Oncologie

Pour tester le chauffage de tumeurs par nanoparticules sous laser ou champ magnétique, 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement. Elles subissent une chirurgie d'implantation de tumeurs des voies biliaires, des injections dans la tumeur et par voie générale, jusqu'à quatre séances de traitement de dix minutes sous anesthésie, des échographies de suivi et des prélèvements sanguins pratiqués sur animal vigile. Le porteur qualifie de légers et de courte durée le stress et la douleur liés à chaque geste, sans décrire ce que produit la croissance tumorale elle-même. Il indique développer en parallèle des cultures cellulaires en trois dimensions pour trier les molécules en amont, ce qui réduirait le nombre de souris, et conclut que ces cultures ne suffisent pas pour évaluer les effets indésirables ni la réponse immunitaire.

Objectifs

Les cancers des voies biliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA), sont difficiles à traiter. Le développement de nanoparticules permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements systémiques conventionnels. Le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'une thérapie anticancéreuse localisée par nanoparticules en association ou non avec une thérapie par voie générale et une exposition à un rayonnement Laser ou un champ magnétique. L’évolution du volume tumorale sera suivie par échographie. L’imagerie permettra aussi de suivre la diffusion et l’élimination des nanoparticules utilisées. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux les plus efficaces avec les meilleures diffusions et sans effet indésirable à long terme.

Bénéfices attendus

Les cholangiocarcinomes (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressifs. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche de traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposées seules ou en combinaison avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet a pour objectif de tester dans des modèles expérimentaux murins, le traitement par nanohyperthermie dans des tumeurs de CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral de la nanohyperthermie dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux locorégional applicable en santé humaine, permettant de réduire à la fois les doses de chimiothérapies et les effets secondaires de ceux-ci dans le cas d'un traitement combinatoire. Au-delà du CCA, la nanohyperthermie pourrait être également utilisée pour traiter d’autres cancers digestifs (péritoine, tubes digestifs, foie, pancréas).

Procédures

- Injections durée 10-20 secondes/animal - Traitement sur souris anesthésiées 10 minutes/souris, répété 4 fois max. - Anesthésie gazeuse durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins sur animal vigile, durée 5 min/souris.

Impact sur les animaux

-injections cutanées : stress et douleur légère de courte durée -anesthésie et chirurgie d'implantation de tumeurs : stress et douleurs modérée -Injections intratumorale et systémiques : stress et douleurs légères de courte durée - Prélèvement sanguin vigile : stress et douleur légères e de courte durée - Anesthésie Gazeuse : un stress légéer de courte durée.

Devenir

Les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Il n'est actuellement pas possible de simuler le développement d'un cancer avec tous ses aspects dans un modèle in vitro. Neanmoins, nous développons également des modèles cellulaires in vitro en 3 dimensions afin de sélectionner les molécules, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque l'effficacité de certaines molécules pourra être testée en amont. Cependant ces expériences menées sur ces modèles cellulaires ne sont pas suffisants et ne permettent pas de remplacer les animaux, notamment pour évaluer la réponse avec un système immunitaire ou pour évaluer les effets indésirables.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Compte tenu des données existantes et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique sera utilisé en pré-opréatoire et en post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence des expériences et études en cancérologie car elle permet de représenter le comportement d'une tumeur se développant chez le patient (réponse immune, diffusion des traitements dans l'organisme). La possibilité de disposer d'animaux de fond génétique défini permet limiter les variabilités biologiques et de mieux identifier les effets des thérapies. Les animaux seront utilisés à l'âge de 5 à 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection des cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop agées induirait un biais dans l'expérimentation.

