Oncologie

Trois interventions chirurgicales d'une heure à une heure trente chacune, sous anesthésie générale : 6 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs vaisseaux sanguins. Avant ces opérations, ils reçoivent une alimentation enrichie en cholestérol destinée à faire apparaître des plaques d'athérome dans leurs artères, et sont hébergés en cages individuelles. L'enjeu déclaré est de tester un prototype de sonde d'imagerie endovasculaire miniaturisée, dont le porteur affirme que la validation in vivo reste "indispensable" malgré les essais préalables sur explants et sur fantômes d'artères. Ces lapins pèseront environ 3 kg et auront 10 à 12 semaines, poids minimum retenu par le porteur pour y introduire les cathéters expérimentaux.

Objectifs

L’objectif principal est de tester et valider in vivo un nouveau système d'imagerie optique miniaturisé pour observer les vaisseaux sanguins dans des conditions proches de l’usage clinique. Il s'agit de démontrer la faisabilité d’imagerie intravasculaire in vivo avec une sonde chez le lapin porteur de plaques d’athérosclérose induites par un régime alimentaire spécifique. Cela permettra de caractériser la composition biologique de ces lésions à l’aide des différentes modalités de microscopie développées (dépôts lipidiques, architecture tissulaire, calcifications éventuelles, signes d'inflammation). Cette étude nous permettra de comparer la qualité de cette imagerie innovante avec celles utilisées en clinique, en particulier en évaluant la robustesse, la reproductibilité et la compatibilité opératoire du dispositif (maniabilité, sécurité mécanique, acquisition d’images exploitables), en vue d'une application future en clinique et plus particuilèrement en cardiologie. Le projet se réalisera sur 2 établissements distincts pour sa réalisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. À court terme, cette étude pilote fournira des preuves de concept essentielles concernant la fiabilité, la sécurité d’utilisation et la performance du prototype miniaturisé. Les données obtenues permettront d’évaluer sa capacité à détecter et à caractériser de manière précise les lésions athérosclérotiques, notamment les dépôts lipidiques, l’inflammation et les éventuelles calcifications. Ces informations sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes d’évolution des plaques et identifier plus précocement les lésions à risque. À plus long terme, les résultats du projet pourraient contribuer au développement d’outils diagnostiques plus sensibles et plus spécifiques que ceux disponibles aujourd’hui en clinique (les maladies cardiovasculaires sont la 2ème cause de mortalité en France). Une imagerie intravasculaire plus fine et plus informative pourrait améliorer le dépistage, affiner les indications thérapeutiques et favoriser une médecine cardiovasculaire plus personnalisée, dans un contexte où l’athérosclérose est un processus qui demeure silencieux avant de déclencher des complications.

Procédures

Les animaux recevront une alimentation particulière, riche en cholestérol, destinée à provoquer progressivement la formation de plaques d’athérome dans leurs artères, susceptible de créer des nuisances aux animaux. Le régime enrichi en cholestérol peut entraîner des nuisances modérées et progressives, incluant une prise de poids, une diminution de l’activité, des troubles digestifs légers et une altération métabolique modérée. La formation de plaques d’athérome est attendue mais ne génère pas de douleur spontanée. Ces effets feront l’objet d’une surveillance clinique régulière avec des critères d’arrêt prédéfinis. Ils subiront également 3 interventions chirurgicales, réalisées sous anesthésie générale et analgésie d’environ 1 h à 1 h 30.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress ou de l’inconfort pendant les phases préparatoires et les manipulations expérimentales. Les interventions sont associées à des nuisances modérées, pouvant engendrer douleur, lésion ou inconfort local au niveau des sites opératoires, ainsi qu’une détresse temporaire liée à l’anesthésie et aux procédures de contention. Les animaux peuvent également ressentir de la peur et du stress en lien avec les manipulations ou la nouveauté de l’environnement. Le régime alimentaire imposé pour induire la formation de plaques d’athérome est susceptible de provoquer des nuisances physiologiques telles que modification du métabolisme, prise de poids, troubles digestifs ou risque accru de maladies systémiques. Enfin, le fait d’être hébergés individuellement peut occasionner des nuisances environnementales, telles qu’un isolement social relatif ou une adaptation limitée à l’environnement de la cage, et des contraintes mineures sur la liberté de mouvement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour la nécessité des études histologiques sur les vaisseaux sanguins.

Remplacement

L’utilisation d’animaux dans ce projet est justifiée par l’objectif scientifique : évaluer in vivo un prototype de sonde endovasculaire miniaturisée, comparable aux sondes utilisées en routine clinique, pour caractériser les lésions athérosclérotiques. Ce type d’évaluation nécessite un modèle physiopathologique dynamique, intégrant le flux sanguin, la réponse de la paroi artérielle, l’inflammation locale et la cicatrisation vasculaire après lésion ou intervention. Ces phénomènes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro, sur explants ou sur modèles artificiels de vaisseaux. Avant toute expérimentation animale, des travaux préliminaires ont été réalisés pour limiter le recours aux animaux : essais sur explants ex vivo, tests sur fantômes d’artères et analyses sur lames histologiques. Ces étapes ont permis d’optimiser les paramètres optiques et techniques du dispositif, et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Malgré ces précautions et méthodes alternatives, l’étude in vivo reste indispensable pour valider le fonctionnement du dispositif endovasculaire dans des conditions physiologiques réelles et garantir la pertinence des résultats pour des applications cliniques futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est strictement limité à cinq lapins expérimentaux et un témoin. Cet effectif a été déterminé en tenant compte de plusieurs critères : le minimum statistique nécessaire pour obtenir des résultats fiables, la variabilité interindividuelle connue du modèle lapin, la nécessité de recueillir des données longitudinales cohérentes tout au long de l’expérimentation. D’après le design expérimental dans le cadre d’une étude pilote, les mêmes individus serviront tout au long de l’étude : ils permettront d’abord de confirmer le développement des plaques d’athérome sous régime riche, puis seront utilisés pour la phase d’imagerie avec le dispositif expérimental. Ce schéma expérimental permet de maximiser la quantité et la qualité des informations obtenues tout en limitant au strict minimum le recours aux animaux, conformément au principe de réduction des expérimentations animales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, mais non étanches et possédant des parois translucides, permettant aux animaux de maintenir des stimuli visuels, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. Avant toute procédure, chaque animal bénéficiera d’une période d’acclimatation d’au moins cinq jours, afin de réduire le stress lié au nouvel environnement. Les cages seront aménagées avec un enrichissement adapté, comprenant notamment des bûchettes à ronger et du foin, pour stimuler les comportements naturels et améliorer le confort. Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien, portant sur leur état de santé et leur bien-être tout au long du protocole expérimental, avec un suivi particulier de leur comportement du fait de l’hébergement individuel. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, et les animaux seront surveillés en continu pendant l’intervention. Un suivi renforcé sera mis en place pendant les premiers jours après chaque procédure pour détecter et traiter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés pour soulager la douleur, et des antibiotiques pourront être utilisés en cas d’infection. Dans le cas où un animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique incompatible avec un bien-être acceptable, et qu’aucune mesure de soulagement efficace ne peut être appliquée, l’animal sera retiré de l’expérimentation et mis à mort. Pour les transferts vers l'établissement 2/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages adaptées à l'espèce, en prenant soin de vérifier les conditions de circulation et météorologiques et sous surveillance du vétérinaire.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi comme modèle animal en raison de sa pertinence scientifique et technique pour les études de navigation intravasculaire. La taille de ses vaisseaux est suffisamment proche de celle de certains vaisseaux humains ciblés par le projet, permettant d’évaluer le positionnement et le fonctionnement du cathéter endovasculaire dans des conditions comparables à la pratique clinique. De plus, le lapin est un modèle bien établi pour l’athérosclérose induite par l’alimentation, reproduisant de manière fiable la formation de plaques d’athérome et leur progression, telle que décrite dans de nombreuses publications scientifiques. Le choix du lapin répond également à des critères éthiques et réglementaires, car il permet d’obtenir des données pertinentes avec un nombre réduit d’animaux, tout en limitant le risque de douleurs ou de dommages durables grâce à sa taille adaptée. Les animaux utilisés seront des jeunes lapins pesant environ 3 kg, généralement âgés de 10 à 12 semaines. Ce poids correspond au minimum recommandé pour réaliser les procédures de navigation intravasculaire et l’introduction des cathéters expérimentaux. Le choix de ce stade de développement permet de garantir des vaisseaux de taille adaptée.

