Oncologie
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Autophagie et stimulation immunitaire précoce : effets neuro-inflammatoires et comportementaux
- Recherche fondamentale
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- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 60 d'entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Dans leurs deux premières semaines de vie, les souriceaux reçoivent des injections intramusculaires de composés pro-inflammatoires sous anesthésie, séparés de leur mère, puis passent des enregistrements de vocalisations ultrasoniques, de l'actimétrie et un test de nidification. À trois mois, chaque animal est isolé pendant trois semaines avant le test d'interaction sociale, pour stimuler ses comportements sociaux. Le porteur présente ces tests comme "non invasifs" tout en décrivant par ailleurs le stress lié à la séparation maternelle, à l'hébergement individuel et aux prélèvements sanguins.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions différentes particules auxquelles l’organisme est exposé dans les premières semaines de vie. La toxicité de ces composés bio-persistants et fortement pro-inflammatoires a été montrée dans différentes études, notamment en lien avec un effet sur le neurodéveloppement. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autres par différents tests de comportements, à différents âges, chez un modèle souris pour lequel i) un gène de l’autophagie a été invalidé ; ii) une exposition précoce aux particules est réalisée. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes cellulaires et la mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs : enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte de séparation maternelle (5 minutes), enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte d’interaction sociale (8 minutes à trois stades : jeune, adolescent, adulte), actimétrie à 2 et 3 mois (2 heures d’enregistrement), test de nidification (suivi sur 24 heures). Les souris sont isolées pendant 3 semaines en amont de la session de test d’interaction sociale à l’âge de 3 mois, afin de stimuler les comportements d’interactions. Les injections intra-musculaires de composés pro-inflammatoires (durée du geste d’environ 10 secondes) sont réalisées sous anesthésie (5 minutes d’anesthésie) et ne sont pas de nature à impacter de manière durable le bien-être des animaux. Ils sont ensuite soumis à une chirurgie sans réveil de quelques minutes réalisée sous anesthésie et analgésie, se finissant par l’euthanasie de l’animal. Deux prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés à deux âges différents, le second prélèvement sera suivi d’une euthanasie.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, l’anesthésie gazeuse, les prélèvements sanguins (douleur légère liée à la piqûre de la veine et risque possible d’hémorragie), la mise en place d’une période d'hébergement individuel pour les animaux, les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques avant la chirurgie sans réveil, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. Pour l’anesthésie une détresse respiratoire et l’hypothermie des animaux est possible.
Devenir
Le projet décrit est réalisé sur des souris. L’ensemble des 1380 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie combiné à une perturbation inflammatoire précoce, sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 1380 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Les paramètres environnementaux comprennent une humidité de 50 pour cent plus ou moins 20 pour cent, une température constante entre 20 et 24 degrés Celsius. L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification ainsi que d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés. Les injections intramusculaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Le stress induit par la séparation est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation. Les travaux antérieurs menés au laboratoire ou par d’autres équipes indiquent que l’injection intramusculaire des molécules pro-inflammatoires d’intérêt n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les portées seront particulièrement observées après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation impactant potentiellement l’élagage synaptique et la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (test à 9 jours de vie), jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie). Les injections seront réalisées pendant les deux premières semaines de vie de l’animal, de manière à modéliser une situation d’exposition réaliste chez l’enfant pendant sa 1ère année de vie.
Elevage et hébergement de souris immunodéprimées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Dépourvues de système immunitaire par construction génétique, ces souris contractent facilement des infections, ce que le porteur qualifie lui-même de phénotype dommageable. 3 286 d'entre elles vont être élevées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, la seule opération prévue étant la mise en accouplement des géniteurs. Elles serviront ensuite à recevoir des greffes de tumeurs pulmonaires prélevées sur des patients, l'élevage sur place évitant d'acheter des animaux à des fournisseurs commerciaux. Le porteur écrit que les conditions d'hébergement "justifient, de notre point de vue le classement léger", et affirme ailleurs que ces mêmes conditions justifient "le classement modéré".
Objectifs
Le cancer du poumon est la première cause de décès par cancer dans le monde et la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques est un challenge majeur. A l’heure actuelle, des traitements existent, mais présentent des récidives quasi systématiques à moins de 5 ans. Notre équipe cherche à identifier une nouvelle cible thérapeutique dans les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC). Nous souhaitons utiliser une lignée murine spécifique, ne présentant pas de système immunitaire et ayant une bonne tolérance aux greffes. Ces animaux seraient utilisés pour nos modèles tumoraux puis traités avec différents inhibiteurs afin de vérifier leur effet thérapeutique. Afin de faciliter la gestion de ces projets, notamment pour les pièces opératoires humaines sans pour autant stocker de façon inutile des animaux provenant de sociétés commerciales, nous souhaitons mettre en place un élevage de ces souris afin de générer les animaux nécessaires à nos expérimentations.
Bénéfices attendus
Cet élevage nous permettra de disposer des animaux sur notre site de recherche afin de pouvoir implanter rapidement les tumeurs de patients obtenues après lobectomie. Ces animaux permettrons de répondre aux questions soulevées dans des autorisations précédement demandées et accordées; à savoir l'étude et le développement de thérapies dans le cancer bronchique.