Pour tester des lymphocytes tueurs associés à des anticorps contre le cancer de l'ovaire, 2 160 souris vont être utilisées sur quatre ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est totalement immunodéficiente, dépourvue de toute cellule immunitaire, afin d'évaluer l'effet de la thérapie cellulaire seule. Toutes reçoivent une injection de cellules tumorales puis un traitement, 360 sont anesthésiées à l'isoflurane deux fois par semaine, et toutes subissent des prélèvements sanguins sous anesthésie. Elles sont tuées soit parce qu'elles ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur. Le porteur annonce une thérapie plus efficace et mieux tolérée pour des patientes, quand le résultat attendu du projet se limite à démontrer un effet sur des tumeurs greffées, et signale une perte de poids et une nécrose tumorale déjà observées lors d'études préliminaires.

Objectifs

En france, le cancer de l'ovaire touche environ 4500 femmes chaque année et entraîne près de 3000 décès ce qui en fait le cancer gynécologique le plus meurtrier. Dans le monde, il figure parmi les cancers féminins les plus fréquents et il est souvent diagnostiqué tardivement car les symptômes sont peu spécifiques. Résultats : les traitements arrivent à un stade avancé de la maladie. Les traitements actuels reposent sur la chirurgie et la chimiothérapie et permettent d’obtenir une rémission chez de nombreuses patientes mais les rechutes sont fréquentes et les effets secondaires importants. Il existe donc un besoin urgent de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées. Notre projet s’inscrit dans un effort de recherche visant à utiliser les défenses naturelles de l’organisme pour lutter contre le cancer. Il a pour objectif de développer une nouvelle thérapie qui permet de mieux cibler les cellules cancéreuses tout en limitant les effets sur les tissus sains. L’idée est de proposer à terme des traitements plus efficaces et plus sûrs pour les patientes. Nous nous intéressons à un type particulier de cellules du système immunitaire, que l’on peut considérer comme des « cellules tueuses » naturelles. Ces cellules ont plusieurs avantages : elles sont capables de reconnaître et de détruire des cellules cancéreuses sans modification particulière, elles peuvent être facilement multipliées à partir d’un simple prélèvement sanguin, et elles peuvent être utilisées chez différents patients, même lorsqu’elles proviennent d’un donneur. Un autre atout important est leur capacité à s’associer à des anticorps, c’est-à-dire des molécules qui reconnaissent très précisément les cellules cancéreuses. En combinant ces cellules tueuses avec des anticorps, nous pouvons les « guider » pour qu’elles ciblent spécifiquement les cellules tumorales, tout en épargnant les cellules saines. Pour tester cette approche, après les tests en laboratoire, nous utilisons des modèles de tumeurs chez l’animal qui reproduisent les tumeurs humaines. Cela permet d’évaluer plus précisément l’efficacité du traitement, et de vérifier toxicité et l’efficacité globale de la thérapie. L’originalité de notre projet repose sur la combinaison de deux approches innovantes : des anticorps de nouvelle génération, conçus pour mieux reconnaître les cellules cancéreuses, et l’utilisation de ces cellules tueuses « armées » pour les attaquer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer, sur un modèle de tumeur primaire et métastsatique ovariennes que l’utilisation d’une thérapie cellulaire innovante basée sur des Lymphocytes en combinaison avec des anticorps thérapeutiques déjà utilisés en clinique permet d’améliorer les effets du système immunitaire tout en réduisant les effets secondaires. Cette approche a deux objectifs principaux : 1. Améliorer la spécificité du traitement. 2. Favoriser son efficacité.

Procédures

Au cours du projet, les souris seront soumises à plusieurs types d'interventions, réalisées sous anesthésies et avec prise en charge de la douleur lorsque nécessaire. L'ensemble des animaux (2160 souris) recevront une injection de cellules tumorales (15 secondes/souris) puis une injection de traitements médicamenteux (10 secondes par souris). Sur l'ensemble des animaux 360 seront anesthésiées par isoflurane deux fois par semaine (10 min/animaux). Une analgésie et une anésthésie générale sont systématiquement utilisées et les animaux sont surveillés après l'intervention jusqu'à leur réveil complet. À différents moments de l'étude, l'ensemble des animaux feront l'objet d'un prélèvement sanguin, réalisé sous anesthésie afin d'éviter toute douleur. Cette intervention dure en moyenne 20 secondes par animal. Ce prélèvement permet d'analyser la présence de cellules tumorales et d'ADN tumoral dans le sang.

