Oncologie

Nées avec une mutation qui bloque la dégradation du céramide, les souris de ce projet ont une espérance de vie de 100 jours et développent dès trois semaines un retard de croissance, un gonflement du foie et de la rate et une faiblesse musculaire qui leur rend l'accès à la nourriture difficile. 1 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des vecteurs viraux censés apporter une copie fonctionnelle du gène ASAH1. Chaque mois, elles subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie au sinus rétro-orbital ou à la mandibule, une mesure de conduction nerveuse de vingt minutes et une heure trente d'observation de leur activité, avant un prélèvement terminal de muscles et une perfusion de fixateur par le flux sanguin. Les souris qui héritent de la mutation partent toutes en expérimentation puis sont tuées, celles qui n'en héritent pas sont mises à la reproduction pour entretenir l'élevage ou tuées faute d'usage.

Objectifs

La maladie de Farber et l’amyotrophie spinale associée à une forme d’épilepsie progressive myoclonique (SMA-PME) sont deux maladies génétiques rares causés par des mutations dans le gène ASAH1. Ce gène produit une enzyme appelée céramidase acide, qui décompose une substance appelée céramide dans les cellules. Lorsque ce gène est défectueux, l'enzyme ne fonctionne pas correctement, entraînant une accumulation toxique de céramide dans les cellules. Ces maladies affectent principalement le système nerveux et d'autres tissus du corps. Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif pour ces maladies. Notre projet vise à développer une thérapie génique pour traiter le déficit en céramidase acide. Pour cela, nous utilisons de virus modifiés appelées AAV comme transporteurs pour introduire une version correcte du gène ASAH1 dans les cellules des patients. Nous avons testé cette thérapie chez des souris modèles représentant la maladie de Farber. Deux méthodes d'injection ont été explorées : l'injection dans tout le corps et l'injection directement dans le cerveau. Les deux méthodes ont montré une amélioration de la survie des souris et une correction des symptômes de la maladie. Cependant, l'utilisation de ce vecteur à des fortes doses peut provoquer des altérations dans certains tissus après injection dans tout le corps. Par conséquence, l'objectif actuel de notre projet est de tester de nouveaux virus AAV qui ciblent plus efficacement les cellules malades. Cela nous permettrait de réduire la dose nécessaire pour obtenir un effet thérapeutique après injection dans tous les corps, minimisant ainsi les risques d'inflammation. Enfin, pour l’injection directe dans le cerveau il est important de confirmer si une telle méthode d’administration pourrait représenter une stratégie efficace pour traiter les formes du déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier de nouveaux candidats médicaments et d’investiguer sur des défauts tissulaires dû à la maladie pour à terme apporter une solution thérapeutique adaptée aux patients qui aujourd’hui n’existe pas. D’abord nous allons investiguer sur la présence ou non d’une atteinte au niveau de la barrière hémato-encéphalique. Si cette hypothèse se révèle correcte, nous en tiendrons compte pour ajuster la conception des thérapies, y compris le choix du vecteur et la dose, afin de favoriser une distribution optimale du traitement. Par la suite, nous espérons choisir un vecteur AAV qui cible mieux les cellules affectées par la maladie. Cela nous permettrait d'utiliser une dose plus faible pour obtenir une correction complète, réduisant ainsi les coûts de production du produit et les effets secondaires liés aux doses élevées, comme observé lors des études précédentes. Enfin, nous aurons une vue plus claire sur l'efficacité de l'injection directe dans le cerveau comme méthode d’administration pour traiter les formes de déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.