Procédures
Dans cette DAP, seule la mise en accouplement des animaux géniteurs sera pratiquée. Aucune autre intervention n'aura lieu. Les animaux seront hébergés dans une zone exempt de pathogènes et opportunistes spécifiques. Les cages seront positionnées sur un portoir ventilé. En utilisant ce type de portoir, chaque cage peut être considérée comme une unité microbiologique. Des contrôles sanitaires seront réalisés trimestriellement, en alternant l'analyse des filtres d'unité de ventilation et celle des souris sentinelles. De telles conditions d'hébergement permettent d'empêcher le développement d'un phénotype dommageable chez les souris immunodéficientes et justifient, de notre point de vue le classement léger.
Impact sur les animaux
Les animaux immunodéprimés portent des mutations génétiques causant une perte partielle ou totale de leur système immunitaire entraînant un risque accru de contracter des infections ce qui constitue un phénotype dommageable. Une attention particulière sera portée à cela. Ainsi, ces animaux seront systématiquement manipulés sous atmosphère contrôlée et/ou dans des zones portant un statut sanitaire strict afin de ne pas les exposer à des pathogènes pouvant leur causer des infections.
Devenir
Ces animaux seront sujet à une utilisation continue. En effet, à l'issue de cette procédure, les animaux ainsi générés seront utilisés à des fins scientifiques afin de satisfaire les besoins expérimentaux liés aux projets disposant déjà d'une autorisation.
Remplacement
« Remplacer ». Nous avons remplacé dès que possible le modèle vivo par des modèles de cultures cellulaires. En effet, nous disposons au laboratoire de différentes lignées cellulaires provenant d’adénocarcinome humain sur lesquelles nous avons testé nos molécules d'intérêt. Nos résultats se sont montrés concluants et nous ont permis de déterminer les conditions adéquates d’administration (concentration, durée de traitement). Il nous reste à prouver leur efficacité sur tumeur en son site anatomique. Cette procédure expérimentale ne peut être remplacée par une autre stratégie ou procédure expérimentale n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et capable d’amener le même niveau d’information.
Réduction
« Réduire ». L’hétérogénéité apportée par le vivant, dues aux différences physiologiques propres à chacun, nécessite un nombre d’individus suffisamment grand afin d’apporter une puissance statistique forte. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux tout en gardant en tête les objectifs scientifiques, nous nous rapprocherons d’un statisticien pour chaque projet afin d’évaluer le nombre d’animaux nécessaire. Nous exploiterons au maximum le potentiel de ces animaux (analyse et prélèvement multiples pour analyse moléculaire ex vivo). Les accouplements seront adaptés en fonction des besoins expérimentaux. Ils devront être mis en pause si les projets ne nécessitent pas d'animaux sur les temps à venir. Cela évitera la naissance d'animaux surnuméraires.
Raffinement
« Raffiner ». Les souris seront hébergées dans des cages d’une superficie supérieure à 500cm2. La litière est faite à base de copeaux de peuplier et le milieu est enrichi avec des bûchettes de bois et des frisottis. Nous porterons une attention particulière au bien-être des animaux et nous prendrons en charge la contrainte que les animaux subissent au cours des procédures expérimentales par l'administration d'analgésique lorsque cela se montrera nécessaire. Les animaux seront hébergés dans une zone exempt de pathogènes et orpotunistes spécifiques. Des contrôles sanitaires sont réalisés régulièrement en alternant l’analyse des filtres d’unité de ventilation et celle des souris sentinelles. De telles conditions d’hébergement permettent d’empêcher le développement d’un phénotype dommageable chez les souris immunodéficientes et justifient de notre point de vue le classement modéré. Les animaux seront observés quotidiennement (y compris week-end et jours fériés)aussi fréquemment qu’il le faut. Si un signe clinique est observé, il fera l’objet de l’ouverture d’une fiche de suivi scorée. Si rien ne peut rapidement être fait pour soulager la souffrance de l’animal ou si l’un des signes cliniques est trop important, alors ils sera euthanasié.
Choix des espèces
Des modèles de souris développant des cancers bronchiques ont déjà été utilisés dans des études précliniques et se sont montrés être un bon modèle de la pathologie humaine tant sur le plan anatomopathologique que biomoléculaire. La greffe de cellules humaines entraine la nécessité de travailler sur un organisme immunodéficient afin d'exclure tout risque de rejet. D’un point de vue expérimental, nous attendrons que les souris aient au moins 6 semaines pour les utiliser. Ainsi, il s’agira d’animaux déjà adultes mais suffisamment jeunes pour que le processus de vieillissement n’impacte pas les courbes de survie. Nous utiliserons seulement des animaux de moins de 6 mois (jeunes) afin qu’ils récupèrent plus facilement après la chirurgie.
Régénération de cellules productrices d’insuline chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris dont la glycémie dépasse 500 mg/dl ou tombe sous 65 mg/dl sont mises à mort, comme celles qui cumulent plus de trois signes sur la grille de douleur du laboratoire. 2 928 souris vont être utilisées, toutes tuées pour examen du pancréas, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées et un régime riche en graisse destiné à provoquer un diabète, puis subissent un jeûne de cinq heures suivi de six ponctions sanguines à la queue étalées sur deux heures. Le porteur qualifie ce diabète de "très modéré" et attribue la nuisance principale aux piqûres, sans détailler le calcul qui aboutit à près de trois mille animaux.
Objectifs
Le diabète résulte de la destruction des cellules fabricant l'insuline dont le rôle est de diminuer le taux de sucre sanguin. Cela conduit une augmentation du taux de sucre sanguin qui peut avoir de graves conséquences. Les traitement actuels consistent en l'injection d'insuline mais le maintien du taux de sucre sanguin n'est pas optimal. Il faut donc développer de meilleurs thérapies. Dans ce but, nous avons identifié des gènes qui induisent la régénération des cellules productrices d'insuline, ce qui est d'intérêt pour les patients diabétiques. Cependant, ces résultats obtenus sur cellules doivent être validés sur l'animal en condition normale mais aussi en condition de diabète (induit par un régime riche en graisse).