L'objet du projet est un instrument, un prototype de sonde d'imagerie optique miniaturisée à valider dans des conditions proches de l'usage clinique. 6 lapins, 5 exposés et 1 témoin, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'examen histologique de leurs vaisseaux. Ils reçoivent une alimentation enrichie en cholestérol destinée à faire apparaître des plaques d'athérome, puis subissent trois opérations sous anesthésie d'une heure à une heure et demie chacune, hébergés seuls en cage et transportés d'un établissement à l'autre. Le porteur retient le lapin parce que la taille de ses vaisseaux approche celle des vaisseaux humains visés, et parce qu'un poids d'environ trois kilos, atteint vers dix à douze semaines, correspond au minimum permettant d'introduire les cathéters.

Objectifs

L’objectif principal est de tester et valider in vivo un nouveau système d'imagerie optique miniaturisé pour observer les vaisseaux sanguins dans des conditions proches de l’usage clinique. Il s'agit de démontrer la faisabilité d’imagerie intravasculaire in vivo avec une sonde chez le lapin porteur de plaques d’athérosclérose induites par un régime alimentaire spécifique. Cela permettra de caractériser la composition biologique de ces lésions à l’aide des différentes modalités de microscopie développées (dépôts lipidiques, architecture tissulaire, calcifications éventuelles, signes d'inflammation). Cette étude nous permettra de comparer la qualité de cette imagerie innovante avec celles utilisées en clinique, en particulier en évaluant la robustesse, la reproductibilité et la compatibilité opératoire du dispositif (maniabilité, sécurité mécanique, acquisition d’images exploitables), en vue d'une application future en clinique et plus particuilèrement en cardiologie. Le projet se déroulera sur 2 établissements distincts pour sa réalisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. À court terme, cette étude pilote fournira des preuves de concept essentielles concernant la fiabilité, la sécurité d’utilisation et la performance du prototype miniaturisé. Les données obtenues permettront d’évaluer sa capacité à détecter et à caractériser de manière précise les lésions athérosclérotiques, notamment les dépôts lipidiques, l’inflammation et les éventuelles calcifications. Ces informations sont cruciales pour mieux comprendre les mécanismes d’évolution des plaques et identifier plus précocement les lésions à risque. À plus long terme, les résultats du projet pourraient contribuer au développement d’outils diagnostiques plus sensibles et plus spécifiques que ceux disponibles aujourd’hui en clinique (les maladies cardiovasculaires sont la 2ème cause de mortalité en France). Une imagerie intravasculaire plus fine et plus informative pourrait améliorer le dépistage, affiner les indications thérapeutiques et favoriser une médecine cardiovasculaire plus personnalisée, dans un contexte où l’athérosclérose est un processus qui demeure silencieux avant de déclencher des complications.

Procédures

Les animaux recevront une alimentation particulière, riche en cholestérol, destinée à provoquer progressivement la formation de plaques d’athérome dans leurs artères, susceptible de créer des nuisances aux animaux. Le régime enrichi en cholestérol peut entraîner des nuisances modérées et progressives, incluant une prise de poids, une diminution de l’activité, des troubles digestifs légers et une altération métabolique modérée. La formation de plaques d’athérome est attendue mais ne génère pas de douleur spontanée. Ces effets feront l’objet d’une surveillance clinique régulière avec des critères d’arrêt prédéfinis. Ils subiront également 3 interventions chirurgicales, réalisées sous anesthésie générale et analgésie d’environ 1 h à 1 h 30.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir du stress ou de l’inconfort pendant les phases préparatoires et les manipulations expérimentales. Les interventions sont associées à des nuisances modérées, pouvant engendrer douleur, lésion ou inconfort local au niveau des sites opératoires, ainsi qu’une détresse temporaire liée à l’anesthésie et aux procédures de contention. Les animaux peuvent également ressentir de la peur et du stress en lien avec les manipulations ou la nouveauté de l’environnement. Le régime alimentaire imposé pour induire la formation de plaques d’athérome est susceptible de provoquer des nuisances physiologiques telles que modification du métabolisme, prise de poids, troubles digestifs ou risque accru de maladies systémiques. Enfin, le fait d’être hébergés individuellement peut occasionner des nuisances environnementales, telles qu’un isolement social relatif ou une adaptation limitée à l’environnement de la cage, et des contraintes mineures sur la liberté de mouvement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour la nécessité des études histologiques sur les vaisseaux sanguins.

Remplacement

L’utilisation d’animaux dans ce projet est justifiée par l’objectif scientifique : évaluer in vivo un prototype de sonde endovasculaire miniaturisée, comparable aux sondes utilisées en routine clinique, pour caractériser les lésions athérosclérotiques. Ce type d’évaluation nécessite un modèle physiopathologique dynamique, intégrant le flux sanguin, la réponse de la paroi artérielle, l’inflammation locale et la cicatrisation vasculaire après lésion ou intervention. Ces phénomènes ne peuvent être reproduits de manière fiable in vitro, sur explants ou sur modèles artificiels de vaisseaux. Avant toute expérimentation animale, des travaux préliminaires ont été réalisés pour limiter le recours aux animaux : essais sur explants ex vivo, tests sur fantômes d’artères et analyses sur lames histologiques. Ces étapes ont permis d’optimiser les paramètres optiques et techniques du dispositif, et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Malgré ces précautions et méthodes alternatives, l’étude in vivo reste indispensable pour valider le fonctionnement du dispositif endovasculaire dans des conditions physiologiques réelles et garantir la pertinence des résultats pour des applications cliniques futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est strictement limité à cinq lapins expérimentaux et un témoin. Cet effectif a été déterminé en tenant compte de plusieurs critères : le minimum statistique nécessaire pour obtenir des résultats fiables, la variabilité interindividuelle connue du modèle lapin, la nécessité de recueillir des données longitudinales cohérentes tout au long de l’expérimentation. D’après le design expérimental dans le cadre d’une étude pilote, les mêmes individus serviront tout au long de l’étude : ils permettront d’abord de confirmer le développement des plaques d’athérome sous régime riche, puis seront utilisés pour la phase d’imagerie avec le dispositif expérimental. Ce schéma expérimental permet de maximiser la quantité et la qualité des informations obtenues tout en limitant au strict minimum le recours aux animaux, conformément au principe de réduction des expérimentations animales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, mais non étanches et possédant des parois translucides, permettant aux animaux de maintenir des stimuli visuels, olfactifs et auditifs avec leurs congénères. Avant toute procédure, chaque animal bénéficiera d’une période d’acclimatation d’au moins cinq jours, afin de réduire le stress lié au nouvel environnement. Les cages seront aménagées avec un enrichissement adapté, comprenant notamment des bûchettes à ronger et du foin, pour stimuler les comportements naturels et améliorer le confort. Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien, portant sur leur état de santé et leur bien-être tout au long du protocole expérimental, avec un suivi particulier de leur comportement du fait de l’hébergement individuel. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, et les animaux seront surveillés en continu pendant l’intervention. Un suivi renforcé sera mis en place pendant les premiers jours après chaque procédure pour détecter et traiter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés pour soulager la douleur, et des antibiotiques pourront être utilisés en cas d’infection. Dans le cas où un animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique incompatible avec un bien-être acceptable, et qu’aucune mesure de soulagement efficace ne peut être appliquée, l’animal sera retiré de l’expérimentation et mis à mort. Pour les transferts vers l'établissement 2/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages adaptées à l'espèce, en prenant soin de vérifier les conditions de circulation et météorologiques et sous surveillance du vétérinaire.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi comme modèle animal en raison de sa pertinence scientifique et technique pour les études de navigation intravasculaire. La taille de ses vaisseaux est suffisamment proche de celle de certains vaisseaux humains ciblés par le projet, permettant d’évaluer le positionnement et le fonctionnement du cathéter endovasculaire dans des conditions comparables à la pratique clinique. De plus, le lapin est un modèle bien établi pour l’athérosclérose induite par l’alimentation, reproduisant de manière fiable la formation de plaques d’athérome et leur progression, telle que décrite dans de nombreuses publications scientifiques. Le choix du lapin répond également à des critères éthiques et réglementaires, car il permet d’obtenir des données pertinentes avec un nombre réduit d’animaux, tout en limitant le risque de douleurs ou de dommages durables grâce à sa taille adaptée. Les animaux utilisés seront des jeunes lapins pesant environ 3 kg, généralement âgés de 10 à 12 semaines. Ce poids correspond au minimum recommandé pour réaliser les procédures de navigation intravasculaire et l’introduction des cathéters expérimentaux. Le choix de ce stade de développement permet de garantir des vaisseaux de taille adaptée.

