Oncologie

640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées pour des analyses histologiques. Celles qui sont opérées passent 1h30 en chirurgie pour l'implantation de fibres optiques dans le cerveau, parfois de pompes sous la peau, puis deux heures de réveil. Selon les groupes, les souris sont aussi isolées de leurs congénères pour provoquer un état anxieux, ou rationnées jusqu'à 90 % de leur poids pour des tâches de conditionnement. Le projet cherche si des métabolites bactériens, moins abondants dans le sang de personnes atteintes de troubles psychiatriques, agissent sur le cerveau, des métabolites qui "pourraient protéger des altérations comportementales", écrit le porteur. Il annonce des tests comportementaux dont certains provoquent "un stress de courte durée", sans préciser lesquels.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, qui controle l'inflammation dans le cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment les métabolites bactériens qui sont diminués chez les sujets atteints de maladies psychiatriques pourraient protéger des altérations comportementales et de neurotransmission dans un modèle validé de pathologies psychiatriques chez la souris.

Procédures

Les animaux subiront des interventions chirurgicales visant à implanter des fibres optiques dans le cerveau et potentiellement des pompes sous cutanées. La chirurgie stéréotaxique dure 1h30 avec une phase de réveil de 2 heures. L'implantation de pompes sous cutanée quant à elle dure au maximum 15 minutes. Cette dernière sera réalisée en même temps que l'implantation pour les souris concernées.

Impact sur les animaux

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum). Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Le modèle de pathologie psychiatrique reposant sur l'isolation sociale qui induira, d'après la littérature scientifique un phénotype anxieux chez les souris. Pour les injections ou les tests comportementaux, les animaux subiront des préhensions et contentions. Les souris réaliserons des tests comportementaux dont certains induisent un stress de courte durée. Enfin dans le cas ou les métabolites ne pourraient être administrés par l'eau de boisson ou la nourriture (pour des raisons organoleptiques conduisant à la non consommation par la souris), une chirurgie visant à implanter des pompes osmotiques sous-cutanées sera réalisée.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (640).

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons des mâles et des femelles. Le nombre d'animaux (640) nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes ayant subis un stress chronique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement ultra-enrichi (carré de coton, maison en carton, pièce en plastique pour se cacher et jouer) même en cas d'isolation sociale. Ce stress chronique a été sélectioné par rapport au stress chronique de défaite sociale, modèle de référence en psychiatrie, car il induit des altérations comportementales similaires sans induire de potentielles blessures à l'animal. Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage (en annexe): - Perte de poids anormale (10-20% score 1, score 3 si supérieur à 20%) - état du pelage - site de chirurgie - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...). Si le score est supérieur ou égal à 3 une mise à mort immédiate aura lieu. Un suivi du bien être animal sera effectué sur tous les animaux de manière quotidienne pendant le protocole de stress et l'étude comportementale en utilisant une fiche de suivi du bien être (en annexe). Le poids, le comportement général, l'apparence et les signes neurologiques seront scorés. Si un animal présente un score supérieur à 3 dans une des 4 rubriques il sera mis a mort. Sinon si un mal être est détecté il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson, la nourriture ou l'implantation d'une mini pompe sous cutanée par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Ce modèle d'étude chez la souris âgée de 8 semaines (jeune adulte) est la référence dans les pathologies psychiatriques et les métabolites d'intérêt dans ce projet sont naturellement présent chez la souris.

Quinze prélèvements de sang par incision du bout de la queue, chacun sur une souris maintenue une minute: 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent dix-huit semaines de régime hypergras jusqu'à l'obésité et le diabète, avec gavages au glucose, mesures de glycémie tous les quinze jours et 72 heures d'hébergement individuel réparties en quatre tests de dix-huit heures. L'objet réel est de vérifier si des "faux lipides" conçus par l'équipe agissent sur un récepteur lingual du goût du gras et coupent l'appétit. Le porteur retient la souris parce que sa lignée génétiquement modifiée n'existe que dans cette espèce, et cite aussi la disponibilité des réactifs et des "coûts limités de maintenance".