Bénéfices attendus
Ce projet se propose de déterminer si nos gènes pourraient induire une augmentation du nombre de cellules beta pancréatiques chez l'animal. Il est clair qu'un tel résultat représenterait un bénéfice d'importance pour les personnes atteintes de diabète chez qui ces cellules sont manquantes (ce qui conduit au diabète).
Procédures
Les animaux recevront des injections (chaque injection durant une dizaine de secondes). Des prélèvements sont prévus pour suivre le taux de sucre sanguin des animaux (1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures du taux de sucre sanguin) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer un diabète très modéré (légère hyperglycémie). La source principale de nuisance est reliée aux piqures des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour examen des organes et du pancréas en particulier.
Remplacement
Le diabète est une maladie ayand plusieurs orgines (génétiques mais aussi environementales). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible (calculé grâce à des tests statistiques) mais permettant l’obtention de résultats exploitables sans besoin de répétition des expériences.
Raffinement
Durant toute la procédure, les animaux seront suivis afin d’évaluer d’éventuelles souffrances. L'expérience serait immédiatement arrétée en cas de souffrance mesurée comme suit: -Déplacement difficile -Diminution du comportement exploratoire Posture inhabituelle (dos vouté, prostration) -Agressivité -Amaigrissement > 10% du poids initial -Aspect du poil (piqué, hérissé, mal entretenu) -Déshydratation -Agressivité à la manipulation - Glycémie: >500 ou
Choix des espèces
Ce projet a pour but de déterminer les effets de plusieurs gènes dans le pancréas. Il est donc essentiel d'utiliser la souris comme modèle intégré. 3 ages seront évalués : 1, 3, 6 mois après la naissance. Ces âges furent sélectionnés afin de représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes, matures, âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter nos observations dans ces animaux.
Prélèvements de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés avec ou sans phénotype dommageable à visée de recherche dans diverses thématiques.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 3000
Un millimètre de queue coupé, une fois par animal, c'est la procédure appliquée à 84 330 souris et 3 000 rats, dans des actes déclarés d'un niveau de souffrance léger. Ce prélèvement sert au génotypage d'animaux génétiquement altérés produits pour la cancérologie, la cardiologie, la neurologie ou les maladies métaboliques, et l'établissement héberge aussi des lignées immunodéprimées. Le porteur écrit que les individus dont le génotype ne présente pas d'intérêt seront mis à mort et que les autres partiront vers d'autres projets, sans jamais indiquer quelle proportion est concernée. Il évoque des méthodes moins invasives, génotypage par la salive ou prélèvement par buvard sur les aérations, en les décrivant comme des pistes encore à l'étude.
Objectifs
Notre établissement utilisateur produit des animaux génétiquement altérés dédiés à la recherche scientifique dans divers domaines tel que la cancérologie, cardiologie, neurologie, maladies métaboliques etc. Pour cela, nous utilisons une méthode de prélèvement de queue pour la caractérisation génétique. De plus, nous hébergeons des lignées immunodéprimées pour certains projets expérimentaux.
Bénéfices attendus
Les lignées immunodéprimées ont pour objectif de répondre à des questions scientifiques dans le domaine de l’immuno-oncologie ou pour le maintien d’un statut sanitaire SPF avec les sentinelles. Le génotypage permet la caractérisation génétique des lignées génétiquement altérées avec (animaux immunodéprimés) ou sans phénotype dommageable pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques des différentes structures travailant dans notre animalerie (thématiques développées : cancérologie, digestif, cardiaque, osseux...).
Procédures
Prélèvement de queue (1mm), une seule fois.
Impact sur les animaux
La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vu immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptées.
Devenir
Les animaux sont prévus pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques. La biopsie de queue permet le gnéotypage et en fonction des croisement effectués permettra d'identifier les animaux utiles aux études. Ceux dont le génotype ne serait pas d'intérêt seront mis à mort en sachant que les croisements sont réalisés de manière à optimiser au maximum la génération d'animaux à génotypes intéressants.
Remplacement
Jusqu’à présent la méthode de biopsie de queue était la plus efficace pour identifier génétiquement les animaux. Cependant nous réfléchissons à mettre en place des méthodes moins invasives tel que le génotypage via prélèvement de la salive. La difficulté d’une méthode non invasive est qu’elle doit être applicable à tous et implique d'avoir une méthode génotypage standard avec des kits commerciaux, ce qui n'est pas le cas dans toutes les équipes de recherche. Nécessité d’utilisation des animaux pour l’objectif de projets en immuno-oncologie. Concernant les sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, ce qui nous affranchirai de l’utilisation des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est basé sur les statistiques des années précédentes et en lien avec les différents besoins en fonction des projets scientifiques. Ce dernier reste suffisamment important pour pouvoir y inclure de futurs projets d’ici les 5 prochaines années. Néanmoins nous avons pu observer une baisse de production des animaux d’élevage depuis 2020. Nous réfléchissons à développer des méthodes de génotypage moins invasives tel que le prélèvement par la salive. Concernant les sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode alternative aux animaux de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, ce qui nous affranchirai de l’utilisation des animaux. Lorsqu’une lignée n’a plus d’intérêt scientifique à long terme, nous optons de plus en plus pour un arrêt de cette dernière et d’envisager une méthode de conservation autre tel que la cryoconservation.
