Oncologie

Des femelles gestantes sont enfermées chaque jour dans une machine à enfumer, placées le matin dans un espace restreint, puis laissées le soir sur une litière humide en cage inclinée, le cycle lumineux étant inversé le week-end. 480 souris, 120 femelles et 360 souriceaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les petits étant exposés à la fumée de cigarette jusqu'à leur trentième jour de vie. Le porteur affirme que les femelles "tolèrent bien" cette exposition, "sans nuisance particulière", tout en anticipant que le stress chronique quotidien peut conduire à un cannibalisme maternel. Toutes sont tuées à la fin de la procédure, pour prélever notamment les poumons et mesurer les effets des deux expositions.

Objectifs

L'objectif de notre projet est d'évaluer les interactions entre les expositions au stress chronique maternel et au tabagisme pendant les premières années de vie et leurs conséquences sur la santé respiratoire de l'enfant/de la progéniture. L'approche expérimentale qui fait l'objet de la présente demande vient compléter une approche épidémiologique réalisée sur une cohorte mère-enfant, avec pour objectif général d'identifier les mécanismes biologiques sous-tendant les interactions entre stress chronique et chimique. Le volet expérimental du projet va nous permettre de comprendre à quel(s) stade(s) du développement pulmonaire cette interaction exerce son effet, grâce aux analyses fonctionnelles et moléculaires qui seront réalisées sur les prélèvements pulmonaires notamment.

Bénéfices attendus

Ce projet explore la relation entre l'exposition aux polluants, en particulier le tabac, et la vulnérabilité induite par le stress sur la santé respiratoire. Il se concentre sur un problème majeur de santé publique qui a été peu exploré jusqu'à présent : comment l'exposition précoce à un événement stressant de la vie rend les individus plus susceptibles de développer des troubles respiratoires après une exposition à des polluants environnementaux tels que le tabac. L'identification de biomarqueurs enrichira la construction d'AOPs (adverse outcome pathways) et donc, au-delà de la science fondamentale, renforcera le panel d'outils de régulation dans ce domaine. Ces biomarqueurs seront aussi recherchés chez les patients, ce qui devrait conduire à terme à de fortes implications en santé publique grâce à l'approche pluri- et transdisciplinaire du projet dans son ensemble (volets épidémiologique et expérimental).

Procédures

Les femelles gestantes seront exposées à la fumée de cigarettes quotidiennement, selon une procédure non douloureuse (cage placée dans une machine à enfumer), et/ou à différents stress chroniques. Ainsi, un évènement de stress léger sera appliqué le matin (femelle placée dans un environnement restreint), ainsi que le soir (litière humide, cage inclinée). Les week-ends, seule une inversion du cycle de lumière (30 min de lumière toutes les 3 h) sera appliquée. La descendance sera exposée quotidiennement à la fumée de cigarette jusqu'au 30è jour de vie. Elle sera soumise à des mesures longitudinales non invasives de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant 1h à plusieurs stades de leur vie (Pléthysmographie).

Impact sur les animaux

D’après nos résultats antérieurs, les souris femelles exposées aux polluants au cours de la gestation tolèrent bien une telle exposition, sans nuisance particulière. Leur descendance ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. L’exposition des femelles au stress chronique chaque jour pendant la gestation pourrait induire un stress pouvant conduire à un cannibalisme maternel. Dans le cadre de ce projet, une attention particulière sera portée à la croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels. La mesure de la fonction pulmonaire par pléthysmographie corps entier est non invasive, elle est réalisée sur animaux vigiles et libres de mouvement, elle n’induit pas d’effets indésirables.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux différents stress (chronique et/ou chimique).

