Oncologie

Deux injections d'hépatocytes humains, une greffe de cellules de foie sous anesthésie, puis des administrations répétées de candidats médicaments par voie intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou par gavage. 5 000 souris immunodéprimées, greffées dès l'âge de trois à quatre semaines pour qu'un foie humanisé s'y développe, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue au motif qu'elles ne recouvreront pas leur état de santé. Le modèle est proposé aux laboratoires pharmaceutiques pour l'évaluation de la toxicité hépatique, et le porteur retient la souris parce qu'elle est "plus acceptable éthiquement que les primates non-humains". Rien n'est dit des molécules qui seront administrées ni du nombre d'études prévues, et les atteintes attendues se résument à une perte de poids, une prostration ou des difficultés à se déplacer, la mise à mort intervenant à 25 % de poids perdu.

Objectifs

Les unités de recherche académiques et les laboratoires pharmaceutiques dépendent en grande partie des modèles murins pour évaluer l'efficacité et la toxicité de nouveaux candidats médicaments. La souris foie humanisée constitue le modèle de choix dans le cadre de la recherche dans le domaine des maladies infectieuses hépatiques (HBV, HCV), du carcinome du foie et de la toxicité métabolique. En effet, l'évaluation de la toxicologie préclinique est l'étape la plus critique du développement d'un médicament, ce faisant la distribution, le métabolisme et l'excrétion (ADME) d'un médicament chez l'homme ont un besoin urgent d'être mieux estimé.

Bénéfices attendus

L'évaluation de la toxicologie préclinique est l'étape la plus critique du développement d'un médicament. Environ 70% des programmes de développement de médicaments échouent en raison d'une toxicité ou de problèmes inattendus lors de la validation de phase 1 sur l'absorption, la distribution, le métabolisme et l'excrétion (ADME) chez l'homme. Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie qui présente une architecture et un fonctionnement complexe qui ne peut être reproduit in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophyles,...). La souris foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les maladies virales et le cancer.

Procédures

2 injections d'hépatocytes humains par voie intraveineuse, gerffe des cellules du foie sous anesthésie, 1 injection sous-cutannée d'anagésique, injections de candidats médiacaments par voir intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse ou par gavage.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par l'injection des hépatocytes humains, la greffe des cellules du foie, l’administrations de traitements, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés selon les procédures en vigueur car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

L'évaluation de la toxicologie préclinique est l'étape la plus critique du développement d'un médicament. Environ 70% des programmes de développement de médicaments échouent en raison d'une toxicité ou de problèmes inattendus lors de la validation de phase 1 sur l'absorption, la distribution, le métabolisme et l'excrétion (ADME) chez l'homme. Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie qui présente une architecture et un fonctionnement complexe qui ne peut être reproduit in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophyles,...). La souris foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les maladies virales et le cancer.

Réduction

Dans ce projet, un nombre maximum de 5000 souris seront humanisées Chaque étude préclinique visant à tester l'efficacité d'un candidat médicament nécessite entre 50 et 100 animaux ( Au minimum 4 groupes seront nécessaires pour la bonne conduite de chaque étude préclinique (3-5 doses du candidat médicament, contrôle négatif, contrôle positif,...). Les études précliniques des candidats-médicaments nécessitent l’utilisation de 8 à 10 individus par group testé. Ce nombre nous permettre d’avoir des résultats statistiquement interprétables et éviter de refaire les études et ainsi limiter le nombre d’animaux totale utilisés.

Raffinement

Les souris seront monitorées quotidiennement et pesée hebdomadairement pour s'assurer de leur état général. Une perte de plus de 25% de leur point initial (sera considérée comme une raison de mise à mort. De même, si un animal présente des signes de prostration, de difficultés locomotrices ou des difficultés à s'alimenter, il sera mis à mort immédiatement. Les animaux seront hébergés dans une animalerie de classe A2 par 5 à 6 animaux par cage ventilée. Les animaux bénéficent d'une période d’acclimatations dans leurs cages de 24h avant le début de l'expérimentation. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours. Les animaux sont hébergés avec à un cycle lumière-obscurité de 12h / 12h (07 :19h). Les animaux sont acclimatés à la présence de l’expérimentateur qui les pèse et les examine tous les jours. L’eau de breuvage (stérile) ainsi que la nourriture (stérile) sont fournies ad libitum sauf si le protocole nécessite une période de jeune. La durée de ce jeune ne pourra jamais dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Pour réduire et éviter le stress et assurer le bien-être des animaux, chaque cage est enrichie avec des objets (cabane en carton) et la litière de chaque cage est changée régulièrement.