Procédures

Le prélèvement d’un petit bout de queue (2/5 mm) sera effectué sur des souris à la naissance ou à 15 jours de vie (5sec). L’administration des vecteurs AAV sera réalisé par voie intraveineux (15sec si volume ≤100 µL/20g; jusqu’à 1min si volume ≤ 250µL/20g) et par voie intra-cérébro-ventriculaire (ICV) (15sec). Afin d’évaluer l’efficacité du traitement lors des études, des tests fonctionnels pourront être réalisés chez des animaux vigiles : évaluation de leur activité tous les mois pendant 1h30 et analyse de leur force musculaire toutes les semaines pendant 10min. La force spécifique d’un muscle sera étudié chez d’autres animaux anesthésiés pendant 1h15 par animal une seule fois lors de l’étude. L’analyse de la transmission électrique entre les nerfs et les muscles sera réalisée chez des animaux anesthésiés pendant 20min tous les mois lors de l’étude. Chaque mois afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique, tous les animaux seront anesthésiés pendant moins de 5min pour réaliser un prélèvement de sanguin. En fin d’étude, des prélèvements de muscles (5min) ainsi que l’injection d’un fixateur par perfusion via le flux sanguin (5min) seront réalisés sous anesthésie générale et sans réveil pour l’animal.

Impact sur les animaux

La mutation dans le gène Asah1 chez la souris entraîne une accumulation toxique de céramide dans plusieurs organes de l’animale en accord avec les manifestations cliniques aussi décrites chez l’homme. Les animaux ont une espérance de vie de 100 jours, avec des symptômes apparaissant dès 3 semaines de vie : retard de croissance, gonflement du foie et de la rate, et faiblesse musculaire généralisée, rendant les déplacements et l'accès à la nourriture difficiles. Le test d'échappement peut causer une légère nuisance avec un pincement de la queue, provoquant rarement un léger saignement. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent occasionner une douleur légère liée à la piqûre.

Devenir

Certaines souris issues des croisements mais ne présentant pas de pathologie seront utilisées pour les accouplements nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage. Les animaux issus des croisements mais ne présentant pas de pathologie et non nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage seront euthanasiées. Toutes les souris présentant le phénotype pathologique seront incluses dans les procédures expérimentales et seront euthanasiées à la fin de la procédure expérimentale ou en cours de procédure si leur état de santé le nécessite.

Remplacement

Le modèle murin utilisé dans ce projet est le premier modèle pertinent publié dans la littérature qui récapitule les symptômes retrouvés chez les patients affectés par la maladie de Farber. Des modèles in vitro 2D existent, mais ils ne permettent pas d’étudier certains défauts majeurs de la pathologie, tels que l'infiltration de cellules immunitaires dans les organes cibles de la maladie. Les modèles in vitro 3D (ou organoïdes) ne possèdent pas à ce jour toutes les structures anatomiques spécifiques de chaque organe. De plus, on ne peut pas reproduire exactement la biodistribution du vecteur après administration dans le corps entier, ce qui limiterait les informations collectées pendant les études pour la transposabilité des résultats vers des études précliniques. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour cette étude.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été déterminé à l’aide de calculs statistiques. Cela permet d’observer les différences entre les animaux sains et malades concernant la barrière hémato-encéphalique, d’étudier le potentiel thérapeutique de chaque vecteur testé et de maintenir les lignées tout au long du projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies avec du coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. Concernant les souris porteuses de la mutation pour le gène Asah1, des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 2 fois par semaine, en plus de l’observation quotidienne des animaux. De plus, un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès à la nourriture des souris malades. Afin de réduire la souffrance et le stress de ces animaux, des points limites ont été établis pour chaque procédure et manipulation. En cours du suivi du traitement, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie mandibulaire ou rétro-orbitale, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et le prélèvement sera au maximum du 10% de volume sanguin total de la souris. La méthode de prélèvement sanguin sera adaptée et réalisée au sinus rétro-orbital dans le cas où un processus de cicatrisation serait en cours (présence de croute, hématome, rougeur ou gonflement). L’œil sur lequel le prélèvement est effectué sera noté sur la fiche de suivi de l’animal afin de privilégier l’autre côté pour un prélèvement le mois suivant. Raffinement pour analyses fonctionnelles et prélèvement des muscles : afin de réaliser une mesure de force musculaire, l’animal recevra une injection d’analgésique en sous-cutanée, ce qui permettra de soulager les douleurs intenses éventuelles, et sera anesthésié par voie intrapéritonéale. L’animal sera également disposé sur un support chauffant tout au long de l’anesthésie.