Remplacement

L'objectif de notre projet est d'évaluer les interactions entre les expositions au stress chronique maternel et au tabagisme pendant les premières années de vie et leurs conséquences sur la santé respiratoire de l'enfant/de la progéniture. De cette co-exposition résulte une complexité impossible à modéliser de manière bioinformatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet est de 480 animaux (360 souriceaux + 120 femelles gestantes). Ce nombre a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données historiques du laboratoire, du nombre moyen le plus bas de naissances par portée, et de données (publiées ou non), nous permettant de réaliser des calculs statistiques permettant de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif et pour déterminer des points d'arrêt d'expérimentation. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations inter individus et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’effet ou non d’une condition expérimentale. Précédemment au laboratoire nous avons harmonisé les procédures afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le choix des points temporels d’analyses a été conservé par rapport aux études précédentes du laboratoire. Ainsi, les résultats précédemment obtenus au laboratoire sur les effets de l’exposition à la fumée de cigarette et/ou sur la période du développement pulmonaire pourront être comparés. En fonction du calendrier des expériences et de la réussite des accouplements, le nombre d'animaux utilisés pourra être revu à la baisse.

Raffinement

Les expérimentations seront réalisées conformément aux règles éthiques visant à respecter le bien être animal, c’est-à-dire dans un environnement contrôlé (stabulation dans des enceintes autonomes d'animalerie). Ces conditions expérimentales offrent de plus l’avantage de minimiser l’impact de stress non contrôlés sur les paramètres mesurés. Plus spécifiquement, pour la réalisation du protocole de stress, les animaux seront stabulés dans des enceintes autonomes. Ces enceintes permettent d'éviter aux animaux d'être dérangés par le bruit extérieur (source de stress que nous ne pourrions contrôler dans un projet qui s'intéresse à l'effet d'événement stressant). Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser le stress (non souhaité), notamment en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanière de papier. Après le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, et seront hébergées en groupes sociaux, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. L'exposition à la fumée de cigarettes se fait en placant directement les cages dans la machine à enfumer Teague, ce qui permet de ne pas avoir à changer les animaux de cages. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort rapide à l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi dans notre projet pour plusieurs raisons. La souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la littérature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, nous maitrisons l'ensemble des techniques nécessaires à l'expérimentation. Les analyses seront réalisées à J21 (stade tardif de l'alvéolisation), J30 (jeune adulte) et J60 (adulte, maturité pulmonaire atteinte).

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

Enfermées seules pendant 72 heures dans une enceinte close qui mesure le méthane qu'elles émettent, avec traite manuelle deux fois par jour, 160 chèvres en lactation vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un séjour pouvant provoquer vocalisations, baisse d'ingestion, perte de poids transitoire et agitation, et reconnaît que l'hébergement individuel est un facteur stressant. Il écrit pourtant que la procédure "n'implique aucune mesure invasive sur les animaux". Les chèvres retournent ensuite à l'élevage, où leur efficience alimentaire et leur résilience continuent d'être mesurées, les données servant à nourrir des modèles mathématiques de réduction du méthane.