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des souris. La douleur associée à l'injection de cellules est équivalente à celle d’une piqûre d’aiguille. Le développement des tumeurs et des métastases sera suivi par des mesures régulières ainsi leur développement ne devrait pas créer de contraintes particulières chez les souris. Concernant les nuisances associées aux traitements, des études préliminaires ont montré une perte de poids, nécrose de la tumeur, inflammation ; Aucune autre nuisance ni effet indésirable n’est prévisible.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments.

Remplacement

Comme évoqué précédemment, il est essentiel de démontrer l’efficacité de cette nouvelle thérapie cellulaire, notamment dans le cadre de l’utilisation d’anticorps en traitement du cancer. Cette preuve a déjà été obtenue en laboratoire (in vitro), mais elle doit maintenant être confirmée dans des modèles précliniques chez la souris, qui reproduisent des tumeurs solides proches de celles observées chez la femme. Ces modèles sont les seuls qui permettent d’évaluer à la fois l’efficacité de la thérapie sur la croissance des tumeurs, de valider cette nouvelle façon d’utiliser les anticorps, et de mieux comprendre les mécanismes de la réponse immunitaire contre le cancer. À ce stade du projet, il n’est plus possible de remplacer les modèles animaux par des modèles in vitro, car ces derniers ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre les cellules tueuses et les cellules tumorales. Les modèles précliniques sont encore peu développés dans le domaine des immunothérapies, en particulier pour ces cellules tueuses, qui sont rares et difficiles à étudier. Même si des premiers tests ont déjà été réalisés sans utiliser d’animaux, une étape chez l’animal reste indispensable pour valider la thérapie avant d’envisager des essais chez l’être humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera au maximum de 2160 souris sur 4 ans. Ce nombre a été déterminé afin de permettre une évaluation complète de notre thérapie, à la fois sur son efficacité contre les tumeurs et sur les mécanismes biologiques impliqués.Le projet a été conçu pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Chaque étape expérimentale ne sera réalisée que si les résultats de l’étape précédente sont concluants, et des études pilotes seront mises en place avant les expériences principales.Le nombre d’animaux par groupe a été défini à l’aide de modèles mathématiques et d’outils statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire.Par ailleurs, notre expérience dans les modèles de cancer, notamment du cancer de l’ovaire, ainsi que notre expertise dans l’utilisation des cellules tueuses et dans les techniques expérimentales, nous permettent d’optimiser les protocoles et de limiter les pertes, contribuant ainsi à réduire encore le nombre d’animaux nécessaires. De plus grâce à notre maîtrise et à notre connaissance des gestes de greffe ou d’administration en sous- cutané et en intrapéritonéale, nous éviterons les artefacts et les pertes liées à l’expérimentateur.

Raffinement

Le milieu est enrichi par une litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et une ouate coton pour le confort des animaux. Le comportement sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience. Ils seront reportés sur une fiche de suivi clinique. Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Les différentes molécules seront utilisées en administration locale en une seule administration dans un composé permettant leur diffusion dans le temps, permettant d’éviter tout effet secondaire et d’éviter des administrations répétées. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être utilisée.

Choix des espèces

Dans un premier temps nous utiliserons une espèce murine immunodéficiente dans notre étude. Cette dernière est la plus relevante pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence les effets de nos molécules sur le long terme. Ces souris, au contraire des autre lignées immunodéficientes, sont totalement immunodéficientes donc ne possèdent aucune cellule immunitaire ce qui nous permettra d’étudier l’efficacité seule de notre thérapie cellulaire. Dans un second temps l’étude portera sur des modèles murins immunocompétents afin d’étudier l’effet de notre thérapie sur des modèles plus complexes contenant tout le micro-environnement tumoral. L’âge des animaux utilisés dans cette étude est de 7 à 8 semaines, âge où l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité, et âge le plus approprié pour atteindre l’objectif scientifique de l’étude. En effet, le cancer de l’ovaire est une pathologie qui touche majoritairement des femmes adultes, avec un âge médian au diagnostic d’environ 63 ans. L’utilisation d’animaux à un stade adulte permet ainsi de se rapprocher au mieux des conditions physiopathologique observées chez les patients.

