Oncologie

458 souris pour une injection unique sous la plante de la patte chacune, suivie de tests de douleur mécanique et thermique dans les vingt-quatre heures. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis disséquées pour prélever la patte, les ganglions rachidiens et la moelle épinière. Le porteur explique que le seuil de douleur est "repéré par l'animal lui-même", le test s'arrêtant au retrait de la patte. L'objet réel est de savoir si des vésicules issues de tumeurs pancréatiques rendent les nerfs plus sensibles, question posée loin en amont de toute application pour les malades.

Objectifs

Le cancer du pancréas est de très mauvais pronostic et douloureux. Nous pensons que cette douleur est causée par des substances libérées par les cellules cancéreuses. Ces substances peuvent rendre les nerfs plus sensibles à la douleur et favoriser leur croissance dans la tumeur, mais leur nature exacte demeure inconnue. Nous proposons d’étudier le rôle potentiel des petites vésicules extracellulaires (appelées EVs) dans ce processus. Notre objectif est de caractériser l’impact des EVs produites par les cellules cancéreuses pancréatiques sur les réseaux nerveux et la douleur associée au cancer chez les souris. Pour cela, nous voulons observer si l'injection de ces EVs dans les pattes des souris provoque : 1/ Une sensibilité accrue à la douleur 2/ Des changements dans l’innervation de la patte 3/ Une activation des circuits neuronaux impliqués dans la douleur.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux régulant l’innervation tumorale et la génération de la douleur dans le cancer. A plus long terme, les résultats pourraient avoir des applications médicales concrètes dans le traitement du cancer et de la douleur afin d’améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Les animaux auront une injection intraplantaire unique avant de subir les tests de comportements pour évaluer la douleur.

Impact sur les animaux

Les injections intraplantaires peuvent causer de la douleur suite à la pénétration de la peau avec l’aiguille au moment de l’injection. Les souris peuvent donc développer un stress, pour éviter cela, elles seront anesthésiées sous isoflurane. Pour les tests de comportement, le stimulus mécanique ou thermique peut provoquer de la douleur qui sera visualisée par un retrait de la patte de l’animal. Le point limite (seuil nociceptif) est donc repéré par l’animal lui-même. Le test est arrêté au retrait de la patte de l’animal donc on ne dépassera pas le seuil. Les expériences sont arrêtées au maximum à 24h post-injection. Une grille de score servira de repère pour vérifier l’état de l’animal.

Devenir

Ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures. Par conséquent, à la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort puis disséqués pour récupérer différents organes (patte, les ganglions de la racine dorsale et la moelle épinière) afin d’être analysés.

Remplacement

Notre recherche vise à comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de la douleur associée au cancer. Nous explorons l'idée que les petites vésicules (EVs) provenant des tumeurs pancréatiques pourraient causer une sensibilité accrue à la douleur en modifiant les nerfs dans la tumeur. Pour étudier cette question, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. Ainsi, l’observation du comportement animal est nécessaire pour comprendre comment la douleur est perçue et transmise au cerveau. Cette approche est d’autant plus pertinente que des différences comportementales entre mâles et femelles peuvent également influencer la façon dont les signaux sensoriels sont traités à différents niveaux dans le corps. En résumé, l'utilisation de souris est essentielle pour étudier les causes pathophysiologiques de la douleur cancéreuse et mener à bien notre projet de recherche.

Réduction

Nous mettrons en place des stratégies pour limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires tout en collectant suffisamment de données pour répondre à nos questions de recherche. Cela implique de définir précisément nos protocoles comportementaux et de choisir judicieusement nos contrôles. Nous utiliserons également des outils statistiques pour estimer le nombre optimal d'animaux nécessaires. En contrôlant les paramètres environnementaux et en surveillant la santé des animaux, nous réduirons la variabilité des résultats expérimentaux et, par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ces procédures sont bien établies dans notre institut et nos chercheurs sont expérimentés dans leur mise en œuvre et dans l'évaluation de l'impact sur le bien-être des animaux. En optimisant notre plan expérimental et en analysant attentivement le nombre d'animaux requis, nous minimisons ainsi l'utilisation d'animaux tout en maintenant la qualité et la validité de nos résultats scientifiques.

Raffinement

Les souris utilisées dans notre projet seront élevées en groupes sociaux et bénéficieront d'un environnement enrichi avec du coton et/ou un dôme pour assurer leur bien-être et favoriser un comportement normal, réduisant ainsi au maximum leur stress. L'élevage des souris est effectué dans notre établissement agréé par une équipe de cinq personnes dédiées à leur organisation et leur entretien. Nous contrôlons quotidiennement la santé et les conditions environnementales des animaux pour assurer leur bien-être. Les procédures expérimentales seront minutieusement planifiées, y compris la disponibilité des locaux, du matériel et la période d'acclimatation des animaux, afin de minimiser leur stress et d'assurer la fiabilité des résultats. Avant les tests comportementaux, les souris seront habituées pendant 45 minutes dans l'enceinte pour s'adapter à leur environnement. Nous établirons également des points limites les plus précoces possibles en fonction des tests comportementaux utilisés. Toutes ces mesures sont mises en place dans le but de réduire, voire d'éliminer, la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. Travaillant sur la physiologie d’animaux adultes, nos tests comportementaux et nos analyses moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines.

Gavées jeunes et vigiles avec une bactérie isolée de patients atteints de cancer colorectal, 576 souris génétiquement prédisposées développent des tumeurs coliques jusqu'à leur mise à mort, 65 jours après le gavage. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend un amaigrissement, une anémie visible aux pattes blanches, des phases de diarrhée ou de constipation, du sang dans les selles et un prolapsus, suivis par un système de score de douleur. Il décrit les actes infligés en trois lignes, "chaque geste technique dure quelques secondes", sans préciser le nombre de prélèvements sanguins ni la dose bactérienne administrée.

Objectifs

Ce projet a pour but de poursuivre les études sur les mécanismes d’action d’une bactérie capable de sécréter une toxine,, dans la carcinogénèse colorectale. En effet, l’infection par cette bactérie isolée de patients atteints de cancer colorectal accélère le développement tumoral dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer .

