Oncologie

60 souris vont être privées de nourriture pendant vingt-quatre heures, puis tuées pour qu'on prélève leurs îlots pancréatiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jeûne fait baisser leur activité, leur température corporelle et leur poids. L'objet est de séquencer les noyaux de leurs cellules pancréatiques pour repérer les gènes dont l'expression change avec le jeûne, dix souris étant utilisées par point de séquençage. Le porteur écrit à deux reprises qu'un jeûne de vingt-quatre heures ne met "en aucun cas" en danger des souris en bonne santé, pour des procédures qu'il déclare lui-même de gravité modérée.

Objectifs

Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel. Une dérégulation de ce système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont associées, comme le diabète. Au laboratoire, nous étudions le développement de l'obésité et ses altérations métaboliques. Dans cette nouvelle étude, nous nous proposons d'analyser la réponse des tissus actifs en réponse au jeûne. Le jeûne est connu pour induire des changements significatifs dans l'expression génique des tissus tels que le cerveau, le pancréas, le foie, les muscles et le tissu adipeux, qui jouent un rôle crucial dans la régulation énergétique et métabolique. Notre objectif est de caractériser ces changements au niveau moléculaire pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels le jeûne influence la balance énergétique et le métabolisme global. En utilisant des technologies de nouvelle génération, nous chercherons à identifier les gènes dont l'expression est modifiée par le jeûne et à élucider les voies de signalisation impliquées. Les résultats de cette recherche pourraient fournir des informations précieuses pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à améliorer la santé métabolique et à prévenir les maladies associées à une dérégulation de l'équilibre énergétique telles que l'obésité et le diabète.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette recherche pourraient fournir des informations précieuses pour améliorer la santé métabolique et prévenir les maladies associées à une dérégulation de l'équilibre énergétique. Bénéfices attendus pour ce projet : nous pourrons identifier de nouvelles cibles potentielles pour des interventions thérapeutiques visant à traiter ou prévenir les maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète.

Procédures

60 animaux seront mis à jeûn durant 24H.

Impact sur les animaux

Un jeûne prolongé de 24H sera nécéssaire avant le prélèvement des tissus des souris. Ce jeûne va entrainer de nombreux effets, notamment metaboliques, sur le systeme digestif, immunitaire, etc, mais ne met en aucun cas en danger les animaux. Un jeûne de 24H pour une souris en bonne santé tel que dans notre cas peut entrainer une baisse de son activité, de sa température corporelle et une légère perte de poids.

Devenir

Après la période de jeûne de 24H qui ne met pas en danger les animaux, les animaux seront euthanasiés et une préparation d'îlots pancréatiques sera faite afin de recueillir les noyaux des cellules, et de les séquencer. Il en sera de même pour les animaux contrôle qui n'auront pas jeûné.

Remplacement

La régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris. Les modèles in vitro ou d'organismes inférieurs ne permettent pas de reproduire l'intégralité de ces interactions physiologiques complexes. Ainsi, l'utilisation de la souris est essentielle pour obtenir des résultats pertinents et transposables aux mécanismes chez les mammifères, y compris les humains. Nous utiliserons des tissus de souris afin de réaliser des séquençages spécifiques. Cette approche permet d'obtenir des données détaillées sur l'expression génétique à l'échelle cellulaire.

Réduction

Nous utiliserons un total de 60 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Une préparation d'îlots pancréatiques provenant d'une souris permet de recueillir environ 30 000 noyaux. Étant donné que 300 000 noyaux sont nécessaires pour réaliser un point de séquençage, 10 souris seront nécessaires pour chaque point de séquençage. Nous prévoyons de réaliser 6 expériences indépendantes, nécessitant ainsi un total de 60 souris. Cette approche nous permet de maximiser les informations obtenues tout en minimisant le nombre total d'animaux utilisés, en conformité avec les principes de réduction. Nous déterminerons si la distribution des échantillons suit une loi normale. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour déterminer le nombre optimal d'animaux à utiliser et pour analyser les données obtenues.