Capturés par pêche électrique, anesthésiés trois à cinq minutes, mesurés et pesés, 900 poissons subissent une incision ventrale de 3 à 5 mm pour l'implantation manuelle d'une puce électronique dans la cavité abdominale. Truites, blageons, chabots et vairons sont maintenus hors de l'eau entre trente secondes et une minute pendant l'opération, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié des individus pêchés en amont des ouvrages en bois sont transportés en aval avant d'être marqués, pour retenir ceux qui seront enclins à remonter. Le porteur signale que certains poissons perdent leur puce dans les semaines suivantes et que des femelles peuvent l'expulser lors de la reproduction. Tous sont replacés dans la rivière après réveil en vivier, aucun n'est tué.

Objectifs

Dans de nombreux cours d’eau dégradés, la mise en place d’ouvrages en bois, dits castor mimétiques, constitue une nouvelle opportunité de restaurer leur fonctionnalité écologique par des moyens peu coûteux et bas carbone. La présence de ces ouvrages modifie les conditions locales d’écoulement et pose ainsi des questions sur la capacité des poissons à maintenir leurs migrations naturelles et accéder à leurs habitats de reproduction ou de croissance. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer la franchissabilité de ces ouvrages castors en suivant précisément le passage des poissons au travers de ces aménagements, pour plusieurs espèces distinctes, différentes classes d’âge et différentes conditions de débit. Pour cela, un panel de poissons représentatif des peuplements du cours d’eau est capturé par des techniques adaptées (pêche électrique). Sous anesthésie générale, chaque individu est mesuré, pesé, examiné, puis équipé d’une puce électronique (PIT‑tag) de taille adaptée, implantée dans la cavité abdominale selon un protocole chirurgical respectant les exigences de bien‑être animal. Les poissons sont ensuite remis à l’eau sous surveillance jusqu’à leur réveil complet, puis relâchés à proximité des ouvrages. Les poissons ainsi marqués peuvent être détectés lorsqu’ils franchissent les ouvrages castors, grâce à des antennes de détection disposées stratégiquement dans le lit du cours d’eau. L’enregistrement de ces passages permet de vérifier si les ouvrages castors restent perméables aux déplacements piscicoles, d’identifier les trajectoires privilégiées et, le cas échéant, de repérer des situations de blocage ou de retard qui pourraient justifier des ajustements de gestion.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de vérifier les conditions de franchissabilité des ouvrages castors par les peuplements piscicoles en présence. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour vérifier s’il est nécessaire de réaliser des modifications de conception de ces ouvrages castors pour que les poissons puissent librement circuler.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et une puce électronique sera implantée manuellement sur 900 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress modéré sur les animaux. Il existe également un risque de douleur légère post-anesthésie suite à l’incision.

Devenir

Tous les individus seront replacés dans leur habitat naturel

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici un ouvrage bois castor mimétique) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.

Réduction

L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements des poissons par espèce et par stade, et évaluer la franchissabilité des ouvrages castors. Il est adapté au gabarit du milieu (rivière de tête de bassin versant) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des puces ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur puce dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser la puce lors de la reproduction. Tous les individus d'une même espèce ne vont pas forcément migrer. Les individus pêchés en amont des ouvrages castors (50%), seront transportés en aval, où ils seront pucés puis relâchés, de manière à privilégier l'étude sur des individus enclins à migrer et in fine réduire le nombre d'individus marqués. Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale menée en milieu naturel, en-dehors des statistiques descriptives (taux de franchissement, voies de passage, durée moyenne de franchissement).