Raffinement
La biopsie de queue est réalisée lors du baguage soit en vigile soit sous anesthésie générale. Cette méthode est approuvée, précise, rapide (quelques secondes), standardisée et réalisée par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vu immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptés avec un statut sanitaire stricte et une fréquence de change rapprochée. Dans toutes les préocédures des points limites précoces sont mis en place afin de minimiser au maximum la douleur des animaux.
Choix des espèces
Nous avons majoritairement des élevages de souris et un petit élevage de rats. Ces animaux sont utilisés en fonction des besoins pour les différents projets scientifiques. Les animaux restent à minima le temps du sevrage de ces deniers, soit 3 semaines (21jours), ils sortent ensuite en fonction des âges utilisés dans les projets pour lesquels ils sont produits. La biopsie de queue quand elle est nécessaire est réalisée entre 1 semaine et 3 semaines d'âge en fonction de l'âge auxquels les animaux seront utilisés dans les études ultérieures.
Rôle de deux gènes dans les tumeurs de lymphome B
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Poinçonnées à l'oreille pour génotypage, elles sont ensuite palpées chaque jour à partir de trois mois pour détecter les tumeurs, pesées et sondées par voie rectale jusqu'à trois fois par semaine, certaines recevant une injection destinée à déclencher une réaction immunitaire. Le suivi court jusqu'à 24 mois, les souris étant tuées dès 20 % de perte de poids ou une température corporelle sous 34 °C, seuils censés éviter les douleurs sévères liées au développement du lymphome. Le porteur conclut qu'"aucune alternative au modèle animal n'est disponible" pour tester l'effet de deux mutations sur un cancer du sang en présence d'un système immunitaire complet.
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but de mieux comprendre le rôle de deux gènes dans le développement du lymphome. Ce sont des cancers du sang qui se forment à partir des globules blancs qui sont les cellules productrices d’anticorps pour défendre les organismes lors des infections. Certains sous-types agressifs de lymphome, malgré des progrès thérapeutiques récents, restent mortels pour 40% des patients qui ont des altérations génétiques pour ces 2 gènes spécifiques. Le projet se développe en deux objectifs principaux : 1/ D'abord, développer une nouvelle lignée transgénique de souris avec des altérations sur les deux gènes puis 2/comprendre comment les altérations de ces deux gènes sont liées et participent à la formation du cancer en analysant le temps de mise en place des tumeurs et le comportement des globules blancs dans les potentielles tumeurs qui se développeront chez les animaux générés
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact de l'altération génétique de ces deux gènes que l'on retrouve chez des patients atteints de lymphome de mauvais pronostic, et d'identifier des mécanismes susceptibles de faire l'objet de développements thérapeutiques pour améliorer la survie et le bien-être des patients atteints par cette maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: - Prélèvement d’un bout d’oreille pour analyse génétique (fréquence: une seule fois, durée: 5 secondes) - Manipulation et palpation des souris pour surveiller leur état général (surveillance quotidienne à partir de 3 mois, durée : 1minute). - Pesée des animaux (durée : 30sec, fréquence : bimensuel jusqu’à 15 mois, hebdomaire entre 15 et 18 mois et 2fois/sem après 18 mois) - Prise de température (durée : 10sec, fréquence : bimensuel jusqu’à 15 mois, hebdomaire entre 15 et 18 mois et 2fois/sem après 18 mois) - Injection ventrale d'une substance générant une réponse immunitaire chez la souris (durée: 20 secondes, fréquence : une seule fois).
Impact sur les animaux
Pour les souris reproductrices et leurs petits, nous attendons une douleur légère et de courte durée lors des prélèvement de peau de l'oreille par poinçonnage des nouveaux animaux pour déterminer leur profil génétique. Pour les souris qui seront étudiés pour le développement du cancer, un stress et un inconfort léger est attendu liée à la manipulation pour observer l’état de l’animal. La pesée engendrera également un stress léger puisque nécessitant de déplacer l’animal. Quant à la prise de température, elle se fera grâce à une sonde rectale engendrant un incofort et un stress léger chez l’animal. De plus, nous attendons des douleurs légères causées par la palpation des tumeurs à surveiller. Nous attendons aussi des douleurs modérées liées au développement tumoral et au vieillissement des animaux. Les points limites mis en place permettront d’éviter des douleurs sévères causées par le développement des lymphomes. Enfin, une douleur légère et de courte durée est attendu pour les souris qui recevront une injection ventrale d’une substance capable de générer une réaction immunitaire. Par la suite, pour ces souris recevant cette injection une douleur et un stress modéré sont attendus en raison de la réaction immunitaire déclenchée par l'antigène.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. En effet, l'information scientifique sera obtenue à la fin de chaque procédure ne nécessitant alors plus de garder les animaux en vie ce qui pourrait engendrer de potentielles souffrances inutiles liées au développement d'un lymphome.
