manipulées deux jours de suite. Les animaux sont surveillés régulièrement tout au long de la journée et au retour au bâtiment afin de vérifier que tout va bien. Tous les animaux seront visités quotidiennement pendant quelques minutes. Si un animal est blessé ou malade (emplumement, picage) ou s’il est en souffrance (prostration permanente), il sera isolé en infirmerie jusqu’à récupération complète.

Choix des espèces

L’objectif étant l’étude de la reproduction au sol des poulets de chair, le modèle le plus adapté est le poulet de chair lui-même. Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux adultes, pour phénotyper des reproducteurs.

Inflammation généralisée, prise de poids et excès de graisse dans le foie sont attendus, et les souris qui franchissent un point limite sont mises à mort. 1 782 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses après la mort, dans des procédures que le porteur classe au niveau de souffrance léger. Une partie reçoit pendant vingt-quatre semaines un régime riche en graisse à partir de l'âge de six semaines, puis toutes reçoivent des injections de dérivés du cholestérol deux jours de suite et deux prises de sang, à quatre puis douze jours. L'objet est de savoir si une protéine de l'immunité innée détecte ces dérivés comme un signal de danger, le porteur utilisant déjà des cocultures et des modèles informatiques mais affirmant avoir besoin de "l'organisme entier".

Objectifs

Des maladies chroniques telles que l’obésité ont énormément progressé depuis le début du siècle. L’obésité, définie comme l’indice de masse corporelle égal ou supérieur à 30 kg/m2 pour les adultes, est un facteur de risque pour d’autres types de maladies, tels que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. Il est bien établi, par exemple, que l’obésité est la cause la plus commune de la résistance à l’insuline, ce qui déclenche le diabète de type 2. C’est pourquoi des stratégies biologiques fondamentales ainsi que cliniques sont essentielles pour empêcher la progression de ce type de complications. Au-delà des différences individuelles et comportementales, l’obésité et des maladies associées ont en commun un défaut dans le métabolisme des lipides, ainsi qu’une inflammation exacerbée. Cette inflammation est causée notamment par les cellules du système immunitaire qui migrent aux sites où il y a un excès de lipides, où elles libèrent des molécules solubles qui assurent la communication entre elles. Par conséquent, le système immunitaire joue un rôle essentiel dans les maladies associées aux excès de lipides. Grâce aux expériences de laboratoire dans des lignées cellulaires ainsi que dans des cellules issues de souris, nous avons découvert qu’une protéine du système immunitaire joue un rôle très important dans le déclenchement de l’inflammation causée par des lipides. L’objectif du projet est alors de comprendre si cette protéine du système immunitaire innée fonctionne comme un détecteur des lipides in vivo pour déclencher une réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Très récemment, il a été décrit que le système immunitaire joue un rôle dans l’inflammation déclenchée par des lipides. Néanmoins, notre étude est pionnière à montrer un lien direct entre une protéine précise du système immunitaire inné et une famille de lipides. C’est pourquoi, à court terme, notre premier objectif est de démontrer que cette protéine du système immunitaire inné est essentielle pour que la souris puisse détecter une famille de lipides comme un signal de danger. Cet objectif correspond à mieux comprendre le mécanisme intervenant entre le système immunitaire inné et le métabolisme des lipides. La compréhension de ce mécanisme pourra servir de base pour l’objectif à plus long terme de développer des agents thérapeutiques contre l’inflammation observée dans l’obésité morbide et /ou le diabète de type II. Enfin, étant donné qu’il y a une forte corrélation entre un excès de lipides et la progression des tumeurs à cause de leurs effets dans plusieurs voies de signalisation, et grâce à l’expertise de l’équipe à la fois dans le développement des agents pour l’immunothérapie du cancer et dans les connaissances fondamentales sur la protéine d’intérêt, notre autre objectif à long terme est d’optimiser les agents thérapeutiques contre le cancer en ciblant notre protéine d’intérêt et ainsi réguler le métabolisme des lipides.