Choix des espèces

La souris permet de re-créer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. De plus les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains et bien caractérisée au niveau génétique. Animaux post-sevrages ou adultes. Le protocole de greffe des hepatocytes ne peut être réalisé que sur de jeunes animaux (trois-quatre semaines), cela est nécessaire pour que le le foie humanisé puisse se développer. L'effiocacité/toxicité des animaux sera quant à elle réalisées sur des animaux adultes afin de normaliser les résultats précliniques

Un fragment de peau est retiré du dos de chaque souris sous anesthésie générale, un anneau de silicone fixé autour de la plaie, puis le pansement changé et la plaie mesurée tous les jours sous anesthésie gazeuse. 114 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur indiquant que des infections peuvent apparaître et que des signes de douleur peuvent se manifester pendant toute la durée de l'expérience. Le mécanisme étudié, une sénescence déclenchée par la rupture de l'enveloppe du noyau sous contrainte mécanique, a été découvert sur des cellules en culture, ce qui n'empêche pas le porteur d'affirmer que ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire les paramètres en jeu. L'effectif de 114 animaux n'est justifié que par le recours à des "outils statistiques", et toutes les souris sont tuées pour analyse des plaies après leur mort.

Objectifs

Comprendre et exploiter les mécanismes de réparation des plaies cutanées pourrait avoir des implications importantes dans le développement de thérapies visant à optimiser le processus de cicatrisation survenues dans des épisodes cliniques aigus (brûlure, choc mécanique,) et chroniques (eczéma, psoriasis…) qui touchent une grande partie de la population. Malgré l’importance des processus de réparation tissulaire, ceux-ci sont encore mal connus. Des données chez l’homme et chez la souris décrivent le rôle central de la sénescence pour la réparation tissulaire. La sénescence est un phénomène biologique qui se produit lorsque les cellules de notre corps cessent de se diviser et de fonctionner correctement. Cependant, il a été montré que la sénescence favorise la régénération tissulaire en limitant la prolifération cellulaire excessive, en éliminant les cellules endommagées et en créant un environnement favorable à la cicatrisation. Récemment nous avons découvert un nouveau mécanisme d’induction de la sénescence cellulaire. Ce mécanisme est déclenché à la suite de la rupture de la membrane du noyau en réponse à des forces mécaniques appliquées sur les cellules. L'objectif du projet est alors de déterminer si ce mécanisme d’induction de la senescence est impliqué dans la réparation des plaies cutanées.

Bénéfices attendus

Jusqu'à présent, il a été décrit qu’à la suite d’une blessure, des cellules sénescentes se forment. Ces cellules jouent un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies. Cependant, on ne sait pas encore clairement ce qui déclenche le mécanisme " de sénescence". L'étude du rôle potentiel de la protéine TREX1 dans l'induction de la sénescence après une blessure pourrait dévoiler une nouvelle cible thérapeutique pour améliorer la réparation tissulaire survenue, par exemple, à la suite de brûlure ou choc mécanique.

Procédures

Quelques jours avant l’excision cutanée, les animaux seront manipulés quotidiennement afin de limiter le stress dû au contact avec l’expérimentateur. Un fragment de la peau sera retiré sous anesthésie générale et un anneau de silicone sera fixé autour de la plaie (durée de l’anesthésie : 20 min). Les souris seront ensuite surveillées, les pansements changés et les plaies mesurées tous les jours sous anesthésie gazeuse (durée de l’anesthésie : 10 min).