Remplacement
Pour étudier le développement tumoral, il est nécessaire d'avoir recours à un organisme vivant. De plus, il n'existe pas encore de modèles alternatifs susceptibles de tester à la fois l'effet de mutations génétiques sur le cancer tout en intégrant le comportement cellules cancéreuses avec un système immunitaire complet. Ainsi, aucune alternative au modèle animal n'est disponible pour répondre à notre question scientifique.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans nos expériences, les mesures suivantes seront prises : 1/ Partage des échantillons cellulaires de souris au sein de l'équipe, de sorte qu'un même échantillon puisse servir à plusieurs projets, évitant ainsi d'utiliser plusieurs souris pour des expériences similaires. 2/ Nous avons effectué un calcul de puissance statistique pour déterminer le nombre de souris et donc de reproducteurs nécessaires dans chaque procédure. puis nous ferons des analyses statistiques pour comparer les groupes de souris et éviter de répéter des expériences inutilement, ce qui réduira le besoin d'animaux. 3/ Optimisation de l'utilisation du matériel prélevé sur les tumeurs en le conservant de manière à ce qu'il puisse être utilisé plusieurs fois. Cela inclut la congélation des cellules provenant de différents organes, l'extraction du génôme et la préparation des organes pour des analyses. Cette approche évitera la duplication des expériences. 4/ Utilisation d'animaux mâles et femelles permettant de réduire considérablement le nombre d'animaux à générer par reproduction. 5/ Mise en place de stratégie de croisement des souris pour obtenir les mutations avec le moins de générations successives de souris possible.
Raffinement
Le raffinement se fera en adaptant la fréquence de surveillance et en enrayant une possible perte de poids et de température liée au développement tumoral. Les souris de plus de 3 mois seront surveillées quotidiennement (7jours/7) avec une prise de poids et de température tous les 15 jours jusqu'à l'âge de 15 mois afin de mettre en évidence l'un des points limites qui entraînera alors la mise à mort de la souris. Dès qu'une perte de poids de 10% sera constatée par rapport au maximum mesuré dans les semaines précédentes, il sera ajouté de la gelée et des croquettes mouillées dans la cage. Si une perte de poids de 20% est constatée, la souris sera immédiatement mise à mort. Pour les souris ayant une température entre 34 et 36°C, elles seront placées dans une enceinte chauffante pendant 48h. En dessous de 34°C, l’animal devra être mis à mort. Au-delà de 15 mois, les souris entrent dans un protocole de vieillissement et le suivi des animaux sera encore plus raffiné car le vieillissement peut accélérer la formation du lymphome. Ainsi, les souris de 15 à 18 mois seront pesées et une prise de température sera réalisée 1 fois par semaine. Pour les souris de 18 à 24 mois, la pesée et la prise de température seront réalisées 2 fois par semaine et au-delà de 24 mois, 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). Dès qu'une perte de poids de 10% sera constatée par rapport au maximum mesuré dans les semaines précédentes, il sera ajouté de la gelée et des croquettes mouillées dans la cage. Si une perte de poids de 20% est constatée, la souris sera immédiatement mise à mort. Pour les souris ayant une température entre 34 et 36°C, placer les souris dans une enceinte chauffante pendant 48h. En dessous de 34°C, l’animal devra être mis à mort. Dans tous les cas, les animaux seront mis à mort à 24 mois maximum.
Choix des espèces
La souris est un modèle qui permet d'étudier le rôle de deux mutations génétiques sur deux gènes différents par croisement d'individus. C'est un modèle de choix pour reconstituer un lymphome qui forme des tumeurs avec un système immunitaire complet similaire à ce qu'on retrouve chez l'Homme. Ainsi, la souris est le meilleur modèle pour comprendre l'impact de mutations génétiques qu'on retrouve chez l'Homme sur le développement tumoral. Pour les couples reproducteurs, les souris seront utilisées à partir de 6 à 8 semaines (ce qui correspond à la maturité sexuelle de ces animaux) et jusqu'à l'âge de 6 mois pour éviter l'expression du phénotype dommageable induit par la mutation d'un gène. Pour les souris utilisées à des fins expérimentales, elles seront utilisées à partir 6 semaines, cela afin d'avoir des individus avec un système immunitaire mature et car nous devons utiliser des souris adultes mais jeunes permettant de voir le développement des tumeurs.
Impact du stress in utero sur l’inflammation et la douleur
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
Trois séances de contention sous lumière vive par jour, trente minutes chacune, six jours de suite pendant la gestation, voilà ce que subissent une partie des 1 442 souris de ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent des pansements posés sur le dos sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines et des injections intrapéritonéales aux jours embryonnaires 7,5 et 10,5. Le porteur écrit que le modèle murin reste un "élément clé et incontournable" pour étudier l'effet du stress prénatal sur l'inflammation de la peau, faute de modèle cellulaire équivalent. Les mâles reproducteurs seront transférés à d'autres équipes, les femelles gestantes tuées à E18.5 ou après le sevrage, et les fœtus prélevés puis tués pour analyse.
Objectifs
Influencés par une variété de facteurs environnementaux, les maladies allergiques connaissent une augmentation constante de leur prévalence à l'échelle mondiale, tant dans les pays développés que dans les pays en voie de développement. D'une façon intéressante, ces maladies sont souvent déclenchées ou aggravées par le stress chronique, bien que les données biologiques expliquant ces phénomènes restent largement incomplètes. Notre projet a donc pour objectif d'examiner l'effet du stress sur la susceptibilité à développer une inflammation allergique, et le cas échéant, de dévoiler les mécanismes moléculaires responsables de cet effet. En effet, la période prénatale est une période critique durant laquelle tous les systèmes physiologiques, y compris les systèmes nerveux et immunitaire, développent leurs fonctions spécifiques et apprennent à s'adapter aux éventuels stimuli déclencheurs. Nous avons récemment mis en évidence l'existence de ce qu'on appelle 'unités sensorielles' dans la peau, formées par les mastocytes (cellules immunitaires spécialisées) et les neurones sensoriels (responsables de la détection de stimuli sensoriels), qui contribuent au développement de l'inflammation allergique de la peau. Nous éméttons donc l'hypothèse que le stress, plus particulièrement le stress prénatal, pourrait contribuer au développement de l'inflammation de la peau de la descendance in utero, en perturbant, au moins en partie, les phénotypes des mastocytes et des neurones sensoriels, et donc les unités fonctionnelles neuro-immunes cutanées associées.