Procédures

Dans un premier lot d’animaux, chaque souris vigile sera injectée avec des traitements, une fois par jour pendant deux jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Quatre jours après la première injection, les souris auront un prélèvement de sang. Huit jours plus tard, un autre prélèvement de sang sera réalisé (durée de chaque prélèvement inf à 20 sec). Dans un second lot d’animaux, des souris à l’âge de six semaines suivront un régime alimentaire normal ou un régime alimentaire riche en graisse pendant 24 semaines. Certains de ces animaux seront injectés avec des traitements une fois par jour pendant deux jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Quatre jours après la première injection, les souris auront un prélèvement de sang. Huit jours plus tard, un autre prélèvement de sang sera réalisé (durée de chaque prélèvement inf à 20 sec).

Impact sur les animaux

À la suite des injections avec les oxystérols (produits résiduels du cholestérol) : - une douleur liée à la piqûre elle-même est attendue (gêne de courte durée) - une inflammation est attendue au niveau systémique (= inflammation généralisée) - une augmentation du poids est attendue - une augmentation du pourcentage de graisse dans le foie. Des anomalies hépatiques pourraient être détectées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

À la suite des expériences in vitro, nous avons constaté que seulement certains types cellulaires sont l’objet de la régulation par la protéine d’intérêt. Une alternative que nous sommes déjà en train d’évaluer est l’utilisation de cocultures, où deux types cellulaires peuvent être analysés en détail in vitro en même temps. Une autre alternative est la modélisation in silico (modèles informatiques), que nous utilisons déjà pour mieux comprendre le fonctionnement de la voie décrite ici au niveau moléculaire. Néanmoins, pour bien caractériser les propriétés des cellules immunitaires qui sécrètent des molécules solubles assurant la communication entre elles, il reste nécessaire d’utiliser un modèle préservant la complexité des interactions entre tous les types cellulaires et au niveau de l’organisme entier.

Réduction

Pour toutes nos expériences, le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de limiter leurs stress. Les animaux seront ensuite suivis deux ou trois fois par semaine afin d’assurer leur bien-être et de surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer fréquemment le stress des souris et des points limites ont été définis. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort

Choix des espèces

L’étude du métabolisme des lipides et leur relation avec l’obésité, ainsi que le rôle de l’immunité innée ont été bien décrits chez la souris. Ces mécanismes sont similaires chez la souris et l’homme. En plus, des données de notre laboratoire montrent que le mécanisme de réponse aux lipides est conservé chez les cellules de souris ainsi que chez les cellules humaines. Nous allons utiliser des souris jeunes à partir de 8 semaines d’âge, quand le système immunitaire de la souris est bien développé, jusqu’à 32 semaines selon la procédure.

Un rat qui montre des signes de mal-être est retiré de l'étude, ce qui n'empêche pas sa réutilisation dans un autre projet. 108 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun tué dans le cadre de ce projet, tous destinés ensuite soit à des expériences sur organes isolés, soit à des travaux pratiques et à la formation à la chirurgie. Ils subissent une à six anesthésies gazeuses pour être rasés des flancs, portent un gilet à capteurs enregistré jusqu'à vingt-quatre heures d'affilée sur une période allant jusqu'à six mois, sont parfois séparés visuellement et olfactivement de leurs congénères, et courent sur un tapis roulant jusqu'à trente minutes à 80 % de leur capacité, stimulés à la queue. Le porteur annonce que ces données serviront à construire des vidéos et une plateforme de simulation pour l'enseignement de la physiologie, et reconnaît qu'un risque de détresse cardio-respiratoire "ne peut être exclu" lors des anesthésies.

Objectifs

Bien que prenant en compte le contexte sociétal, l’enseignement de la physiologie à l’université continue d’inclure des animaux principalement en raison de l’absence de méthodes alternatives satisfaisantes. Les systèmes de simulation actuellement disponibles restent rares, rudimentaires, peu évolutifs et restreints à des conditions basiques. Ce projet vise à acquérir de façon non-invasive des données physiologiques de la fonction cardio-respiratoire, de la mobilité et des vocalisations chez le rat pour construire un ensemble de supports d’enseignement incluant des vidéos de démonstrations et une plate-forme digitale permettant de simuler différentes conditions en lien avec la vie quotidienne. Cela permettra à terme de réduire au maximum l’utilisation d’animaux en enseignement à l’université et d’envisager son remplacement dans certaines filières où l’acquisition de gestes pratiques n’est pas nécessairement obligatoire.

