Oncologie

Les souris utilisées sont immunodéficientes, privées de rate par ablation chirurgicale, et porteuses de cellules immunitaires et tumorales humaines greffées : 297 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après la splénectomie viennent une injection intrapéritonéale de cellules immunitaires humaines et une injection sous-cutanée de cellules tumorales, puis une injection intraveineuse d'un photosensibilisateur suivie trois heures plus tard d'une illumination de trente minutes, des injections intraveineuses hebdomadaires d'immunothérapie, des prélèvements de sang chaque semaine et des mesures de la tumeur au pied à coulisse. Dans les groupes témoins et chez les souris que le traitement ne freine pas, le porteur écrit que la tumeur continuera de croître jusqu'au point limite. Il conclut que "ces nécessités, éthiques et scientifiques" justifient la mise à mort des souris en fin de procédure, après avoir écrit : "Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite".

Objectifs

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est un cancer fortement immunogène. Le traitement de première intention repose sur des thérapies ciblées quand cela est possible ou des chimiothérapies de sels de platines avec ou sans immunothérapies. Cependant certains patients échappent au traitement. Dans ce contexte, il est indispensable de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le CPNPC humain. Les paramètres de PDT-Neptune testées ont préalablement été sélectionnés sur un ensemble d'expériences réalisées sur les modèles cellulaires en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de la PDT-Neptune dans le cadre d'un être vivant complet humanisé. Les bénéfices à long terme seront de pouvoir mettre sur le marché un nouveau traitement et d'aider dans la lutte contre le CPNPC. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire sur leur mode d'action fait que ces futurs traitements pourront s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient au bénéfice d'une médecine personnalisée.

Procédures

Toutes les procédures ont en commun la mise en place du modèle et pour cela les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale (10 min entre l’endormissement et le réveil). Une semaine après, les animaux subiront l’injection de cellules humaines (immunitaires en IP avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm) et tumorales SC avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 23G (0.6 x 25 mm). Le modèle en place permettra de tester les traitements. Pour la PDT, les animaux auront une injection intra veineuse du PS Neptune et seront illuminées (extracorporel) 3h après pendant 30 min. L’immunothérapie sera ajoutée par une injection IV qui sera répétée toutes les semaines (1 fois par semaine) avec un cathéter 24G (0.7 x 19 mm) dans la veine caudale. Pour le suivi immunologique, un prélèvement de sang sera réalisé préalablement à tout traitement, puis une fois par semaine. Le suivi de la croissance se fera par 2 méthodes. Pour les procédures il s’agira d’utiliser les propriétés du modèle cellulaire et de faire un suivi par imagerie. Ce dernier nécessite l’endormissement sous anesthésie gazeuse des animaux, puis l’injection IP du substrat lumineux avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm). Toutes les souris auront également le suivi régulier de la croissance par le pied à coulisse. En fin de protocole, l’ensemble des animaux sera euthanasié, le sang, la tumeur et les organes vitaux seront récupérés pour analyse complémentaires

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent être relevés sur ce projet lors de nos interventions : - injections / prélèvement sanguins / pesées ; ces actions nécessitent une contention qui peut générer un stress léger de courte durée mais répété - anesthésie; les anesthésies notamment gazeuses à l'Isoflurane peuvent également générer un stress léger de courte durée mais répété - acte chirurgical pour la splénectomie; peut générer un problème lors de la cicatrisation notamment une légère démangeaison pendant un maximum de 5 jours – la croissance tumorale: les cellules tumorales sont injectées en un point précis prévu pour ne gêner en rien le comportement normal de l'animal, un risque de gène du déplacement pourrait être observable au cours des 4 semaines mais cela sera strictement géré (cf. points limites).

Devenir

Tous les animaux auront reçu l'injection d’une masse tumorale suivi ou non d'un traitement expérimental. Selon l’efficacité des traitements la croissance de la tumeur sera ralentie voire disparaitra, dans le cas contraire et pour les groupes témoins, la tumeur continuera de croitre jusqu'au point limite critique pour son bien-être. Nous pouvons ajouter également que pour des raisons scientifiques, nous devons procéder à la récupération des tissus (sang, tumeur, organes vitaux) qui nous serviront à confirmer l'efficacité du traitement et confirmer son mode d'action. L'ensemble de ces nécessités, éthiques et scientifiques, justifient le sacrifice des animaux en fin de procédure.