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus pourraient permettre de mieux comprendre les mécanismes de l'interaction bactéries-hôtes sur la carcinogénèse et d'étudier les voies de signalisation cellulaires/moléculaires impactées. A long terme, les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant la colonisation bactérienne

Procédures

Chaque geste technique dure quelques secondes et est réalisé par un personnel formé. Des prélèvementsde sang sont réalisés à différent temps sous anesthésie gazeuse . Un gavage est réalisé sur souris vigiles jeunes.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables liés au développement tumoral et à l'infection sont attendu L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal durant toute la durée de l’expérimentation (de la naissance à la mise à la mort, soit de J-36 (naissance) à J65 (mise à mort), J0 étant le jour de gavage). Une baisse d’activité, de locomotion, une perte de poil, une posture voutée, une anémie (pattes blanches) et un amaigrissement sont attendus. Au niveau digestif, l’expérimentateur pourra également observer des phases de diarrhée ou de constipation, un hyper toilettage anal ou à l’inverse un orifice souillé, du sang dans les selles et un prolapsus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort

Remplacement

L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n'existe aucuns modèles d'infections chroniques sur cellules.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure ou cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité du modèle, de la colonisation bactérienne post gavage et de son maintien au cours du temps. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Le nombre de 8 souris par lot permettra donc d’analyser statistiquement les résultats de colonisation bactérienne, de perméabilité intestinale et le développement tumoral observées dans les différents lots. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d’abord un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau / de nourriture et observera le comportement général de l’animal (activité, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, sang, anémie…etc). Cela permettra de repérer d’éventuelle anomalies comportementales et de traiter rapidement tous signes de douleurs par des antalgiques fort, utilisés dans le traitement des douleurs cancéreuses. Enfin, si les douleurs ne sont pas soulagées par les antalgiques, une mise à mort anticipées de l'animale sera réalisée. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de score et le suivi des animaux sera réalisé par une personne formée en interne et désignée compétente au suivi de ce modèle murin prédisposé à développer des tumeurs.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l’homme. En effet, ce modèle animal présente plusieurs avantages pour l’étude du développement tumoral : -La mutation du gène est retrouvée dans 80% des cancers colorectaux chez l’homme -Les souris développent spontanément des tumeurs au niveau ducôlon -Il est représentatif des relations entre cellules tumorales et cellules de l’environnement tumoral -Il s’agit du modèle le plus proche de la physiologie humaine et le plus représentatif de l’interaction entre microbiote et tube digestif. Également, ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur les questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal. De plus, nos animaleries sont adaptées à la prise en charge de ce type d’animaux. Le matériel utilisé est conforme aux règles du bien-être animal (cages, enrichissements, température, cycle jour/nuit) et le personnel a suivi une formation adaptée à la gestion et à la prise en charge de ces animaux. L’étude sera réalisée chez les souris femelles adultes. Les animaux seront gavés à l'âge de 6semaines (20-25 g). L’objectif est de réaliser l’expérience sur des animaux adultes et suffisamment jeunes puisque la durée totale de l’expérimentation est estimée à 50 jours

Piégées au sol, transportées dans un sac, puis anesthésiées de dix à trente minutes, 650 marmottes alpines subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À la première capture de leur vie, elles reçoivent un transpondeur et des marques auriculaires et subissent un prélèvement de peau, puis chaque année des prélèvements de poils, de sang et, pour les mâles matures, de sperme obtenu par électrostimulation en dix à vingt minutes. Le porteur signale un risque d'hyperthermie potentiellement fatale quand un animal reste piégé trop longtemps par forte chaleur, sur un site où aucun arbre ne fait de l'ombre, et le compense par des ombrelles posées sur les cages et de l'eau versée sur l'animal. Toutes sont relâchées près de leur terrier après environ deux heures, avec le risque, pour une marmotte dominante trop longtemps absente, qu'un rival ait pris son territoire et tué les marmottons.

Objectifs

Les suivis à long-termes de populations d’animaux sauvages constituent aujourd’hui une ressource scientifique précieuse pour répondre à de nombreuses questions concernant l’écologie et la biologie évolutive. L’objectif du présent programme de recherche est la perpétuation d’un suivi démographique, phénotypique, génétique, physiologique d’une population de marmotte Alpine (Marmota marmota). La marmotte Alpine est une espèce sociale, à reproduction despotique (seul le couple dominant se reproduit) et hibernante. Ces caractéristiques biologiques en font une espèce modèle originale pour les mammifères et, de manière plus générale, pour les espèces qui vivent en groupes structurés et stables. Nous souhaitons mieux comprendre le rôle de la vie en groupe et de la socialité sur l’écologie des populations et de mettre en évidence la manière dont la variabilité environnementale (par exemple les changements globaux) affecte le rapport coût – bénéfice de la vie en groupe. Nous étudierons également les variations de la sex-ratio des jeunes en réponses aux changements globaux. Cela passe notamment par une quantification de la variabilité inter- et intra-individuelle de la proportion relative de spermatozoïdes avec un chromosome Y versus X.

Bénéfices attendus

Nous testerons l’hypothèse que les changements climatiques ont des répercussions majeures sur la socialité des individus, qui deviennent en quelque sorte plus égoïstes, en préférant quitter le groupe de naissance que de rester et aider à l’élevage des marmottons frères et sœurs. Les résultats attendus auront des implications pour les autres espèces sociales, y compris l’homme face aux changements globaux. Enfin, déjà fragilisée par le changement climatique, la marmotte Alpine est chassée à l’automne dans certains départements du sud-est de la France. La chasse à la marmotte semble assez marginale, mais les effets négatifs du changement climatique pourraient pousser nos décideurs politiques à en interdire la pratique. Notre projet apportera une meilleure compréhension du rôle des pères dans l’allocation selon les sexes en comparant la proportion de spermatozoïdes avec un chromosome X versus Y. La recherche sur l’allocation selon les sexes s'est concentrée jusqu’ici presque exclusivement sur le rôle de la mère alors que les parents peuvent avoir des intérêts divergents. Quelques études récentes ont montré une proportion déséquilibrée des chromosomes sexuels X et Y dans les échantillons de sperme de bovins domestiques et dans les populations humaines affectées par des polluants, ce qui rend difficile l’extrapolation des résultats à des populations sauvages comme la marmotte alpine. L’importance du rôle des pères reste à démontrer, mais ses multiples implications potentielles pour l’évolution de l’allocation selon les sexes et les conflits parentaux invitent à un surcroît d’attention.