Impact sur les animaux

À la suite de l’excision tissulaire, des infections peuvent apparaitre au niveau des plaies et des signes de douleurs peuvent se manifester tout au long de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Lorsqu’une plaie survient, des cellules sénescentes tels que les myofibroblastes (des cellules spécialisées qui jouent un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies et la réparation des tissus se forment aux alentours. Ces cellules devenues sénescentes sécrètent des signaux et des facteurs qui inhibent la prolifération des cellules voisines. Tous ces facteurs élargissent le champ d'attraction de l'état de cicatrisation orchestré par plusieurs types cellulaires. Chaque organe, voire chaque partie d'organe, présente un microenvironnement particulier lié à la fois aux cellules qui y sont présentes, la façon dont elles communiquent ensemble, et surtout de tout ce qu'il s'est passé depuis la formation de cet organe (infections, lésions…). Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire tous ces paramètres, ce qui nous oblige donc à utiliser des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet a été calculé à l’aide d’outils statistiques pour limiter au maximum le nombre d’animaux en permettant l’obtention de résultats statiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de limiter leurs stress. Lors de la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et recevront des anesthésiques locaux pour gérer la douleur. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de surveiller leur bien-être et de surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Les plaies seront mesurées tous les jours pour contrôler la vitesse de cicatrisation et l’état général de celles-ci (propreté, aspect...). Les pansements recouvrant la plaie seront changés tous les jours afin de limiter les risques d’infection. Toutes ces mesures ainsi que le nettoyage de la plaie nécessitant d’anesthésier les souris, elles seront espacées d’au moins deux jours si les premières expériences montrent que cela est possible. Une grille de score a été établie afin d’évaluer quotidiennement l’état des souris et des points limites adaptés ont été définis. Si la souris présente des signes de douleur de la buprénorphine sera administrée. Si une infection de la peau est détectée, celle-ci sera d’abord traitée à l’aide d’antibiotique et d’antiseptique, ce qui ne devrait pas impacter le processus de fermeture de la plaie. Si aucune amélioration ou à l’inverse qu’une aggravation de l’aspect de la plaie est observée, cela constitue un point limite. Ce suivi des souris s’applique à toute procédure.

Choix des espèces

Le rôle de la sénescence dans la réparation tissulaire a été bien décrit chez la souris. Les mécanismes de sénescence sont similaires chez la souris et l’homme. En plus, des données de notre laboratoire montrent que le mécanisme de sénescence induit par la protéine d’intérêt est conservée chez les cellules de souris comme chez les cellules humaines. De plus, le modèle d’excision cutanée murin utilisé dans ce projet a été montré comme mimant le processus de réparation cutanée humain, ce qui pourrait déboucher sur des données applicables cliniquement.

Toutes tuées pour prélever leurs organes, 80 souris juvéniles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante d'entre elles reçoivent pendant cinq semaines un régime pauvre en protéines qui reproduit la malnutrition infantile. Chaque souris subit une biopsie du bout de la queue, cinq anesthésies pour la mesure de taille, un jeûne de six heures suivi d'un gavage de glucose, puis dix prélèvements de sang à la queue après incision et deux ponctions de 50 microlitres dans la veine sous-mandibulaire. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un "organisme dans son entier" en contexte de malnutrition, et conclut à la "nécessité" de l'expérimentation animale.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur à travers le monde. Elle entraîne un retard de croissance, ainsi qu’un métabolisme altéré (problèmes de glycémie et de production d'insuline par exemple) chez les enfants. Des études récentes ont suggéré que la réponse à la malnutrition infantile pourrait être différente en fonction du sexe, les garçons étant plus susceptibles d'être malnutris que les filles. En accord avec cela, des études précédentes ont permis de montrer qu’un régime alimentaire mimant la malnutrition impactait différemment les souris juvéniles mâles et femelles. De plus, une hormone produite par le foie en réponse à un manque de protéines dans l’alimentation est différemment affectée par la malnutrition chez les mâles et les femelles juvéniles. Cela incite donc à comprendre plus précisément les mécanismes liés à ces différences entre les sexes dans la réponse à la malnutrition juvénile, et en particulier à explorer le rôle potentiel de cette hormone. En combinant l’utilisation de souris ne produisant pas cette hormone avec un modèle de régime alimentaire faible en protéines et induisant une malnutrition, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de cette hormone dans la réponse différentielle des mâles et des femelles à la malnutrition juvénile.

Bénéfices attendus

Les altérations physiologiques induites pas la malnutrition dans un contexte juvénile sont encore mal connues, de même que les différences entre les sexes dans ce contexte. Ce projet permettra d’élucider le rôle d’une hormone produite par le foie dans les adaptations physiologiques à la malnutrition juvénile, ainsi que dans la réponse différentielle entre les sexes. Cela permettra de comprendre comment optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition juvénile, et notamment d’adapter le traitement en fonction du sexe.