De quatre à douze semaines de croissance tumorale, selon les lignées de cellules cancéreuses humaines greffées : 896 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est anesthésiée au gaz pour recevoir l'injection dans le flanc, puis pesée et mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine, avec un contrôle quotidien du frottement de la tumeur quand elle se développe dans la région ventrale et peut saigner ou gêner les déplacements. Le projet cherche à savoir si la surexpression, puis l'invalidation, d'une liste réduite de gènes augmente ou diminue la capacité de ces cellules à déclencher une tumeur, ce que le porteur dit ne pas pouvoir reproduire en culture cellulaire. Les xénogreffes sont pratiquées sur des souris immunodéficientes de huit semaines, et le porteur écrit que toutes vont développer des tumeurs "qui ne permettent pas la survie de l'animal après la fin du projet".

Objectifs

Ce projet vise à caractériser les cellules souches cancéreuses (CSC) mammaires afin de mieux comprendre leur nature et leurs mécanismes d'action. Les CSC jouent un rôle majeur dans l'initiation et la progression des cancers du sein. Elles sont également impliquées dans la résistance aux traitements et, par conséquent, dans les rechutes observées chez les patientes. Comparées aux autres cellules tumorales, les CSC possèdent une capacité nettement supérieure à initier une tumeur, propriété qui constitue leur principale caractéristique fonctionnelle. L'évaluation de ce potentiel tumorigène nécessite une approche expérimentale in vivo reposant sur la greffe de cellules dans des souris receveuses. Lors de travaux antérieurs, nous avons identifié une liste de gènes dont l'expression est augmentée dans une population de CSC mammaires isolées chez la souris. Cette surexpression suggère que certains de ces gènes pourraient contribuer aux propriétés biologiques des CSC, notamment à leur capacité d'initiation tumorale. L'objectif du présent projet est d'évaluer, pour un nombre limité de gènes issus de cette liste, leur implication dans le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses. Plus précisément, nous déterminerons si la surexpression de chacun de ces gènes dans une lignée de cellules cancéreuses mammaires humaines augmente leur capacité à initier une tumeur après greffe chez une souris receveuse. À l'inverse, nous évaluerons si l'invalidation de ces mêmes gènes réduit cette capacité. L'identification de gènes capables de moduler le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses permettra de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles et de sélectionner les gènes les plus prometteurs pour des études fonctionnelles ultérieures.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d'identifier des gènes dont l'expression est spécifique des cellules souches cancéreuses (CSC) mammaires et de déterminer leur rôle dans les propriétés biologiques de ces cellules. Les connaissances acquises permettront de mieux comprendre les mécanismes qui confèrent aux CSC leur capacité d'auto-renouvellement, leur potentiel d'initiation tumorale ainsi que leur résistance aux traitements anticancéreux. L'identification de ces gènes pourrait également conduire à la mise en évidence de nouveaux marqueurs moléculaires, notamment de marqueurs de surface permettant une meilleure identification et caractérisation des CSC. Ces gènes constituent par ailleurs des candidats susceptibles de représenter de nouvelles cibles thérapeutiques visant spécifiquement cette population cellulaire, considérée comme responsable de la persistance de la maladie et des rechutes après traitement. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus ciblées, destinées à améliorer l'efficacité des traitements du cancer du sein en limitant la survie des CSC. Les résultats obtenus dans ce projet viendront alimenter la sélection des gènes les plus pertinents pour des études précliniques ultérieures. L'évaluation du rôle de ces gènes dans le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses nécessite une analyse dans un organisme vivant, permettant d'étudier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. À ce jour, cette propriété ne peut pas être reproduite de manière suffisamment fidèle par les modèles expérimentaux in vitro. Le recours au modèle murin constitue donc une étape indispensable pour établir le rôle fonctionnel de ces gènes dans les propriétés des CSC.

Procédures

Tous les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse afin de procéder à l’injection (aiguille 29G - 0,33 x 12,7 mm) des cellules tumorales au niveau de leur flanc (durée de l’anesthésie: 10 minutes). Toutes les souris seront pesées 3 fois par semaine (1 minute) et la croissance des tumeurs sera mesurée 3 fois par semaine avec un pied à coulisse (2 minutes). Le développement tumorale se déroule entre 4 et 12 semaines, selon les lignées cancéreuses humaines utilisées

Impact sur les animaux

Le type de greffe de cellules tumorales se fait par injection sous-cutanée . Les tumeurs qui se développent peuvent potentiellement gêner la mobilité des souris si la tumeur se développe dans la région ventrale. Une fois la tumeur apparue, les souris concernées seront suivies plus régulièrement que les autres et l’on vérifiera journellement que le frottement de la tumeur n’induit pas de saignement ni de gène sévère à la mobilité. Si c’est le cas, l’expérience sera arrêtée et l’animal mis à mort. Au regard de notre expérience acquise au cours de plusieurs années d'utilisation de ce type de souris, ce type de nuisance est rare, mais ne doit pas être sous-estimée.

Devenir

Toutes les souris vont développer des tumeurs qui ne permettent pas la survie de l'animal après la fin du projet.