Bénéfices attendus
Le présent projet aborde une question clé en explorant le rôle de l'exposition du fœtus au stress prénatal et ses conséquences sur la susceptibilité à développer une inflammation après la naissance. Il permettra de dévoiler, pour la première fois, les mécanismes biologiques sous-jacents activés par l'exposition au stress. Cela apportera des informations inestimables sur d'éventuels événements indésirables prénataux associés au développement des caractéristiques classiques de l'eczema pédiatrique, donnant lieu à des publications de haut niveau, protégées par des brevets découvertes et, surtout, de nouvelles options thérapeutiques/préventives potentielles pour les troubles allergiques.
Procédures
- Procédures 1/3: Les souris seront mises en stress de contention sous une lumière vive, 3 fois par jour durant 30 minutes, sur 6 jours consécutifs. Nombre de souris: 140 (P1)+162 (P3) = 302 - Procédure 2: Un pansement imbibé d'une solution physiologique sera déposé sur le dos des souris, sous anésthésie, 2 fois par semaine (lundi et mercredi, 3-5min par souris), pour une durée de 3 semaines (3 cycles au total). Nombre de souris: 504 - Procédure 4: Les souris seront injectées au jour embryonnaire 7.5 ou E10.5 en intra-péritonéal (~1min/souris). Nombre de souris: 360 - Procédure 5: Les souris seront injectées en intra-péritonéal avant chaque session de stress (~1min/souris), voir trois fois par jour, sur 6 jours consécutifs. La génération F1 sera patchée (3-5min par souris). Nombre de souris: 276
Impact sur les animaux
Dans le projet proposé, les souris subiront des procédures de classe modérée qui pourraient avoir des effets indésirables ou des nuisances. Les principales nuisances attendues sur les animaux incluent: (1) comportements anormaux liés au stress comme la prostration, isolement, absence de nettoyage (bien que nous n’ayons pas observé de nuisance qui perturberait le comportement soit de la souris stressée, soit de la descendance dans les expériences que nous avons déjà faites en accord avec le protocole éthique précédent utilisant ce modèle); (2) Irritation cutanée due à l'application du patch: l'application de patch peut causer une légère gêne cutanée, une irritation temporaire sur la zone d'application et une légère inflammation; (3) Les injections pourraient causer une douleur passagère au site d'injection et un stress modéré due à la manipulation répétée. Ces effets indésirables vont être soigneusement surveillés et gérés pour minimiser l'impact sur le bien-être des animaux, en appliquant les mesures de raffinement appropriées décrites dans la section 5.10.3.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure correspondante: - Les souris mâles utilisées pour les accouplements seront séparées et proposées à la communauté scientifique. - Les souris femelles utilisées pour les accouplements et subissant le stress seront euthanasiées ou bien au jour embryonnaire E18.5 ou bien après le sevrage (semaine 3). - Les souris de la descendance seront euthanasiées à E18.5 ou à la semaine 8 avant toute intervention ou après le patch.
Remplacement
Ce projet vise à identifier les mécanismes biologiques, induits par l'exposition au stress durant la gestation. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire qui peut substituer l'usage d'animaux pour investiguer cela. La substitution également par l'humain n'est pas évidente, étant donné que le niveau de stress est relatif à chaque personne (ce qui sera source de variabilité pour notre étude), et l'accès à des échantillons de foetus ou de mamans durant la gestation/ou atteints d'éczema n'est pas toujours possible. Le modèle murin est donc un élément clé et incontournable pour étudier l'effet du stress prénatal sur le dialogue entre neurone sensoriel et mastocyte dans le cadre de l'inflammation de la peau.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans le modèle de stress prénatal et de patch de peau (protocoles éthiques obtenus précedemment) et la présence de data préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne (12 femelles par groupe, par génotype, réparties entre controle et stress). Ce nombre pourra éventuellement varier à la hausse ou à la baisse (+/- 3 animaux par groupe) en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. Ces femelles seront accouplées avec 8 mâles aux génotypes correspondants, pour un rapport 2mâles x 3femelles. Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées.
Raffinement
Jusqu'à présent, le taux de mortalité issu des expériences proposées n'atteint pas les 0.1%. Quant au modèle de patch ou de stress, aucun taux de mortalité n'a été détecté jusqu'à présent. D'autre part, lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera monitoré régulièrement. Nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels que le comportement de prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si nécessaire, des antalgiques seront administrés (surtout si des effets indésirables liés au patch surviendront bien qu'aucune manipulation précédente n'a impliqué cela). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien des signes de baisse de température (isolement, mouvement moindre, confirmée par la prise de la tempéraure corporelle et détéction d'une baisse de 3° par rapport à la température d’origine), les animaux seront euthanasiés. Ces cas de figure n’ont encore pas été présentés lors des procédures employées dans d’autres protocoles éthiques déjà validés. Enfin, nous utiliserons des techniques de préhension adaptée (main en coupe ou igloo) aux souriceaux afin d'éviter un stress supplémentaire et maintenir le bien-être des souris. Les injections seront aussi réalisées par un personnel compétent pour éviter la douleur des souris. Les souris mâles mis en accouplement seront réutilisés par d’autres expérimentateurs.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines, surtout l'inflammation de la peau (taux de similarité important). En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués transgéniques, qui dans notre cas, permettront l'étude du rôle des mastocytes et des neurones sensoriels, et l'effet du stress sur ces cellules. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sont déjà disponibles dans le laboratoire. L'utilisation de méthodes alternatives (ex. avoir recours à des biopsies humaines, etc. sera d'un grand intêret mais cependant limite le projet, étant donné que les niveaux de stress sont relatifs à la personne en question, ce qui apportera une variabilité dans nos analyses. Trois stades/périodes de développement seront d'intêret durant notre projet: 1- Jour embryonnaire E13 à E18: cette période de gestation sera la période durant laquelle les sessions de stress seront conduites. Non seulement cette période est celle décrite pour le modèle, mais elle correspond également à la période de développement des cellules d'intêret, y compris les neurones et les mastocytes. 2-Jour embryonnaire E18.5: les souris gestantes seront euthanasiées et les foetus prélévés, euthanasiés et analysés pour les études à l'état basal. Ce stade représente le dernier jour du protocole de stress ainsi qu'un time-point où les neurones et les cellules immunitaires sont déjà présents dans la peau des souris. 3- Semaine 8: les souris de la génération F1 seront patchées à l'âge de 8 à 12 semaines car elles présentent un système immunitaire mature à ce stade. Le modèle de patch dure 3 semaines, les souris seront euthanasiées à la fin du modèle.