Raffinement

Les cages seront étiquetées pour cette procédure et les animaux seront surveillés par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort, cependant un jeûne de 24H ne met en aucun cas en danger des souris en bonne santé. Les animaux conservent leurs congénères et leurs conditions d'hébergement avec accès à l'eau de boisson et un carré de chanvre est mis à leur disposition permettant la fabrication d'un nid utile pour préserver leur température corporelle, pendant ces 24H.

Choix des espèces

Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. Ce choix est justifié par plusieurs raisons : Similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain : La souris partage de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec l'humain, ce qui permet de transposer plus facilement les résultats obtenus chez la souris aux humains. Cela est particulièrement pertinent pour les études sur le métabolisme et les maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète. Historique de recherche étendu : Il existe une vaste base de données et une longue histoire d'utilisation des souris dans la recherche biomédicale, fournissant un contexte riche et des outils bien développés pour l'analyse des résultats. Les souris sont donc bien caractérisées en termes de biologie et de réponses métaboliques, facilitant les comparaisons et l'interprétation des données. Les souris seront utilisées à l'âge de 10 semaines pour plusieurs raisons importantes: À l'âge de 10 semaines, les souris ont atteint un stade de développement où leur physiologie, y compris leur métabolisme, est généralement stable. Cela permet de minimiser les variations dues à la croissance et au développement, assurant ainsi une plus grande cohérence des résultats expérimentaux. L'utilisation de souris âgées de 10 semaines offre une combinaison optimale de maturité physiologique, de stabilité métabolique, de standardisation des conditions expérimentales et de comparabilité avec la littérature existante, ce qui en fait un choix approprié pour notre étude sur les mécanismes métaboliques en réponse au jeûne.

Capturées en rivière, anesthésiées trois à cinq minutes, mesurées, pesées, puis incisées sur trois à cinq millimètres au ventre pour y glisser un transpondeur, 1 000 truites communes sauvages sont maintenues hors de l'eau jusqu'à une minute avant d'être remises à l'eau vivantes. Les procédures sont classées en souffrance modérée et aucune truite n'est tuée, le porteur indiquant qu'une pommade antiseptique est appliquée sur l'incision et que le réveil est surveillé dans un vivier. L'effectif tient compte des marques perdues dans les semaines qui suivent et de celles que les femelles expulsent lors de la fraie, pour garantir un minimum de redétections. Ce que le suivi mesure, c'est le fonctionnement d'une passe à poissons construite sur un barrage, les truites étant utilisées comme moyen de vérifier l'ouvrage.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer le franchissement par les truites d’un barrage sur une rivière de montagne. La truite, espèce caractéristique sur ce cours d’eau, réalise en effet une migration automnale avant sa reproduction et peut être bloquée. Une passe à poissons a été récemment aménagée pour permettre aux poissons de franchir ce barrage et de remonter la rivière. Le suivi biologique mis en œuvre dans ce projet permettra de vérifier son bon fonctionnement. La méthodologie proposée implique l’implantation de transpondeur électroniques (PIT tags) », dans des truites sauvages. Des dispositifs de détection fixes seront installés à l’entrée et à la sortie de la passe à poissons, et le suivi sera réalisé sur deux années minimum pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales. Si le quota d’animaux marqué n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mettre en lumière la « transparence » du barrage à la migration des truites, c’est à dire le bon franchissement de la passe à poissons pour les différentes classes de tailles des truites et l’absence de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour permettre à cette espèce de rejoindre des habitats piscicoles de qualité, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1000 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, comme l’indiquent les retours d’expériences lors des recaptures.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des passes à poissons doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire de l’espèce considérée, dans le cas présent la truite de rivière. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval de l’ouvrage étudié. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des comportements, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Le taux de détection attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : -L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera fréquemment renouvelé pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours < 19°C (température de stress pour la truite commune, espèce la plus exigeante) et pour éviter l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie. Les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. L’expérience du personnel permet de réduire le temps global de manipulation à moins d’une minute. La taille des PIT tags sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière.