Objectifs

Chez les ruminants, La dégradation des aliments se produit principalement dans le rumen (estomac) grâce à l'action d'une communauté microbienne complexe. Ce microbiote est responsable de la fermentation des aliments dont les produits principaux sont les acides gras volatils, le gaz carbonique et le méthane. La réduction des émissions de méthane des ruminants est un défi majeur pour le secteur de l'élevage. La conception de stratégies optimales de réduction de méthane nécessite la prise en compte des éléments de productivité et de résilience animale. En effet, une stratégie de réduction des émissions ne doit peut pas défavoriser la santé et la production (e.g. production du lait des chèvres laitières dans notre cas). Dans ce contexte, ce projet associe la modélisation mathématique et l’expérimentation animale pour contribuer à une meilleure compréhension des interactions entre caractères clés. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la dynamique de production de méthane de chèvres dont les caractéristiques et les capacités de résilience et d’efficience alimentaire sont connues. Les données résultantes seront utilisées pour le développement de modèles mathématiques. Par efficience alimentaire, on entend le rapport entre les produits animaux et les ressources mobilisées. Ce ratio résulte de la capacité des animaux à transformer les ressources alimentaires en produits (lait, viande). Par résilience, nous entendons la capacité à court terme de l'animal à faire face aux perturbations environnementales. Notre hypothèse est que des animaux présentant des différences en termes de leur efficacité ou robustesse pourraient présenter des différences dans leur dynamique de production de méthane. Nous espérons que ce travail produira des connaissances permettant la conception de stratégies de réduction de la production du méthane tout en conservant résilience animale et des productions optimales. Ce projet s’appuie sur des projets en cours et futurs de notre équipe autour de l’efficience alimentaire et la résilience.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des liens entre émissions de méthane par des ruminants et caractères d’intérêt clés, comme leur production de lait et leur santé ou bien-être Cette approche globale est centrale pour la conception des stratégies durables pour la réduction d’émission de méthane dans l’atmosphère. Le projet fournira, de plus, des données clés (cinétiques d’ingestion couplées aux cinétiques de production de méthane) pour les travaux de modélisation portés par notre équipe. Ces modèles prédictifs s’intègrent dans une démarche d’élevage de précision en produisant des outils d’aide à la décision pour le suivi de l’élevage et la formulation de stratégies alimentaires durables. En plus, les modèles mathématiques résultants sont des outils qui pourraient aider à réduire le besoin d'expérimentations animales pour prédire les réponses des animaux aux changements alimentaires, ce qui répond aux principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner).

Procédures

Pour toute la durée de la procédure, les animaux serons soumis à un hébergement individuel pendant 72 heures dans des enceintes fermées permettant la mesure de la production de méthane. Pendant le séjour dans les enceintes, les animaux serons soumis à une traite manuelle 2 fois par jour, pour un totale de 6 traites d’une durée d’environ 3 minutes chacune.

Impact sur les animaux

Les séjours (3 jours) dans les enceintes peuvent entraîner un stress en raison de l’hébergement individuel des animaux. Le séjour dans les enceintes peut conduire certains animaux à vocaliser et à diminuer leur ingestion, ceci conduisant à une perte de poids transitoire. Le séjour pourrait avoir un impact sur l’activité de l’animal (excrétions excessives, agitation ou immobilisation).

Devenir

La procédure de mesure de méthane n’implique aucune mesure invasive sur les animaux. Les chèvres retournent dans l’élevage à la fin.

Remplacement

Les modèles mathématiques résultants de ce projet seront des outils permettant d’étudier des alternatives durables pour la réduction de méthane. La construction des modèles doit impérativement reposer sur des données expérimentales obtenues in vivo, en prenant en compte la spécificité de l’animal (i.e. son comportement alimentaire et son niveau de production). Des systèmes in vitro existent pour étudier la production de méthane. Néanmoins, les conclusions basées sur ces études in vitro sont limitées car ce type de système ne tient pas compte des facteurs physiologiques importants de l’hôte, comme par exemple l’absorption des acides gras volatils à niveau du rumen. Pour ce projet, l’expérimentation animale est donc essentielle et irremplaçable. Le but est que, dans l’avenir, les modèles résultants du projet constituent une alternative à l’expérimentation animale dans certains cas spécifiques.

Réduction

La procédure impliquera l’utilisation de chèvres dont le comportement alimentaire, l’efficience alimentaire ou la résilience auront déjà été caractérisées dans des expérimentations précédentes ou à venir. L’objectif est de déterminer la production de méthane chez des animaux avec des profils d’efficience et résilience variés pour permettre d’évaluer notre hypothèse. Pour éviter des conditions environnementales d'inconfort (température, humidité), nous avons décidé de n'utiliser le dispositif qu'au printemps et à l'automne. Pour chaque saison, nous caractériserons la production de méthane d'animaux avec deux niveaux différents de résilience ou efficience alimentaire. L’expérimentation en 2 saisons nous permettra évaluer 2 stades de lactation. Nous utiliserons 4 animaux par traitement (16 animaux par saison, par an) afin de tenir compte de la possibilité que certains animaux ne réussiront pas la phase d'habituation et sortiront de l’expérimentation sans passer par la phase de mesure de production de méthane. Les animaux à utiliser seront sélectionnées en connexion avec des protocoles précédents permettant la caractérisation de leur résilience ou de leur efficience alimentaire. La procédure a une durée de 5 ans pour permettre élargir le phénotypage d’un nombre important des animaux dans notre installation expérimentale. Ces animaux auront une caractérisation en termes de leur résilience/efficience dans des expériences à venir dans le cadre de projets de recherche de l’équipe. La consolidation d’une base des données important intégrant des données de production de méthane, résilience et efficience alimentaire sera un atout pour le développement de modèles mathématiques de notre équipe.