Bénéfices attendus

De tels outils pédagogiques permettront d’envisager à terme un remplacement de l’utilisation d’animaux pour les filières générales et une réduction significative de leur nombre et un raffinement des procédures pour les formations professionnalisantes.

Procédures

Les animaux seront soumis à une à six anesthésies générales volatiles durant quelques minutes en vue d’être rasés sur les flancs. Par la suite ils seront habillés avec un gilet contenant des capteurs physiologiques ; les enregistrements parfois quotidiens, pourront durer jusqu'à 24h pour une période allant jusqu'à 6 mois. Les rats seront observés en condition de vie quotidienne ou suivront un protocole d’exercice physique. Certains rats seront hébergés individuellement sans pour autant être isolés socialement (isolement visuel et olfactif), cet isolement des congénaires n'exédant pas 24h. D'autres rats seront contraints à une course sur tapis roulant n'exédant pas 30 minutes à maximum 80 % de leur capacité physique. Ils y seront encouragés par stimulation physique non douloureuse.

Impact sur les animaux

L'ensembre des rats subira des contraintes de niveau léger : notament trois brèves anesthésies générales volatiles pendant laquelle le risque de détresse cardio-respiratoire ne peut être exclu. Certains rats peuvent ne jamais s’adapter au protocole : port du gilet et surtout course contrainte. Ceci engendrerait un mal être et une prostration.

Devenir

L’ensemble des procédures du projet permet d’envisager la réutilisation totale des animaux. A ce jour, deux types de réutilisation sont envisagées : soit une réutilisation pour la réalisation d’experience sur organes isolés, soit une réutilisation en enseignement universitaire (Formation à la chirurgie, TP de licence professionnelle).

Remplacement

Ce projet n’offre pas une alternative complète à l’utilisation d’animaux puisqu’il nécessite l’utilisation des animaux vigiles pour la production initiale des données et la création de la base. En revanche il contribue de façon significative à chacun des 3R puisque les résultats du projet permettront d’envisager la réduction du nombre d’animaux utilisé en formation et en enseignement, de remplacer l’utilisation d’animaux en enseignement dans certaines filières générale et d’envisager le raffinement des procédures expérimentales par un suivi de paramètres physiologiques de façon non-invasive. C’est sur ces éléments que les acteurs du projet axeront leur communication (communication dans des conférences sur le bien- être animal) auprès de tous les acteurs du domaine.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été réduit au minimum afin de permettre d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour obtenir des statistiques descriptives (moyenne, écart-type,) pour chacune des conditions expérimentales et a été fixé à 5 à 24 rats par sexe. S'agissant d'études physiologiques et comportementales, l’effet du sexe et de l'âge doit être pris en compte. Le nombre d'animaux permettra de réaliser les supports didactiques à utiliser en TP ou en formation professionnelle. Un nombre minimal (inferieur à 5) sera utilisé pour la mise au point du dispositif de suivi et la finalisation des réglages techniques.

Raffinement

A leur réception, les rats bénéficieront d'une semaine d'acclimatation. Le milieu de vie de chaque rat sera enrichi le plus possible suivant les protocoles de la SBEA. La tonte des flancs est systématiquement réalisée sous brève anesthésie générale volatile. Les rats bénéficieront tous d'une phase individualisée d'acclimatation/habituation au port du gilet et aux phases d'enregistrement. L’utilisation de la technologie de télémétrie consistant en un dispositif radio non invasif maintenu dans un gilet ergonomique porté par l'animal, permet une surveillance combinée de l'activité cardiaque, de la fonction respiratoire et de l'activité locomotrice au cours de l’exercice physique. Ce dispositif couplé aux enregistrement vidéo et audio permet l'acquisition des données sans contrainte supplémentaire pour l'animal. Les séances d'exercice physique (course sur un tapis roulant) nécessitent le recours à une stimulations physique non douloureuse au niveau de la queue des animaux. Dans tous les cas, nous veillerons à ce que les exercices soient réalisés avec le moins de stimulations possibles. Si l’objectif d’apprentissage de la 1ère semaine n’est pas atteint, l’animal ne suivra pas la seconde semaine de conditionnement, il sera retiré du projet mais pourra être réutilisé dans d’autres projets. Tout signe de mal être d’un animal conduira à son retrait de l’étude, et ce même pendant la période initiale de stabulation.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le rat adulte, qui constitue le modèle le plus utilisé en enseignement de la physiologie experimentale à l’université et qui présente une taille compatible avec le dispositif de suivi de la fonction cardio-respiratoire utilisé dans ce projet. Nous utiliserons des rats adultes d’un poids corporel de 250 à 450g (c’est-à-dire entre 8 et 24 semaines). Les animaux compris dans cette gamme de poids sont les plus utilisés dans le domaine cardiorespiratoire et en adéquation avec la taille de la version actuelle du dispositif. De plus, l’utilisation d’animaux de poids différents permet de valider la continuité des mesures même lors du changement de gilet lié à la taille des animaux.