Choix des espèces

Pour évaluer des stratégies thérapeutiques contre le déficit en céramidase acide, le modèle murin porteur d’une mutation dans le gène Asah1 a été choisi car il reproduit très fidèlement les symptômes de la maladie observées chez l’homme. Pour générer les animaux nécessaires à l’étude, les souris seront mises en reproduction entre l’âge de 8 semaines et 6 mois. Afin d’investiguer un défaut de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, les animaux contrôles et malades seront injectés à l’âge de 7 semaines et euthanasiés 8 jours après le traitement. À ce stade, la pathologie est suffisamment avancée pour déterminer si une altération existe et pour étudier les conséquences à court terme sur la capacité du vecteur à atteindre les régions touchées par la maladie. Lors de l’étude visant à identifier la combinaison vecteur-dose la plus efficace après injection via la veine de la queue, les souris seront traitées à l’âge de 7 semaines. Pour évaluer si l’injection directement dans le cerveau de vecteurs sélectionnés peut prévenir l’état inflammatoire dans le système nerveux central ainsi qu’au niveau des tissus périphériques pour les formes les plus sévères et précoces de la maladie, les animaux seront traités le jour de leur naissance.

Les souris seront tuées dès les premiers signes cliniques de l'infection, seuil qui fixe la limite de ce que le protocole les laisse endurer. 2 127 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans l'abdomen une injection de Toxoplasma gondii, avec des souches de type I que le porteur décrit comme conduisant systématiquement à la mort en l'absence de traitement, puis un gavage quotidien pendant sept jours et quatre séances d'imagerie sous anesthésie, avant dissection du cerveau pour compter les kystes. Le porteur teste des molécules déjà approuvées par l'agence américaine du médicament et situe les retombées possibles à moyen et long terme, aucun traitement n'existant à ce jour contre les formes persistantes.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet de recherche est double, visant à approfondir notre compréhension d'une maladie due à une infection par des parasites, et à développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans un premier volet, l'équipe se concentre sur l'identification et la caractérisation des des protéines sécrétées par les parasites lors de l'infection de la cellule hôte. L'objectif ultime est de déterminer le rôle de ces protéines dans le processus de virulence du parasite chez son hôte intermédiaire naturel, la souris. Ce volet comprend une analyse in vivo, en se penchant particulièrement sur la phase initiale de la maladie et la formation de kystes pendant la phase persistante de la maladie. Dans un second volet, le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité in vivo de composés antiparasitaires, préalablement sélectionnés parmi des molécules approuvées par la "U.S. Food and Drug Administration" (FDA, fda.gov). La FDA veille à ce que des médicaments sûrs et efficaces soient disponibles pour améliorer la santé de la population des États-Unis. Ces composés sont donc déjà utilisés dans le traitement de différentes maladies, garantissant leur non-toxicité chez l'humain. L'objectif est de comparer leur efficacité à la sulfadiazine, un médicament antiparasitaire utilisé actuellement en clinique, tout en confirmant in vivo leur cible moléculaire. Notez que ce projet se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (nommés EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche présente des avantages significatifs sur plusieurs aspects. Tout d'abord, il vise à répondre à des questions fondamentales sur les infections causées par les parasites, en éclairant le rôle des protéines sécrétées dans la virulence et le processus infectieux. À moyen terme, ces réponses permettront de mieux comprendre le dialogue établi entre le parasite et son hôte ainsi que les mécanismes permettant le contrôle de l'infection, guidant ainsi le développement de nouvelles approches thérapeutiques. En ce qui concerne le deuxième volet, l'évaluation in vivo des composés antiparasitaires présente un intérêt majeur. À long terme, si ces composés s'avèrent efficaces, cela pourrait ouvrir de nouvelles perspectives dans le traitement contre les infections parasitaires, offrant des alternatives potentielles aux traitements actuels, tout en minimisant les effets secondaires. Il est important de souligner ici qu'il n'existe jusqu'à présent aucun traitement contre les formes persistantes d’infections parasitaires. Une fois établis, les kystes persistent théoriquement pendant toute la durée de vie de l'hôte. Pour information, il est estimé que 30% de la population mondiale est infectée par un parasite. En somme, ce projet offre une approche globale, alliant une compréhension approfondie des mécanismes d'infection à des solutions thérapeutiques novatrices. Les connaissances générées et les avancées thérapeutiques potentielles contribueront à la lutte contre les maladies parasitaires, avec des implications positives pour la santé publique à moyen et long terme.