Remplacement

Notre objectif est de tester l’efficacité anti tumorale de la PDT-Neptune (qui de plus est immuno-activatrice) seule ou en combinaison avec des Immunothérapies (réduction des mécanismes immunorégulateurs). Des travaux préalables ont été réalisés sur les modèles de lignées cellulaires. Ces résultats mettent en évidence la faisabilité du projet au travers de la validation de l'application de la PDT et/ou des Immunothérapies in-vitro ; dont plusieurs paramètres ont été ainsi fixés. Cependant, s'agissant de développer une nouvelle approche thérapeutique, il est primordial que celle-ci soit également évaluée dans un système physiologique complet, en ce sens un modèle in- vivo est le plus adéquat, voire nécessaire. Le suivi par bioluminecence permet de diminuer le nombre d'animaux, néanmoins, une validation de l'efficacité nécessite d'emblée que plusieurs groupes expérimentaux soient présents, notamment les groupes contrôles (PS Neptune seul ; pour la PDT), non traité, et traitement unique ou traitement combiné de manière à limiter quantitativement les expérimentations. Dans la mesure où la modélisation expérimentale cellulaire ou in-silico est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à la validation de ces futurs traitements.

Réduction

Grâce à notre expérience nous bénéficierons de protocoles déjà approuvés et mis en place au laboratoire, ce qui permet de ne pas avoir à faire de mise au point. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les expériences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisamment solides d'un point de vue biostatistique (validé grâce à l'outils de l'EDA). Ainsi, pour des modèles humanisés des groupes de 5 souris pour 5 reconstitutions seront suffisants. Le suivi de croissance tumorale se fera de manière externe sans nécessité de recours à une dissection, permettant ainsi un suivi longitudinal optimisé sans sacrifice. Enfin, il s'agira de ne tester que les molécules déjà présélectionnés pour leur efficacité dans les modèles précliniques in-vitro. Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.

Raffinement

Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de 5 animaux maximum par cage, dans un environnement enrichi (maison, carré de coton) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycles jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 à 10 jours dans leur salle d'hébergement. Concernant le projet, nous avons cherché à optimiser l'expérimentation en mettant en place une méthodologie d'étude courte et efficace : suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou détresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportements et la capacité de prise de greffe. Les animaux plus jeunes, seront manipulés régulièrement et ainsi entrainés en vue d'une réduction du stress. En cours d'expérimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutanées (au flanc) de manière à ne gêner en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un système d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C et aura préalablement reçu une injection de luciférine). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.

Choix des espèces

Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l'étude efficace des effets des molécules thérapeutiques testées en faibles quantités. Nous utilisons des souris SCID pour permettre la xénogreffe de cellules humaines (tumorales et immunitaires). Par ailleurs le campus dispose d'outils performants spécialement adaptés à la souris (Imagerie du petit animal). Les souris entreront en phase expérimentales à partir de l’âge de 7 semaines. Elles seront déjà sevrées et sexées. A ce stade de développement elles seront suffisamment robustes pour supporter les traitements et suffisamment grande pour supporter les injections et le développement des cellules tumorales.