Procédures

L’ensemble de ces prélèvements est réalisé après induction d’une anesthésie générale (~ de10 à 30 minutes): - Prélèvements de tissu cutané, injection d’un transpondeur et pose de marques auriculaires lors de la première capture dans la vie de l’animal (10 minutes) ; - Prélèvements de poils à chaque première capture de l’année (1 minute) ; - Prélèvements sanguins à chaque première capture de l’année (de 1 à 5 minutes) ; - Prélèvement de sperme chez les mâles sexuellement matures à chaque première capture de l’année (de 10 à 20 minutes) ;

Impact sur les animaux

Les principales sources de nuisance identifiées pour les marmottes sont (i) les risques de blessures superficielles, de traumatologie et le stress thermique causé par la capture (phase d’attente dans le piège puis transfert dans le sac de transport) ; La marmotte étant une espèce thermosensible avec une thermorégulation comportementale marquée (refuge dans le terrier), il existe un risque d’hyperthermie potentiellement fatal lorsqu’un animal reste piégé pendant trop longtemps lors des épisodes de forte chaleur (note : il n’y a aucun arbre sur le site d’étude). (ii) douleur et stress lors des mesures biométriques et lors des prélèvements biologiques ; (iii) le risque de déstructuration sociale par la prise de pouvoir sur un territoire par des rivaux lors de la capture d’un individu dominant. Un changement de dominance par un animal transient ou d’un territoire voisin, change la composition du groupe et induit souvent un infanticide des marmottons.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie et relâchés dans leur milieu de vie après la procédure à proximité immédiate du terrier où ils ont été capturés.

Remplacement

Notre programme de recherche sur la marmotte Alpine repose en grande partie sur l’étude des réponses individuelles et populationnelles aux variations des conditions environnementales d’origine diverse (ex : climat, phénologie de la végétation, socialité). Ces réponses sont étudiées aux niveaux comportemental, physiologique et démographique. Notre étude s’inscrit dans la lignée des suivis à long termes en écologie évolutive qui repose sur le suivi le plus long et plus exhaustif des individus au cours de leur vie en milieu naturel. Les populations de marmottes en captivité (par exemple en zoo) ne constituent pas une alternative pertinente à l’utilisation de populations sauvages lorsqu’il s’agit d’étudier le rôle de l’environnement sur la démographie et les processus évolutifs. Il n’existe donc, par essence, aucune méthode substitutive à notre protocole de recherche. Notre protocole a été réfléchi de sorte que toutes les quantités de tissus prélevées soient utilisées pour répondre à nos problématiques de recherche. Toutefois, si certains échantillons s’avéraient non utilisés (en particulier les échantillons de sperme pour lesquels nous ne pouvons pas anticiper de manière précise la quantité que nous allons collecter), les échantillons supplémentaires seront mis à disposition de notre réseau de collaboration et participent ainsi à du “remplacement” pour des projets futurs.

Réduction

Chaque année, 30 familles de marmottes Alpines sont suivies, correspondant ainsi à environ à 250 individus capturés. Ce nombre de 30 est le nombre minimal permettant d’approximer la distribution réelle de traits quantifiés dans la population par la loi normale et ainsi utiliser les outils statistiques appropriés. D’autre part, étant donnée les forts effets structurant de l’âge dans les paramètres démographiques des espèces à longue durée de vie, la description de la dynamique des populations nécessite des tailles d’échantillon substantielles d’animaux d’âge connu (donc suivis de la naissance à la mort) afin d’estimer les paramètres démographiques (survie, reproduction, dispersion). Le suivi longitudinal des animaux nous permet d’avoir des mesures répétées pour les individus et contribue ainsi à limiter le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats interprétables et fiables.

Raffinement

Nous réduisons les risques d’hyperthermie en plaçant des « ombrelles » sur le dessus des cages à pièges qui recouvrent environ la moitié de leur longueur, offrant une zone ombragée pour l’animal le temps qu’un membre de l’équipe arrive sur place. Des bouteilles d’eau sont prévues pour arroser légèrement l’animal pendant le transport quand la température de l’air est 27°C, et une vérification des pièges est faite systématiquement toutes les 30 minutes de 07:00 à 21:30, une plage horaire qui couvre l’activité journalière des marmottes. Le stress lié à la manipulation et à la contention est atténué car les animaux sont anesthésiés avant que les prises de mesures, d’échantillonnage des tissus et le marquage débutent. Les manipulations sous anesthésie sont effectuées dans un local réservé à cet effet par du personnel qualifié et le plus silencieusement possible. La durée totale entre la capture et le relâcher est en moyenne de 2 heures incluant 20 minutes de contention et de manipulation en dehors du sac de capture, mais il existe une forte variabilité individuelle dans le temps de réveil. Un temps de réveil long est risqué pour un dominant car pendant son absence un animal transient ou voisin peut tenter de prendre le contrôle de son territoire en tuant notamment les marmottons. Bien que nous limitions ce risque en plaçant un effaroucheur ou une personne sur le territoire le temps de la manipulation, cela n’est pas optimal en termes de dérangement. Ainsi en 2024, nous prévoyons d’expérimenter un nouveau protocole d’anesthésie dans le but de réduire le temps de réveil des individus et d’induire une analgésie plus puissante. Une analgésie plus puissante est mise en place pour les mâles sexuellement matures afin de limiter les possibles douleurs associées à l’électrostimulation dont la mise en place est prévue en 2024. Les protocoles d’anesthésie et d’électrostimulation seront optimisés en fonction des réponses des marmottes aux protocoles initialement définis. Nous envisageons aussi des protocoles alternatifs, comme la collecte de sperme par pharmo-induction si l’électrostimulation s’avérait trop inconfortable pour les animaux.