Procédures

8 lots de 10 souris seront utilisés dans cette procédure. 4 lots seront nourris avec un régime contrôle et 4 lots de souris seront soumis à un régime nutritionnel pauvre en protéines, mimant la malnutrition infantile, pendant 5 semaines. Tous les lots de souris seront mesurés chaque semaine sous anesthésie générale pendant 3 minutes puis pesés (< 1 min) pendant 5 semaines. Pour faire des analyses génétiques, toutes les souris auront un prélèvement d’une biopsie au bout de la queue sous anesthésie (3 minutes d’anesthésie, moins de 5 secondes de prélèvement). Dans le cadre d’un test métabolique, toutes les souris seront mises à jeun pendant 6 heures puis gavées avec du glucose, suite à une contention (environ 10 secondes). Elles auront ensuite une incision à la queue (environ 1 seconde) puis subiront 7 prélèvements à la queue d’environ 3 µL de sang (environ 5 secondes par prélèvement) et trois prélèvements additionnels à la queue d’environ 20 µL par prélèvement pour mesurer le taux d’insuline (environ 1 minute). A deux autres moments de la procédure, toutes les souris auront un prélèvement de 50 µL de sang en veine sous-mandibulaire sous anesthésie (3 minutes d’anesthésie, 30 secondes de prélèvement).

Impact sur les animaux

La biopsie du bout de la queue pour l’analyse génétique induira une douleur ainsi qu’un léger stress. La mesure de la taille des animaux (une fois par semaine pendant 5 semaines) n’induira qu’un léger stress lors de l’induction de l’anesthésie. Les pesées et la caractérisation de la maturation sexuelle induiront un léger stress associé à la contention de l’animal. Le jeûne de 6 heures induit un stress léger sur la souris. Le test de tolérance au glucose induira un stress modéré lié à la contention et au gavage des souris, ainsi qu'une douleur liée à l'incision d’un bout de queue d’environ 1 mm et au prélèvement de gouttes de sang au niveau de la queue. Le gavage des animaux ne devrait entraîner qu’un léger stress lié à la contention et un inconfort lors du gavage, ainsi que la possibilité d’irritation ou de fausse route. Les deux prélèvements de sang en veine sous-mandibulaire sous anesthésie générale induiront un stress modéré ainsi qu’une douleur.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires et à l’invalidation d’un gène, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Chaque groupe expérimental contient 10 animaux. Des tests statistiques seront utilisés. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie et pourront être réutilisées.

Raffinement

La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine. Les animaux seront suivis du lundi au dimanche, du lundi au vendredi par les expérimentateurs habituels, et les week-ends par une astreinte formée et expérimentée. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Des points limites suffisamment prédictifs seront établis pour anticiper tout stress et toute souffrance animale. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental, et le test de tolérance au glucose oral ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. L’invalidation du gène étudié dans le foie a été décrit dans la littérature et n’entraîne pas de modification du bien-être animal (phénotype non délétère).

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de sa physiologie, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin d’étudier l’effet d’une hormone dans une étude nutritionnelle. * L'objectif du projet est d'étudier les effets d’une invalidation d’un gène sur le métabolisme et la puberté pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour la croissance, la maturation sexuelle et la maturation métabolique.

Infectées par instillation directe dans la trachée sous anesthésie, 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent ensuite neuf à dix-sept fois en tube de contention pour une mesure de composition corporelle, et quatre à neuf tests de tolérance au glucose, chacun précédé de cinq heures sans nourriture et suivi de sept prélèvements de sang à la queue. L'objectif est de mesurer ce qu'une infection bronchique chronique de trente à quatre-vingt-dix jours fait aux os, aux muscles et au métabolisme du glucose. Le porteur écrit que la perte de poids n'excède jamais 5 % et que les souris reprennent une activité normale en deux jours, tout en indiquant que l'infection peut se compliquer du décès de l'animal dans moins de 5 % des cas.