Pour vérifier chez le rat un résultat obtenu chez la souris et jugé incertain, la présence dans le rein diabétique d'une substance impliquée dans la digestion, 22 rats Sprague-Dawley mâles reçoivent une injection de streptozotocine dans la veine de la queue. Le diabète ainsi provoqué s'installe pendant huit semaines, avec augmentation de la soif, de la faim et du volume d'urine, perte de poids modérée, déshydratation, altération du pelage et baisse d'activité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois prélèvements sanguins suivent l'évolution, et deux rats ont été ajoutés au groupe traité pour absorber un décès éventuel. Tous sont tués à huit semaines pour prélever les reins et une partie de l'intestin grêle, le porteur écrivant que ces prélèvements sont "indispensables" et qu'ils ne peuvent pas être réalisés sur des rats maintenus en vie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les effets du diabète de type 1 sur le rein. Le diabète de type 1 est une maladie dans laquelle l’organisme ne produit plus d’insuline, ce qui entraîne une augmentation du sucre dans le sang et peut endommager plusieurs organes, notamment les reins. Les chercheurs s’intéressent ici à une substance produite naturellement par l’organisme, appelée cholécystokinine. Cette substance est normalement impliquée dans la digestion des aliments, mais des travaux récents suggèrent qu’elle pourrait aussi être présente dans le rein chez les personnes atteintes de diabète. Cependant, ces premiers résultats restent incertains et doivent être confirmés avec des méthodes plus fiables. Le projet vise donc à vérifier si cette substance est effectivement présente dans le rein en situation de diabète, et à mieux comprendre son rôle. Cela permettra de déterminer si elle participe aux mécanismes liés aux atteintes rénales observées dans cette maladie. Les premières observations ayant été réalisées chez la souris, cette étude sera menée chez le rat, un modèle bien connu et largement utilisé, permettant d’obtenir des résultats plus robustes. À terme, ces travaux pourraient améliorer les connaissances sur les complications du diabète et contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour le suivi ou le développement de futurs traitements.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de vérifier de manière fiable des résultats scientifiques récents suggérant qu’une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine, pourrait être présente dans le rein en cas de diabète de type 1. Les données obtenues contribueront à confirmer ou à remettre en question ces observations, et ainsi à améliorer la solidité des connaissances dans ce domaine. À plus long terme, une meilleure compréhension du rôle éventuel de cette substance dans le rein pourrait apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes impliqués dans les complications rénales du diabète. Ces complications étant fréquentes et importantes, toute avancée dans leur compréhension est susceptible d’avoir un intérêt scientifique et médical. Les résultats de ce projet pourraient également orienter des recherches futures visant à identifier de nouveaux indicateurs biologiques utiles pour suivre l’évolution de la maladie, ou de nouvelles pistes d’étude pour le développement de stratégies thérapeutiques. Toutefois, ces applications potentielles nécessiteront des travaux complémentaires avant toute utilisation concrète.

Procédures

Les animaux recevront une seule injection intraveineuse à la queue (durée maximum de 3 minutes) destinée à provoquer un diabète expérimental permettant l'étude de la maladie. Ils feront ensuite l'objet de trois prélèvements sanguins (durée maximale de 1 minute par prélèvement) au cours de l'étude (après 1, 4 et 8 semaines) afin de suivre l'évolution du diabète. La durée totale de suivi sera de huit semaines.

Impact sur les animaux

L'injection destinée à induire le diabète peut entraîner une augmentation durable du taux de sucre dans le sang. Les animaux concernés peuvent présenter une augmentation de la consommation d'eau et de nourriture, une production accrue d'urine, une perte de poids modérée ainsi qu'une diminution de l'activité. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un inconfort bref au moment de leur réalisation. Une surveillance régulière est prévue afin d'identifier rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les mesures nécessaires.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des organes nécessaires aux analyses scientifiques, notamment les reins et une partie de l’intestin grêle. Ces prélèvements sont indispensables pour atteindre les objectifs du projet et ne peuvent pas être réalisés sur des animaux maintenus en vie.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de répondre pleinement à l'objectif de cette étude. L'expression de la cholécystokinine (CCK) dans le tissu rénal doit être étudiée dans le contexte d'un organisme vivant présentant un diabète induit et conservant l'ensemble des interactions physiologiques entre le pancréas, le système endocrinien, le système cardiovasculaire, le rein et les différents mécanismes métaboliques. Des approches in vitro telles que les cultures cellulaires ou les organoïdes rénaux ont été considérées. Toutefois, elles ne permettent pas de reproduire l'état diabétique systémique ni ses conséquences endocriniennes et métaboliques complexes. Les outils de modélisation informatique disponibles ne permettent pas non plus de prédire de façon fiable les modifications de l'expression tissulaire de la CCK dans ce contexte. L'utilisation d'animaux demeure donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum compatible avec l'obtention de résultats scientifiquement exploitables. Le projet comprend deux groupes expérimentaux : un groupe traité par streptozotocine développant un diabète (12 animaux) et un groupe contrôle (10 animaux). Le dimensionnement des groupes repose sur les données disponibles dans la publication de référence et sur l'expérience acquise avec ce modèle expérimental. Chaque animal contribue à plusieurs critères d'évaluation au cours de la même procédure (suivi glycémique, prélèvement terminal de plasma et collecte des reins), ce qui permet de maximiser les informations obtenues à partir de chaque individu. L’ajout de 2 animaux supplémentaires dans le groupe traité permet de s’affranchir d’un éventuel décès et de garantir la robustesse des résultats. Par ailleurs, les prélèvements terminaux permettront la valorisation maximale des tissus récoltés afin d'éviter la réalisation d'études complémentaires nécessitant de nouveaux animaux lorsque cela sera scientifiquement pertinent.