Choix des espèces

La marmotte Alpine (Marmota marmota) est une espèce particulièrement pertinente pour l’étude de la socialité (élevage coopératif, groupes sociaux hiérarchiques et stables), et représente un modèle biologique pour nombre d’espèces de mammifères sociaux. Sa structure sociale est bien décrite, et son comportement de territorialité et sa longévité (jusqu’à 16 ans) facilitent grandement le suivi des compositions de groupe et de leur dynamique temporelle. Ces caractéristiques biologiques permettent donc d’appréhender en détails la façon dont la vie en groupes sociaux affecte les traits d’histoire de vie et comment la socialité contraint les stratégies biodémographiques des espèces. Grâce à ce projet, nous disposons d’un jeu de données biodémographiques conséquent à l’échelle individuelle (30 ans de suivis) ainsi qu’une connaissance de nombreux facteurs environnementaux (météorologie, pathogènes…). Le recours à des populations captives ne permettrait pas de répondre aux objectifs de nos projets. Tous les stades de développement sont concernés par l’étude. La marmotte Alpine étant particulièrement longévive (longévité maximale observée sur le site de 16 ans), il est impératif de prendre en compte la structure d’âge de la population, et donc de connaître l’âge exact des animaux. A notre connaissance, la seule méthode fiable à disposition est de marquer les individus au stade juvénile (marmottons c’est-à-dire les jeunes de l’année), seule classe d’âge pouvant être déterminée à l’année près avec certitude. Ensuite, le statut social des marmottes est une variable capitale structurante les traits d’histoire de vie (conditionnant l’accès à la reproduction, la dispersion, et le taux de mortalité des individus) mais qui changent rapidement au cours d’une saison et d’une année à l’autre – ce n’est pas une variable fixe propre à chacun. Nous devons alors capturer les animaux tout au cours de leur vie pour être en mesure de décrire leur histoire de vie correctement.

Deux chirurgies, d'une heure puis d'une heure quarante-cinq, pour implanter des électrodes dans le cerveau, une électrode sous la peau du thorax et une canule dans le nez. 128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent ensuite jusqu'à trois heures par jour la tête fixée sur une roue pendant une semaine, certaines étant entraînées une à deux heures par jour pendant plusieurs mois à une tâche auditive, avec des jets d'air et des goûts amers comme stimuli aversifs. Une partie reçoit des substances qui augmentent l'anxiété ou la sensation de panique, que le porteur ne nomme pas, en indiquant seulement que la hausse du stress dure "au maximum quelques heures".

Objectifs

La perception, implicite ou explicite, que nous avons de l’état de notre corps repose sur un sens, appelé interoception. Ce sens participe à réguler nos états affectifs (émotionnels ou motivationnels) et donc affecte les décisions que nous prenons. En conséquence, une dérégulation de cette perception peut être liée à des maladies psychiatriques. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’interoception sont mal connues. Nous ne savons pas par exemple quelle région de notre cerveau représente notre fréquence cardiaque ou respiratoire et avec quelle précision. L’objectif de ce projet est d’une part d’étudier comment le cerveau représente ces informations. D’autre part, nous testerons si cette représentation est modifiée dans des conditions liées à l’anxiété ou les crises de panique. Pour ce faire nous administrerons des agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie qui augmentent ou diminuent respectivement le niveau d’anxiété ou de panique de l’animal. Finalement, nous évaluerons ci cette représentation est modifiée pendant la prise de décision. Pendant ces expériences, le nombre d’animaux nécessaire et le nombre de sessions d’enregistrement seront réduits grâce à l’utilisation de systèmes d’enregistrement de point permettant d’acquérir une grande quantité de données en peu de sessions. De plus, nous raffinerons le protocole en utilisant des traitement anesthésiques et analgésiques adaptés, administrés selon des points limites clairement établis à l’avance et évalués à l’aide de grilles d’évaluation. Nous développerons et calibrerons des méthodes d’enregistrement non-invasifs pour la respiration qui pourront aussi être utile pour la communauté plus largement. A chaque étape, puisque nous enregistrons non seulement le comportement de l’animal mais aussi son état corporel, nous disposerons d’un suivi fin et en temps réel de son état. Ce projet permettra de mieux comprendre notre capacité à percevoir notre corps et contribueront, à plus long terme, à la meilleure compréhension de la participation de notre corps aux états affectifs et à établir comment cette perception intéroceptive peut être dérégulée.

Bénéfices attendus

Il existe de nombreuses hypothèses suggérant que notre corps influence notre état émotionnel et donc les décisions que nous prenons. Ceci découle en partie de l’expérience subjective du lien très fort entre notre état émotionnel et notre corps mais également de mesures en laboratoire qui ont montré que l’état de notre corps et comment nous le percevons varie avec nos émotions. De plus lorsque cette perception du corps dérégulée, des troubles psychiatriques peuvent résulter. Celles-ci peuvent être liées à une intéroception de précision réduite (autisme, trouble du déficit de l’attention) ou hypersensible (anxiété, syndrome de l’intestin irritable). Cependant les zones cérébrales qui sous-tendent cette perception et comment elle est modifiée dans des états émotionnels normaux et pathologiques reste mal connu. Ce projet permettra d’identifier des mécanismes par lesquels le cerveau représente ce que nous percevons de notre corps (par exemple : quelle est notre fréquence cardiaque ? quelle est notre fréquence respiratoire ?). En particulier nous pourrons identifier où dans le cerveau ces informations sont représentées et avec quelles précision. De plus nous testerons si la façon dont notre cerveau représente notre corps est modifié dans deux conditions : d’une part dans des états liés aux crises de panique ou l’anxiété (grâce à l’utilisation d’agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie) et d’autre part lors de la prise de décisions difficiles suscitant des émotions. Une retombée concrète du projet sera de mieux connaître quelles régions corticales encodent l’état de notre corps. Ceci peut permettre de cibler plus efficacement les études de neuro-imagerie chez l’humain qui étudient ces déficits intéroceptifs. De plus, ces mesurer l’impact d’agents pharmacologiques utilisés dans le cas de maladies psychiatriques sur la représentation neuronale de l’état corporel. Ceci permettra d’évaluer si ces agents agissent directement sur la perception du corps, permettant de préciser leurs mécanismes d’action.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies pendant lesquelles nous implantons des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au niveau du thorax et une canule nasale. Les chirurgies durent respectivement 1h et 1h45 maximum et sont séparées d’au moins 5 jours ou plus pour que l’animal récupère un état ‘normal’ d’après notre grille d’évaluation. Tous les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement allant jusqu’à 3h par jour pendant un maximum de 7 jours. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux sont également entraînés dans une tâche auditive pendant une à deux heures par jour sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. A la fin des procédures, les animaux subissent une chirurgie sans réveil pour prélévement du cerveau.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal, surtout lors des premières sessions d’habituation. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques liés à l’anxiété ou les crises de panique. Parmi ces agents, 2 ont tendance à diminuer soit l’anxieté soit la sensation de panique . Les 2 autres ont tendence à augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Dans ce cas, nous utilisons des doses calibrées pour que l’augmentation du stress dure au maximum quelques heures. Pendant le protocole, l’animal sera soumis à de brefs stimuli légèrement aversifs (goût amer ou jet d’air) qui pourront engendrer une gêne.