Raffinement

L’hébergement individuel est un facteur stressant pour les animaux. Pour réduire les nuisances sur le bien-être animal, une phase d’habituation sera mise en place pour minimiser le stress dans les enceintes. Dans cette phase d’habituation, les animaux seront exposés à l’hébergement individuel de manière graduelle. Les enceintes sont équipées d’un matelas qui laisse passer l’urine pour améliorer le confort de l’animal. Des brosses et des petites chaines seront installées comme enrichissement. La présence de parois transparentes (qui permettent la visibilité avec leurs congénères et de la présence humaine) et la présence d’une veilleuse pour la nuit pendant les phases d’habituation et de mesures réduiront le stress. Les animaux seront observés régulièrement pendant toute la durée du protocole d’habituation et pendant les mesures. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Une caméra vidéo enregistrera en continu les comportements des 4 chèvres durant la période de mesures pour surveiller et détecter un éventuel changement de comportement. Les vidéos seront sauvegardées et visionnées systématiquement le lendemain matin par les animaliers. Si un animal présente des comportements anormaux durant la nuit, il sera sorti du dispositif. Une étape en amont des essais sera effectuée pour sélectionner des animaux qui, potentiellement, auront moins de stress. Cette sélection sera faite sur l’observation des comportements. L’observation de la production de lait et de la mamelle sera aussi prise en compte pour choisir des animaux ave une bonne conformation des trayons pour faciliter la traite manuelle.

Choix des espèces

Ce projet s’intègre dans le programme de recherche de l’équipe. Il utilisera l’animal modèle de l’unité : la chèvre laitière. Nous allons utiliser des chèvres en lactation dans des conditions similaires à l’élevage conventionnel de chèvres laitières .pour avoir des résultats représentatifs du contexte de production des élevages commerciaux. Nos travaux de modélisation suivent une approche mécanistique générique qui peut être appliquée aux autres espèces de ruminants y compris les bovins.

12812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir huit prélèvements sanguins à la queue, des gavages quotidiens pendant 30 semaines et des injections intrapéritonéales deux fois par semaine sur la même durée. S'y ajoutent une chirurgie de pose d'implant d'œstrogène, une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines dans les deux flancs, une ligature vasculaire, une biopsie de la queue au sixième jour de vie et des transports entre cinq établissements. Le porteur signale un risque de perforation de l'œsophage et de passage de la solution dans les poumons lors des gavages, des douleurs dès que la tumeur atteint un certain volume, des démangeaisons et des difficultés à s'alimenter et à s'abreuver. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique, celles de l'élevage restant en vie pour l'accouplement sauf les mâles immunodéficients, et le bénéfice annoncé tient en une phrase, une meilleure compréhension des syndromes d'hypercroissance et l'identification potentielle de nouveaux traitements.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

Pêchés dans la Saône, 1680 poissons de quatre espèces, chevesnes, spirlins, gobies à tache noire et chabots communs, vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est anesthésié pour recevoir une marque d'élastomère, puis de nouveau à chaque transfert entre aquariums, avant un préconditionnement thermique de une à six semaines et deux séries de tests comportementaux d'une heure, certains subissant en plus un test de performance de nage. Le porteur attend un stress accru par la pêche et le changement de milieu, avec un risque d'infection plus élevé du fait de l'origine sauvage des animaux, dont il dit ignorer l'histoire. 1280 poissons sont tués pour des mesures de bioénergétique cellulaire, 400 sont remis à l'eau, et les gobies à tache noire, classés invasifs, ne peuvent en aucun cas être relâchés.