Remplacement

À ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant de remplacer totalement l'utilisation de l'animal pour évaluer le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses mammaires. Cette propriété correspond à la capacité des cellules à initier et développer une tumeur dans un organisme vivant. Ce type de propriété ne peut pas être reproduites de manière satisfaisante par les modèles expérimentaux in vitro. L'équipe utilise néanmoins de façon systématique des approches alternatives en culture cellulaire avant toute expérimentation animale. Les effets de la modulation des gènes étudiés sont d'abord évalués sur des cultures cellulaires afin de sélectionner uniquement les gènes présentant un phénotype d'intérêt. Les expériences de xénogreffe chez la souris ne sont réalisées qu'en dernière étape, pour valider les observations obtenues in vitro et déterminer leur impact sur le potentiel tumorigène.Cette stratégie expérimentale, développée et optimisée par l'équipe grâce à sa longue expérience des modèles de xénogreffe, permet de limiter le recours à l'animal aux seules expériences indispensables et contribue ainsi à l'application du principe de remplacement chaque fois qu'une méthode alternative est scientifiquement appropriée.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé de manière à répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en respectant le principe de réduction. Cette estimation s’appuie sur l’expertise de l’investigateur principal, sur les données de la littérature obtenues avec des modèles cellulaires et animaux similaires, ainsi que sur les résultats générés dans le cadre de notre précédent projet. L’expérience acquise au cours de ces travaux a permis d’optimiser le plan expérimental, de limiter le nombre de groupes et d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables et statistiquement exploitables.

Raffinement

Le projet sera conduit dans des conditions d’hébergement optimales afin de limiter le stress et de préserver le bien-être des animaux. Les souris seront maintenues en animalerie SOPF, dans des cages appropriées et réglementaires, avec un enrichissement adapté de leur environnement et un suivi sanitaire permanent assuré par le personnel qualifié de l’animalerie. Le développement des tumeurs sous la peau au niveau de la région mammaire sera suivi régulièrement par inspection visuelle, palpation et mesure au pied à coulisse. Les animaux seront également pesés régulièrement afin de détecter précocement toute altération de leur état général. L’expérience acquise avec ces modèles nous permet de connaître l'évolution des tumeurs, ce qui facilite l’adaptation du suivi des animaux et l’application précoce des critères d’arrêt prédéfinis. Les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée afin de détecter rapidement tout signe de douleur, de souffrance ou d’altération de l’état général, conduisant, si nécessaire, à l’interruption de l’expérience conformément aux critères d’arrêt établis. Lorsque des procédures susceptibles d’induire une douleur ou un inconfort seront réalisées, une prise en charge analgésique adaptée sera mise en œuvre conformément aux recommandations vétérinaires. Afin de réduire le stress lié aux manipulations expérimentales, les animaux seront progressivement habitués à la présence et aux manipulations de l’expérimentateur au cours des semaines précédant l’étude. Les manipulations seront réalisées préférentiellement selon une méthode non aversive (prise à l’aide d’un tunnel ou dans le creux de la main), afin de limiter le stress associé à la contention.

Choix des espèces

La souris est le modèle d’étude du potentiel tumorigène des cellules du cancer du sein. Combiné avec toutes les approches in vitro, les xénogreffes dans des souris immunodéficientes est le modèle de référence pour les cellules cancéreuses humaines. Animaux adulte âgés de 8 semaines ; c’est l’âge choisi classiquement pour des xénogreffes tumorales, pour avoir des souris jeunes adultes qui permet une bonne prise de greffe.

Tuées à des points définis du développement pour prélever leurs tissus musculaires, 72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souriceau reçoit peu après la naissance une injection dans les muscles d'une patte arrière, contenant soit du sérum salé, soit une substance qui bloque la contraction musculaire. L'atteinte annoncée est une paralysie des membres postérieurs à cinq jours de vie, dont le porteur ne précise ni la durée ni la prise en charge, tout en affirmant qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les interactions entre contraction, attache tendineuse et maturation des tissus. Les retombées annoncées, mieux comprendre les maladies musculaires et les lésions tendineuses, sont renvoyées au conditionnel et au long terme, quand la paralysie des souriceaux est l'objet même du protocole.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment une région spécialisée du muscle, appelée jonction myotendineuse, se forme après la naissance. Cette jonction relie le muscle au tendon et assure la transmission des forces lors des mouvements. Bien que cette structure soit essentielle au fonctionnement normal du muscle, les mécanismes de son développement au début de la vie restent encore mal connus. Nos observations préliminaires montrent que des changements moléculaires importants surviennent dans cette région au cours des deux premières semaines après la naissance, période correspondant également au moment où les jeunes animaux commencent à se déplacer et à utiliser leurs muscles. Nous émettons l’hypothèse que la contraction musculaire elle-même joue un rôle clé dans le déclenchement de la formation et de la maturation de la jonction myotendineuse. Pour tester cette hypothèse, nous bloquerons temporairement la contraction musculaire chez des souris nouveau-nées et analyserons les conséquences de cette perturbation sur le développement de cette jonction, aux niveaux moléculaire et structural.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la manière dont les muscles s’adaptent aux contraintes mécaniques au cours du développement précoce. Comprendre comment la jonction myotendineuse se forme pourrait aider à expliquer pourquoi cette région est particulièrement vulnérable aux lésions et aux maladies. À plus long terme, ces résultats pourraient contribuer à une meilleure compréhension des maladies musculaires, des lésions tendineuses et des pathologies dans lesquelles les connexions muscle–tendon sont fragilisées, et ainsi orienter le développement de futures stratégies thérapeutiques.

Procédures

Les animaux recevront une unique injection intramusculaire dans les muscles du membre postérieur peu après la naissance. Cette injection contiendra soit une solution de NaCl, soit une substance permettant de bloquer transitoirement la contraction musculaire. Aucune procédure chirurgicale ne sera réalisée. Les animaux seront ensuite suivis au cours du développement normal, puis euthanasiés à des points temporels définis, afin de permettre le prélèvement des tissus pour analyse.

Impact sur les animaux

Notre expérience induira une paralysie des membres postérieurs chez des souriceaux au stade néonatal (P5).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever les tissus musculaires nécessaires aux analyses moléculaires et structurales. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants et sont indispensables à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle alternatif sans recours aux animaux ne permet de reproduire les interactions complexes entre la contraction musculaire, l’attache tendineuse et la maturation tissulaire qui se produisent au cours du développement précoce. Les systèmes de culture cellulaire in vitro ne permettent pas de générer une jonction myotendineuse fonctionnelle. Par conséquent, l’utilisation d’animaux est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été soigneusement réduit au minimum grâce à l’optimisation du design expérimental. Les deux membres postérieurs de chaque animal sont utilisés pour différentes analyses, ce qui diminue le nombre total d’animaux nécessaires. De plus, les analyses les plus coûteuses en ressources ne sont réalisées que lorsque les résultats préliminaires justifient des investigations supplémentaires.

Raffinement

Toutes les procédures sont conçues pour minimiser la douleur et le stress. Les injections sont réalisées rapidement par du personnel formé, à l’aide d’aiguilles fines adaptées aux souriceaux. Les animaux sont étroitement surveillés afin de détecter tout signe d’inconfort ou de modification du comportement, et des points limites sont appliqués lorsque cela est nécessaire. Les conditions d’hébergement et de soins respectent les normes institutionnelles et réglementaires afin de garantir le bien-être des animaux tout au long du projet.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées dans ce projet car elles constituent un modèle bien établi pour l’étude du développement musculaire, et les analyses antérieures de l’expression génique et de la structure tissulaire ont été réalisées chez cette espèce. Cela permet une comparaison directe avec les données existantes. L’étude se concentre sur les stades postnataux précoces, car il s’agit d’une période critique au cours de laquelle la jonction myotendineuse subit une maturation rapide. Ces stades ont été sélectionnés sur la base d’observations préliminaires précises mettant en évidence d’importants changements moléculaires et structuraux durant cette fenêtre temporelle.