Raffinement

La durée d’acclimatation sera d’une semaine minimum. Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, avec enrichissement et manipulation selon les bonnes pratiques. Après évaluation de la douleur potentielle (paliers définis avec l’équipe vétérinaire et la SBEA), une analgésie pourra être administrée si nécessaire (signes de douleur, inconfort ou absence de fèces). Une observation quotidienne de l’état général est réalisée tout au long de la procédure, avec soins adaptés en cas de signes cliniques (traitements, soins locaux, enrichissement, réhydratation, réchauffement, ajout d’aliments et/ou gels hydratants, facilitation de l’accès à l’eau). Des points limites sont définis et ajustés selon les observations, avec traçabilité via grilles de score et documents qualité. L’induction du diabète par streptozotocine peut entraîner des symptômes du diabète : hyperglycémie, polyurie (augmentation de la quantité d'urine), polydipsie (augmentation de la consommation d'eau), polyphagie (augmentation de la consommation de nourriture), perte de poids, déshydratation, altération du pelage et baisse d’activité. Les animaux diabétiques feront l’objet d’une surveillance renforcée incluant le suivi du poids, de l’hydratation, du pelage, de la mobilité, des consommations alimentaire et hydrique et de la glycémie. La fréquence des observations sera augmentée dès l’apparition de signes compatibles. Des mesures de soutien (réhydratation, aliments accessibles ou humidifiés, gels hydratants, enrichissement complémentaire) seront mises en place précocement afin de limiter l’impact du modèle et prévenir toute aggravation. Pour l’injection intraveineuse de streptozotocine, les animaux seront habitués à la manipulation via des tunnels dans la cage. L’administration sera réalisée avec un tunnel de contention adapté afin de réduire le stress. Une vasodilatation préalable par réchauffement modéré facilitera l’accès veineux et limitera les tentatives. Les injections seront effectuées par du personnel formé afin de minimiser la durée et les complications.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans l’étude du diabète, car leur organisme présente de nombreuses similitudes avec certains mécanismes observés chez l’Homme pour cette maladie. De plus, ce modèle est bien connu et largement documenté, ce qui permet de comparer les résultats obtenus avec de nombreuses données scientifiques déjà disponibles. Des rats jeunes adultes seront utilisés. Les animaux seront transférés en zone d’expérimentation à l’âge de 4 semaines afin de bénéficier d’une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant le début de l’étude. L’induction du diabète sera réalisée à l’âge de 5 semaines, puis les animaux seront suivis pendant 8 semaines. Le choix de cet âge est directement lié aux objectifs du projet. Lorsque la substance utilisée pour induire le diabète est administrée à des animaux très jeunes, elle conduit à un modèle présentant des caractéristiques proches du diabète de type 2. En revanche, une administration réalisée à partir de 5 semaines d’âge permet d’obtenir un modèle bien caractérisé et largement utilisé du diabète de type 1, qui correspond à la maladie étudiée dans ce projet. Par ailleurs, le projet vise à étudier une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine. Chez le rat, la production de cette substance évolue fortement au cours des premières semaines de vie avant de se stabiliser. L’utilisation d’animaux âgés d’au moins 5 semaines permet donc de limiter l’influence du développement normal de l’animal sur les résultats et d’obtenir des données plus fiables concernant les effets du diabète.

Une partie des 1 220 souris utilisées sont des femelles gestantes, dont l'abdomen est ouvert sous anesthésie de 45 minutes pour injecter des particules dans le cerveau de leurs embryons, une injection de cinq secondes qui peut tuer certains d'entre eux. D'autres souris adultes restent anesthésiées deux heures pour une chirurgie du cerveau de quinze minutes, et des souriceaux sont anesthésiés par hypothermie pendant dix minutes avant une injection. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et une autre partie du projet consiste à induire chez des souris témoins les mutations responsables de la microcéphalie pour en caractériser les défauts. Les femelles gestantes sont tuées pour prélever leurs embryons, et les embryons, souriceaux et adultes ayant subi une procédure sont tués pour prélèvement d'organes et analyses génétiques.