Objectifs

Des études récentes effectuées chez l’homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors, TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Le récepteur CD36 est le récepteur du gras qui est impliqué dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Dans le but de réduire la prise alimentaire des aliments gras. Nous avons développé des faux lipides qui sont soit des analogues d’acides gras ou un extrait d’origine végétale. Ces molécules sont capables d’interagir avec le lipido-récepteur CD36 et de mimer le goût du gras comme des acides gras naturels. Cela, ouvre des perspectives de l’utilisation de ces « faux lipides » comme modulateurs du gout du gras et du comportement alimentaire Le but de cette étude est de 1-Vérifier si nos molécules agonistes de CD36 « faux lipides » sont capables d’induire la satiété et de réduire l’incidence de l’obésité. Le test de comportement « test double choix » la mesure de prise alimentaire, du poids corporel ainsi que la glycémie à jeun fourniront des éléments de réponses à ce sujet. 2-Démontrer par l’utilisation de souris qui n’expriment pas le récepteur du gras uniquement dans les papilles linguales, l’implication, in vivo, de ce récepteur lingual dans l’action des faux lipides

Bénéfices attendus

Il a été rapporté que le goût du gras représente une sixième modalité gustative aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. Le récepteur du gras CD36 est responsable non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. L’altération du gout du gras conduit à une attirance excessive pour les aliments gras, favorisant ainsi l’installation de l’obésité et les maladies métaboliques associées tels que l’insulinorésistance et le diabète de type 2. Les études réalisées chez les souris n’exprimant pas récepteur du gras CD36 ont démontré qu’elles perdent la perception du goût du gras. A court terme, ce projet permettra la description et l’utilisation ultérieure d’une nouvelle lignée génétiquement modifiée, qui n’exprime pas le récepteur du gras uniquement dans les papilles linguales,qui pourra servir de modèle animal pour les études ou les interrogations relatives au rôle de CD36 dans le gout du gras. A long terme ce projet nous permettra de développer de nouvelles molécules anti-obésité ciblant le récepteur du gras « CD36 »

Procédures

L’ensemble des souris sera nourri avec un régime standard ou hypergras et sera pesé de façon hebdomadaire. Des mesures de la glycémie tous les 15 jours pendant 18 semaines au niveau de la queue ainsi qu’un test tolérance au glucose en fin de protocole nécessitent une mise à jeun de 6h, un gavage au glucose (moins d’une minute) et une incision de l’extrémité de la queue, ces mesures de glycémie seront réalisées par bandelette glucomètre Ainsi pour la mesure de la glycémie, chaque souris subira un total de total 15 prélèvements d’une goutte de sang après incision de queue. Le prélèvement sera réalisé réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). Les souris seront hébergées individuellement en tout pendant 72 h (4 tests de 18h) pour réaliser un test comportemental. Un prélèvement sanguin terminal intracardiaque (sous anesthésie générale) sera réalisé avant la mise à mort (toujours anesthésiées). Après euthanasie, les organes d’intérêt seront prélevés.

Impact sur les animaux

- Inconfort lié à l’obésité induite par le régime alimentaire hyper-gras : l’obésité ou le surpoids peut réduire la mobilité des souris qui développent également un diabète de type 2. Nous avons limité la durée du régime alimentaire à 18 semaines. Durée optimale pour observer les effets des molécules anti-obésité limitant ainsi les inconforts liés à l’obésité. - Douleur lors des prélèvements sanguins au niveau de la queue. Les prélèvements sanguins (une goutte sur une bandelette de glycomètre) nécessitent une section de 0.5 à 1mm de l’extrémité de la queue qui peut induire une douleur et une infection locale. Les souris subiront en tout 15 prélèvements sanguins (10 prélèvements tous toutes les deux semaines pour suivre l’installation du diabète type 2 et 5 prélèvements lors du test un test de tolérance au glucose). Pour pallier à cette nuisance, nous effectuons une anesthésie locale (crème emla 5%) avant incision et nous désinfectons (solution antiseptique) la queue avant et après l’incision de même que les instruments (ciseaux) à l’alcool. - Irritation de la gorge lors des gavages : le test de tolérance au glucose (OGTT) nécessitant un gavage avec une solution de glucose, afin de minimiser cette irritation malgré la qualification de l’expérimentateur nous utilisons des sondes en plastique souple adéquates pour souris (38 mm longueur et 1,2 mm de diamètre de la pointe). -Stress lors des manipulations : les gavages nécessitent également une contention. Pour pallier à ce stress, nous limitions la durée de contention à quelques secondes. - Stress lors d’hébergement individuel des souris : les souris seront en hébergement individuel en tout pendant 72 h pour réaliser des tests de doubles choix (4 tests de 18h). Nous avons limité cette durée d’hébergement individuel à 18h qui représente la durée minimale pour réaliser ce test comportemental

Devenir

A l’issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort..