Objectifs

Notre projet a pour but d’étudier les effets de l’infection bronchique chronique au niveau extra-pulmonaire. Les infections pulmonaires chroniques sont une complication fréquente des maladies bronchiques chroniques et ont un lourd impact pronostic. Elles sont responsables d’un déclin plus rapide et plus marqué de la fonction respiratoire et d’une augmentation du nombre d’exacerbations respiratoires (aggravation aigue de la maladie chronique). De plus, les maladies respiratoires chroniques s'accompagnent souvent de comorbidités ou de manifestations extra-respiratoires telles que l'ostéoporose, la perte de muscles, la dénutrition, le diabète, et les maladies cardiovasculaires. Le rôle de l’infection pulmonaire chronique dans la survenue de ces manifestations extra-respiratoires n’est à ce jour pas connu et n’a jamais fait l’objet d’études spécifiques dans le cadre de modèles animaux. Le modèle murin d’infection bronchopulmonaire chronique développé dans notre laboratoire est particulièrement adapté à la réalisation d'études longitudinales. L’objectif de ce projet est donc d’étudier les effets de l'infection bronchique chronique sur la composition corporelle et musculaire, l'architecture osseuse, l'inflammation sanguine, et le métabolisme du glucose.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à faire progresser les connaissances scientifiques afin de générer des bénéfices substantiels en santé humaine. Les infections pulmonaires chroniques, complications fréquentes des maladies bronchiques chroniques, ont un lourd impact sur la santé des patients et sont souvent associées à des comorbidités graves comme l'ostéoporose, la sarcopénie, la dénutrition, le diabète et les maladies cardiovasculaires. Cependant, le lien entre ces manifestations extra-respiratoires et les infections pulmonaires chroniques demeure largement inexploité scientifiquement, notamment dans les modèles animaux. Les bénéfices attendus de cette recherche sont multiples. Premièrement, elle permettra d'élucider les mécanismes reliant les infections bronchiques chroniques aux anomalies musculo-squelettiques et métaboliques, ainsi qu'à l'inflammation systémique. Ces connaissances pourraient conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter ou prévenir ces complications chez les patients atteints de maladies bronchiques chroniques. Une meilleure compréhension de l'interaction entre l'infection chronique et le métabolisme du glucose pourrait offrir des pistes pour des interventions visant à réduire le risque de diabète chez ces patients. Deuxièmement, cette étude pourrait modifier les pratiques cliniques en améliorant le suivi et la prise en charge des patients. L'identification de biomarqueurs spécifiques d'inflammation systémique et d'infection chronique permettrait une meilleure surveillance de la progression de la maladie et d'ajuster les traitements en conséquence, ralentissant ainsi la progression des comorbidités et améliorant la qualité de vie des patients. Enfin, ce projet a le potentiel d'enrichir la littérature scientifique en fournissant des données précises et inédites sur les effets systémiques des infections pulmonaires chroniques. En résumé, ce projet permettra d'approfondir notre compréhension des infections pulmonaires chroniques et de leurs effets systémiques, tout en fournissant des bases solides pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes, avec des bénéfices à long terme pour les patients et le système de santé.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions. Tout d'abord, ils seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) puis infectés par vvoie intra-trachéale directe. Cette intervention sera réalisée une fois pour chaque animal et devrait durer quelques minutes (anesthésie + infection). Des mesures de la composition corporelle des souris seront réalisées de manière répétée tout au long de l'étude (9, 13 ou 17 mesures selon le temps d’infection qui sera de 30, 60 ou 90 jours). Cette procédure implique la pesée des souris suivie d'une analyse par scanner à résonance magnétique nucléaire pour évaluer la masse grasse et la masse maigre de chaque animal. Le scan se fait en contention dans un tube adapté pour les rongeurs pendant 3 minutes (animal vigile). Enfin, seront effectués des tests métaboliques tels que l'IPGTT (test de tolérance au glucose intrapéritonéal). Pour évaluer les profils glycémique et insulinémique après une charge en glucose (IPGTT), les souris subiront une restriction alimentaire de 5 heures (de 9h à 14h), puis recevront du glucose en fonction de leur poids. Les mesures de glycémie seront prises à t=0’, 5’, 10’, 15’, 30’, 60’ et 120’ (prélèvement sanguin de 5 microlitres). Des prélèvements sanguins (environ 40 microlitres) seront effectués à t=0’, 15’, 30’ et 60’ pour doser l’insuline. La glycémie est mesurée en premier pour éviter tout impact de stress sur la valeur initiale. Durant tout le test, les animaux ont accès uniquement à l’eau, et la nourriture leur est remise à la fin du test. Les animaux sont laissés au repos pendant au moins une semaine entre chaque test. Ce test sera réalisé 4, 6 ou 9 fois sur chaque animal selon le temps d’infection (30, 60 ou 90 jours). Enfin, au terme de l'infection, les animaux seront mis à mort selon un protocole établi, impliquant une injection intrapéritonéale de d'anesthésiques et d'analgésiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux dans le cadre de ce projet sont : 1° Stress et inconfort liés aux manipulations : Les animaux seront soumis à des mesures régulières de poids et de composition corporelle, ainsi qu'à des prélèvements sanguins, ce qui peut causer du stress et de l'inconfort. 2° L'infection bronchique peut causer un stress initial (manipulation, anesthésie) et des difficultés respiratoires temporaires (résolutives en moins de 30 minutes suivant l'instillation généralement). Dans de rares cas (

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort au terme des différents temps expérimentaux.