Choix des espèces

L’espèce cible est la truite commune. Cette espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. Pour les truites, seuls les individus subadultes et adultes seront marqués, à l’aide de PIT tags adaptés à leur taille. Les individus plus petits que 120 mm seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

7 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une administration du composé et trois prélèvements sanguins. Les prélèvements se font par ponction de la veine caudale et par ponction sous la mandibule, et les composés sont administrés par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou par gavage, avec les risques que le porteur énumère lui-même : perforation d'organes internes, œdèmes, hématomes, perforation de l'œsophage, passage du liquide dans les poumons. L'objet reste en amont de tout traitement, il s'agit de mesurer comment cinq variantes d'une protéine antidiabétique se répartissent dans le corps selon la dose et la voie d'administration. Le porteur affirme par ailleurs que trois animaux par condition suffisent, sans que le passage de ce chiffre à 7 560 souris soit détaillé.

Objectifs

Notre recherche porte sur le diabète de type 1 (DT1), une maladie caractérisée par la destruction des cellules du pancréas qui produisent de l'insuline. Cela entraîne des hyperglycémies chroniques pouvant provoquer de graves complications vasculaires. Nous avons identifié une protéine capable de régénérer ces cellules et développé cinq variantes de cette protéine, que nous avons testées sur des souris diabétiques. Nos résultats préliminaires montrent que ces protéines peuvent stimuler la prolifération des cellules productrices d'insuline, ce qui pourrait en faire des traitements prometteurs pour le DT1. Pour développer un médicament antidiabétique, nous souhaitons analyser le comportement de ces nouvelles protéines dans le corps (pharmacocinétique) afin de déterminer la meilleure dose et la meilleure méthode d'administration. Chaque variante de la protéine étant unique, nous devons tester différentes combinaisons de méthodes et de doses pour comprendre leur fonctionnement. Nous testerons donc cinq concentrations différentes avec quatre méthodes d'administration (intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse et orale) sur trois modèles de souris : des souris saines pour garantir des résultats représentatifs des réponses physiologiques normales ; des souris diabétiques pour évaluer l'efficacité des composés dans le contexte du DT1 ; et des souris génétiquement modifiées pour mieux simuler les humains. Notre approche sera séquentielle et hiérarchisée : si l'une des protéines candidates montre de bons résultats avec une méthode et une dose spécifiques, nous pourrons écarter les autres options, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires. Au total, nous prévoyons d'utiliser 7 560 souris pour ce projet, tout en respectant strictement les principes des 3R : Remplacement (l'étude du diabète nécessite l'utilisation d'animaux, car cette maladie ne peut pas être entièrement reproduite en laboratoire), Réduction (nous utiliserons le minimum d'animaux nécessaires et ajusterons les expériences selon les résultats), et Raffinement (une grille de score évaluera la souffrance et le stress des animaux, avec des seuils adaptés).

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude seront essentiels pour déterminer la dose et la voie d’administration qui assurent la meilleure exposition du composé antidiabétique dans les tissus et le sang. Ces données guideront les conditions expérimentales des futures études sur l'efficacité à long terme et la pharmacodynamique du composé candidat. En combinant ces études complémentaires, nous maximiserons les chances de succès dans le développement thérapeutique pour le diabète de type 1 (DT1).

Procédures

Trois prélèvements sanguins seront effectués sur chaque animal, selon les modalités suivantes : deux prélèvements seront réalisés par ponction de la veine caudale (l'un au début de la procédure et l'autre à la fin; durée de l'intervention : 30 secondes) ; et un prélèvement sera effectué par ponction submandibulaire (soit à 0 min, avant administration du composé, soit à 30 min, 60 min, 120 min, 24 h, ou 48 h après l’administration ; durée de l'intervention : 1 minute). Une injection ou une administration du composé sera effectuée sur chaque animal (durée pour les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et orales : entre 30 secondes et 1 minute).