Devenir

A la fin de chaque procédure, l’animal est mis à mort afin de réaliser l'analyse histologique du cerveau.

Remplacement

Le projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’interoception à l’état affectif, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue une tâche sensorielle. Finalement, chez l’animal anesthésié, l’encodage neuronal est profondément modifié et le système cardio-respiratoire dans un état très ralenti, totalement différent de l’éveil. D’éventuels résultats obtenus sous anesthésie seraient donc très difficiles à généraliser.

Réduction

Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement électrophysiologies et somatique qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaire pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Nous avons un protocole adapté à cette diminution : - L’utilisation d’électrodes implantées « en aigu » permet d’enregistrer à un endroit différent chaque jour et donc de couvrir efficacement une grande zone anatomique - Nous utiliserons des électrodes qui contiennent un grand nombres de sites d’enregistrement. Ceci augmente l’efficacité de la récolte de données.

Raffinement

Hébergement : Les animaux ont accès à un enrichissement (dôme, coton) et sont hébergés ensemble sauf s’il y a de l’agressivité entre individus dans quel cas ils peuvent être isolés. Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Pendant la chirurgie, l’état de l’animal est suivi à intervalles réguliers pour adapter le niveau d’isoflurane. De plus un analgésique systémique et une analgésique locale sont administrées avant et après l’intervention. En post-opératoire, les animaux reçoivent une analgésie supplémentaire ajouté dans l’eau de boisson ou Dietgel pendant 5 jours) et les animaux sont suivis quotidiennement. Manipulations : Les animaux seront d’abord habitués à la manipulation manuelle nécessaire pour les transporter jusqu’à l’environnement de l’expérience. Toute manipulation par la queue sera évitée. Contention en tête fixée : L’animal est habitué en augmentant progressivement les durées. De plus, il est placé sur une roue où nous avons observé des comportements divers (sommeil, course, toilettage) dans des proportions similaires à un animal libre de ces. A chaque session la respiration, l’activité cardiaque et la température sont enregistrés et le comportement de l’animal suivi par vidéo. La mesure de toutes ces variables permettra, en temps réel, de surveiller très finement l’état de l’animal. Développement de procédures raffinées : Pendant ce projet nous enregistrons la respiration avec une canule intranasale, ce qui nécessite une chirurgie invasive. Nous essayerons de raffiner ce protocole en mettant en œuvre des mesures non-invasives de la respiration : soit avec un capteur externe de pression soit par suivi vidéo en caméra thermique des narines de l’animal. La canule intranasale étant la méthode de référence donnant les informations les plus précises, nous devons d’abord calibrer les autres méthodes contre celles-ci avant d’éventuellement utiliser ces nouvelles approches moins invasives. Utilisation de statistiques adaptées : Les analyses statistiques utilisées dans cette étude seront basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux. Puisque nos méthodes permettent d’enregistrer un grand nombre de neurones par session et par animal, ceci permet d’acquérir une grande puissance statistique avec peu d’individus. Nous utiliserons des statistiques paramétriques et appariées.

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles (pas de poumons, pas de flux d’air nasal ou buccal pour les premiers, non-homéothermes pour les seconds). La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement (donc avec peu d’animaux et dans un temps d’expérience réduit) de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal (implantation aigue d’électrodes multi-sites). De plus, des développements ultérieurs de cet axe de recherche nécessiteront l’utilisation d’outils de manipulation qui reposent sur notre excellente connaissance génétique de la souris. Finalement, l’équipe possède une grande expertise dans la chirurgie et le comportement chez la souris, ce savoir-faire assure une application de qualité des procédures. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune devant prendre jusqu'à 60 % de son poids sous régime riche en gras et passer cinq heures exposée au froid. S'y ajoutent une prise de sang à la veine mandibulaire, cinq micro-prélèvements en deux heures par incision du bout de la queue, trois injections intrapéritonéales et une séance d'imagerie TEP-scanner sous anesthésie profonde. L'enjeu déclaré tient à une seule protéine, dont l'absence semble protéger les mâles de la prise de poids, et dont le porteur veut savoir si elle protège aussi les femelles. Il conclut que le métabolisme énergétique dépendant de plusieurs organes, il a "besoin de l'organisme entier".