Impacts directs et multigénérationnels d’obésogènes et de perturbateurs métaboliques sur le xénope tropicalis (Silurana xenopus tropicalis)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
4 640 xénopes tropicaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 1 500 têtards sont exposés dix mois durant, du stade têtard à l'âge adulte, à un mélange de six polluants dont le tributylétain et le benzo[a]pyrène, 1 500 autres servant de témoins, et leurs descendants sur deux générations subissent les mêmes mesures. Les tests imposent des injections dans le ventre ou dans les sacs lymphatiques, des prélèvements de sang au doigt toutes les heures pendant six heures, et une injection de phytohémagglutinine dans une patte pour mesurer le gonflement à douze heures puis sept jours plus tard. Le porteur écrit que ces concentrations ne sont pas censées faire souffrir tout en reconnaissant qu'il ne peut pas évaluer la souffrance liée à l'exposition, et présente le recours au xénope plutôt qu'au rongeur comme un "Remplacement".
Objectifs
Des études récentes suggèrent que les effets métaboliques transgénérationnels induits par les perturbateurs endocriniens (PE) sont des facteurs impliqués dans le déclin des populations d’amphibiens en altérant leur capacité à se reproduire. Cependant, plusieurs questions se posent : Comment les PE agissent chez les amphibiens ? Quelles sont leurs effets sur les autres axes endocriniens ? Quel parent transmet l’effet à la descendance ? Quels sont les mécanismes responsables de la transmission des effets sur plusieurs générations ? Ce projet répondra à ces questions en étudiant les effets d’une mixture de 6 PE à concentrations environnementales sur 3 générations de X. tropicalis (F0 directement exposée, F1/F2 non exposées). Les effets seront évalués à chaque génération par l’étude du développement, des effets reproducteurs, thyroïdiens et neuro-développementaux, des perturbations métaboliques et de la transmission des effets entre générations.
Bénéfices attendus
D'un point de vue scientifique, la recherche générera de nouvelles connaissances et technologies dans les domaines de la physiologie animale, de la perturbation endocrinienne, de la transmission des effets au cours des générations et de l'écotoxicologie. Les informations sur l'impact transgénérationnel des PE chez les vertébrés font défaut et les méthodologies d'exposition des animaux à de faibles concentrations de polluants tout au long de leur vie doivent être testées. Ce projet permettra de comprendre quel sexe transmet les effets des PE à la descendance. D'un point global, la protection de la biodiversité et de la santé humaine est essentielle. Les amphibiens représentent une proportion élevée de la diversité des espèces mondiales et sont largement répandus. Plusieurs études ont démontré que plus la biodiversité des amphibiens est grande dans les zones humides, plus l'écosystème est protégé contre les maladies, y compris celles qui touchent les humains. En fournissant des résultats sur les effets transgénérationnels métaboliques des PE, les données obtenues peuvent être appliquées non seulement aux amphibiens mais aussi aux vertébrés supérieurs, y compris les humains. Comme le modèle xénope partage de nombreuses voies métaboliques avec l'homme, il est de fait un bon prédicteur des effets des PE chez l'homme. Toutes les données générées par ce projet multidisciplinaire seront disponibles pour les organisations qui gèrent la biodiversité ou sont impliquées dans l'évaluation des risques chimiques (OFB, ANSES) et aideront les décideurs à protéger la qualité de l'environnement naturel et à améliorer la santé des écosystèmes. Un objectif important est d'identifier des biomarqueurs précoces potentiels de perturbations métaboliques qui seront applicables à différentes espèces d'amphibiens vivant dans des écosystèmes pollués. La recherche proposée soutiendra l'élaboration de politiques et de lignes directrices qui guideront la conservation des populations d'amphibiens et la gestion des PE.