Remplacement

L’obésité est une maladie multifactorielle impliquant l’altération du métabolisme des lipides et glucides, les dérégulations hormonales (hormones du tissu adipeux), l’activation du système immunitaire, l’inflammation. Ainsi malgré les résultats obtenus, in-vitro, le recours à l’animal est indispensable. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après une estimation statistique, la taille minimale des groupes est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien-être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront hébergées individuellement, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo et matériau de nidification en cellulose). Les souris seront habituées à la contention pour diminuer le stress, lors des pesées et des prélèvements. Un anesthésiant local sera appliqué sur la queue lors des prélèvements sanguins et une anesthésie générale sera réalisée avant la mise à mort.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix pour des études sur l’obésité et le comportement alimentaire. Bien que techniquement plus difficile que l’utilisation du rat, notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (anticorps, kits de dosage etc…) et les coûts limités de maintenance contribuent au choix de modèle souris. De plus, l’élevage et l’induction de la modification génétique étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix pour notre étude. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 8 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. Des souris mâles de 4 à 5 semaines seront mises sous régime obésogène pour maitriser l’induction de l’obésité. Il y’a pas de référence pour déterminer l’obésité chez la souris tels que l’indice de masse corporelle chez l’humain. Cependant les souris ayant un poids corporel au-delà de 45 g sont considérées comme obèses et développent une hyperglycémie à jeun. A la fin de l’étude, les animaux auront alors entre 22-23 semaines et seront donc adultes. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique (induites par des régimes obésogènes) telles que le diabète de type 2 normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.

Toutes tuées à la fin des procédures pour éviter la dissémination d'organismes génétiquement modifiés, 2 770 souris transgéniques sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir une greffe de cellules leucémiques, des injections antitumorales deux fois par semaine pendant quatre semaines, un gavage quotidien sur la même durée, jusqu'à douze prélèvements sanguins et trois prélèvements de moelle osseuse. Une partie est irradiée avant greffe, ce que le porteur qualifie d'affaiblissement modéré et transitoire, les animaux à pathologie avancée perdant du poids et s'affaiblissant jusqu'à l'arrêt de la procédure. Sur le remplacement, il conclut que le modèle murin est "incontournable", notamment parce que les lignées cellulaires cultivées divergent des échantillons de patients.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Les mutations sur lesquelles nous travaillons restent de très mauvais pronostic. Dans l'ensemble, l'objectif de ce projet est d'améliorer la compréhension du développement, de l’évolution et de la rechute des leucémie aigues myéloïdes et d'identifier les mécanismes impliqués dans la leucémogenèse et la résistance aux traitements permettant d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Nos résultats précédents indiquent que le stade développemental (ex: fœtal, nouveau-né ou adulte) dans lequel ces altérations surviennent est important. Nos analyses moléculaires suggèrent que des mécanismes induits par ces fusions et des mécanismes de coopération entre différentes mutations sont importants pour les cellules leucémiques. Il est donc indispensable de développer des modèles physiologiques prenant en compte le stade du développement pour comprendre les mécanismes de la transformation leucémique et tester leurs rôles dans l'initiation ou le maintien des tumeurs. A ce jour, l'étude de l'inactivation de certains gènes in vivo, ainsi que le rôle chez l'animal entier ne peuvent pas encore être complètement remplacés par les modèles sophistiqués de remplacement. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies à mauvais pronostic et de tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, dans le contexte d’un organisme entier.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer la compréhension du développement, de l’évolution et de la rechute des leucémie aigues myéloïdes et d'identifier les mécanismes impliqués dans la leucémogenèse et la résistance aux traitements permettant d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette à court terme: -De caractériser les mécanismes impliqués dans le développement leucémique, le maintien leucémique, la rechute et la résistance aux traitements. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -D’évaluer l’effet de l’inflammation dans le développement et la propagation leucémique. -A plus long terme, nous visons l'identification de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ces leucémies.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend entre quelques secondes et 3 à 5 minutes en fonction de la voie d'injection. -Injection de molécules: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et sont journaliers sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle: jusqu'à 3 prélèvements par souris avec un intervalle d'au moins 15 jours entre deux prélèvements. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général qui récapitule la maladie humaine nécessitant une surveillance renforcée, des soins puis un arrêt de la procédure. Les gavages pourront entraîner un stress léger et un inconfort temporaire. L’irradiation peut également entrainer à court terme un affaiblissement modéré transitoire des souris .