Objectifs

Nous avions montré que l’absence de la protéine X chez la souris modifie le volume du tissu adipeux de la moelle au cours de la maturation squelettique et dans un modèle d’ostéoporose induite. Ces résultats nous ont conduit à étudier le rôle de cette protéine dans la régulation des tissus adipeux périphériques. Ces tissus adipeux jouent un rôle important dans la régulation du métabolisme énergétique grâce à leur fonction de sécrétion d'hormones, leur fonction de stockage des lipides dans les adipocytes blancs et leur capacité à dissiper l’énergie sous forme de chaleur. La régulation de la température par l'organisme est une fonction vitale qui permet de stabiliser la température corporelle et de lutter contre l’accumulation de masse grasse. Nos travaux récents indiquent que les masses de tissus adipeux sont inférieures en absence de la protéine X. Nos résultats préliminaires obtenus chez les mâles soumis à un régime riche en gras indiquent que les mâles dépourvus de cete protéine résistent à la prise de poids. Pour aller plus loin dans la compréhension des mécanismes d’action de cette protéine dans la régulation du métabolisme énergétique, nous allons poursuivre l’analyse du rôle métabolique de cette protéine chez les souris mâles et femelles, en répondant aux questions suivantes : - les femelles n'exprimant pas cette protéine sont-elles résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras ? - la faible quantité de tissus adipeux et la résistance à la prise de poids sous régime riche en gras des souris dépourvues de la protéine X sont-elles dues à une augmentation de l’activité de régulation de la température par les cellules des tissus adipeux ?

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les mécanismes d’action de la protéine X comme nouveau régulateur de l’activité thermogénique des tissus adipeux. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de certaines maladies métaboliques, telle que l’obésité

Procédures

- pesée des animaux 1x/semaine - un prélèvement de 50µl de sang à la veine mandibulaire – deux injections IP à une semaine d’intervalle - 5 micro-prélèvements sur une durée de 2h - 5h de présence dans un environnement froid – une injection IP (100µl) – une séance d’imagerie TEP/CT sous anesthésie profonde (durée : 10 minutes de TEP, 15 secondes de CT)

Impact sur les animaux

Ce protocole conduira à une prise de poids (maximum 50-60%) et à l’apparition d’une glycémie un peu plus élevée qu’en condition standard mais sans atteindre l’état de diabète (170-200mg/dl versus 140mg/dl). Un stress modéré est attendu lors des injections IP et de la pesée des animaux. Un stress modéré est attendu lors des micro prélèvements sanguins - une douleur légère et de courte durée lors de la petite incision de l’extrémité de la queue. L’exposition au froid induira une baisse transitoire de la température corporelle

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélèvements d'organes (mesure du poids des organes, analyses histomorphométriques et analyses moléculaires)

Remplacement

Le projet concerne l'analyse des effets de l’absence d'une protéine sur la régulation du métabolisme énergétique dans des conditions standard ou dans un modèle d’obésité induite. Le métabolisme énergétique est sous le contrôle de plusieurs organes (tissus adipeux, muscle squelettique, foie, cerveau), nous avons donc besoin de l’organisme entier pour répondre à la question posée.

Réduction

D’après nos travaux antérieurs et nos analyses statistiques, n=12 animaux par groupe est le nombre suffisant pour observer une différence significative. Deux situations peuvent se présenter : 1/ les femelles mutantes sont résistantes à la prise de poids sous régime riche en gras. Elles seront alors soumises à ce même régime à thermoneutralité pour vérifier si ce phénotype de résistance dépend du processus qui contrôle la température corporelle; 2/ les femelles mutantes se comportent comme les souris contrôles (gain de poids sous régime riche en gras). Le protocole s'arrêtera à cette étape (le nombre de souris total pour cette procédure sera alors réduit de 48 animaux).

Raffinement

Pour la mesure de poids hebdomadaire, les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue. Ce geste limite le stress des animaux. L'hébergement à thermoneutralité aura deux effets possibles : 1/ la résistance à la prise de poids est la même que celle observée à température ambiante dès les 8 premières semaines sous régime riche en gras ou 2/ les souris mutantes perdent leur capacité à résister au régime riche en gras. Dans le cas n°1, nous arrêterons le protocole après 8 semaines de régime puisque nous pourrons conclure sur les effets de la mise à thermoneutralité. La procédure sera donc réduite à 8 semaines au total. Dans le cas numéro 2, nous poursuivrons le protocole pour vérifier si la résistance apparait plus tardivement (maximum 14 semaines de régime riche en gras). Nous avons pris en compte le bien-être animal, un examen régulier permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant les analgésiques adaptés à notre procédure. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate). Nous identifions deux types de points limites. Les points limites généraux applicables à toutes nos expériences utilisant des souris et les points limites spécifiques à la procédure (prises de poids maximales attendues sous régime riche en gras de 50% à 60%). Cette prise de poids peut amener à une légère réduction de la mobilité non dommageable. Pour les tests de tolérance à l’insuline, nous utilisons une dose faible, mais si une souris présente une réponse trop marquée, celle-ci sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques comme l’obésité. Le modèle murin est utilisé de longue date pour comprendre les mécanismes physiopathologiques des maladies métaboliques. Ce projet est la poursuite de la caractérisation phénotypique de souris invalidées pour le gène X qui nous a permis de mettre en évidence, pour la première fois, un rôle potentiel de la protéine X dans la régulation du métabolisme énergétique (résultats non publiés). Sans ce modèle, cette nouvelle fonction n’aurait pas pu être découverte. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines, âge auquel le métabolisme énergétique est stable.

Documenter la toxicité d'un candidat anticancéreux avant une demande d'autorisation de mise sur le marché : deux chiens vont être utilisés, tués à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre perfusions intraveineuses de dix minutes en huit jours, à jeun jusqu'à douze heures avant, puis se voit prélever du sang à quatorze reprises, dont six fois en vingt-quatre heures et six fois en six heures. Après chaque administration, les deux chiens sont séparés pendant six heures et gardés en contact visuel et auditif. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal entier et écrit que deux animaux constituent le minimum interprétable, sans qu'aucune approche statistique n'ait été réalisée.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets toxicologiques d'un élement test après une administration intraveineuse répétée 4 fois à 2 ou 3 jours d'intervalles.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de développer un nouveau médicament contre le cancer (Leucémie myéloide aigue récidivante ou réfractaire et le Lymphome diffus à grandes cellules récidivant ou réfractaire) chez l'homme.