Impact sur les animaux

Une partie des souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l'étude du diabète de type 1 (DT1), présentant généralement une hyperglycémie modérée. Le prélèvement submandibulaire, réalisé en prélevant du sang sous la mandibule avec une aiguille ou une lancette, peut provoquer du stress et un inconfort local. Il y a également un risque de formation d'œdème autour du site de ponction et d'infection si les conditions d'asepsie ne sont pas rigoureusement respectées. La ponction de la veine caudale, qui implique l'extraction de sang de la veine située dans la queue, peut entraîner une douleur ou un inconfort, avec un risque d'infection si le site n'est pas correctement aseptisé. L'administration par voie orale (ou gavage) peut causer du stress et de l'inconfort, avec des risques de perforation ou de blessure de l'œsophage, ainsi que d'aspiration du liquide dans les poumons, entraînant des difficultés respiratoires si la sonde n'est pas correctement insérée. Les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV) peuvent entraîner des risques d'inconfort et de douleur au site d'injection. Pour les injections IP, il existe également un risque de perforation des organes internes. Concernant les injections SC, les risques incluent la formation d'œdèmes ou d'hématomes si l'injection est trop rapide. Pour les injections IV, les risques comprennent des saignements et des dommages veineux. Dans tous les cas, des infections peuvent survenir au site d'injection si les conditions d'asepsie ne sont pas strictement respectées.

Devenir

À la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre des analyses post-mortem.

Remplacement

Dans notre étude, les composés développés présentent des caractéristiques pharmacocinétiques uniques qui ne peuvent être correctement évaluées que dans des systèmes biologiques complexes, comme ceux des souris. L'étude in vivo est indispensable pour déterminer avec précision comment ces molécules sont absorbées, distribuées, métabolisées et éliminées dans l'organisme, car ces processus ne peuvent pas être simulés de manière fiable par des méthodes in vitro ou par modélisation informatique.

Réduction

Nous utiliserons un nombre minimal d'animaux pour nos expériences. Des tests statistiques sur des échantillons préliminaires ont montré que trois animaux par condition suffisent pour obtenir des résultats exploitables sans nécessiter de répétition supplémentaire. Certaines souris peuvent ne pas développer d’hyperglycémie, mais elles ne seront pas écartées, car elles présentent une infiltration lymphocytaire significative, un indicateur préclinique important du diabète de type 1 (DT1). Ainsi, notre étude inclura les souris diabétiques et prédiabétiques pour obtenir des données complètes et fiables sur la pharmacocinétique de nos composés. Enfin, pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous adopterons une approche séquentielle et hiérarchisée. Si un composé montre un profil d’exposition optimal avec une voie d’administration spécifique et une concentration donnée, les autres conditions expérimentales pourront être écartées. Nous ajusterons les expériences en fonction des résultats obtenus, conformément aux principes de réduction des 3R.

Raffinement

La glycémie sera mesurée par prélèvement d'une goutte de sang de la veine caudale. Avant l'incision, une crème analgésique contenant de la lidocaïne sera appliquée sur le bout de la queue pour une anesthésie locale. La ponction sera effectuée rapidement et avec précision pour minimiser le stress, et une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement et prévenir les hématomes. Le prélèvement submandibulaire sera réalisé par un opérateur expérimenté pour garantir rapidité et précision, réduisant ainsi l'inconfort. Des lancettes ou aiguilles stériles seront utilisées pour minimiser le risque d'infection ou d'œdème. Après le prélèvement, une légère pression sera appliquée pour arrêter le saignement. Pour les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (SC) et intraveineuses (IV), une désinfection locale sera effectuée avant et après chaque injection pour réduire le risque d'infection. Des aiguilles de petit calibre seront utilisées pour diminuer la douleur et les traumatismes tissulaires. Avant une injection IV, la queue de la souris sera réchauffée dans de l’eau tiède pour dilater les vaisseaux sanguins, facilitant l'injection et réduisant les tentatives. Les volumes administrés seront limités afin d'éviter tout inconfort. Pour l'administration orale (ou gavage), des sondes d’alimentation appropriées seront utilisées pour minimiser le risque de perforation de l’œsophage ou de blessures internes. Les animaux seront surveillés pour tout signe de détresse ou difficulté respiratoire. Tous les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux, dans des portoirs ventilés. Ils auront accès à de l'eau stérilisée et des aliments irradiés pour minimiser les risques de contamination. Durant toute la procédure, les animaux seront surveillés à l’aide d'une grille de score pour évaluer et objectiver les éventuelles souffrances, avec des points limites précoces et des mesures correctives adaptées.