Opérées trente minutes pour recevoir un cathéter dans la veine jugulaire et une pompe programmable, une partie des souris est ensuite perfusée en hormone de croissance pendant cinq jours, le débit changeant toutes les trois heures. Au total 108 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 62 nouvelles souris transgéniques et 26 issues d'un autre protocole. La glycogénose est induite chez l'adulte par cinq jours d'injections, la glycémie est mesurée après section de l'extrémité de la queue, et une partie des souris est soumise pendant un mois et demi à un régime qui provoque une fibrose du foie. Le porteur indique que l'induction à l'âge adulte évite les hypoglycémies sévères "qui peuvent être fatales", et rapporte par ailleurs 1 à 2 % de décès, généralement nocturnes, liés à ces hypoglycémies. Toutes seront tuées pour prélever leur foie, leur hypophyse, leur hypothalamus et leurs testicules.

Objectifs

Modif.11/05/26] Alors que le diabète se caractérise par trop de sucre (hyperglycémies) dans le sang, la glycogénose de type 1 est une maladie métabolique rare qui entraine des hypoglycémies (baisse du sucre dans le sang) pouvant être fatales. Elle est due à des mutations génétiques qui empêchent l’organisme de produire du sucre entre les repas, pour maintenir une glycémie stable. Une prise en charge nutritionnelle est basée sur la consommation de sucres complexes comme la Maïzena et sur une prise alimentaire régulière y compris la nuit. Ces patients développent aussi un foie gras, et environ 80% de ces patients présentent des tumeurs du foie, quel que soit le sexe. Cependant, la maladie hépatique n’évolue pas vers le stade de cirrhose (fibrose importante du foie) alors que 80% des tumeurs se développent sur un foie cirrhotique chez les patients diabétiques, avec une prédominance chez les hommes. Grâce au développement d’un modèle de souris viables reproduisant fidèlement la pathologie hépatique de la glycogénose, il a été montré un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance. Cette hormone, produite par l’hypophyse, présente une sécrétion différente selon le sexe biologique, ce qui influence son action sur le foie. Notre projet consiste à évaluer l’effet de la libération contrôlée de l’hormone de croissance chez des souris mâles atteintes de glycogénose, afin d’étudier son impact sur l’évolution de la maladie hépatique. Ceci sera réalisé grâce à une mini-pompe programmable délivrant régulièrement l’hormone dans la circulation sanguine ou par des injections quotidiennes sous-cutanées, similaires aux traitements administrés chez l’humain. Les premières observations montrent que ce traitement permet de rétablir partiellement certaines caractéristiques d’un foie sain, et ce, quel que soit le protocole de traitement utilisé. En revanche, ce traitement n’a pas agi sur les gènes liés à l’inflammation ou la fibrose. Pour aller plus loin, de nouvelles expériences ajoutées à ce projet [Modif.11/05/26] incluront des souris soumises à un régime alimentaire déséquilibré connu pour favoriser la fibrose du foie, en comparaison à un régime normal. Les objectifs sont 1) de vérifier si le traitement par injections quotidiennes reste efficace dans ces conditions et peut moduler le développement de la fibrose, et 2) observer les effets après une durée de traitement prolongée.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie hépatique associée à la glycogénose. A partir de nos données préliminaires démontrant un défaut de sécrétion de l’hormone de croissance, nous avons émis l’hypothèse que le rétablissement de sa sécrétion à des rythmes physiologiques devrait permettre de retrouver un contexte hépatique similaire à ce qui est observé chez les patients diabétiques obèses qui présentent aussi un foie gras. Dans le cadre de la glycogénose, quelques rares données suggèrent des perturbations hormonales, en particulier une diminution de la sécrétion de l’hormone de croissance. Ceci explique les retards de croissance observés chez ces patients. Notre étude devrait mettre en évidence que ces perturbations hormonales ont un impact plus large, en particulier sur la progression de la maladie hépatique. Nos résultats pourraient être importants pour la prise en charge d’autres pathologies puisque la pulsatilité de la sécrétion de l’hormone de croissance n’est jamais prise en compte dans les traitements chez l’homme. Une délivrance plus physiologique de cette hormone pourrait éviter les effets secondaires liés à son injection chronique à des doses supra-physiologiques.

Procédures

Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un petit morceau (1mm) de tissu sera prélevé à l’extrémité [Modif.11/05/26] de la pina de l’oreille pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. A l’âge de 6-8 semaines, les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris). Environ 4 mois après le développement de la glycogénose, une partie des souris subira une chirurgie afin de poser un cathéter en veine jugulaire et une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. La chirurgie devrait durer au maximum 30 min. Après une période de récupération post-opératoire d’au moins 1 semaine, les souris seront perfusées soit avec une solution d’hormone de croissance, soit avec du sérum physiologique, de façon pulsatile (changement de débit toutes les 3h), pendant 5 jours. [Modif.11/05/26]: Un autre lot de souris subira 1 injection quotidienne d’hormone de croissance pendant 5 jours ou 15 jours (quelques secondes/souris). Un groupe de souris saines et un groupe de souris atteintes de glycogénose seront injectés avec du sérum physiologique et constitueront les groupes de référence (quelques secondes/souris). L’étude sera réalisée sur des animaux nourris en régime standard et sur des animaux nourris pendant 1,5 mois avec un régime connu pour induire de la fibrose au niveau du foie (stade avant le développement de la cirrhose). En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. Le prélèvement durera environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

A l’âge de 7 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie [Modif.11/05/26] de la pina de l’oreille afin de les génotyper. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. L’induction de la glycogénose sera obtenue après une série d’injections en sous-cutané pendant 5 jours, à l’âge de 6-8 semaines, pouvant engendrer une légère douleur. L’immobilisation de la souris ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Ces souris peuvent développer des hypoglycémies sévères si elles ne s’alimentent pas régulièrement. Dans ce cas, les souris présentent un mal-être important lié à l’hypoglycémie. Actuellement, la gestion de l’élevage permet de limiter les décès liés aux hypoglycémies sévères, mais 1 à 2% de décès peuvent être rencontrés généralement durant la nuit. Les hypoglycémies peuvent être plus fréquentes lors de l’anesthésie et lors de la mise à jeun en fin de protocole. La glycémie sera mesurée à partir d’une goutte de sang obtenue après section de l’extrémité de la queue ce qui entraine de la douleur Au-delà de 15 mois de maladie, ces souris peuvent développer des tumeurs du foie. Dans ce projet, les souris seront mises à mort au plus tard 6 mois après l’induction de la maladie. Après 4 mois d’induction de la maladie, certaines souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un cathéter en veine jugulaire et d’une pompe programmable permettant la délivrance pulsatile d’hormone de croissance. Le risque d’hémorragie lors de la chirurgie est très faible et la chirurgie est susceptible de provoquer de la douleur. [Modif.11/05/26] Un autre lot de souris subira 1 injection/jour pendant 5 ou 15 jours, ce qui peut induire une légère douleur. Le régime qui induit une fibrose du foie peut entrainer une légère perte de poids et, au-delà de 3 mois, ce régime peut avoir des effets délétères sur les fonctions du foie, entrainant un mal-être important chez la souris. L’immobilisation de la souris pour ces injections ne nécessite pas de contention en main mais peut induire un léger stress. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. La piqure entraine une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et les testicules afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires

Remplacement

Même s’il est maintenant possible de produire des petits organes en culture qui intègrent les différents types de cellules du foie, la pathologie hépatique de la glycogénose met en jeu un dialogue complexe entre ces cellules du foie et les cellules du système immunitaires de la circulation sanguin ainsi que des régulations hormonales. Une étude préliminaire réalisée in vitro sur des cellules du foie de souris traitées avec de l’hormone de croissance de façon cyclique a permis de valider notre hypothèse de travail. Cependant, il est important maintenant de conserver la physiologie de l'organisme pour comprendre les mécanismes initiés par la pulsatilité de l’hormone de croissance sur le foie. Ce projet nécessite donc de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter organes. Dans le cadre de cette étude, l’hypothalamus, l’hypophyse, les testicules, le foie et le sang seront prélevés pour étudier en détail l’ensemble des régulations à l’échelle de l’organisme

Réduction

-Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 10 souris maximum, permettront de réaliser à la fois les études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. -Dans le but de réduire le nombre d’animaux à produire, certains animaux sont des souris déjà utilisées dans un autre protocole, sans avoir subi de procédures sévères entrainant un mal-être ou une douleur importante. [Modif.11/05/26] -Au total, ce projet réalisé sur 5 ans nécessitera au maximum 108 souris, incluant l’obtention de 62 nouvelles souris transgéniques et de 26 souris « réutilisées ».