Procédures

Lors de ce projet, les interventions sur les animaux vivants seront de trois types : (i) Les injections au niveau abdominal (1 par expérience et par souris, durée du geste : quelques secondes) des parasites dans le but de déclencher l'infection parasitaire avec une charge parasitaire contrôlée. Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU1. (ii) Traitement des animaux par administration par voie orale des composés à l'aide de sondes de gavage adaptées à la souris (1 gavage par jour pendant 7 jours consécutifs et par souris, durée du geste : quelques secondes à chaque gavage). Cette étape sera réalisée dans les Etablissements Utilisateurs EU1 et EU2. (iii) Pour les expériences d'imagerie in vivo, les animaux sont anesthésiés et le produit luminescent est injectée dans l’abdomen des animaux (4 fois par souris à J0, J2, J5, et J7, durée du geste : quelques minutes chaque jour). Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les infections parasitaires peuvent est caractérisées par deux phases distinctes : la première phase de l’infection, qui correspond à la phase de dissémination des parasites dans les différents organes de l'hôte (la souris ou l’homme). Celle-ci peut être mortelle chez la souris comme chez l'homme si elle n'est pas contenue et contrôlée par le système immunitaire. Les souches de type I sont particulièrement virulentes chez les souris de laboratoire et conduisent systématiquement à la mort des animaux infectés en l'absence de traitement. Les souches de type II, non-virulentes, induisent une première infection légère, conduisant systématiquement à une infection parasitaire persistante sans symptômes. Cette phase correspond à l'étape où la multiplication des parasites est contenue par le système immunitaire de l'hôte, et seuls les parasites capables de s'enkyster dans les muscles et le cerveau vont survivre. Cette étape se met en place plus tardivement, et les kystes vont persister pendant toute la durée de vie de l'hôte.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements sur les animaux morts tels que le prélèvement du sang dans le but de détecter la présence d’une réaction immunitaire contre le parasite et la dissection du cerveau pour la détection et la quantification des parasites sous forme de kystes dans le cerveau des animaux.

Remplacement

Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Des études préliminaires réalisées in vitro en culture cellulaire nous ont permis d’identifier spécifiquement des gènes (24 gènes candidats) du parasite codant pour des protéines du parasite sécrétées dans la cellule infectée et ayant donc un rôle potentiel dans le contrôle de la virulence chez l’animal. De même, que des études de biochimie ont permis de montrer que ces protéines s’associent avec des protéines de la cellule hôte confirmant leur rôle potentiel dans la régulation des interactions hôte-parasite. Il est donc essentiel de pouvoir réaliser des expériences chez la souris afin de déterminer l’importance de ces gènes dans le contrôle de la virulence, ainsi que dans la capacité des parasites à persister chez l’animal sous forme de kystes (infection persistante). En effet, aucune autre approche alternative in vitro ou de culture cellulaire ne permet de répondre à ces questions. Le modèle murin d’étude des maladies parasitaires est communément utilisé par la communauté scientifique. En effet, la souris constitue un hôte intermédiaire naturel et privilégié étant donné que le cycle sexué du parasite s’effectue exclusivement chez les félidés en tant qu’hôte définitif, après ingestion de proies infectées. Contrairement aux études in vitro de culture cellulaire, la souris permet l’étude de l’infection parasitaire avec la formation de kystes dans les tissus. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides" : L'activité antiparasitaire des composés (27) a été déterminée à travers des tests effectués sur des cellules in vitro. Il est maintenant essentiel de tester ces composés in vivo chez la souris afin de confirmer leur activité parasiticide chez un mammifère. En effet, des essais cliniques chez l'homme ne seront envisageables que si des études précliniques chez l'animal ont été réalisées.