Objectifs

Le changement climatique est souvent caractérisé par une augmentation de la température moyenne, mais rarement par les variations de températures non prédictibles de plus en plus fréquentes qui l’accompagne. Cette variabilité thermique imprévisible, ou « stochasticité thermique » reste à ce jour encore peu étudiée mais peut entrainer des effets délétères sur les organismes vivants, et plus particulièrement sur les ectothermes, comme les poissons, dont la température interne dépend fortement de la température environnementale. Pour faire face à ces variations thermiques aléatoires, seuls les organismes possédant une large gamme de réponses comportementales et/ou physiologiques (= plasticité phénotypique) pourront se maintenir à moindre coût. En reproduisant cette stochasticité thermique en conditions contrôlées de laboratoire, ce projet a donc pour but de caractériser les réponses physiologiques et comportementales des poissons mises en place lors de ce stress thermique aigu. On s’attend donc à une augmentation de la dépense énergétique des poissons soumis à un régime thermique stochastique (aléatoire), en comparaison avec un régime thermique variable prévisible (saisonnier ou journalier) ou un régime thermique stable. On s’attend également à des répercussions au niveau comportemental, notamment à travers une diminution de l’activité physique et une augmentation de la quête alimentaire en fonction du potentiel adaptatif des espèces étudiées. Pour décrire les différentes composantes physiologiques et comportementales de la plasticité phénotypique, 4 espèces de poissons couramment rencontrées en Saône seront utilisées : le chevesne et le spirlin (2 espèces pélagiques eurythermes), le gobie à tache noire (espèce benthique invasive) et le chabot commun (espèce benthique native). Ces quatre espèces communes et représentatives des différentes niches écologiques permettront de généraliser au maximum les informations obtenues au cours de cette étude. Au total, 1680 poissons seront utilisés au cours des 5 prochaines années, dont une partie pourra être replacée dans le milieu naturel. En concertation avec les gestionnaires de biodiversité, nous nous assurerons de l’effet négligeable de ces prélèvements sur les populations naturelles.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de documenter et de mieux prédire l’impact du changement climatique sur les populations de poissons d’eau douce, en se focalisant plus particulièrement sur des variations rapides et stochastiques de la température encore très mal prises en compte dans la littérature scientifique. A l’aide d’une approche interdisciplinaire, entre écologie comportementale et physiologie, cette étude va permettre à court terme i) d’apporter des connaissances fondamentales pour définir les limites thermiques de certaines espèces en Saône et ii) de caractériser les effets d’une stochasticité thermique accrue sur le comportement et la physiologie des poissons. Ces données participeront par exemple à la compréhension des conséquences des changements environnementaux rapides souvent liées à l’activité humaine. A plus long terme, ces données pourront servir concrètement pour réfléchir à des directives de conservations des écosystèmes basées sur des données physiologiques et comportementales individuelles, en support aux données populationnelles. Les conclusions de ce projet d’envergure réalisé sur plusieurs espèces de poissons seront susceptibles d’être généralisables aux écosystèmes similaires à la Saône, dans un but de conservation des écosystèmes aquatiques, qui reste au centre des préoccupations du grand public, des instances gouvernementales et des chercheurs.