Devenir

Tous les animaux sont transgéniques et doivent être euthanasiés à la fin de la procédure pour éviter la dissémination des OGM. Des analyses post-mortem sur les organes des animaux permettent aussi de caractériser la pathologie par des analyses histologiques.

Remplacement

L'utilisation de modèles murins dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération de toutes les cellules du sang n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

Pour déterminer l’efficacité des modèles, nous évaluons le développement tumoral entre les groupes contrôles et les groupes expérimentaux à l'aide de différents paramètres (nombre de globules blanc, globules rouges, plaquettes dans le sang; pourcentage de cellules anormales par les analyses de cytométrie en flux; poids des rates et des foies) grâce à un test statistique. La robustesse des modèles est évaluée en confrontant ces résultats au cours du temps. Les nombres calculés dans ce projet sont des nombres maximaux calculés par des méthodes de calcul de puissance ou limités par le matériel cellulaire disponible (ex: dans le cas de populations purifiées de progéniteurs hématopoïétiques). Pour ce projet, nous avons favorisé l'utilisation de modèles transgéniques développés sur la base d'une expression des oncogènes proche de la physiologie et qui développent des hémopathies de manière pénétrante. Ainsi, le développement tumoral est contrôlé et le nombre de souris utilisé correspond précisément au nombre de souris permettant d'obtenir une valeur statistique des résultats.

Raffinement

Les procédures douloureuses sont accompagnées d’anesthésie et d’analgésie appropriées. Les animaux sont observés avec une fréquence adaptée à la procédure. L'utilisation d'une grille de score nous permet de suivre les animaux et d'intervenir pour les soulager en cas d’observation d'une souffrance. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Comme explicité plus haut, l’irradiation peut entrainer à court terme un affaiblissement des souris. Pour prévenir les conséquences après une irradiation léthale suivie de greffe et assurer le confort des animaux durant le premier mois post-irradiation, une nourriture enrichie est mise à disposition.

Choix des espèces

L'espèce souris a été choisie pour les raisons suivantes : -Les souris possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l'homme et de nombreux modèles de souris existent déjà permettant des croisements avec nos modèles. -Les approches précliniques in vivo sur souris sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères. Les nombreux modèles murins déjà disponibles reposent sur la proximité entre le développement des cellules du sang chez l'homme et la souris et ils permettent de comparer les résultats avec ceux d'autres études. Nous utiliserons des souris adultes et/ou des nouveau-nés et des embryons. Les souris adultes auront entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, un article récent montre l’importance d'utiliser des receveurs à différents stade de développement. Ainsi, nous utiliserons à la fois des cellules fœtales (foie fœtal), des cellules de nouveau-nés et des cellules adultes qui seront greffées dans des receveurs soit nouveau-nés soit adultes, âges qui correspondent à la population de patients..

Six injections intrapéritonéales sur animal vigile, quatre semaines de corticostérone dans l'eau de boisson, quatre prélèvements sanguins hebdomadaires puis un test de tolérance au glucose ou à l'insuline après cinq heures de jeûne : 144 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux tiers d'entre elles reçoivent une dernière injection abdominale sept minutes avant d'être tuées, toutes l'étant pour prélèvement du pancréas, du foie, des muscles et des tissus adipeux. Le porteur indique que la corticostérone peut faire monter la glycémie, augmenter l'émission d'urine et la prise de boisson, et provoquer une perte de poids. L'enjeu déclaré reste une étape de connaissance sur la contribution du muscle squelettique à l'adaptation du pancréas, sans application annoncée pour les 4,3 millions de personnes diabétiques que le porteur cite à l'appui du projet.