Réduction

Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, 3 souches mutantes différentes seront testées en parallèle d’une souche sauvage parentale de référence. Par exemple, les souches mutantes de type I seront comparées entre elles et à la souche sauvage de référence de type I. Idem pour les souches parasitaires de type II. Concernant les souches de type I (virulentes), une première lignée des souris seront d’abord testées. Si une atténuation de virulence est observée, l’analyse sera poursuivie sur lignée différente de souris. Ces dernières étant plus sensibles, cette expérience permettra d'évaluer la robustesse de l’atténuation de virulence. Si aucun effet du mutant n’est observé sur la virulence avec la première lignée de souris, l’expérience ne sera pas poursuivie sur la deuxième lignée de souris, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides dans les phases initiale et persistante de l’infection parasitaire" : La première expérience sera conduite avec 2 à 3 animaux par condition à tester (totalisant 13 souris pour cette première expérience). L'objectif est d'assurer une efficacité totale des composés, et les expériences subséquentes ne seront menées que si la survie atteint 100% parmi les souris traitées avec les composés testés lors de cette première expérience. Si les composés se révèlent seulement partiellement efficaces, le protocole ne sera pas poursuivi. De plus, les contrôles sont mutualisés puisque les trois composés sont testés simultanément. En cas de réussite, les expériences ultérieures seront menées avec 2 à 5 animaux par condition à tester.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un établissement utilisateur agréé par du personnel formé. Les souris seront maintenues en groupes autant que possible, dans des cages offrant un enrichissement du milieu de vie, et leur bien-être sera régulièrement contrôlé. Les animaux seront logés dans un environnement contrôlé, exempt de germes dangereux pour les animaux, afin d'éviter toute infection supplémentaire pouvant biaiser l'interprétation des résultats obtenus. Dès le début de chaque expérience, les souris sont observées 3 fois par semaine jusqu'à l'apparition des symptômes, puis quotidiennement (jusqu'à deux fois par jour) jusqu’à la fin de la procédure expérimentale et elles seront euthanasiées dès l'apparition des premiers signes cliniques dû à l’infection parasitaire, avec le point limite défini dans ce document. Les composés testés, non toxiques, seront mis en solution selon une formulation préalablement déterminée. Pour l'expérience d'imagerie in vivo réalisée dans une autre animalerie, les animaux seront transportés dans des conditions optimisées afin de limiter le stress lié au transport.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé pour étudier les infections parasitaires est largement adopté par la communauté scientifique. La souris, en tant qu'hôte intermédiaire naturel du parasite, offre un cadre privilégié, car le cycle sexué du parasite se produit exclusivement chez les félidés, en tant qu'hôtes définitifs, après l'ingestion de proies infectées. Les souris développent ainsi une infection parasitaire avec une réponse immunitaire comparable à celle observée chez l'homme. Les souches de souris utilisées présentent des niveaux de sensibilité variables aux parasites. Il est donc pertinent d'explorer le potentiel rôle des effecteurs parasitaires dans la virulence des différents types de parasites (Type I virulent et Type II non-virulent), ainsi que chez des souris présentant divers niveaux de sensibilité à cette infection. De plus, les modèles murins sont particulièrement adaptés pour étudier l'efficacité de composés antiparasitaires, car les souris peuvent reproduire les différentes phases de l’infection, tant infection initiale que persistante. Seules des expériences in vivo, réalisées sur des modèles murins, permettront de confirmer l'efficacité de ces composés au cours des différentes phase de l’infection parasitaire, et de répondre à la question cruciale : représentent-ils de véritables candidats médicaments ? Par conséquent, les expériences seront réalisées sur de jeunes adultes, car le système immunitaire doit être mature afin de pouvoir répondre à l’infection parasitaire.