Objectifs

Notre laboratoire s’intéresse au développement du cerveau. Des anomalies génétiques chez l’homme affectant les processus de prolifération et de différentiation cellulaire peuvent entraîner des malformations cérébrales. Des études préliminaires nous ont permis de mettre au point des particules (PLA) ayant la faculté d’entrer spécifiquement dans les cellules en division du cerveau embryonnaire. Ce projet vise (i) à déterminer si ce type de PLA est pertinent pour développer une approche de thérapie génique au cours du développement. Nous voulons donc tester chez la souris, la capacité des PLA à compenser la perte de ce gène et corriger les anomalies de développement du cerveau qui lui sont associées. Nous voulons également (ii) utiliser cet outil pour étudier un autre type de malformation cérébrale, la microcéphalie, en induisant des mutations du gène responsable de cette pathologie chez des souris contrôles, afin de mieux caractériser les défauts liés à la perte de ce gène.

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu du projet est de déterminer si l’utilisation de PLA pour corriger une anomalie génétique constitue une approche thérapeutique valide. Le deuxième bénéfice est de comprendre les défauts développementaux qui apparaissent après une mutation d'un gène entraînant une microcéphalie chez l'humain.

Procédures

Des animaux adultes subiront une injection dans la queue d'une durée de 20 secondes. Des femelles gestantes subiront une anesthésie générale de 45 minutes au cours d’une chirurgie qui comprendra l’ouverture de l’abdomen et des points de suture. Des animaux subiront des injections d’une minute 1 fois par jour pendant 2 jours. Des embryons subiront une injection d’une durée de 5 secondes. Des animaux adultes subiront une anesthésie de 2 heures lors d’une chirurgie d'une durée de 15 minutes qui permettra l’injection des PLA dans le cerveau d’une durée de 4 minutes et des points de suture. Des souriceaux subiront une anesthésie par hypothermie de 10 minutes, et une injection d’1 minute. Des animaux subiront, au moment de la mise à mort, une anesthésie et analgésie générale terminale.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent un stress léger et une douleur légère de quelques secondes. L’induction de l’anesthésie gazeuse lors des chirurgies entraîne un stress moyen de quelques secondes, une hypothermie, un déssèchement des yeux et une déshydratation. Les injections intra-cérébrale in utero peuvent entrainer la mort de certains embryons. L'anesthésie pour les injections stéréotaxique entraîne un stress léger de quelques secondes, une hypothermie et un déssèchement des yeux.

Devenir

Les femelles gestantes sont mises à mort pour prélèvement des embryons. Les embryons, nouveaux nés et animaux adultes qui ont subi une procédure sont mis à mort à l’issue de la procédure pour prélèvement d’organes et analyses génétiques et phénotypiques.

Remplacement

Les questions scientifiques posées dans le cadre de ce projet concernent le développement du cortex cérébral, un processus complexe qui ne peut être étudié que sur des cerveaux prélevés sur des embryons de mammifères. A l’heure actuelle, aucun modèle de culture cellulaire ne permet de reproduire l’ensemble des étapes de développement cortical ni d’en mimer la diversité cellulaire et les interactions qui s’y déroulent. Le modèle murin, en particulier la souris, constitue une référence dans ce domaine en raison de la richesse des outils génétiques disponibles et de la caractérisation fine des processus qui permettent le développement du système nerveux, ce qui en fait un modèle de choix pour la conduite de ces recherches.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat significatif déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à volonté et en groupe social avant et après la procédure. Lors des actes chirurgicaux les souris, placées sur une plaque chauffante, seront anesthésiées et recevront des analgésiques en pré et en post-opératoire. Une litière spécifique, adaptée aux animaux opérés, sera utilisée afin de minimiser le risque d’infection post-opératoire. Un gel ophtalmique sera appliqué durant toute l’anesthésie pour prévenir le dessèchement des yeux et du PBS chauffé à 37°C sera administré aux femelles afin de prévenir la déshydratation. Après l'opération chirurgicale, la surveillance des animaux sera quotidienne afin de détecter d’éventuels signes de souffrance. Une grille de score d'évaluation des animaux sera mise en place. Une injection d'analgésique ou la mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cerveau entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce permettant de répondre à nos questions scientifiques tels que les modèles génétiquement modifiés. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Une expérimentation est menée sur des embryons entre les jours embryonnaires E12.5 et E15.5, ce qui correspond aux fenêtres d’expression de nos gènes d’intérêt. Une expérimentation se déroulera sur des animaux adultes, car la question à laquelle veut répondre cette expérimentation ne nécessite pas de stade de développement particulier. Des animaux utilisés dans une autre expérimentation seront injectés au jour post-natal P0 et mis à mort à P15 et P30. Cela nous permet d’étudier les effets de notre traitement sur les défauts qui apparaissent à ces stades.