Raffinement

-La pathologie est induite uniquement dans le foie des souris à l’âge adulte ; ceci permet d’éviter les hypoglycémies sévères qui peuvent être fatales et de passer la période néonatale. -Contrôle des risques d’hypoglycémie en limitant les efforts des souris pour accéder à la mangeoire (croquettes dans la cage et tétines de biberon longue). En cas d’hypoglycémie, une solution de sucre (glucose) sera administrée à la souris et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle. Les animaux seront entraînés à recevoir du glucose à la pipette par voie orale avant l’induction de la maladie. -Afin de limiter la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones qui peuvent être douloureuses. -Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Elle sera réalisée dans des conditions d’asepsie afin d’éviter tout risque d’infection. Afin de limiter au maximum le risque d’hypothermie pendant la chirurgie, un module permettant de chauffer la boîte à induction et un tapis chauffant seront utilisés. La glycémie sera aussi contrôlée régulièrement afin d’intervenir au plus tôt pour administrer une solution de sucre. Enfin, tout le suivi post-opératoire se fera dans une pièce permettant de garder les souris à thermoneutralité. [Modif.11/05/26] Un suivi de poids mensuel, puis quotidien pendant la période post-opératoire ou bihebdomadaire lors du changement de régime permettra d’identifier une perte de poids anormale de l’animal. La durée du régime induisant une fibrose du foie sera limitée dans le temps afin de prévenir la survenue de dommages hépatiques et d’un mal-être important. La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet.

Choix des espèces

En ce qui concerne la régulation de la glycémie, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle de souris transgéniques reproduit toute la pathologie humaine de la glycogénose, y compris le développement de tumeurs. Le protocole sera débuté chez des souris adultes âgées d’au minimum 6 à 8 semaines. L’induction de la glycogénose sera réalisée à l’âge adulte ce qui permet d’éviter l’apparition de retard de croissance dû à la maladie et de passer la période périnatale sans phénotype dommageable. Les perfusions [Modif.11/05/26] ou les traitements à l’hormone de croissance seront réalisés 4 mois après le développement de la glycogénose. Seule la biopsie de la pina de l’oreille [Modif.11/05/26] pour génotypage sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7 jours.

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, donc plus exposée aux infections et maintenue sous couvercle filtrant. 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales dans les deux flancs, puis des molécules fluorescentes et des anesthésies répétées pour l'imagerie, avec deux tumeurs pouvant atteindre 250 mm3, des nécroses traitées au spray cicatrisant et une mise à mort déclenchée au-delà de deux millimètres de nécrose ou de 15 % de perte de poids. Toutes seront tuées pour observer la fluorescence de leurs tumeurs et de leurs organes, dans un projet où cinq souris sont prévues par molécule testée et dont le porteur annonce que ces agents pourraient "réduire le nombre d'animaux utilisés dans les expériences précliniques".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester des molécules couplées à des sondes fluorescentes permettant de détecter par imagerie de fluorescence les tumeurs. Ces agents pourront ensuite permettre le suivi de la prise tumorale chez la souris et pourront également servir pour réaliser de la chirurgie assistée par fluorescence ou délivrer des agents thérapeutiques. Dans ce projet, nous testerons la capacité de ces molécules à cibler et permettre la détection des tumeurs sous-cutanées. Il s’agit ici de faire la preuve de concept de l’utilisation de ces molécules.

Bénéfices attendus

Ce projet est la partie preuve de concept (POC) de projets de plus grandes ampleurs. Il permet de tester aussi bien la possibilité des molécules imageantes à reconnaitre leur cible que leur capacité à être imagées. L’étape suivante sera de tester les meilleurs agents dans des modèles plus proches de l’Homme avant de pouvoir envisager leur utilisation chez l’Homme. Ces agents pourront également faciliter le suivi de la progression tumorale chez les souris et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans les expériences précliniques.

Procédures

Les animaux recevront l’injection de cellules tumorales dans les deux flancs (100 µl en 30 secondes) après avoir été anesthésiés. Ils recevront également une injection de molécules imageantes (maximum 200 µl en 1 minute)

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées lors de l’injection des cellules tumorales - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs pourrait provoquer un léger stress. - La présence de deux tumeurs sur les flancs pouvant atteindre jusqu’à 250 mm3 pourrait générer une légère gêne au mouvement et donc impacter légèrement leur état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - L’injection des agents imageants (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure et les tumeurs et les organes seront alors récupérés pour visualisation de la fluorescence ex-vivo.

Remplacement

La preuve de concept de l’utilisation de ces molécules imageantes pour visualiser les tumeurs nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’animal et l’Homme et donc d’avoir des tumeurs. Le but est de montrer que ces agents sont capables d’aller jusqu’à la tumeur, de reconnaitre leur cible et d’être visualisable. Cette preuve de concept ne peut donc être faite que sur des animaux porteurs de tumeurs exprimant les cibles des molécules testées. Tous les tests in vitro préalables ont déjà été faits.

Réduction

Pour chaque molécule imageante à tester, 1 groupe de 5 souris sera constitué afin de générer un groupe avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer leurs capacités à reconnaitre la tumeur et à être imagé. L’implantation de tumeurs porteuses de la cible ou non sur le même animal permet de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant de devoir faire des expériences supplémentaires.

Raffinement

L’hébergement des souris se fera en groupe pour éviter le stress et ces souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Les différentes lignées de cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée dans le flanc de souris anesthésiées. Les animaux seront suivis tous les 2-3 jours pour vérifier leur bien-être et déterminer la progression tumorale par mesure du volume de la tumeur. En cas d’apparition de nécrose les tumeurs seront traitées avec un spray cicatrisant, si la nécrose dépasse 2 mm de diamètre ou si d’autres signes de souffrance apparaissent (ex : perte de 15% du poids de la souris), les animaux seront mis à mort. Les animaux immunodéficients étant plus sensibles aux infections, ils seront maintenus sous couvercle filtrant.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouvelles molécules imageantes utilisées en cancérologie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes ou immunodéficientes selon la cible de la molécule et donc les cellules tumorales à implanter. Les souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée de ces cellules cancéreuses. Des souris adultes d’au moins 6 semaines seront utilisées pour permettre une bonne prise tumorale et l’obtention d’un système immunitaire fonctionnel dans le cas des souris immunocompétentes

Des souriceaux nouveau-nés reçoivent une injection sous-cutanée d'antibiotique de quinze secondes, leurs mères allaitantes recevant le même produit dans l'eau de boisson. 336 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort pour des analyses histologiques. L'objet est fondamental, comprendre le rôle d'une molécule de guidage et de son récepteur dans la formation du réseau lymphatique de l'utérus, une demande d'autorisation ultérieure étant annoncée pour le cancer de l'endomètre. Le porteur affirme avoir déterminé par des outils statistiques le nombre d'individus qu'il juge "nécessaires", et avoir divisé cet effectif par deux en scindant les cornes utérines, sans dire ce qui conduit à 336 souris.