Objectifs

Les diabètes de type 1 et 2 sont caractérisés par une augmentation de la concentration du sucre dans le sang entrainant notamment des maladies du cœur et des reins mettant ainsi en jeu la vie des patients diabétiques. L’excès de sucre dans le sang se met en place lorsque le pancréas produit de façon insuffisante l’insuline qui est l’hormone capable de baisser la concentration de sucre dans le sang. Le pancréas est capable d’augmenter sa production d’insuline en réponse à une résistance à l’insuline des tissus périphériques tels que le foie, le tissu adipeux et le muscle squelettique. Toutefois, la communication entre ces organes et qui sous-tend cette adaptation pancréatique reste méconnue. Le laboratoire a développé un modèle murin d’insulino-résistance par traitement chronique aux glucocorticoïdes (GC) et a caractérisé l’adaptation pancréatique qui en découle. Cependant, la contribution des différents tissus sensibles à l’insuline reste méconnue. Des résultats indiquent un rôle important des muscles squelettiques en réponse aux GC. L’objectif du projet est de définir la contribution des muscles squelettiques dans les conséquences métaboliques et l’adaptation pancréatique en réponse à un traitement chronique aux GC chez la souris.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 1 est caractérisé par un déficit total en cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline, la seule hormone hypoglycémiante de l’organisme. Le diabète de type 2 est caractérisé par une résistance à l’insuline associée à une carence relative en insuline. En France, on dénombre 4,3 millions de personnes diabétiques. La prévalence augmente depuis des années et est passée de 5,6 pour cent en 2015 à 6,07 pour cent en 2021 (source Santé Publique France et Fédération Française des diabétiques). Si les tendances restent identiques, 520 000 personnes deviendront diabétiques d’ici 2027 en France. 90 pour cent des diabétiques sont atteints du diabète de type 2, maladie touchant préférentiellement les adultes et associée à l’obésité. 10 pour cent des patients sont atteints du diabète de type 1 dont le déclenchement est observé majoritairement chez l’enfant et est lié à une dérégulation du système immunitaire. Des traitements contre cette maladie existent avec notamment des anti-diabétiques oraux pour le diabète de type 2 et des injections quotidiennes d’insuline pour le diabète de type 1. Il est bien connu que le pancréas est capable de produire plus d'insuline lorsque les tissus comme le foie, le tissu adipeux et les muscles deviennent moins sensibles à cette hormone, ce qui est appelé résistance à l'insuline. Cependant, on comprend encore mal comment ces organes communiquent entre eux pour permettre cette adaptation du pancréas. Nous avons développé un modèle chez la souris où la résistance à l'insuline est induite par un traitement prolongé avec des glucocorticoïdes (un type de médicament souvent utilisé pour réduire l'inflammation). Ce modèle nous permet de mieux comprendre comment le pancréas réagit à cette situation. Le but de notre projet est de découvrir le rôle des muscles dans cette réponse et dans les changements métaboliques qui surviennent suite à un traitement prolongé avec ces médicaments chez la souris.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement par injections intrapéritonéales afin d’induire la modification génétique, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours puis une injection unique de rappel 4 semaines après, soit un total de 6 injections par souris. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Les animaux seront ensuite soumis à un traitement via l’eau de boisson durant 4 semaines. Nous réaliserons des prélèvements sanguins de faible volume effectués une fois par semaine pendant 4 semaines. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal soit 4 prélèvements sur la durée de traitement. A la fin des traitements, les souris seront soumises à l’un des deux tests pour évaluer soit la tolérance au glucose ou celle à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun courte (5h), les souris seront injectées en intrapéritonéal et 5 à 7 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Une partie des animaux (environ 2/3) subira une injection unique au niveau de l’abdomen 7 minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

L’induction du modèle génétiquement modifié reposent sur une injection intrapéritonéale tous les jours pendant 5 jours puis une injection unique un mois après, pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection pour les animaux. Aucun effet secondaire n’a été décrit dans la littérature pour cette administration. L’administration de corticostérone via l’eau de boisson pourrait induire un stress de courte durée lors de sa mise en place en raison de la peur de la nouveauté des souris (néophobie) et après plusieurs semaines le traitement pourrait induire un une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et éventuellement une perte de poids. De même, le suivi glycémique longitudinal des animaux pourra induire un stress et une douleur de courte durée. Les tests métaboliques, qui comprennent une injection intrapéritonéale puis plusieurs prélèvements sanguins de faible volume afin de suivre la glycémie, peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Ils peuvent également induire un stress et une légère sensation de faim pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun.