Procédures

À la suite de leur prélèvement en milieu naturel, tous les poissons seront acclimatés à l’animalerie et stabulés dans des conditions adaptées à leur espèce. Les poissons seront soumis à une anesthésie / analgésie afin de les implanter avec des marques pour les individualiser. Cette intervention dure au maximum 15 minutes par poisson. Les poissons seront ensuite soumis à une période de pré-conditionnement thermique (entre 1 et 6 semaines selon la procédure). A chaque manipulation (lors des transferts entre les aquariums de stabulation et les enceintes expérimentales), les poissons seront légèrement anesthésiés afin de limiter le stress du déplacement. Cette anesthésie ne fera pas effet pendant plus d’une minute sur le poisson. Tous les poissons en pré-conditionnement subiront deux séries de tests comportementaux (2 fois 1h) espacés de 2 jours de repos en conditions expérimentales. Certains d’entre eux subiront par la suite un test de performance de nage (

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de ces protocoles pourrait être un niveau de stress accru faisant suite à la pêche, à la stabulation dans un nouveau milieu, et/ou aux expérimentations. Cette augmentation du stress peut s’exprimer via l’apparition d’infections chez les poissons. En effet, les risques d’infections sont plus hauts que la normale car comme les poissons viennent de milieux naturels, on ne connaît pas leur histoire et ce qu’ils auraient pu rencontrer dans leur habitat. Un autre point de surveillance sera lié à la période d’isolement des poissons (entre 2h et

Devenir

80 poissons (chevesnes) seront euthanasiés à la suite du protocole permettant de construire une courbe de performances thermiques pour réaliser une étude de performance thermique au niveau cellulaire. Sur les 1600 poissons prévus pour caractériser les conséquences physiologiques et comportementales des périodes de pré-conditionnements aux différents régimes thermiques, 1200 individus seront euthanasiés pour réaliser des mesures de bioénergétique cellulaire, et 400 poissons (100 de chaque espèce) seront replacés dans leur milieu naturel. De plus, les gobies à tache noire, étant considérés comme invasifs, ne peuvent pas être relâchés dans le milieu naturel.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble des réponses physiologiques et comportementales des organismes soumis à des contraintes environnementales. Dans le contexte de l’intensification du changement climatique, ce projet cherche à décrire les conséquences des variations de température sur des poissons issus du milieu sauvage (la Saône), afin d’apporter un éclairage pertinent et des prédictions des effets de ce stress thermique sur les écosystèmes aquatiques. De plus, l’utilisation d’espèces variées s’avère indispensable pour apporter des conclusions pertinentes, robustes et généralisables sur les conséquences d’une augmentation de la stochasticité thermique sur la biodiversité des rivières.

Réduction

Compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans ce projet, le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, notamment grâce au marquage individuel permettant l’utilisation de tests à mesure répétées, prenant l’individu comme facteur aléatoire. Outre les 80 chevesnes nécessaires pour l’étude des courbes de performances thermiques, c’est surtout le protocole de comportement alimentaire (réponse fonctionnelle), qui selon la littérature implique pour établir une courbe robuste 5 individus au minimum par densité de proies (au nombre de 7), qui conditionne l’effectif choisi. Ainsi, 5 poissons x 7 densités de proies x 2 durées d’acclimatation x 5 profils thermiques x 4 espèces = 1400 poissons seront expérimentés au maximum. Afin de palier une mortalité possible liée à l’origine « sauvage » des poissons, 50 poissons supplémentaires par espèces seront pris en compte dans les calculs, soit au total 1680 poissons pêchés au cours des 5 ans du projet. Tout aménagement de protocole permettant de réduire encore le nombre de poissons utilisés au cours des expériences sera favorisé et certains poissons pourront également être relâchés après expérimentation.