Procédures

L'élément test sera administré par voie intraveineuse en perfusion de 10 minutes en quatre occasions: le premier jour, troisième, cinquième et huitième jour. Volume d'administration: 4 mL/kg. Temps de l'administration 10 minutes. Puis les animaux auront des prélèvements sanguins: - Jour -7 : 2.7 mL - Jour 0: 6 temps dans les 24h après traitement. Un volume de 0.3 mL de sang sera collecté à chaque temps de prélèvement. -Jour 7: 6 temps dans les 6 H aprés traitement Un volume de 0.3 mL de sang sera collecté à chaque temps de prélèvement. - Jour 8 : 3.0 mL. Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute pour tous les prélèvements

Impact sur les animaux

Le produit test fait partie de la classe thérapeutique oncologie. Les effets indésirables susceptibles d'être observé suite aux traitements sont une hypotonie. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. Dans ce projet les nuisances sont: l'administration des éléments tests par voie intraveineuse avec mise à jeun au maximum 12h avant. Cela necessite une contention legère des animaux. Effets indésirables susceptibles, manque de mobilité . Les prélèvements sanguins seront réalisés. Les sites de prélèvements seront alternés autant que possible. Les prélèvements seront réalisés par un personnel formé et conformément à la réglementation en vigueur. Les prélèvements sanguins peuvent engendrer du stress pour l'animal, de l'inconfort lié à la contention et peut être une douleur au niveau du site de prélèvement. On ne s'attend pas à d'autre effet indésirable en particulier.

Devenir

Les animaux, aupréalablement anesthésiés, sont euthanasiés à l'issu de la procédure pour prélever les organes.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, ni de mimer la toxicité des produits administrés, il est indispensable de recourir à l’animal entier. L'utilisation des animaux reste une exigence dans le cadre de la réglementation liée à l'autorisation de mise sur le marché (AMM) d'un nouveau médicament. Les méthodes alternatives: travail in vitro, ou le travail sur cellules isolées par exemple ne peuvent pas remplacer l'animal.

Réduction

Deux animaux seront inclus. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables. Aucune approche statistique a été réalisé pour ce projet.

Raffinement

Les deux chiens seront hébergés ensemble pendant la période d'acclimatation. Les animaux seront hébergés de manière individuelle aprés chaque administration pendant 6h. Durant cette période les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. De l'enrichissement (exemple: jouet) sera présent dans chaque box autant que possible. Tout geste réalisé sur l'animal sera fait par un personnel formé. Si un animal présente un signe de souffrance, un problème de comportement, un signe clinique sévère ( exemple vomissement trés intense à répétition, trouble de la miction ou troubles de l'alimentation), cet animal pourra être pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra avoir un traitement adapté pour soulager ses maux ( exemple administration d'un antivomitif, distribution d'aliment humide si nécessaire) Après le dernier prélèvement l'animal sera anesthésié puis euthanasié par une méthode chimique administrée par voie intraveineuse.

Choix des espèces

Espèce requise pour un produit pharmaceutique à visée humaine. Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet. Animaux qui ont fini leur croissance.

Provoquer un cancer du foie par deux produits chimiques puis y ajouter de la dioxine pour voir si une molécule expérimentale freine les tumeurs : 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une première injection de diéthylnitrosamine leur est faite à quinze jours de vie, suivie à partir de huit semaines de deux injections de tétrachlorure de carbone par semaine pendant douze semaines et d'un gavage hebdomadaire de dioxine jusqu'à vingt semaines. Le porteur indique que les tumeurs hépatiques ainsi obtenues restent indolores à leurs débuts et deviennent douloureuses aux stades tardifs. Il annonce que toute souris chez qui une douleur serait observée serait mise à mort par anticipation, sans décrire ce qu'il surveille au-delà d'une observation quotidienne du comportement.

Objectifs

La dioxine est un polluant environnemental qui est présent dans notre alimentation et qui peut induire le développement d’un cancer du foie après une exposition chronique. La toxicité de la dioxine résulte pour une grande part de l'activation du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AHR). Dans ce projet, nous étudierons la capacité d'une molécule qui s'oppose aux effets d’AHR (antagoniste AHR) à réduire le développement du cancer du foie induit par la dioxine. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de cancer du foie induit par deux produits chimiques, le dihétylnitrosamine (DEN), administré aux souris âgées de 15 jours, et le tétrachlorure de carbone (CCl4), administré aux souris 2 fois par semaine pendant 12 semaines à partir de l’âge de 8 semaines. Ce modèle permet le développement de tumeurs hépatiques (induites par le DEN) sur un foie avec une fibrose (induite par le CCl4). Les souris seront également soumises à une administration chronique de dioxine ou son diluant (corn oil) par gavage une fois par semaine à partir de l'âge de 8 semaines jusqu'à 20 semaines. Cette administration de dioxine combinée avec le DEN/CCl4 permet de mimer la physiopathologie observée chez l’Homme au cours de laquelle les polluants environnementaux agissent comme des co-facteurs de développement et de progression des cancers. La dioxine agit alors comme un promoteur de tumeurs. Son administration sans DEN/CCl4 permettre d’étudier son effet en tant qu’initiateur de tumeurs. Les souris seront également soumises à une administration de l'antagoniste d'AHR qui sera incorporé à l'alimentation pendant 4 semaines (pendant les semaines 17 à 20). Ces expériences seront réalisées chez des souris contrôle ainsi que des souris génétiquement modifiées pour étudier les effets de l'absence du gène AHR dans un type cellulaire particulier. Ce projet est dans la continuité d'un autre projet visant à étudier les mécanismes par lesquels la dioxine favorise le développement du cancer du foie et qui a permis de montrer un rôle de la voie AHR des cellules endothéliales dans les effets pro-tumoraux de la dioxine.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de déterminer si une approche thérapeutique basée sur l’utilisation d’un antagoniste d'AHR permet de contrer les effets des polluants environnementaux sur la carcinogenèse hépatique.