Devenir

Notre étude nécessite le prélèvement d’organes afin de caractériser l’effet des traitements sur les adaptations métaboliques et pancréatiques en présence ou non du récepteur des glucocorticoïdes dans les muscles squelettiques. Ainsi, l’euthanasie des animaux est strictement nécessaire afin de répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Les cellules bêta pancréatiques produisent l’insuline qui va agir sur ses tissus cibles pour stimuler le stockage du glucose, inhiber la production de glucose et la lipolyse. Lorsque l’insuline est produite en quantité insuffisante, la concentration de glucose dans le sang n’est plus régulée et augmente de façon chronique. C’est l’hyperglycémie qui est le symptôme premier du diabète, maladie multi-organes. Nous développons des stratégies afin de définir comment produire un plus grand nombre de cellules produisant de l’insuline dans le pancréas et notamment comment le muscle squelettique produit des facteurs qui induisent l’adaptation pancréatique. Nous étudions donc la communication inter-organes adaptative. Un organisme vivant est nécessaire pour définir la contribution spécifique des organes et notamment des muscles squelettiques. Il n’est pas possible de recréer en culture de cellules la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires rentrant en jeu.

Réduction

Un total de 144 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous analyserons sur chaque souris les cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline mais également les tissus cibles de l’insuline tels que le foie, les différents types de muscles squelettiques et les tissus adipeux gonadiques et sous cutanés. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe tout en nous assurant que nous obtiendrons des résultats statistiquement fiables. En effet, en raison des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (formation, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés. La principale contrainte concerne les injections intrapéritonéales pour induire le modèle génétiquement modifié qui seront effectuées par du personnel formé au geste. De même, l’administration via l’eau de boisson de glucocorticoïdes sera surveillée et les biberons changés 3 fois par semaine afin de garantir une bonne qualité de l’eau de boisson. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids et de la glycémie sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous avons montré qu’il existait une adaptation pancréatique chez les souris traitées aux glucocorticoïdes (GR). Le projet actuel vise à caractériser plus en avant cette adaptation en absence du GR dans le muscle squelettique. Ce modèle d’invalidation du GR est disponible chez la souris. C’est la raison pour laquelle nous souhaitons réaliser nos expériences chez la souris. Justification des stades de développement Les études se feront avec des animaux adultes. En effet, le projet s’intéresse aux adaptations métaboliques et pancréatiques en réponse à un traitement chronique aux GC, ce qui nécessite de réaliser les expériences dont le métabolisme glucido-lipidique est fixe, c’est-à-dire chez des souris adultes, post-sevrage et post-puberté. En effet, le sevrage est associé à des modifications profondes de l’utilisation des substrats énergétiques car l’alimentation pré-sevrage est principalement lipidique (lait maternel) tandis que l’alimentation post-sevrage est majoritairement glucidique. D’autre part, la puberté est associée à une insulino-résistance transitoire qui pourrait impacter nos études métaboliques.

Toutes tuées à l'issue pour des analyses sur les tissus prélevés, 328 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, jusqu'à deux injections d'un virus modifié ou de solution salée, et deux séances d'imagerie de seize minutes sur cinq semaines. Le virus retenu se fixe 210 fois plus sélectivement sur les cellules cancéreuses que sa version d'origine, selon des essais menés en culture cellulaire. Parmi les bénéfices attendus, le porteur annonce une régression tumorale "sans perte de poids ou effet secondaire notable", alors que la liste des effets indésirables qu'il prévoit comprend la perte de poids, une nécrose au point d'injection et une encéphalite provoquée par le virus.

Objectifs

Malgré les traitements existants, les tumeurs cérébrales restent parmi les cancers ayant les plus mauvais pronostiques à court terme. La chirurgie n’est pas toujours possible, et même lorsqu’elle l’est, cette solution n’est souvent pas suffisante, comme en témoigne l’émergence de récidives dans la majorité des cas. La radiothérapie et la chimiothérapie ne sont pas plus efficaces, car elles engendrent rapidement une sélection des population cellulaires résistantes responsable des récidives. Ces aspects limitent l’espérance de vie des patients à 1 ou 2 années malgré la prise en charge thérapeutique. L’échec de ces thérapies est généralement lié à la récidive tumorale engendrée par des cellules résistantes aux traitements conventionnels surexprimant un marqueur tumoral spécifique. Le projet vise à développer un protocole complémentaire aux thérapies traditionnelles basé sur l’utilisation de virus capables d’éliminer les cellules cancéreuses. A ce jour le test le plus avancé pour l’utilisation de ce type de virus dans le cadre des glioblastomes repose sur l’injection d’un adénovirus directement dans la tumeur. Toutefois cet adénovirus n’est pas sélectif des cellules cancéreuses. Même s’il les élimine moins efficacement que les cellules cancéreuses, il est aussi capable d’infecter les cellules saines. Cette non sélectivité induit une perte d’efficacité de la thérapie, des effets secondaires et complique son administration aux patients. Afin d’éliminer ces problèmes, nous utiliserons un virus innovant, capable de sélectionner préférentiellement les cellules résistantes exprimant le marqueur spécifique. La modification principale du virus consiste modifier une protéine de surface permettant d’obtenir un virus ciblant spécifiquement les cellules tumorales porteuse du marqueur spécifique. Il a été montré, en culture de cellules, que cette ce virus modifié se réplique préférentiellement sur les cellules tumorales par rapport aux cellules non tumorales.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : la mise en évidence d’une régression tumorale suite à l’injection du virus (en mono ou bi injection) sans perte de poids ou effet secondaire notable ainsi que la possibilité d’administrer le virus par voie intraveineuse tout en conservant son efficacité