Une tumeur hypophysaire est implantée par chirurgie stéréotaxique dans le crâne de chaque rat, avec une canule d'injection laissée en place pendant les soixante jours du protocole. 60 rats Wistar Furth vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils développent des symptômes d'hypertension intracrânienne quand la tumeur devient volumineuse, ressentent une gêne de type démangeaison à cause de la canule, et sont tués au soixantième jour pour peser les tumeurs et chercher des métastases par autopsie cérébrale. Le porteur qualifie cette chirurgie de "peu douloureuse" et les injections intratumorales de "non douloureux", en faisant valoir que les mêmes gestes se pratiquent chez l'être humain sous simple anesthésie locale.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier l’effet des analogues de la somatostatine sur le contrôle des tumeurs hypophysaires sécrétant l’hormone de croissance en fonction de la voie d’administration du traitement (voie orale versus traitement local intratumoral) afin de s’affranchir de l’obstacle que représente la barrière hémato-encéphalique

Bénéfices attendus

Si notre hypothèse de travail selon laquelle les analogues de la somatostatine donnés comme traitement des tumeurs hypophysaires sont relativement peu efficaces à cause de leur incapacité à pénétrer dans l'hypophyse à cause de la barrière hémato-encéphalique, les résultats de notre projet pourraient ouvrir la voie au développement d'une technique chirurgicale visant à délivrer la médicament directement dans la tumeur résiduelle et à améliorer les taux de guérison de ces patients. de guérison des adénomes somatotropes.

Procédures

Les animaux seront initialement soumis à une procédure chirurgicale (stéréotaxie) peu douloureuse (sous anesthésie générale gazeuse). A titre de comparaison, ces chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous anesthésie locale pure chez l'homme en pratique clinique courante en France. Les autres procédures comporteront des prises de sang bi-mensuelles (sous anesthésie générale gazeuse) ainsi que des injections bi-hebdomadaires sur la canule d'injection prévue à cet effet (non douloureux, mais anesthésie générale gazeuse de < 1 minute envisageable en cas d'angoisse de l'animal). Au total, chaque animal ne subira qu'une seule procédure chirurgicale initiale pour implanter la tumeur (20 minutes de chirurgie sous anesthésie générale), puis 3 prises de sang à 15 jours d'intervalle (10 minutes sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont principalement en lien avec les symptômes d'hypertension intracrâniennen lorsque les tumeurs deviennent trop volumineuses. Aussi, les animaux peuvent ressentir une gêne à type de démangeaison en raison de la canule intratumoral qui restera en place pendant toute la durée de l'expérimentation. Enfin, les injections hebdomadaires peuvent être source d'anxiété chez les animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, après 60 jours, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tumeurs hypophysaires obtenue pour les peser et les analyser sur le plan moléculaire. Aussi, une autopsie cérébrale sera réalisée à la recherche de métastases à distance.

Remplacement

L’utilisation de modèle animaux pour l’étude du développement tumoral dans son microenvironnement habituel est indispensable. L’effet de la somatostatine administré par voie systémique sur ces tumeurs est connu mais son effet après administration directement dans la tumeur n’est pas connu. Bien que les propriétés de la barrière hémato-encéphalique soient largement connues, il est indispensable de confirmer notre hypothèse dans un modèle préclinique avant d’envisager toute nouvelle procédure chez l’homme. Actuellement il n’existe pas de modèle préclinique non-animal fiable de cette barrière hémato-encéphalique.