Raffinement

Lors des protocoles in vivo (mesure de la consommation d’oxygène associée aux performances de nage et tests comportementaux), un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesures et changement de milieu – tunnel, chambre ou nouvel aquarium) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h dans le tunnel de nage ou la chambre métabolique, avant les protocoles de respirométrie ou de 15 à 30 min avant les protocoles de comportement. Après chaque expérience, les poissons seront replacés dans leur aquarium de stabulation et toutes les précautions seront prises pour leur éviter toutes nuisances visuelles et sonores. Les poissons sont maintenus dans des aquariums de 60L ou 90L en densité adaptée à leur espèce. Les spirlins et les chevesnes juvéniles sont des poissons vivant en banc. Ils seront donc maintenus à plusieurs dans les aquariums (environ 15 par bac) afin d’optimiser les conditions de stabulation. Des cachettes adaptées (tubes de gros diamètres leur permettant de se cacher en banc), des plantes artificielles et du gravier sont disposés dans chaque aquarium. Un système de pompe filtrante assurera également une circulation d’eau bullée continue dans les aquariums. Les poissons seront nourris une fois par jour, avec des cubes de moules hachées avec du mix (différentes larves de moustiques, daphnies et de la verdure (épinards, spiruline)) et lors du nourrissage, leur comportement sera particulièrement observé. En effet, si un poisson ne se nourrit pas, des mesures seront prises à son égard. Une observation biquotidienne sera réalisée par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de veiller au bien-être des animaux depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à l’euthanasie. Les états de santé et de bien-être des animaux seront ainsi évalués en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d’évaluation afin de définir des points limites adaptés. Dès l’apparition de signes cliniques de mal-être, les animaux seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage. Dans le cas où des signes de douleur ou de mal-être devaient persister au-delà de 24 heures après la mise en stabulation, les animaux seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Les 4 espèces de poissons sont couramment rencontrées dans la Saône et représentent plusieurs stratégies de vie au sein des poissons d’eau douce. Elles ont été identifiées en concertation avec les partenaires à l’origine de ce projet et le nombre d’individus prélevés n’aura aucun impact sur les populations naturelles. Le chevesne est une espèce très répandue dans la Saône, avec une tolérance thermique très large. Le spirlin est également une espèce ubiquiste, plutôt thermophile, de plus petite taille, permettant une stabulation optimale en condition expérimentale. Ce sont toutes les deux des espèces pélagiques. Le gobie à tache noire est une espèce benthique extrêmement invasive, qui se trouve actuellement en Haute-Saône, suspectée d’être plus tolérante face aux variations thermiques que l’espèce native qui occupe la même niche écologique que lui, le chabot commun. Du fait de leur diversité, ces 4 espèces permettront d’obtenir des résultats généralisables à la biodiversité des rivières. Les poissons utilisés seront soit des juvéniles, soit de jeunes adultes, soit des adultes, dont la taille sera adaptée à l’utilisation des tunnels de nage à disposition au laboratoire (entre 8 et 15 cm). Les spirlins, les gobies à tache noire et les chabots communs utilisés seront des adultes. Leur taille (entre 8 et 15 cm) permet des mesures en tunnel de nage. La taille des chevesnes adultes (>30 cm) étant incompatible pour une telle étude, seuls des chevesnes juvéniles seront employés.

160 souris immunodéficientes vont être utilisées, chacune portant une tumeur humaine greffée sous la peau du flanc et recevant jusqu'à trente-deux injections intraveineuses sur seize semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont attrapées et maintenues six fois par semaine pour la mesure de la tumeur et la pesée, et subissent des prélèvements de sang sous anesthésie légère. Cinq lignées de cancer humain leur sont greffées, du sein, du pancréas, du poumon, du foie et un mélanome, pour comparer un groupe traité par microARN à un groupe sous placebo. Toutes sont tuées pour que les tumeurs soient collectées, tandis que l'avancée annoncée pour les patients reste écrite au conditionnel.