Procédures

Les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale 15 jours après la naissance ; deux injections intrapéritonéales par semaine à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 12 semaines ; un gavage par semaine à partir de l'âge de 8 semaines pour une durée de 12 semaines. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 15 secondes par souris et les gavages de 30 secondes par souris. Les souris auront un prélèvement de sang au moment de la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les souris auront une administration de diétylnitrosamine ou vehicle (douleur légère de courte durée) ; des administrations de tétrachlorure de carbone ou vehicle (douleur légère de courte durée) ; des administrations de TCDD (douleur légère de courte durée). Les souris traitées avec DEN/CC4 développeront des tumeurs hépatiques (sans douleur aux stades précoces et modérée aux stades plus tardifs).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets de l'antagoniste d'AHR.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux est essentielle pour étudier les effets d'un antagoniste d'AHR sur le développement tumoral induit par la TCDD. Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives. En effet, il n’existe aucun moyen de remplacer une telle étude dans laquelle la réponse physiopathologique est complexe et met en jeu plusieurs types cellulaires (hépatocytes, cellules endothéliales, cellules inflammatoires, fibroblastes, …).

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % de l'aire tumorale.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en présence de papier kraft et de carrés de coton pour faire leur nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose. Par ailleurs, nous effectuerons un suivi quotidien des souris tout au long du protocole en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Si nous observons une douleur chez un animal, cela entraînerait sa mise à mort anticipée.

Choix des espèces

La souris est l’espèce couramment utilisée dans ce protocole de carcinogenèse hépatique. De plus, nous avons utilisé le même modèle pour mettre en évidence le rôle de la voie AHR dans les effets pro-tumoraux de la TCDD. Ainsi, cette étude permettra de montrer l'effet protecteur d'un antagoniste d'AHR dans le même modèle. Enfin, ce modèle présente l'avantage qu'il nous permet de travailler avec des souris génétiquement modifiées. En effet, nous disposons de souris génétiquement modifiées pour étudier les effets de l'absence du gène AHR dans les cellules endothéliales. Le diétylnitrosamine est un produit chimique qui induit des cancers du foie s’il est administré chez le souriceau de 15 jours en combinaison avec des administrations de CCl4 à partir de l’âge adulte (8 semaines).

Une injection d'huile minérale dans le ventre déclenche chez les souris de ce projet un lupus qui se développe ensuite sur huit à vingt-quatre semaines. 1 940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent jusqu'à dix injections intrapéritonéales en quinze jours et un prélèvement sanguin sous anesthésie, l'objectif étant de savoir si la suppression d'une cellule immunitaire rare, le basophile, freine la maladie. Le porteur écrit que ni douleur chronique ni souffrance permanente ne sont attendues et qu'aucun médicament contre la douleur n'est donc "nécessaire", tout en décrivant une maladie inflammatoire chronique entretenue pendant six mois.

Objectifs

Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles) dans l'amplification des facteurs responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs protéines dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de la suppression de ces cellules dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de Lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales »), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et certains seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale une seule fois dans le but d'induire la maladie étudiée. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois sur une période de 8 ou 24 semaines: une fois dans le but de d'induire la maladie étudiée et 4 fois dans le but d'éliminer les cellules étudiées sur une période de 10 jours. Ces dernières souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale une seule fois avant d'éliminer les cellules d'intérêt la première fois. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant et après élimination des cellules. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale de huit à dix fois sur une période de 15 jours dans le but d'étudier l'effet de l'élimination des cellules d'intérêt dans un modèle de vaccination.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables induits sur les animaux sont de deux catégories. La première catégorie concerne le stress et les douleurs brèves induites par la contention manuelle des animaux, les injections intrapéritonéales multiples et les prélèvements sanguins (une seule fois) sous anesthésie générale. La deuxième catégorie concerne l’induction d’une maladie inflammatoire chronique (le lupus) par l’injection d’une huile minérale (pristane) dans le péritoine (le ventre) des souris. Cette huile peut induire, chez un faible pourcentage de souris, une difficulté respiratoire sur 2-3 jours, 2 à 3 semaines après l’injection. Après ce stade, la gêne disparaît. Les souris seront suivies de très près pendant cette phase pour s’assurer qu’aucune ne développe une forme respiratoire grave. La maladie induite (lupus) se développe alors sur une période de 8 à 24 semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'en analyser différents organes. La mort sera confirmée par vérification de l'arrêt cardio-respiratoire.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des procédures seront également utilisés pour réaliser des cultures cellulaires et des expériences in vitro après leur mise à mort. Les échantillons des souris chez lesquelles la maladie a été induite serviront de contrôles positifs pour des expériences ultérieures. Le but est de valider nos approches thérapeutiques afin de pouvoir les développer pour la pathologie humaine. Le nombre d’animaux qui seront utilisés est réduit au minimum mais est suffisant pour pouvoir obtenir des conclusions scientifiques solides.

Raffinement

Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Aucun médicament contre la douleur n'est donc nécessaire. Tous les animaux seront observés quotidiennement par le personnel compétent de l'animalerie. Afin de réduire au minimum le stress et la douleur qui pourraient être ressentis par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions : Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents infectieux. L’enrichissement de l’environnement des souris dans les cages (cotons pour construire des nids, maisonnettes en plastiques pour se cacher…) permet d’optimiser le bien-être des animaux. Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Les animaux devant être prélevés d'un peu de sang pour des analyses le seront après une brève anesthésie générale. Différentes actions seront mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Les procédures dureront 24 semaines maximum pour notre modèle induit (souris âgées de 32 à 36 semaines au maximum en fin de procédure). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour analyse des paramètres de la pathologie. Aucun animal ne sera réutilisé dans des expériences ultérieures. L’état général des animaux chez qui la pathologie est induite sera suivi sur une grille de score permettant de s’assurer que l’état des animaux n’est pas altéré. En cas d’altération trop marquée, les animaux concernés seraient euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris) est le seul modèle de mammifères disposant des animaux modifiés génétiquement pertinents pour les objectifs scientifiques de notre projet ayant trait au lupus. Toutes les souris entreront en procédure à l’âge adulte (minimum 8 semaines d’âges) et seront analysées au maximum à 36 semaines d’âge.