Procédures

Dans la procédure 1 : Chaque animal recevra au maximum 3 injections sous anesthésie gazeuse de 3 minutes chacune soit 9 minutes maximum. Pas de prélèvement sur animal vigile. Dans la procédure 2 : Chaque animal aura : - 1 anesthésie de 3 minutes pour injection de cellules tumorales à J0 - 2 anesthésies de 3 minutes pour injection de virus ou solution saline - 2 anesthésies de 16 minutes pour les séances d'imagerie . Total 50 minutes maximum sur 5 semaines

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : - hématome transitoire au niveau du site d'injection intraveineux caudale (72h maximum) , - nécrose transitoire des tissus au niveau du site d'injection intratumoral, - perte de poids de l'animal, - développement de tumeur suite à l'injection de cellules tumorales, - encéphalite induite par le virus

Devenir

a la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des études complémentaires ex vivo sur les tissus et organes prélevés.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux testés, la spécificité des virus a déjà été étudiée en culture cellulaire in vitro. Le Sindbis (virus non modifié) n’a pas montré de sélectivité particulière pour les cellules tumoralespar rapport aux cellules non tumorales , alors que le virus Sinerpedoxx (virus modifié ciblant les intégrines) permet une infection 210 fois plus sélective (que le variant Sindbis) des cellules cancéreuses par rapport aux cellules non tumorales. La capacité des virus Sindbis et Sinerpedoxx à générer la mort cellulaire des modèles cellulaires tumorales a aussi été démontrée dans des expériences préliminaires (ainsi que dans la littérature). Il est maintenant indispensable de tester l’effet antitumoral de l’administration du virus sur un modèle animal de glioblastome. En effet, le modèle cellulaire ne peut pas recréer le micro-environnement tumoral ni les interactions avec le système immunitaire ainsi que l’impact de la voie d’administration (intraveineuse ou intratumorale) sur l’effet thérapeutique.

Réduction

L’imagerie TEP est peu invasive qui permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin, il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. Nous utiliserons ainsi 10 souris par radiotraceur à l'inclusion afin d’avoir des statistiques sur les résultats obtenus. Cet effectif est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité et des sorties d'étude en raison d’atteinte de point limite. Le test statistique utilisé est adapté pour les petits effectifs.

Raffinement

Les animaux sont placés à plusieurs par cage, ont accès à l' eau et à la nourriture à volonté, et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les interactions sociales et permettre une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite sa thermorégulation ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des animaux. Ainsi, un score clinique est attribué et une grille de points limites a été mise en place pour identifier la souffrance animale.

Choix des espèces

Des tests cellulaires in vitro ont déjà été réalisés. Cependant, le modèle animal est indispensable pour évaluer l’effet thérapeutique des virus dans des modèles tumoraux, en l’occurrence le glioblastome. La souris est l’espèce la plus adaptée pour répondre à cette question. De plus par sa taille, elle permet de réduire les quantités de radioactivité injectées à l’animal et donc les effets secondaires. Nous utiliserons des souris adultes de 7 ou 8 semaines conformément à la littérature et à notre expérience

288 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie profonde pour prélever un volume important de sang. Chacune reçoit une injection sous-cutanée sur animal vigile de cellules coliques humaines exposées pendant plusieurs mois à trois pesticides, puis un prélèvement dans le sinus rétro-orbital. La question posée consiste à savoir si ces cellules, déjà transformées en culture par les pesticides, forment une tumeur une fois greffées. Le porteur justifie ce passage à l'animal par le fait que ces pesticides sont commercialisés depuis trop peu de temps pour qu'une étude épidémiologique soit possible chez l'être humain.