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront stockés dans des viviers placés directement dans la rivière. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée toutes les 30 minutes, pour éviter que la température du bain n’augmente et soit toujours suffisamment fraiche pour éviter le stress des poissons et l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière. L’application de points limites stricts et spécifiques du projet limitera les risques de douleur tout au long de la procédure.

Choix des espèces

4 espèces de poissons sont ciblées et sont caractéristiques de la rivière et du territoire concerné : truite, blageon, chabot, vairon. 1 stade de développement est retenu : subadultes-adultes.

Les souris utilisées sont génétiquement modifiées, seule façon selon le porteur d'identifier les fibroblastes associés aux cellules B. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, adultes et nouveau-nés. Chacune subit des injections tous les trois jours pendant trois semaines, trois gavages, une injection sous-cutanée dans la patte arrière sous anesthésie et des prélèvements sanguins pratiqués sur animal vigile. Les souriceaux sont séparés de leur mère pendant dix minutes au maximum pour être injectés et génotypés par biopsie de tissu. Toutes sont tuées en fin de projet pour l'analyse post-mortem de leurs ganglions lymphatiques.

Objectifs

Les anticorps protègent contre des pathogènes mais provoquent aussi l’autoimmunité, comme la maladie de Sjögren ou l’arthrite rhumatoïde. La production d’anticorps implique les cellules B, productrices d’anticorps, et des fibroblastes qui sont en contact directe avec les cellules B. Dans cette étude nous cherchons à comprendre comment ces fibroblastes se différencient et comment ils participent à la réponse immunitaire. Ce savoir pourrait avoir des implication dans la vaccination contre des infections ou pour le traitement de maladies autoimmunes.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la formation des fibroblastes associés au cellules B et leur implication dans la réponse immune. Ces résultats pourraient avoir des retombées à moyen terme sur une nouvelle application en découvrant des nouveaux médicaments contre des maladies impliquant le système immunitaire comme l’auto-immunité.

Procédures

Des souris vigiles sont soumises à des injections tous les trois jours (durée < 1 min) pendant 3 semaines. Les souris vigiles sont gavées 3 fois (durée < 1 min). Les souris anesthésiées sont soumises à une injection d’un agent induisant une réponse immunitaire (durée < 1 min). Des prélèvements de sang sont effectués sur animal vigile (durée du prélèvement quelques secondes).

Impact sur les animaux

Pour les injections des souriceaux et leur génotypage, une séparation de la mère et de sa portée pendant quelques minutes (10 au maximum), ainsi qu’une contention légère pour chaque animal sont nécessaires. Cela peut être une source de stress pour les animaux. Une douleur légère de courte durée peut être ressentie par l’animal lors de la biopsie de tissu. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent être source de stress et de l’anxiété tout comme une douleur légère de courte durée pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation peut conduire à une inflammation au site d’injection.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible stress ou inconfort sont entrepris. Aucune habituation n’est prévue pour les nouveau-nés ou animaux juvéniles. Il n’y pas d’acclimatation nécessaire. L’anesthésie est prévue pour les injections par voie sous-cutanée dans la patte arrière afin de cibler spécifiquement les ganglions poplités et inguinaux. Les sites de prélèvement sous-mandibulaires sont alternés. Le bien-être de l’animal est évalué tous les jours par un personnel expérimenté, prenant en compte une surveillance des lieux de d’injection, le poids, l’apparence, le comportement et la locomotion. Les critères sont notés sur une fiche de score. Lorsque qu’une anomalie est observée l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. Si le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Les souris sont hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis par cage.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour connaitre plus sur le mécanisme de la formation et la fonction des cellules du ganglion lymphatique. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des organes lymphoïdes où se trouvent ces cellules et une souris génétiquement modifié qui permet d’identifier ces cellules. Il n’existe aujourd’hui aucun autre moyen pour les identifier. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature. Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux étudier le développement du système immunitaire impliquant la formation de ces cellules. La souris génétiquement modifiée est justifiée par être le seul moyen d’identifier les fibroblastes associés aux cellules B.