Remplacement

Dans le domaine de la recherche en santé respiratoire, les alternatives non animales les plus fréquemment utilisées sont les modèles in vitro (cultures cellulaires) et les organoïdes. Ces méthodes présentent cependant des limitations significatives lorsqu’il s’agit d’étudier des systèmes complexes comme par exemple les réponses physiopathologiques mises en jeu au niveau systémique en réponse à une infection pulmonaire chronique. En effet, les modèles in vitro et les organoïdes ne permettent pas de reproduire de manière fidèle les interactions entre différents systèmes corporels ni de simuler l'inflammation systémique et les réponses immunitaires globales de l'organisme. Par conséquent, l'utilisation d'animaux vivants, en l'occurrence des modèles murins d'infection bronchopulmonaire chronique, est essentielle pour atteindre les objectifs de ce projet. Les souris offrent un modèle biologique pertinent en raison de leurs similarités physiologiques et immunologiques avec les humains, ce qui permet une évaluation détaillée et intégrée des effets systémiques des infections chroniques. Cela inclut l'étude des interactions entre l'infection pulmonaire et les réponses musculo-squelettiques, métaboliques et inflammatoires à l'échelle de l'organisme entier. En utilisant des modèles murins, nous pourrons obtenir des données précises et transposables, cruciales pour comprendre les mécanismes physiopathologiques et développer des stratégies thérapeutiques efficaces pour les patients. Enfin, les règles de l’éthique médicale ne nous permettent pas de réaliser ces études sur l’homme.

Réduction

Grâce à nos expériences passées sur des modèles animaux similaires, nous avons déterminé qu'un groupe de 8 animaux est généralement suffisant pour obtenir des résultats statistiques robustes. Toutefois, en raison de la variabilité inhérente à la qualité des instillations et du risque de décès par insuffisance respiratoire aiguë lors de ces procédures, nous avons décidé d'augmenter la taille des groupes à 10 souris. Cette approche a été validée par des études antérieures. Les autres mesures prises pour appliquer le principe de réduction ont été les suivantes : 1. Optimisation des techniques d’instillation : Nous avons raffiné et standardisé nos techniques d’instillation endotrachéale pour maximiser la consistance et minimiser les pertes animales. Une formation rigoureuse et continue des opérateurs est mise en place pour garantir la qualité des procédures. 2. Optimisation et maximisation du nombre et des types de prélèvement afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires aux différentes analyses du projet. 3. Analyse en temps réel : L’utilisation d’analyses statistiques en temps réel permettra d'arrêter l’expérience dès que les données suffisantes auront été recueillies, évitant l’utilisation de plus d'animaux que nécessaire. Analyses statistiques : • Études de survie : Les courbes de Kaplan-Meier seront utilisées pour analyser la survie des animaux, permettant une visualisation claire des différences potentielles entre les groupes. • Données quantitatives : Les données seront initialement analysées à l’aide du test de Kruskal-Wallis, qui est adapté aux échantillons non paramétriques et permet de détecter les différences globales entre les groupes. • Comparaisons multiples : Si le test de Kruskal-Wallis révèle une différence significative, des comparaisons multiples seront effectuées à l’aide du test de Dunns, pour identifier spécifiquement quelles paires de groupes diffèrent.

Raffinement

Toutes les procédures invasives seront effectuées par un expérimentateur entraîné. L’instillation des billes se fera sous anesthésie générale. Nous prévoyons une surveillance clinique quotidienne des animaux dans les 5 jours suivant l'instillation. Un score de douleur et de confort respiratoire sera établi en observant quotidiennement le comportement des animaux. Si nécessaire une analgésie sera mise en place ou si ce score est considéré comme trop important, l’animal sera mis à mort. Les souris seront hébergées à 5 par cages au maximum et du matériel d’enrichissement (nidification, jeux…) sera mis à disposition dans les cages. Elles bénéficieront d’une période d’adaptation minimale de 7 jours entre leur arrivée dans l’animalerie et le début des expérimentations. Tout animal présentant des signes de détresse respiratoire ou moribond sera mis à mort.