Réduction

L'évaluation de l'effet des médicaments selon la voie d'administration nécessite de comparer le médicament à la fois à un placebo mais aussi à sa voie d'administration systémique habituelle (sous-cutanée) ce qui nécessite au moins 3 groupes. Idéalement, il serait utile de tester la voie d'administration en placebo la molécule et la voie d'administration, soit 4 groupes d'animaux. Néanmoins, on peut s'affranchir d'un groupe d'animaux si tous les animaux recoivent une injection locale et une injection sous-cutanée (de placebo ou de médicament), permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux en n'utilisant pas de 4ème groupe. D'un point de vue statistique, le nombre d'animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique à partir des différences de survie moyenne observées entre les groupes d'animaux dans notre précédente étude de survie des animaux de notre modèle expérimental en fonction de leur exposition à un médicament anti-tumoral. Le nombre d'animaux nécessaire est estimé statistiquement à 19 par groupes. Le geste technique d'insertion d'une canule d'injection intra-sellaire étant nouveau, 3 rats supplémentaires semblent nécessaires à l'optimisation de la technique opératoire. Le nombre total d'animaux nécessaire s'élève donc à 60 animaux (19 par groupe + 3 de mise au point).

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ils seront maintenus par deux minimum dans chaque cage avec de l’enrichissement du milieu par copaux de bois et tunnel en carton. Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaitre les points limites. Les animaux ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie et celle-ci sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Toute procédure pouvant engendrer une douleur (prise de sang, injection) sera également effectuée sous anesthésie générale gazeuse. Tous les animaux seront opérés et surveillés par les membres de l’équipe qui a mis au point le modèle expérimental de tumeur hypophysaire orthotopique, sont habitués à ces procédures et à la reconnaissance précoce des points limites des animaux. Les points limites surveillés par l'équipe sont les suivants : hérissement du poil, isolement, aggressivité, ralentissement, inconfort. En cas d'apparition d'un de ces signes clinique, une fiche individuelle sera réalisée de manière quotidienne et ous les animaux qui présentent un score supérieur ou égal à 6/10 seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le choix d'un modèle animal de rat repose l'absence d'autre modèle expérimental préclinique de tumeur hypophysaire orthotopique. En effet, des modèles d'adénomes hypoophysaires obtenues par modifications génétiques chez la souris ne permettent ni d'étudier ces maladies dans un contexte immunologique physiologique, ni d'étudier des pathologies hypophysaires sécrétantes, ces modèles se limitant à des adénomes non-sécrétant. De plus, les adénomes hypophysaires chez l'homme sont sporadiques dans plus de 95% des cas et les modèles génétiques ne correspondent donc qu'à de rares situations cliniques chez l'homme. Le choix de cette souche spécifique de rats (Wistar Furth) est en lien avec la seule lignée cellulaire immortalisée de cellules hypophysaires somatotropes (GC) qui provient de cette souche de rat. Plusieurs tentatives de reproduction de norte modèle dans des souches plus courantes (Wistar Wi et Han) ont été réalisées, sans succès. Les procédures expérimentales débuteront entre 8 et 12 semaines après leur naissance, âge qui correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d’obtenir un environnement ostreogénique favorable au développement des tumeurs.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est rendue obèse et diabétique par trois mois de régime hypercalorique, puis reçoit sept prélèvements sanguins par la queue coupée aux ciseaux, une mini-pompe osmotique implantée sous la peau, trente injections sur dix semaines et, pour certaines, un cathéter posé dans la veine jugulaire au cours d'une chirurgie de 45 minutes. Cinq jours d'isolement en cage servent à mesurer la prise alimentaire, avec le stress et la perte de poids que le porteur en attend. Il conclut que seul un "modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l'animal entier" permet de comprendre l'effet du peptide testé sur l'obésité et le diabète.

Objectifs

Ce projet permettra d'étudier la régulation de l’expression d'une séléno protéine au niveau de l'hypothalamus. Cette protéine anti-oxydante pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique, un défaut de son activité pourrait contribuer au développement de l’obésité et ses comorbidités, notamment le diabète de type 2. Ce projet permettra également de tester les effets d'un nouveau peptide thérapeutique, capable de mimer l'activité de la séléno protéine, pour le traitement de l’obésité et du diabète de type 2. Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de ces pathologies.