Des cellules cancéreuses sont injectées dans la glande mammaire de souris femelles, qui reçoivent ensuite trois injections d'immunoliposomes et trois injections d'un anticorps d'immunothérapie. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leurs tissus. La tumeur est mesurée au pied à coulisse, et le porteur indique que son développement métastatique peut entraîner une altération progressive de l'état général, une perte de poids et une gêne respiratoire, moins de 5 % des souris pouvant aussi développer une nécrose partielle de la tumeur. La description des procédures place ces injections "sur animaux vigiles", alors que la description des effets indésirables les dit réalisées "sous anesthésie légère (isoflurane) pour minimiser l'inconfort".

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent dans le monde, avec environ 1,8 million de nouveaux cas par an en 2016, dont 50 000 en France. Une femme sur huit recevra un diagnostic au cours de sa vie. Bien que les avancées thérapeutiques aient amélioré la prise en charge, les rechutes restent fréquentes. Les traitements actuels, bien que plus efficaces, montrent encore des limites, en particulier chez les patients en rechute. Afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques, nous avons développé et validé des immunoliposomes. L’objectif de ce projet est d’évaluer leur efficacité dans un modèle préclinique de cancer du sein connu pour être résistant à l’immunothérapie. Nous utiliserons des souris, greffées avec une lignée cellulaire cancéreuse murine très utilisé dans la recherche préclinique et reproduisant ainsi un cancer du sein de stade IV. Les animaux recevront un traitement à base d’immunoliposomes et d’un anticorps d’immunothérapie utilisé dans le domaine clinique afin d’évaluer leur impact sur l’activation de l’immunité antitumorale et la croissance tumorale. Nous prévoyons aussi d’étudier des transplantations de cellules spécifiques que nous avons identifiées dans les ganglions drainant la tumeur des souris dans des souris receveuses. Cette étude préclinique s’inscrit dans la continuité de nos travaux précédents et vise à améliorer les approches thérapeutiques existantes pour les cancers résistants aux traitements standards.

Bénéfices attendus

Nos premiers essais sur le modèle murin de cancer du sein ont montré que l’administration d’immunoliposomes permettait une diminution significative de la croissance tumorale, voire une régression complète des tumeurs dans certains cas. Ces résultats prometteurs suggèrent un fort potentiel thérapeutique de notre approche. Dans cette nouvelle étude, nous souhaitons approfondir nos investigations afin d’évaluer l’impact des immunoliposomes sur la formation et la progression des métastases. L’objectif est de déterminer si notre traitement peut limiter efficacement la dissémination tumorale, un enjeu majeur dans la prise en charge des cancers avancés. Par ailleurs, nous comparerons l’efficacité des immunoliposomes avec celle d’une immunothérapie, actuellement utilisée en clinique. Si nos immunoliposomes s’avèrent plus efficaces ou permettent une meilleure activation du système immunitaire, ils pourraient représenter une alternative innovante aux traitements existants, réduisant potentiellement les effets secondaires liés aux immunothérapies classiques. A terme, ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers du sein, en particulier ceux en rechutes ou résistants aux traitements actuels.