Choix des espèces

L'utilisation des souris dans ce projet présente plusieurs avantages significatifs. Leur petite taille facilite leur hébergement en animalerie, permettant de maintenir un grand nombre d'animaux dans un espace réduit tout en assurant leur bien-être. Les manipulations, y compris l'anesthésie, sont relativement simples à mettre en œuvre, ce qui minimise la souffrance et l'inconfort des animaux tout au long des procédures expérimentales. La physiopathologie de l'infection broncho-pulmonaire chronique chez la souris est remarquablement similaire à celle observée chez l'homme. Cette similitude permet une transposition pertinente des résultats aux conditions humaines, ce qui est crucial pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus, notre modèle d’infection broncho-pulmonaire chronique chez la souris a été validé par la communauté scientifique, en particulier dans le cadre de la recherche sur la mucoviscidose (Martin et al., European Respiratory Journal, 2011). L'utilisation continue de ce modèle nous permettra de fournir des données novatrices sur les infections respiratoires chroniques et leurs effets systémiques. En résumé, les souris représentent un modèle idéal pour notre étude en raison de leur gestion pratique, de la simplicité des procédures expérimentales, et de leur pertinence biologique pour comprendre les mécanismes des infections broncho-pulmonaires chroniques et leurs comorbidités associées.

Des cellules tumorales leur sont injectées, puis la tumeur est mesurée au pied à coulisse une à deux fois par semaine. Jusqu'à 14 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent deux injections de traitement par semaine pendant neuf semaines, une injection de produit d'imagerie dix minutes avant chaque séance, et un prélèvement sanguin sous anesthésie toutes les deux semaines, l'objet du projet étant de tester des vésicules extracellulaires modifiées comme piste d'immunothérapie. Le porteur décrit pourtant des modèles qui "nécessitent un minimum d'intervention" et ne demandent "pas l'administration d'anti-douleurs", chez des souris porteuses de tumeurs pendant neuf semaines.

Objectifs

Le cancer est actuellement la deuxième cause principale de décès à l'échelle mondiale. L'immunothérapie a révolutionné le traitement de certains patients mais dans environ 70% des cas, cette approche s’avère inefficace. Pour améliorer les traitements, il est essentiel de comprendre comment le cancer communique avec notre système immunitaire. Une partie de cette communication se fait via de petites vésicules lipidiques appelées "vésicules extracellulaires", porteuses d’informations génétiques et protéiques, sécrétées par les cellules tumorales mais aussi les cellules du microenvironnement tumoral. Elles peuvent moduler la croissance des tumeurs, notamment en interagissant avec la surface des cellules immunitaires ou après capture par ces mêmes cellules. Il existe une grande variété de vésicules, certaines semblent aider le cancer à se développer en empêchant le système immunitaire de reconnaître le cancer, alors que d’autres semblent aider l’organisme et son système immunitaire à se débarrasser du cancer. Il est nécessaire de comprendre quelles vésicules renferment l’activité anti-tumorale et quelles vésicules contiennent l’activité pro-tumorale, afin de pouvoir créer de nouveaux traitements anti-cancéreux efficaces. De récentes études ont montré qu’on peut changer la composition des vésicules extracellulaires en modifiant les cellules qui les sécrètent. Nous avons identifié quelques molécules cibles ou produits pharmacologiques, qui changent les propriétés des vésicules extracellulaires in vitro, en particulier quand elles interagissent avec des cellules du système immunitaire. Nous devons donc évaluer l’effet in vivo de ces vésicules modifiées ou de leur sécrétion in situ sur la croissance des tumeurs et leur reconnaissance, voire leur destruction par le système immunitaire. L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau mode de communication entre les cellules cancéreuses et le système immunitaire pour identifier des vésicules extracellulaires capables de diminuer la croissance et la progression des tumeurs. Il pourrait ouvrir la voie au développement de futures thérapies anticancéreuses utilisant ces vésicules modifiées ou leur sécrétion locale.