Les 872 souris utilisées sont immunodéficientes, donc plus sensibles aux infections, et reçoivent une injection de cellules tumorales de cancer colorectal. Dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune peut subir jusqu'à trente injections de traitement à l'état vigile, deux par semaine, et quinze séances d'imagerie sous anesthésie générale. La croissance tumorale peut provoquer une cachexie, les administrations fréquentes un risque de péritonite, et les sites de piqûre peuvent s'infecter. Toutes sont tuées à la fin, le porteur indiquant que l'injection de cellules tumorales rend impossible de les garder en vie et que les analyses portent sur les tissus et organes prélevés après la mort.

Objectifs

Nous avons mis en évidence, via des analyses ex vivo sur des cohortes de patients, que l’induction de l’expression d’une protéine cible est impliquée dans la progression des cancers colorectaux. L’objectif de ce projet est de valider in vivo cette hypothèse et d’évaluer l’efficacité de l’inhibition de cette protéine comme nouvelle stratégie thérapeutique du cancer colorectal.

Bénéfices attendus

Le cancer du côlon est la quatrième cause maligne diagnostiquée et la cinquième cause de décès par cancer dans le monde. En France, il touche chaque année plus de 47 500 personnes et cause près de 17 000 décès. Il présente un des pronostics les plus sombres en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie pour le traitement du cancer du côlon.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une seule injection de cellules tumorales. Une partie des souris sera soumise à une anesthésie générale (moins de 5 minutes/animal). Tous les animaux vigiles seront soumis à des injections pour des traitements antitumoraux (pour un total maximum de 30, 2 fois par semaine, moins d’une minute par animal). Une partie des souris sera soumise à des examens non invasifs d’évaluation tumorale sous anesthésie générale (dix minutes par animal, une fois par semaine, 15 fois maximum). A la fin des expériences, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéficientes présentent une sensibilité accrue aux infections. L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie) et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections peuvent s’infecter. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité thérapeutique de l’inhibition d’une protéine cible. Ces stratégies inhibitoires (via des anticorps et des oligos antisense) ont été développés, in vitro, après l’identification de cette protéine via des criblages transcriptomiques sur des cohortes de patients. Cette étude peut exclusivement être conduite in vivo, car il est essentiel d’utiliser un model reproduisant au mieux l’environnement tumoral. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les cytokines peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 872 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes homogènes de souris pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous utiliserons des tests statistiques pour évaluer et comparer les effets dans les divers groupes de traitements. Une veille bibliographique attentive et constante sera effectuée pour s’assurer que les expériences planifiées n’ont pas été déjà rapportées dans la littérature scientifique.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, maisonnettes, …). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général et le poids des animaux sera suivi. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Des points limites surveillés seront mis en place lors des procédures de croissance tumorale. L’anesthésie générale des animaux sera effectuée (avec tapis chauffants). Selon le modèle, afin de réduire l’inconfort, une analgésie est prévue. Si les souris apparaissent affaiblies (prostration) pendant la procédure, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques. La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Notre établissement utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Une greffe de cellules de lymphome dans le flanc sous anesthésie, puis trois injections de nanoparticules lipidiques chargées de chimiothérapie ou trois injections d'un anticorps bloquant, pratiquées sur animal vigile, attendent 98 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie pour récupérer les tumeurs et les organes. Le travail porte sur le rôle de la granzyme A, une enzyme produite par les cellules cancéreuses, dans la croissance du lymphome et l'immunité intratumorale. Le porteur annonce que les souris vont développer des cancers avec prolifération des cellules au niveau du flanc, et qualifie de temporaire l'inconfort des injections. Sur l'effectif, il écrit seulement qu'une réflexion biostatistique a été intégrée à la construction du projet, sans donner ni calcul ni taille de groupe, et il ne précise pas les points limites retenus pour la taille des tumeurs.