Procédures

L’injection des cellules cancéreuses se fera sur animaux vigiles au début des expérimentations, la durée sera de moins de 5 secondes. Une seconde injection sera effectuée au jour 40 uniquement chez les souris présentant une régression tumorale. Les injections des immunoliposomes se feront sur animaux vigiles trois fois, la durée des injections sera de moins de 5 secondes. L’injection d’un anticorps d’immunothérapie se fera trois fois sur animaux vigiles, la durée sera de moins de 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’injection sera réalisée dans la glande mammaire (voie orthotopique) chez des souris femelles. Cette injection entraîne un stress modéré et une douleur locale. L’intervention est réalisée sous anesthésie légère (isoflurane) pour minimiser l’inconfort. Les injections par voie intra péritonéale peuvent causer un inconfort temporaire. Le risque de réactions locales ou de difficulté d’injection est limité par une manipulation soigneuse. Une surveillance post-injection est assurée. L’évolution tumorale sera suivie par la mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse. Le développement tumoral métastatique peut induire une altération progressive de l’état général, une perte de poids et une dyspnée. Lors de l’expérimentation sur la mémoire immunitaire, la première exposition tumorale pourrait avoir induit une mémoire immunitaire, limitant la croissance tumorale et entraînant une réponse inflammatoire locale et un inconfort transitoire. Parfois certaines souris (dans moins de 5% des cas) peuvent développer une nécrose partielle de la tumeur, celle-ci sera traitée par une suspension cutanée commerciale destinée au traitement protecteur des plaies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie à l’issue des expériences afin de permettre l’analyse des effets du traitement sur les tissus et cellules d’intérêt dans différents organes.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler in vitro, sur des cellules ou des tissus. Les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives. Ceci nous permet d’être sûrs que les composés qui vont être étudiés in vivo ciblent bien les cellules du système immunitaire. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche. L'efficacité thérapeutique des immunoliposomes repose sur l'implication du système immunitaire. Il est donc essentiel, à ce stade de nos recherches scientifiques, d'évaluer leur efficacité in vivo sur un organisme entier, en utilisant des modèles murins porteurs de cancers.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour le modèle du cancer du sein, nous testerons lors d’une première expérimentation, la capacité des immunoliposomes à diminuer le nombre de cellules immunitaires favorisant le développement des tumeurs. Si nous obtenons une bonne efficacité, l’effet des immunoliposomes sur le ralentissement de la croissance tumorale sera alors réalisé, dans une seconde expérimentation.

Raffinement

Pour minimiser la douleur et le stress des animaux, les protocoles expérimentaux sont soigneusement planifiés, avec des critères d’arrêt anticipé définis afin d’éviter toute souffrance excessive. Les souris sont hébergées en groupes de 5 à 10 dans des cages enrichies de structures en carton ou en plastique, leur permettant de se cacher et de se regrouper, favorisant ainsi leur bien-être. Les manipulations, y compris les injections et les mesures de la tumeur, sont réalisées par du personnel formé afin de réduire au maximum la contrainte et le stress. Pour les injections intra veineuses, les animaux sont placés sous une lampe chauffante pour faciliter la dilatation des vaisseaux, ce qui permet une manipulation plus rapide et moins invasive. La contention est limitée au strict nécessaire et ne dépasse pas trois minutes. Pour limiter le stress des injections, nous mettrons en place une habituation à ces gestes avant de les faire. Les souris sont surveillées régulièrement pour détecter tout signe de détresse, de douleur ou de souffrance excessive. Des critères stricts sont mis en place, notamment une perte de poids excessive, une altération du comportement, une détresse respiratoire ou une difficulté à se déplacer, déclenchant l'arrêt anticipé de l’expérimentation pour l’animal concerné. Afin d’assurer un suivi optimal, le personnel de l’animalerie est informé des critères d’arrêt et des signes de détresse à surveiller. Toute anomalie détectée entraîne une prise en charge immédiate, qui peut inclure un soulagement de la douleur ou l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal. En dernier recours, une mise à mort de l’animal est réalisée.

Choix des espèces

Nous utilisons une lignée cellulaire murine établie et reconnue, injectée dans des souris immunocompétentes pour garantir une réponse immunitaire fonctionnelle. Le modèle murin femelle est indispensable pour le cancer du sein, car la tumeur se développe au site d’injection dans la glande mammaire, reproduisant ainsi la progression tumorale observée chez l’humain. Le système immunitaire des souris est similaire à celui de l’homme en termes de réponse antitumorale, rendant ce modèle pertinent pour évaluer l’efficacité des immunoliposomes et leur potentiel en thérapie anticancéreuse. Il est couramment utilisé en recherche préclinique pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules cancéreuses et l’obtention d’un système immunitaire fonctionnel.