Choix des espèces

Une partie des souris utilisées dans cette étude constitue un modèle classique pour l’étude du diabète de type 1 (DT1), car elles développent spontanément la maladie par des mécanismes similaires à ceux observés chez l'humain. Leur phénotype et les étapes de progression du DT1 sont bien documentés, ce qui permet de mener des études précises et reproductibles. Dans notre recherche, ces souris sont essentielles pour évaluer l’efficacité de nos composés dans le contexte du DT1. Une autre partie des souris de cette étude est dite "humanisée" ; elles ont été modifiées génétiquement pour exprimer un gène humain, ce qui permet de mieux prédire les réponses humaines aux composés étudiés. Des souris non modifiées seront également utilisées afin d’obtenir des données fiables sur le comportement des composés dans un contexte physiologique normal. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 20 semaines pour examiner comment les différents composés se comportent dans le corps. Cet âge correspond à la période adulte, où leur métabolisme est stabilisé, garantissant ainsi des réactions plus prévisibles aux traitements. À ce stade, les souris ont un métabolisme bien développé, ce qui nous permettra d’obtenir des résultats plus fiables et applicables, tout en réduisant les variations liées à la croissance ou au sevrage.

Douze ponctions ovariennes par animal, sous anesthésie épidurale et sur bête vigile, avec pose et retrait répétés d'un dispositif vaginal et cinq injections de superovulation à douze heures d'intervalle avant chaque collecte : 12 génisses Prim'Holstein subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et sont gardées en vie à l'issue. L'ensemble sert à produire 400 embryons pour mettre au point la détection des anomalies chromosomiques dès le stade préimplantatoire, afin d'éviter les transferts sans issue et de réformer les animaux porteurs. Le porteur mentionne des hématomes possibles au point d'injection et un stress ponctuel lié aux contentions. Il classe la procédure en gravité modérée du fait de la répétition d'actes légers et, écrit-il, en l'absence de données objectives sur le sujet.

Objectifs

Depuis 2009, la sélection génomique s’est développée dans la filière bovine avec près de 300 000 analyses annuelles du génome réparties désormais dans une quinzaine de races, dont 80% pour une gestion du renouvellement en élevage. La lecture du génome peut également être effectuée plus précocement, dès le stade embryonnaire préimplantatoire après analyse de l’ADN préamplifié issu d’une biopsie de quelques cellules d‘un embryon (utilisation dans le cadre des schémas de sélection). Ces données génomiques sont principalement utilisées aujourd’hui pour prédire les performances futures de chaque individu mais ne sont pas valorisées pour détecter des problèmes d‘aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes) qui peuvent survenir à chaque génération. Ces anomalies chromosomiques entrainent souvent l’arrêt du développement voire des problèmes d’infertilité ou de stérilité sur l’individu né. Le projet présenté vise à développer des approches méthodologiques permettant valoriser les données de génotypage pour détecter les anomalies chromosomiques (monosomie, trisomie) le plus précocement possible chez l’embryon et chez le veau afin de les prévenir et les gérer. Le projet justifiant cette demande d’autorisation porte uniquement sur la détection des anomalies chromosomiques chez les embryons, les approches chez les veaux nécessitant uniquement l’exploitation de données de génotypages déjà disponibles dans les bases de données nationales.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de développer et valider des méthodologies de détection des problèmes de ploïdie (monosomie, trisomie) dès le stade embryonnaire préimplantatoire chez les bovins. Ces indicateurs permettront à la fois d’éviter de transférer les embryons aneuploïdes (probabilité de gestation et naissance quasi-nulle alors même que l’aspect morphologique semble bon) mais également de mieux diagnostiquer des problèmes de fertilité chez des animaux aneuploïdes et ainsi les réformer pour éviter la dissémination de ces tares génétiques.