Objectifs

En France, avec près de 430 000 nouveaux cas de cancers (incidence) et à 150 000 décès (mortalité) en 2023, les cancers représentent l’une des principales causes de mortalité. Le nombre de nouveaux cas de cancers détectés correspond à près de 1 200 cas par jour sur une année. Les cancers les plus fréquents sont ceux du pancréas, du sein, du côlon-rectum et du poumon. Dans ce contexte, les microARNs (miARNs) sont de petites molécules régulant la biologie des cellules cancéreuses. Ils sont actuellement très étudiés en oncologie et représentent de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre objectif est de démontrer l’efficacité de ces candidats sur l’inhibition de la croissance des cellules tumorales humaines dans un modèle de greffes sous-cutanées chez la souris immunodéficiente. Ainsi, 1 lignée de cancer du sein, 1 lignée de cancer du pancréas, 1 lignée de cancer du poumon, 1 lignée de cancer du foie et 1 lignée de mélanome seront utilisées. L’étude de l’effet de ces miARNs sur la croissance des tumeurs de souris greffées avec des cellules cancéreuses, consistera à comparer un groupe de souris traitées avec le médicament à un groupe de souris traitées avec un placebo.

Bénéfices attendus

A ce jour, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique des patients atteints de cancer du sein, du pancréas, du poumon, du foie et de mélanome de type agressif et réfractaire. Notre étude s’attache à proposer de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.

Procédures

Des cellules humaines seront injectées en sous cutané (1 fois, 5 minutes), ceci entrainera le développement d'une tumeur au niveau du flanc. Les animaux seront pris en contention 3 fois/ semaine (1 minute) pour la mesure de la tumeur et 3 fois /semaine (30 secondes) pour la prise de poids, pendant 16 semaines maximum et subiront une prise de sang (45 secondes). Lors des traitements thérapeutiques (durée de 4 à 16 semaines), les animaux subiront des injections intra-veineuses (8 fois minimum à 32 fois maximum, 20 secondes) et un prélèvement sanguin (sous anesthésie légère).

Impact sur les animaux

Le développement d’une tumeur après inoculation de cellules tumorales peut entrainer une gêne à la locomotion dans de très rares cas. Lors des traitements, les animaux subiront des injections intra-veineuses répétées et un prélèvement sanguin (sous anesthésie légère). Ceci pourrait entrainer une irritation au point d’injection et une légère douleur. Les contentions multiples pour les traitements, le suivi tumoral ou la prise de poids peuvent entrainer un stress.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, afin de collecter les tumeurs pour analyses.

Remplacement

Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions (type sphéroïdes, tumoroïdes et organoïdes) permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant in vitro l’efficacité des miARNs. Seuls les miARNs ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales ont été choisis dans cette étude. Bien que pertinents, ces systèmes comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité du développement tumoral chez l’homme ce qui explique le recours à des animaux.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons utilisé un test statistique ainsi que des résultats préalables, détaillés dans la littérature. Grâce à ces approches, nous avons déterminé que des groupes expérimentaux composés de 10 animaux permettront d’obtenir des résultats statistiquement corrects et qui ne compromettront pas l’interprétation de nos résultats. Les travaux seront réalisés sur des souris femelles pour les modèles de cancer du sein et sur des souris mâles pour les autres cancers.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi pour limiter leur stress. Les animaux seront surveillés hebdomadairement par le personnel animalier lors du change et quotidiennement par les personnes en charge de l’expérimentation afin d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées afin d’assurer le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront anesthésiés pour la greffe cellulaire. Ils seront anesthésiés et recevront un analgésique lors du prélèvement sanguin. Les animaux seront également suivis périodiquement avec des points limites définis en lien avec le site d’implantation des cellules tumorales. Si l’un des points limites définis est atteint, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Dans le cadre de notre étude, nous utilisons des modèles qui sont bien caractérisés dans la communauté scientifique. L’utilisation de souris mâles et femelles permet une analyse statistique plus étendue en comparaison des mammifères de plus grandes tailles et représente un modèle de choix compte tenu des similitudes avec l’Homme. Dans le cadre de notre étude, nous utilisons des modèles qui sont bien caractérisés au laboratoire ou par ailleurs. Dans ce contexte, les modèles de souris immunodéficientes représentent les modèles les mieux caractérisés pour la mise en place de greffe de cellules humaines sans rejet. Nous utiliserons des souris adultes d’âge homogène de 8 à 12 semaines. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise de greffes à 100%.