Bénéfices attendus

Le cancer est la seconde cause de décès dans le monde, malgré les récentes innovations thérapeutiques. Les immunothérapies visant à reprogrammer le système immunitaire contre le cancer présentent une efficacité spectaculaire chez certains patients, mais très variable et le bénéfice n’est observé que sur un nombre limité de patients. Il est donc essentiel de développer de nouvelles approches ou combinaisons d’approches pour bénéficier à un plus grand nombre de patients. Les vésicules extracellulaires permettent une communication entre les cellules tumorales et le système immunitaire, et peuvent aussi interférer avec les traitements d’immunothérapies. Ce projet étudie l’utilisation de vésicules extracellulaires modifiées par les chercheurs, comme nouveaux outils de thérapie anti-tumorale, permettant d’augmenter l’activité du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Il découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Avant d'envisager toute application clinique ou thérapeutique chez l'Homme, l’étude de ce processus dans un modèle de tumeur in situ chez la souris est une étape cruciale. Nous prévoyons d'atteindre ces objectifs dans les cinq prochaines années. Les résultats que nous recueillerons grâce à ce projet peuvent ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques utilisant la modification de la sécrétion des vésicules extracellulaires par les chercheurs, seule ou en combinaison avec d’autres traitements.

Procédures

Des cellules tumorales seront injectées aux souris vigiles (1 fois par expérience – durée du geste inf à 10 sec). Les animaux seront suivis, à raison de 1 à 2 fois par semaine soit sur animaux vigiles pour mesurer la tumeur au pied à coulisse soit par imagerie sur animaux anesthésiés (durée de l’anesthésie 10 min). Dix minutes avant chaque séance d’imagerie, les animaux seront injectés avec un produit spécifique pour l’imagerie (durée du geste inf à 10sec) Certains animaux recevront également des traitements par injection à raison de 2 fois par semaine pendant 9 semaines maximum (durée du geste inf à 10 sec) ou à raison de 2 injections au cours de l’expérience (9 semaines max) (durée du geste inf à 10 sec) Un prélèvement sanguin est effectué une fois toutes les 2 semaines sur les animaux anesthésiés(durée de l’anesthésie inf à 5 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales seront celles liées à injection elle-même (gêne de courte durée et de faible intensité due à l’introduction d’une aiguille). Suite à ces injections les animaux développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée). Ces types de traitement n’induisent pas d’effets secondaires négatifs connus. Pour le suivi des réponses immunitaires, des prélèvements sanguins pourront être effectués. Ces prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés pour réduire le stress lié à la contention et la douleur liée à la piqûre elle-même.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture, ayant permis la caractérisation des vésicules extracellulaires modifiées et de leur mode d’interaction avec les cellules cibles, tumorales et immunitaires. Le projet, ayant pour objectif final d’identifier des traitements ciblant les vésicules extracellulaires permettant l’activation des réponses immunes anti-tumorales, nécessite l’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires, et de l’organisme entier. A notre connaissance, aucun modèle in vitro (co-culture, organoïde) ou in silico ne peut se substituer à un modèle animal. Le modèle murin est le plus adapté compte tenu de l’organisation de son système immunitaire, proche de celle de l’Homme.

Réduction

1. Nous utiliserons de façon générale 10 souris par groupe expérimental. Ce nombre prend en compte la variabilité intrinsèque à nos modèles, notamment le taux d’obtention de tumeur suite à l’injection de cellules tumorales. Il se base aussi sur nos connaissances de ces modèles tumoraux et de leur cinétique et variabilité de développement. Les lignées tumorales modifiées pour sécréter des vésicules extracellulaires différentes, et l’absence de conséquence directe sur la multiplication des cellules ont toutes été validées in vitro. 2. le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe sera défini à l’aide d’outils statistiques. 3. Pour chaque procédure et chaque molécule, 2 expériences montrant une absence d’effet sur la croissance tumorale seront utilisées comme point d’arrêt de l’expérience, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. 4. Si les 2 premières modifications testées s’avèrent avoir l’effet recherché, nous ne continuerons pas avec les autres molécules. Le nombre total d’animaux utilisés sera réduit de 14160 (nombre maximum) pour 5 molécules testées à 7446 pour 2 molécules.

Raffinement

Les modèles développés pour ce projet nécessitent un minimum d’intervention sur les souris, réduisant le stress et la douleur potentielle, et ne nécessitent pas l’administration d’anti-douleurs. Les animaux greffés seront contrôlés deux à trois fois par semaine afin de vérifier que le développement de la tumeur n’ait pas d’effet notable sur le bien-être général, ni sur leur poids (en prenant en compte le poids additionnel de la tumeur). Une grille de score sera utilisée pour évaluer leur état de manière objective. Si un état général compromis est observé, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Comparé à d’autre modèles animaux, la souris est le modèle de choix pour les recherches en immunologie et cancérologie pour sa proximité avec l’homme, et nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris. Les modèles de tumeurs transplantées sont de plus couramment utilisés chez cette espèce Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 16 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.