Procédures

La production des embryons nécessitera la répétition, pour chaque génisse du projet, de 12 collectes d'ovocytes (1 collecte d'ovocytes tous les 15 jours par animal) réparties en deux séries entrecoupées d’une période de repos de plusieurs semaines. Au début de chacune des deux séries de collecte d'ovocytes, un traitement de synchronisation des chaleurs sera effectué comprenant la pose et le retrait d'un dispositif vaginal ainsi qu'une injection intramusculaire (chaque intervention durant moins d'une minute à chaque fois). Chacune des collectes d'ovocytes nécessite une succession d'interventions sur les animaux : ponction ovarienne (15 minutes) et pose d'un dispositif vaginal (moins d'une minute) suivi 2 jours plus tard d'un traitement de superovulation (5 injections intramusculaires à 12 heures d'intervalle; chaque injection durant moins d'une minute à chaque fois) et enfin ponction ovarienne multiple sous contrôle échographique (30 minutes) avec changement de dispositif vaginal (moins d'une minute). Les ponctions ovariennes seront systèmatiquement effectuées sur animaux vigiles anesthésiés.

Impact sur les animaux

Du fait des injections intramusculaires liées aux traitements de superovulation, un hématome peut apparaitre au niveau du site d’injection. Afin de limiter ces risques, les injections seront réalisés alternativement de chaque côté de l'encolure. De plus, les différentes interventions et contentions prévues dans le projet peuvent engendrer un stress ponctuel chez les animaux. Néanmoins, du fait de la répétition d'actes induisant des nuisances légères et en l'absence de données objectives sur le sujet, la procédure expérimentale est considérée en degré de sévérité modérée dans ce projet.

Devenir

Toutes les génisses seront gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

Avant de passer à l’utilisation de l’animal, les méthodes de détection de l’aneuploïdie ont d’abord été développées et validées sur embryons produits in vitro à partir d’ovaires prélevés post-mortem en abattoir. Néanmoins, compte-tenu des différences de qualité ovocytaire avec le modèle de prélèvement sur animaux vigiles et de la volonté d’étudier l’impact de la répétition des sessions de production sur le taux d’aneuploïdies des embryons, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. De plus, la production d’embryons in vitro après ponction folliculaire sur animaux vigiles représente le protocole principalement utilisé par les professionnels de la filière. Le développement méthodologique effectué doit donc nécessairement être validé en conditions de production réelles avant d’être mis en œuvre en routine.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été déterminé en fonction du nombre d’embryons à produire pour étudier le taux d’aneuploïdie (nombre anormal de chromosomes) des embryons selon les facteurs étudiés (protocole de production des embryons, taureau utilisé pour la fécondation, rang de collecte des ovocytes) et en tenant compte des impératifs pratiques imposés par le protocole de production (nombre de femelles traitées par jour et intervalle de temps entre les sessions). Ainsi, l’utilisation de 12 génisses permet de limiter le nombre d’intervention sur chaque animal avec 12 ponctions ovocytaires par individu permettant la production de 400 embryons sur l'ensemble du projet. Ces effectifs sont à priori nécessaires pour mettre en évidence, s'ils existent, les effets du taureau (présumés faibles), du protocole de production d’embryons (présumés importants) et du rang d’OPU (inconnus; aucune donnée bibliographique n'étant disponible sur le sujet) avec les exigences statistiques fixées (risque de 5% de conclure que l'effet existe alors qu'il n'existe pas; risque de 20% de conclure que l'effet n'existe pas alors qu'il existe).