Toutes remises au troupeau après l'intervention, dans leurs conditions normales d'élevage, 1 500 brebis Martinik de lignée Black Belly sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'acte se limite à une prise de sang unique à la veine jugulaire, sous contention, réalisée une seule fois dans leur vie. Il s'agit de génotyper une mutation déjà connue pour contrôler la prolificité et de la relier aux données d'élevage enregistrées, dans un objectif de gestion de la reproduction et de "durabilité des troupeaux". Sur le remplacement, le porteur se borne à affirmer que le suivi d'un effectif important est "nécessaire" en génétique et qu'il n'est "pas possible de remplacer ces effectifs".

Objectifs

La présente demande d’autorisation de projet expérimental concerne la caractérisation d’une mutation déjà connue pour contrôler la prolificité dans une race ovine brésilienne. Une étude génomique sur la séquence du gènome complet d’un bélier de race Black Belly montre la présence de cette mutation dans son ADN. L’objectif de ce projet est donc de montrer la ségrégation de cette mutation dans la population ovine Black Belly en génotypant (diagnostic génétique) des brebis dont les données d’élevage sont déjà enregistrées. Ainsi, il sera possible de faire le lien entre leur capacité prolifique et la présence de la mutation.

Bénéfices attendus

Face aux problèmes de reproduction qui existent dans les élevages, l’étude du contrôle de la fonction ovarienne reste d’actualité chez ces espèces. Pour ces études basées sur l'exploitation de la variabilité génétique, les races ovines nous procurent des modèles uniques. Ainsi, les recherches sur les mécanismes de contrôle du nombre d'ovulations s'appuyant sur ces races ovines ont déjà permis de mettre en évidence 13 mutations naturelles dans 4 gènes différents qui contrôlent ce caractère. D’une part, ces découvertes permettent de faire avancer nos connaissances scientifiques sur le fonctionnement de ces gènes et le contrôle biologique de la fonction ovarienne. D’autre part, le génotypage de ces mutations dans les populations ovines permet une gestion raisonnée de la reproduction et donc la durabilité des troupeaux.

Procédures

Les animaux seront soumis à une prise de sang, réalisée une seule fois durant leur vie, afin de permettre l'étude de marqueurs génomiques.

Impact sur les animaux

La seule nuisance attendue concerne le stress de la contention et la douleur ressentie lors de la piqure, nécessaire pour la réalisation de la prise de sang à la veine jugulaire. Mais l'impact cumulé de ces nuisances peut être considéré comme léger,les interventions étant pratiquées par du personnel expérimenté.

Devenir

Suite aux prises de sang et avec l’accord du responsable du projet, tous les animaux sont replacés dans le troupeau dans leur condition normale d’élevage.

Remplacement

Le suivi d'un effectif important d'animaux est nécessaire dans les travaux de recherche en génétique, ,et il n'est pas possible de remplacer ces effectifs.

Réduction

Afin de réduire les interventions sur les animaux, une prise de sang unique sera réalisée et stockée congelée

Raffinement

Le mouton étant un animal grégaire, les brebis, ainsi que les jeunes animaux post sevrage sont maintenus en lot d’élevage d’une cinquantaine d’animaux environ. La contention des animaux pour la procédure de prise de sang sera réalisée par les animaliers expérimentés (en binôme), dans un espace réduit (en parc de tri) en présence de congénères et dans le calme pour limiter le stress dû à l’isolement. La présence répétée des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du comportement de fuite de l’animal et donc de son stress face à la contention.

Choix des espèces

L’espèce ovine est l’espèce cible de l’étude. Les animaux prélevés seront des animaux adultes ou des jeunes d'environ 1 an d'âge.