Bénéfices attendus

L'obésité et le diabète de type 2 connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans de sorte que la pandémie actuellement observée au niveau mondial constitue un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que l’hypothalamus de sujets obèses est soumis à un stress oxydatif et inflammatoire permanent, suggérant que des facteurs de contrôle de ce stress pourraient être impliqués dans l’homéostasie énergétique et constituer des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l’obésité associée au diabète de type 2. Le peptide que nous allons tester présente plusieurs avantages qui peuvent en faire un outil thérapeutique très intéressant pour combattre l'obésité et le diabète de type 2 qui lui est associé. En effet, ce peptide atteind le cerveau et pénètre dans les cellules pour réduire le stress oxydant en général. Il peut agir aussi bien au niveau central que dans des tissus périphériques impliqués dans le contrôle du métabolisme énergétique. Les études intégrées que nous projetons de réaliser requièrent des analyses in vivo qui pourront déboucher sur des applications chez des patients atteints d'obésité et de diabète de type 2.

Procédures

Une partie des souris sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 3 mois, ainsi ces animaux deviendront obèses et diabétiques. Des prélévements de sang seront effectués à partir de la queue des animaux qui resteront libres de leurs mouvements (7 prélèvements par animal, chacun des prélévements prendra moins d'une minute). L'implantation de mini-pompes osmotiques sous la peau des animaux, afin de délivrer un composé en permanence, sera effectuée sur souris anesthésiées et toutes les précautions d'usage seront suivies pour minimiser la douleur. Au total, l'intervention durera 10 min par souris. Les mini-pompes osmotiques sont implantées pour des traitements d'un mois. Les traitements par injection (3 par semaine) dureront 10 semaines. Certains animaux seront opérés pour placer un cathéter dans la veine jugulaire. Ils seront opérés une fois, la chirurgie sous anesthésie générale dure 45 minutes. Après 1 semaine de repos ces animaux suivront un autre test : ils seront libres de leurs mouvements et porteront un collier. Pendant 2 heures nous mesurerons leur glycémie 16 fois et nous prélèverons un petit volume de sang (au bout de la queue, 7 fois). Il n’y aura qu’un seul test de ce type pour ces animaux.

Impact sur les animaux

#1. Régime hypercalorique : Après 2 mois de régime hypercalorique les animaux ont un surpoids et présentent les premiers signes d'apparition du diabète de type 2. #2. Tests effectués sur les animaux : le gavage, l’injection intra-péritonéale et les prélèvements sanguins peuvent stresser les animaux. La queue des animaux sera coupée au ciseau, cela entraine une douleur. #3. Mesure de la prise alimentaire : les animaux seront isolés 5 jours, cela entrainera un stress et une possible perte de poids. #4. Pose d’un cathéter dans la veine jugulaire : plusieurs effets indésirables sont possibles. Des souris peuvent mal supporter l'anesthésie. La chirurgie peut entrainer des douleurs et des problèmes de récupération. #5. Mesure du renouvellement du glucose : le risque est de créer une hypoglycémie lors du test, si les niveaux de perfusion d’insuline et de glucose ne sont pas optimaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car nous avons besoin de prélever leurs organes pour les analyser ultérieurement.

Remplacement

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, les effets du peptide thérapeutique dans la dérégulation de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité, associée au diabète de type 2, et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme.

Réduction

En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. L’effectif des groupes d’animaux pourra être diminué à 10 lors des études concernant la régulation de la protéine, tout en conservant des données statistiquement fiables. De plus, les procédures, n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux intercalées avec des périodes de repos au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. Au cours de ce projet, plusieurs peptides seront examinés d'abord in vitro dans des cultures de neurones. Ils seront sélectionnés pour leur capacité neuro-protectrices, les plus prometteurs seront étudiés chez la souris obèse. Cette approche réduira sigificativement le nombre d'animaux qui seront utilisés.

Raffinement

L’ensemble des actes pouvant entraîner une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront un traitement analgésique pour prévenir la douleur. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le personnel de l'animalerie. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance.

Choix des espèces

Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'Homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie; et sont souvent utilisées comme modèles de pathologies humaines, comme l'obésité et le diabète de type 2. De plus, nous voulons tester l'effet d'un peptide thérapeutique sur un modèle animal, dans la perspective de le tester ensuite dans une phase clinique humaine. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.