Objectifs

Le système lymphatique est constitué d'un réseau ouvert, unidirectionnel et à faible pression de vaisseaux lymphatiques. Il maintient le volume et la composition du liquide situé entre les cellules de l’organisme, participe à l'absorption intestinale des graisses et des vitamines alimentaires et contribue au bon fonctionnement du système immunitaire. Ces vaisseaux sont tapissés par des cellules qui délimitent l’intérieur du vaisseau et le tissu. La formation du réseau lymphatique à partir de la vascularisation préexistante est un processus hautement contrôlé appelé lymphangiogenèse. Ce mécanisme fait intervenir de nombreuses molécules, dont des molécules connues pour contrôler le développement du système nerveux. Ce projet vise à comprendre le rôle d'une de ces molécules et de son récepteur au cours de la mise en place de ce réseau lymphatique dans l’utérus. Ce projet sera réalisé à l’aide de plusieurs modèles génétiques murins permettant de moduler l’expression de gènes d’intérêt dans un tissu spécifique et à un moment donné. Ce contrôle spatio-temporel permet d’éviter les événements délétères sur les animaux. Ce projet pourrait donc permettre de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation et l’organisation des vaisseaux lymphatiques au cours du développement mais également d’ouvrir de nouvelles perspectives d’études dans des conditions pathologiques comme le cancer. En effet, le système lymphatique est impliqué dans la progression métastatique où il est une voie de dissémination pour les cellules cancéreuses, notamment dans les cas de cancer de l’endomètre.

Bénéfices attendus

Ce projet a un but exclusivement fondamental. Son objectif est de clarifier le rôle d’une molécule de guidage axonal et son récepteur dans la mise en place du réseau lymphatique de l’utérus. Si ce projet aboutit à l’identification d’une fonction pour ce couple ligand/récepteur. Nous déposerons une nouvelle demande de projet pour tester ce rôle dans un contexte tumoral (cancer de l’endomètre). En effet, le système lymphatique est connu pour être une voie de dissémination métastatique dans les cancers de l’endomètre.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons uniquement des interventions sur des nouveau-nés. Nous réaliserons une injection sous-cutanée (15 secondes). Enfin, nous prélèverons les tissus post-mortem pour des analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les nouveau-nés recevront une injection sous-cutanée d’un antibiotique afin de déclencher l’évènement génétique permettant d’étudier la fonction de nos gènes d’intérêt. Nous n’attendons pas d’effet délétère fort, mais plutôt un retard de croissance du système lymphatique. Les mère allaitantes auront également l'antibiotique dans leur eau de boisson.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure, car nous réaliserons des analyses sur tous les Animaux (histologiques).

Remplacement

La compréhension du développement du système vasculaire lymphatique ne peut être réalisée uniquement chez l’animal. En effet, l’organisation du réseau vasculaire lymphatique est hautement complexe et les mécanismes impliqués dans son développement font intervenir des interactions tissulaires. Il est impossible de récapituler in vitro l’ensemble de ces différentes caractéristiques.

Réduction

Une attention particulière sera accordée à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. L’analyse développementale est principalement basée sur des caractères histologiques qui seront quantifiés. Nous avons pu ainsi déterminer à l’aide d’outils statistiques le nombre d’individus nécessaires permettant d’obtenir des résultats robustes. Par ailleurs, les cornes utérines seront scindées en deux ce qui permet de diviser par 2 le nombre d’individus.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections sous-cutanées seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Le contrôle spatial et temporel de l’évènement génétique permet de restreindre les défauts au système vasculaire lymphatique par rapport aux animaux constitutivement invalidés pour les gènes étudiés.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% de son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Dans ce projet, le système lymphatique sera analysé grâce à des souris génétiquement modifiées dont l’expression des molécules candidates est perturbée. Les analyses seront réalisées à différents âges qui ont été choisis suite à une étude préliminaire qui a montré que le système lymphatique de la corne utérine se développe entre 2 jours post-natals et 21 jours post-natal (le réseau a atteint sa maturité).

Gavées à trois reprises, puis anesthésiées au gaz pour recevoir une injection dans l'oreille, 124 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes mises à mort pour des coupes histologiques. Le gavage administre un analogue d'hormone qui déclenche la modification génétique visée, sur des lignées dont l'expression des molécules candidates est perturbée. Le projet est fondamental, comprendre comment une molécule et son récepteur maintiennent l'intégrité des vaisseaux lymphatiques, avec l'idée lointaine de bloquer la dissémination des métastases par cette voie. Le porteur retient la souris au motif qu'elle partage "98% de son patrimoine génétique" avec l'humain, et conduit les analyses chez l'adulte pour éprouver la fonctionnalité du réseau lymphatique.

Objectifs

Le système lymphatique est constitué d'un réseau ouvert, unidirectionnel et à faible pression de vaisseaux lymphatiques. Il maintient le volume et la composition du liquide situé entre les cellules de l’organisme, participe à l'absorption intestinale des graisses et des vitamines alimentaires et contribue au bon fonctionnement du système immunitaire. Ces vaisseaux sont tapissés par des cellules qui délimitent l’intérieur du vaisseau et le tissu. La formation du réseau lymphatique à partir de la vascularisation préexistante est un processus hautement contrôlé appelé lymphangiogenèse. Ce mécanisme fait intervenir de nombreuses molécules, dont des molécules connues pour contrôler le développement du système nerveux. Ce projet vise à comprendre le rôle d'une de ces molécules et de son récepteur dans le maintien de l’intégrité du réseau vasculaire lymphatique dans des conditions physiologiques et pathologiques (ici le cancer). Ce projet sera réalisé à l’aide de plusieurs modèles génétiques murins permettant de moduler l’expression de gènes d’intérêt. Ce projet pourrait donc permettre de mieux comprendre comment les cellules tumorales détournent la fonction du réseau vasculaire lymphatique afin de se disséminer dans tous l’organisme.

Bénéfices attendus

Ce projet a un but principalement fondamental, puisqu’il vise à mieux comprendre comment le réseau lymphatique maintient son intégrité et comment sa fonction peut être détournée dans des conditions pathologiques. À plus long terme, ce projet pourrait éventuellement permettre de développer des molécules permettant de bloquer la dissémination métastatique par la voie du réseau lymphatique.

Procédures

Les animaux seront gavés à trois reprises (15 secondes). Dans un second temps, ils recevront également une injection dans l’oreille sous anesthésie gazeuse (15 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront gavé avec un analogue d’hormone afin de déclencher l’évènement génétique permettant d’étudier la fonction de nos gènes d’intérêt. Nous n’attendons pas d’effet délétère fort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure, car nous réaliserons des analyses sur tous les animaux (coupes histologiques et marquages).

Remplacement

La compréhension du développement du système vasculaire lymphatique ne peut être réalisée que chez l’animal. En effet, l’organisation du réseau vasculaire lymphatique est hautement complexe et les mécanismes impliqués dans son développement font intervenir des interactions tissulaires. Il est impossible de récapituler in vitro ces différentes caractéristiques.

Réduction

Une attention particulière sera accordée à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. L’analyse développementale est principalement basée sur des caractères histologiques qui seront quantifiés. Nous avons pu ainsi déterminer à l’aide d’outils statistiques le nombre d’individus nécessaires permettant d’obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections sous-cutanées seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Le contrôle spatial et temporel de l’évènement génétique permet de restreindre les défauts au système vasculaire lymphatique par rapport aux animaux constitutivement invalidés pour les gènes étudiés.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% de son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Dans ce projet, le système lymphatique sera analysé grâce à des souris génétiquement modifiées dont l’expression des molécules candidates est perturbée. Les analyses seront réalisées chez l’adulte afin de tester la fonctionnalité du réseau lymphatique.