Raffinement

L’étude est mise en place sur 12 génisses qui seront hébergées dans une stabulation libre avec aire paillée intégrale. Les génisses donneuses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales, enrichissement de milieux avec différents objets,...). Afin de limiter les risques d’hématomes, au niveau du site d’injection IM du traitement de superovulation, nous alternerons le lieu et le coté des injections. De plus, une anesthésie épidurale sera réalisée préalablement aux ponctions ovocytaires. Enfin, dans un objectif de renforcement positif, une récompense alimentaire (concentrés) sera donnée aux femelles après chaque passage dans la cage de contention, lors de la phase d’acclimatation ainsi que pour les collectes d'ovocytes.

Choix des espèces

Compte tenu de l’objectif même de l’étude, aucune autre espèce animale ne peut être choisie. La race Prim’Holstein choisie est la 1ère race laitière française en effectif, et est particulièrement concernée par les biotechnologies de l’embryon sur le terrain. Afin de produire les embryons du projet, il est nécessaire d'utiliser des génisses, toutes pubères et âgées de 14 à 18 mois. Le modèle génisse est représentatif de la population de donneuses d’embryons en France et à l’étranger. De plus, il a l’avantage, par rapport à un modèle vache, de ne pas présenter de biais expérimentaux liés à l’historique des femelles (conditions de mise bas, interactions avec la production laitière….).

Dix à douze prélèvements de sang hebdomadaires et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie par animal : 1 856 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées entre la douzième et la quatorzième semaine suivant l'injection de cellules cancéreuses. Une partie reçoit ces cellules par voie intraveineuse, une autre sous la peau, pour reproduire les deux formes de la mastocytose. Le porteur signale que l'expansion des cellules dans la peau provoque des démangeaisons et que leur installation dans les membres inférieurs et le bassin gêne progressivement les déplacements, des mouvements d'étirement des pattes signalant selon lui une greffe qui prend. Il précise aussi que les souris d'élevage non utilisées sont tuées, en particulier les mâles, dont le taux de greffe est inférieur à celui des femelles.

Objectifs

Le projet vise à démontrer, chez l’animal, comment deux gènes mutés dans la même cellule contribuent au développement de la mastocytose, une maladie qui affecte plusieurs organes ou uniquement la peau. Nous pourrons ainsi valider les observations réalisées in vitro sur l'implication de nouveaux gènes dans la maladie et qui soulignent la nécessité de développer des traitements personnalisés ciblant les effets de ces gènes sur les patients. Avant de tester de nouveaux médicaments, il est crucial de comprendre comment ces gènes influencent la maladie.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet confirmeront la nécessité de développer des thérapies personnalisées ciblant les dérégulations qui ont lieu chez les patients. La réalisation de ce projet est indispensable avant de prévoir l’étude pré-clinique qui consistera à tester l’efficacité de nouvelles drogues. Cette stratégie a démontré son efficacité dans notre précédente étude.

Procédures

Une seule injection de cellules cancéreuses sera réalisée chez les souris, soit par voie intraveineuse (dans la veine) soit par voie sous-cutanée (sous la peau). L’injection, effectuée sous anesthésie générale dans les deux cas, dure seulement quelques secondes. Un petit échantillon de sang sera prélevé chaque semaine sur les souris ayant reçu une injection intraveineuse, avec un total de 10 à 12 prélèvements ; chaque prélèvement dure moins de 5 secondes. Ces animaux seront également examinés par imagerie 3 à 5 fois au total. Les deux méthodes d’analyse sont complémentaires pour le suivi précis de la cinétique de multiplication des cellules. Pour les souris ayant reçu une injection sous-cutanée, un seul prélèvement de sang sera réalisé à la 10ème semaine, pour vérification, car les cellules ne devraient pas migrer dans le sang. Le suivi de la greffe cutanée est fait par imagerie (8 au total). L’imagerie est réalisée sous anesthésie générale et dure maximum dix minutes.