Objectifs

Le cancer colorectal, au niveau mondial, est le 3ème cancer le plus diagnostiqué après le cancer du poumon et du sein (plus de 1,8 million de nouveaux cas par an) et le 2ème cancer le plus mortel après le cancer du poumon (plus de 900 000 décès par an). Selon les estimations, ces chiffres devraient encore augmenter et atteindre plus de 2,2 millions de nouveaux cas et 1,1 million de décès par an d'ici 2030. Au cours de ces dernières années, certains facteurs environnementaux sont apparus comme une cause possible de l'augmentation de la prévalence de maladies chroniques, y compris certains cancers. In vitro nous avons observé qu’une exposition chronique de cellules non tumorales coliques pendant plusieurs mois à trois pesticides, seuls ou en cocktail provoque des changements importants et irréversibles (persistant après la levée de l’exposition). Notre objectif est de déterminer si ces altérations reflètent un mécanisme de cancérisation des cellules et si cette exposition chronique aux pesticides peut favoriser ou non le développement tumoral.

Bénéfices attendus

L’objectif est de déterminer si l’exposition chronique de cellules coliques non tumorales à trois pesticides fréquemment détectés dans notre alimentation favorise ou non le développement tumoral. La mise sur le marché de ces composés est en effet encore trop récente pour permettre de mener des études épidémiologiques chez l’homme et estimer le risque que peut représenter une exposition chronique à ces composés sur la santé humaine. L’étude permettra également de valider des biomarqueurs tumoraux sanguins destinés, à terme, à améliorer le diagnostic et suivi des patients atteints de cancers

Procédures

La procédure implique au maximum une injection sous-cutanée sur animal vigile en début d’expérience (moins d'1 minute) et un prélèvement sanguin sur animal anesthésié en cours d’expérience (1-2 minutes maximum).

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à une légère douleur de courte durée lors des injections de cellules chez l’animal vigile. On peut également s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. Nous n'attendons pas d'autres nuisances ou effets indésirables majeurs sauf peut-être de très rares cas de détérioration de l’état général des animaux (perte de poids, par exemple) ou de nécrose de la tumeur. Un prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbital au cours du suivi du développement tumoral chez l’animal anesthésié ne devrait pas non plus occasionner de nuisance particulière, si ce n’est peut-être une légère douleur ou inconfort au réveil.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde (sans réveil) et sous analgésie pour permettre le prélèvement d’un volume de sang important.

Remplacement

Nos résultats in vitro démontrent que l’exposition chronique de cellules coliques non tumorales aux pesticides provoque des changements morphologiques importants et irréversibles. La question que nous posons est de savoir si ces cellules ont acquis la capacité de développer une tumeur, une question qui ne peut être résolue qu’in vivo, dans un microenvironnement complexe. Il n’y a, en effet, pas de systèmes alternatifs pour évaluer de façon fiable le processus d’initiation tumorale.

Réduction

Pour tester l’hypothèse selon laquelle l’exposition aux pesticides in vitro pourrait conférer à nos cellules une capacité à former des tumeurs lorsqu’elles sont xenogreffées chez la souris nude, nous avons évalué, à l’aide du logiciel G-Power, le nombre minimum requis de souris par groupe à 8 pour obtenir des données statistiquement valides.

Raffinement

La procédure a été optimisée au cours d’études similaires précédentes, dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis et la surveillance de l’état clinique des animaux se fera au quotidien, y compris les week-ends et jours fériés afin de détecter le moindre signe de souffrance et/ou de détresse de l’animal. Les observations et l’évolution de l’état général des animaux conditionneront les prises de décisions (injection d’analgésique et si nécessaire, euthanasie).

Choix des espèces

La souris est l’espèce la mieux définie génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence (y compris les nôtres) dans le domaine de la cancérologie sont nombreuses, bien documentées et bien validées. En particulier, les modèles de souris immunodéprimées sont idéaux pour la recherche sur les greffes de cellules cancéreuses et sont classiquement utilisés pour analyser la réponse tumorale. Après 1 semaine d’acclimatation en zone d’hébergement, les souris agées de 6 semaines seront réparties de manière homogène entre les lots à raison de 8 souris/lot. Les souris adultes offrent en effet un modèle expérimental plus robuste, stable et pertinent pour les études de xénogreffe tumorale (plus grande facilité de manipulation, meilleure tolérance des procédures, croissance tumorale plus prévisible et plus uniforme, pertinence par rapport à la tumorigenèse humaine qui est plus fréquente chez les adultes).