Objectifs

Le lymphome est un cancer des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules matures cancéreuses. Les lymphomes se caractérisent par la prolifération excessive des lymphocytes au niveau des ganglions, du foie, de la rate, plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de comprendre l’évolution de ce développement tumoral. Nous avons identifié, dans plusieurs modèles in vitro (lignées cellulaires humaines), que les cellules lymphomateuses expriment la granzyme A, une protéine physiologiquement utilisée par les cellules de l’immunité pour défendre l’organisme, et dont le rôle, lorsqu’elle est produite par des cellules cancéreuses, n’a pas encore été établi. Une lignée cellulaire murine exprime également l’enzyme d’intérêt et nous souhaitons dans ce projet, à travers l’utilisation d’un modèle murin, comprendre son rôle sur la croissance tumorale et les perturbations de l’immunité intratumorale. Pour cela, nous allons utiliser des greffes de différentes cellules cancéreuses murines dans des souris. Certains animaux recevront un traitement à base de nanoparticules lipidiques transportant une chimiothérapie et d’anticorps bloquants afin d’évaluer le rôle de l’enzyme d’intérêt et son interaction avec l’immunité antitumorale et la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal concerne la compréhension du rôle d’une enzyme dans le développement du lymphome et de son rôle sur l’immunité intratumorale, pouvant contribuer à la mise en place d’une thérapie chez les patients atteints de lymphome.

Procédures

Les animaux seront soumis à une transplantation de cellules de lymphome dans leur flanc, de 30 seconde, après avoir été anesthésiés. Les injections des nanoparticules lipidiques se feront sur des animaux vigiles, trois fois, la durée des injections sera de moins de 5 minutes. D’autres souris recevront l’injection d’un anticorps bloquant à 3 reprises également, en vigile, d’une durée qui sera de moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules lymphomateuses au niveau de la zone d’injection, donc du flanc de l’animal. Les injections des nanoparticules lipidiques peuvent causer un inconfort temporaire pendant quelques minutes.

Devenir

Les animaux seront sous anesthésie mis à mort à l’issue des expériences, dans le but de récupérer les tumeurs ainsi que des organes pour des analyses biologiques.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Nous avons d’ores et déjà testé in vitro par des méthodes alternatives l’expression de la protéine cible dans des lignées cellulaires, ainsi que les nanoparticules lipidiques que nous allons tester dans ce projet préclinique. Il nous faut maintenant valider sur une étude préclinique in vivo le rôle de cette protéine sur la croissance tumorale et l’immunité antitumorale. Le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche, où l’interaction du système immunitaire au sein de l’organisme constitue un élément clé de notre recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un établissement utilisateur autorisé. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupes de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture, conformément aux conditions réglementaires. Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, nous utilisons des protocoles pensés pour réaliser plusieurs analyses en une seule expérience lorsque cela est possible. Nous utilisons également une grille établie au préalable de points limites (ou critères d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Toute anomalie dans le comportement social, alimentaire, et la gestuelle (apparition de signes de douleur) de l’animal détectée par l’expérimentateur lors de ses visites (tous les 2 jours minimum) entraîne une prise en charge immédiate, qui peut inclure un soulagement de la douleur ou l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal. En dernier recours, si le soulagement de la douleur ne peut pas être résolu par l’expérimentateur, une mise à mort de l’animal est réalisée.

Choix des espèces

Cette étude ne peut se réaliser que sur le modèle murin. L’étude sur l’immunité antitumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme et c’est ce modèle qui est choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur les lymphomes et l’immunité en général. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux.

Jusqu'à six séances d'imagerie IRM ou SPECT-PET-CT sur une même souris, et jusqu'à quatre actes expérimentaux de trente minutes à une heure, tel est le programme des 640 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement. Le protocole consiste à injecter des cellules de glioblastome dans le cerveau, à créer une cavité d'exérèse pour reproduire les conditions d'une récidive, puis à administrer une radiothérapie interne sur place. Sans traitement, l'injection de cellules tumorales dégrade l'état général et peut tuer la souris au bout de trente jours. Deux souches sont utilisées, des C57BL/6JRj pour les greffes de cellules murines et des CB17-SCID immunodéprimées pour les cellules humaines, le porteur indiquant que ces dernières ne permettent pas d'étudier le rôle de l'immunité.