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale provoque une baisse de la température corporelle, un assèchement des yeux et un stress dû à la manipulation. L’injection des cellules pourrait provoquer une douleur légère et de courte durée après le réveil. L’imagerie peut entrainer du stress et une gêne de courte durée liée à l’anesthésie. Les prélèvements de sang, bien que brefs et sous anesthésie, peuvent provoquer du stress et une douleur légère durant les minutes qui suivent le réveil. L’expansion des cellules au niveau cutané peut provoquer des démangeaisons. L'expansion des cellules préférentiellement au niveau des membres inférieurs et du bassin, peuvent entrainer une difficulté progressive de se mouvoir. Des mouvements d’étirements des pattes indiquent une greffe réussie qui évolue, à surveiller de près.

Devenir

Les animaux utilisés sont mis à mort entre la 12ᵉ et la 14ᵉ semaine suivant l’injection des cellules, ce délai correspondant au stade où la greffe est suffisamment développée pour permettre l'analyse des souris. Les animaux d’élevage non utilisés sont mis à mort, notamment les mâles en raison d'un taux de greffe inférieur à celui des femelles.

Remplacement

Au cours des trois dernières années, nos recherches en laboratoire ont cherché à comprendre comment certains gènes interagissent dans la mastocytose, un type de cancer qui peut se manifester soit dans plusieurs organes, soit uniquement sur la peau. Cependant, ces études en laboratoire ont leurs limites, car elles ne reproduisent pas entièrement les conditions réelles, où l'environnement autour des cellules joue un rôle crucial dans le développement du cancer, sa propagation et la résistance aux traitements. Les souris sont essentielles pour recréer, même partiellement, les conditions pathologiques chez les humains et pour explorer comment les gènes interagissent afin de tester de futurs traitements. Par exemple, pour mieux étudier la forme cutanée de la maladie, nous utilisons des souris sans poils. Ce modèle nous aide à suivre de près comment les cellules cancéreuses envahissent la peau, de manière similaire à ce qui se passe chez les patients.

Réduction

Nous avons choisi deux types de souris pour notre étude en raison de leur pertinence pour notre travail et de leur utilisation fréquente en recherche. Le premier type nous aide à étudier le cancer quand il touche différents tissus dans le corps, tandis que le second est utilisé pour observer la forme du cancer qui se manifeste uniquement dans la peau. Grâce à notre expérience et aux informations recueillies de précédentes études, nous savons combien de cellules injecter, comment les tumeurs se développent avec le temps, à quelle fréquence nous devons prélever du sang, quand et comment réaliser l’imagerie et quand il est nécessaire de mettre fin à l’étude.

Raffinement

Dans le cadre de notre projet, nous mettrons en place des méthodes de raffinement qui visent à garantir que les modèles animaux sont traités de manière éthique et que leur bien-être est pris en compte. 1.Anesthésie pendant les procédures douloureuses d’injection ou de prélèvement de sang pour réduire la douleur et l'inconfort des animaux. 2.Monitoring de la santé : La surveillance régulière de la santé des animaux permet de détecter rapidement toute anomalie ou signe de détresse, ce qui permet une intervention précoce. 3. Enrichissement de l'environnement avec des éléments tels que des abris, des jouets, ou des matériaux à mâcher pour stimuler les comportements naturels et améliorer le bien-être des souris. 4.Protocoles de manipulation douce : Les procédures de manipulation des animaux doivent être effectuées avec précaution pour minimiser le stress, l'anxiété et la douleur. 5.Les étudiants travaillant avec les animaux sont formés pour mettre en œuvre les actes diminuant le stress. 6.Réduction du nombre d'animaux en utilisant le nombre minimal pour atteindre les objectifs du projet. 7.Respect les cycles circadiens et éviter les manipulations tardives.

Choix des espèces

Le modèle souris s'avère particulièrement approprié pour notre étude sur la mastocytose, car il répond à notre besoin de comparaison avec la pathologie observée chez les patients et repose sur des recherches préexistantes, éliminant ainsi la nécessité de mises au point supplémentaires. Les souris seront greffées entre 5 et 8 semaines d'âge. Les expériences antérieures montrent que ce stade est optimal pour une bonne prise de greffe dans les deux souches, bien qu'il soit possible de les greffer jusqu'à 12 semaines d'âge.