Comprendre quels neurones du cortex relient une action à un but conduit à opérer 1 876 souris du cerveau, sous anesthésie générale, pendant soixante à quatre-vingt-dix minutes. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse histologique des neurones marqués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une à trois semaines de récupération, chacune passe jusqu'à dix séances de trente minutes où elle doit introduire le museau dans un orifice pour obtenir une récompense sucrée, sous restriction alimentaire destinée à entretenir son appétit. Le porteur qualifie ce geste d'"action non stressante" et annonce par ailleurs une perte de poids sur toute la durée du protocole, des douleurs post-opératoires et un isolement de trois semaines qui "peut être une source de stress".

Objectifs

Pour répondre à un besoin essentiel comme la faim ou la soif, un individu doit être capable d’identifier un objectif et de choisir les actions qui permettent de l’atteindre. Par exemple, lorsque l’on ressent la faim, on compare plusieurs possibilités (manger les restes disponibles ou commander un repas) ainsi que les actions nécessaires pour y accéder (aller au réfrigérateur, passer la commande sur son téléphone). Le but de cette étude est d’étudier les mécanismes cérébraux qui déclenchent une action orientée vers un but, pour mieux comprendre les troubles où ces comportements sont altérés, comme certaines formes d’impulsivité (addictions, trouble du déficit de l’attention) ou la baisse de motivation (dépression, bipolarité). Des travaux ont montré qu’une partie du cortex joue un rôle clé pour relier une action à un but, mais les mécanismes précis restent à identifier. Notre objectif est de déterminer quels groupes de neurones du cortex réalisent ces associations, quelles sont leurs caractéristiques moléculaires (pour développer de futurs traitements) et quel est leur mode d’activité électrique (pour servir de marqueur signant les dysfonctions). Pour cela, nous utiliserons des souris comme modèle animal. Les souris réaliseront une action non stressante : un nose-poke (introduire brièvement leur museau dans un petit orifice du mur), afin d’obtenir une récompense sucrée. Ce modèle permet de combiner l’étude de comportements dirigés vers un but avec l’utilisation d’outils génétiques permettant de marquer, enregistrer et manipuler précisément certains neurones, ce qui n’est pas possible chez d’autres espèces.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche apportera des connaissances essentielles sur la manière dont le cerveau génère un comportement volontaire, un mécanisme fondamental au cœur de nombreuses actions du quotidien. À court terme, il nous permettra de caractériser précisément les neurones activés lorsqu’un animal réalise une action orientée vers un objectif. Cette compréhension des circuits cérébraux impliqués sera rapidement accessible grâce aux premières publications issues du projet. Sur le plan clinique, les retombées concernent directement la santé mentale. Dans plusieurs troubles psychiatriques, tels que le trouble de déficit de l'attention et hyperactivité (TDAH), la dépression, l’addiction ou les troubles impulsifs, la prise de décision orientée vers un but est altérée : elle peut être mal dirigée, insuffisamment contrôlée ou désorganisée dans le temps. Ces difficultés peuvent aller à l’encontre des besoins exprimés par les personnes concernées. Comprendre en détail comment le cerveau structure une décision volontaire est donc primordial pour mieux expliquer l’origine de ces troubles, mais aussi pour identifier les mécanismes qui pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques. À plus long terme, ce projet offrira des bases solides pour développer des stratégies cliniques pour renforcer l’autonomie et la qualité de vie des personnes touchées par ces pathologies.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une neurochirurgie réalisée sous anesthésie générale avec analgésie durant environ 60 à 90 minutes, qui sera suivie d’une période de récupération de 1 à 3 semaines. Après récupération, les animaux participeront à un maximum de dix sessions d’apprentissage à l’obtention de récompense, chacune d’une durée de 30 minutes. Après récupération, les animaux participeront à un maximum de dix sessions de conditionnement opérant (30 minutes chacune), où ils devront effectuer un nose poke pour obtenir une récompense sucrée. L’ensemble de ces procédures sera réalisé sous faible restriction alimentaire pour motiver l’appétit face aux récompenses. Dans la première procédure, chaque session d’apprentissage sera précédées d’une injection unique. Ces tests seront effectués par paires, avec une injection dans le ventre (peu douloureuse) administrée 20 minutes avant chaque session. Chaque injection dure environ 1 minute, et l’effet de la pharmacologie sur les neurones s’étend sur plusieurs heures. La durée totale du protocole pour chaque animal est estimée à environ un mois et demi, incluant la chirurgie, la récupération, les sessions comportementales et les injections. Aucun prélèvement n’est prévu sur les animaux vigiles.

Impact sur les animaux

La restriction alimentaire mise en place entrainera une perte maîtrisée de poids sur les animaux sur la durée complète des procédures. Les chirurgies peuvent entraîner des douleurs, potentielles inflammation du site de chirurgie et un inconfort post-opératoire durant 1 à 3 jours. La consommation d’antibiotique peut entraîner des inconforts intestinaux. L’isolement des souris durant 3 semaines peut être une source de stress

Devenir

Les animaux sont tous mis à mort après les procédures pour effectuer des analyses histologiques sur l’identité cellulaire des neurones étiquetés

Remplacement

Nous cherchons à comprendre comment le cerveau prend des décisions en fonction de la valeur des options (par exemple choisir ce qui est le plus avantageux). Pour cela, nous étudions l’activité des neurones pendant que le sujet réalise une tâche. La prise de décision fait intervenir de nombreuses régions du cerveau qui communiquent entre elles, mais aussi avec le reste du corps (comme le foie, les muscles ou le tissu adipeux). C’est pourquoi les méthodes réalisées uniquement sur des cellules ou des tissus isolés, ne permettent pas encore de reproduire toute la complexité d’un organisme vivant et de son interaction avec l’environnement.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaire en utilisant les données préliminaires. Pour la manipulation des ensembles neuronaux au cours de la tâche, chaque souris sera testée dans deux conditions distinctes. Cela permettra que chaque animal puisse générer son résultat et son propre contrôle, ce qui permet de diviser par deux le nombre d’animaux nécessaires. Enfin, à l’issue de chaque procédure, les animaux mobilisés sur les expériences seront prélevés post mortem afin d’éviter de mobiliser un troisième groupe d’animaux dédié à l’étude de l’architecture neuronale.

Raffinement

Dans le cadre des procédures impliquant de la neurochirurgie, la santé des animaux sera surveillée en continu tout au long de l’intervention, notamment par le contrôle des paramètres physiologiques. Une habituation préalable des animaux sera faite afin de limiter leur stress. Le déroulement des chirurgies sera accompagné de mesures de confort et d’une analgésie adaptée tout au long de la procédure. Un suivi post-opératoire poussé, avec une grille d’observation, permettra la mise en place de soins adaptés.

Choix des espèces

D’un point de vue technique, la souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés. Elle est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. De plus, la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical. Notamment sur le système de décision qui est relativement bien conservé par rapport à celui de l’Humain, anatomiquement et fonctionnellement. Ce qui n’est pas le cas chez les invertébrés, poissons et oiseaux, pour lesquels l’organisation anatomique du circuit de décision est trop différente pour que ces espèces puissent être utilisées pour comprendre les mécanismes neuronaux. De plus, ces comportements de prise de décision (motivation alimentaire, apprentissage d’action et mémoire) sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adéquate pour comparer avec de précédentes études. Toutes les souris arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 11 semaines, et les procédures expérimentales débuteront après 1 semaine d’habituation. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris ne seront plus utilisées au-delà de 11 mois.