Objectifs

Le glioblastome est une tumeur cérébrale particulièrement agressive, son incidence de 3,3/100 000 est en augmentation, avec une multiplication par 4 sur les 10 dernières années, en faisant un véritable problème de santé publique. Une étude approfondie des caractéristiques tumorales et la découverte de potentielles nouvelles cibles pour le traitement dans différents modèles de glioblastome sont essentielles. Le projet consiste à mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques de radiothérapie interne aussi bien pour traiter les tumeurs ou leur récidive. Ces nouvelles stratégies seront basées sur des molécules qui ont été testées en amont lors d’expériences in vitro et qui méritent une attention particulière pour des développements thérapeutiques pertinents.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique en ce qui concerne les glioblastomes ou leur récidive dans le but d’améliorer la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées (durées d'environ 30 minutes à 1 heure) telles que l'injection de cellules tumorales, la création de cavité d’exérèse, l’administration de thérapies spécifiques dans le cerveau et d’un suivi par imagerie IRM / SPECT-PET-CT. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 4. Le nombre d’IRM / SPECT-PET-CT maximal réalisé sur un même animal est de 6.

Impact sur les animaux

L’administration des traitements peut entraîner une certaine fatigue et un affaiblissement rapidement réversible (environ deux jours) de l'animal. L'induction d'une tumeur par injection de cellules entraîne en l'absence de traitement une détérioration de l'état général de l'animal pouvant entraîner la mort au bout de 30 jours.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort pour réaliser des prélèvements.

Remplacement

Le projet ici proposé a pour but le ciblage par une thérapeutique innovante sur tumeur en place ou dans des conditions mimant la récidive pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux pour valider les étapes finales d’élimination (au travers de l’application de procédures de traitement par des vecteurs sur tumeur en place ou dans des cavités d’exérèse), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Il n'y a d’ailleurs pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoïdes, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.

Réduction

En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces cellules tumorales in vitro ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables. L'utilisation de l'imagerie pré-clinique SPECT-PET-CT a son importance en ce qui concerne l'éthique puisqu'il permet de réduire le nombre d'animaux avec un suivi longitudinal où le même animal est son propre contrôle.

Raffinement

Les animaux sont stabulés dans un environnement favorable à leur bien-être, par ailleurs vérifié par la SBEA local. Pour chaque procédure, un suivi quotidien du comportement de l'animal et de sa cicatrisation est effectué suite à la chirurgie. Le suivi de la perte de poids sera réalisé 2 ou 3 fois/semaine puis quotidiennement à partir d’environ 20 jours après la chirurgie en rapport avec la croissance tumorale. Un suivi IRM ou SPECT-PET-CT est également réalisé de manière hebdomadaire pour surveiller la progression du volume tumoral dans le cerveau de l'animal. Les animaux bénéficient d’une surveillance accrue jusqu’à leur réveil afin de détecter précocement toute forme de souffrance. Ils bénéficient de soins post-opératoires, mesures de gestion de la douleur avec analgésique, conditions d'hébergement optimale, enrichissement du milieu. Les animaux seront hébergés dans un environnement dont la température, l’humidité, le renouvellement de l’air ainsi que le cycle d’éclairage sont contrôlés selon les normes légales en vigueur. Un enrichissement du milieu avec des petites maison et tunnel ainsi que des frisotis est mis en place du début à la fin. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Une anesthésie gazeuse sera appliquée aux animaux lors du suivi IRM ou SPECT-PET-CT hebdomadaire.

Choix des espèces

Pour ce projet, il est nécessaire de travailler avec la souris car il est prévu d’implanter des lignées cellulaires murines (modèle syngénique de gliobastome avec la souche C57BL/6JRj). Pour les modèles xénogéniques de gliobastome, des lignées cellulaires humaines seront implantées et nécessiteront cette fois-ci la souche CB17-SCID. La raison pour laquelle il est envisagé d’utiliser des cellules murines mais aussi humaines, donc d’utiliser deux souches différentes de souris, est de pouvoir réaliser à la fois des tests à partir de cellules humaines de glioblastome mais également de pouvoir étudier le rôle de l’immunité qui n’est pas possible d'évaluer avec les modèles de glioblastomes humains. Les souris seront utilisées de 8 à 12 semaines car elles seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.