Procédures
Les xénopes de la génération F0 seront exposés à un mélange de perturbateurs endocriniens (tributylétain, di-2-éthylhexyl phthalate, polybromodiphényle éther 47, triclosan, benzo[a]pyrene, et 4,4’-dichlorodiphényldichloroéthylène) du stade têtard (stade 10 de Nieuwkoop et Faber) au stade adulte pendant une génération (F0) (~10 mois). Au total 1500 têtards seront exposés aux PE et 1500 serviront de contrôles. Pour les tests de tolérance au glucose et de résistance à l’insuline, des injections sont effectuées sur animaux vigiles dans le ventre (intrapéritonéale) ou dans les sacs lymphatiques dorsaux. A la suite de ces injections des dosages de glycémie sont effectués par prélèvements digitaux toutes les heures pendant 6 heures (2 lots d’animaux, exposés et témoins, pour la génération F0 et 4 lots pour les générations F1 et F2 soit un total de 400 animaux (80 F0, 160 F1 et 160 F2). Pour les tests de sécrétion d’insuline, les xénopes subissent une injection intrapéritonéale de glucose à T0 et sont euthanasiés 30 minutes après. 10 mâles et 10 femelles par condition seront utilisés pour les tests de de sécrétion d’insuline après injection de glucose à chaque génération soit un total de 200 animaux (40 F0, 80 F1 et 80 F2). Pour les tests immunitaires, les animaux reçoivent une injection de phytohémagglutine A dans la jambe droite (50 µl à 2 mg/ml) et de solution saline (50 µl de PBS dans la jambe gauche). A T0 et T12heures, le diamètre de chaque jambe est mesuré et un prélèvement digital est réalisé pour faire un frottis sanguin. Cette opération est répétée 7 jours après pour évaluer la mémoire immunitaire. 10 mâles et 10 femelles par condition seront utilisés pour les tests. Pour la fécondation in vitro, les animaux reçoivent deux injections dans les sacs lymphatiques dorsaux d’hCG à 20 heures d’intervalle. A la suite de la seconde injection, les femelles sont laissées tranquilles dans des aquariums pour attendre la ponte qui se fait de manière naturelle environ deux heures après. Les mâles sont euthanasiés deux heures après la deuxième stimulation. Les femelles sont euthanasiées à la fin de la période de ponte. 15 mâles et 15 femelles par condition (traités et non traités pour F0 et les 4 conditions issues des 4 modalités d’accouplement pour F1 et F2) seront utilisés à chaque génération pour les accouplements en vue d’obtenir la génération suivante. Le nombre total d’animaux sera de 300 (60 pour F0, 120 pour F1 et 120 pour F2).
Impact sur les animaux
Les concentrations utilisées sont celles des normes de qualité environnementales. Elles ne sont pas senser induire de souffrance chez les animaux. Il se peut cependant que les effets des PE puissent entrainer une surmortalité ou des malformations mais il n’est pas possible d’évaluer le degré de souffrance engendré par l’exposition. Les prises de sang digitales pour les tests de tolérances au glucose ou de résistance à l’insuline et les injections intrapéritonéales de glucose ou d’insuline dans les sacs lymphatiques sont susceptibles d’entrainer des douleurs légères. Au stade têtard des déformations de la colonne vertébrale sont décrite comme pouvant survenir lors d’un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d’organes ou des tests métaboliques.
Remplacement
Les manipulations réalisées sur ces animaux ne peuvent pas être substituées par des manipulations sur cultures cellulaires car les effets observés sont le jeu d’actions et d’interactions entre différents organes et systèmes. Le modèle xénope pour évaluer l’effet des PE en milieu aquatique permet le « Remplacement » du modèle rongeur classiquement utilisé en toxicologie.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal pour ne pas mettre en péril les manipulations et avoir des résultats significatifs statistiquement (plan d’expérience élaboré avec des statisticiens). Chaque animal est utilisé pour plusieurs types de manipulation et l’utilisation des différents lots n’est justifié que par la petite taille des organes et des volumes possibles de prélèvements sanguins qui limitent le nombre de manipulations possible sur un même échantillon.
Raffinement
Les protocoles d’exposition mis en œuvre permettent de mimer les conditions du milieu (exposition par l’eau) pour confirmer et transposer les résultats obtenus à court terme sur le terrain. Ce genre d’exposition n’entraine pas de souffrance chez l’animal contrairement à l’injection de polluant par voie intrapéritonéale classiquement utilisée en toxicologie. Des points limites ont été définis et adaptés au modèle xénope
Choix des espèces
Le choix de l’espèce xénope tropicalis est justifiée par deux raisons majeures : 1) son temps de génération court pour un amphibien (~10 mois du stade œuf à adulte mature) permet l’étude de l’effet des polluants sur plusieurs générations et 2) c’est une espèce dont le génome est entièrement séquencé et diploïde permettant ainsi des études transcriptomiques ou épigénétiques. C’est un modèle dont nous maitrisons l’élevage au laboratoire (certificat de capacité obtenu) et pour lequel nous avons déjà réalisé des études multigénérationnelles. Les animaux seront utilisés du stade gastrula au stade adulte mature sexuellement. Les PE agissent sur de nombreuses cibles au stade larvaire et durant tout le cycle de développement jusqu'au stade adulte mature sexuellement. Il est donc important de regarder les impacts de ces polluants à différents stades du développement des animaux.
Suivi du devenir des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs et de leurs effets sur le système immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
7 324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales, une partie ensuite des injections intraveineuses ou directement dans la tumeur deux fois par semaine pendant neuf semaines au maximum, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires sur trois semaines et une mesure de la tumeur au pied à coulisse deux fois par semaine. Le projet vise à suivre les vésicules émises par les tumeurs et à comprendre comment elles agissent sur les cellules immunitaires, des applications thérapeutiques n'étant évoquées que comme une possibilité ouverte à cinq ans. Le porteur annonce dix souris par groupe expérimental comme règle générale, sans expliquer comment on passe de ce chiffre aux 7 324 animaux du projet.
Objectifs
Le cancer est actuellement la deuxième cause principale de décès à l'échelle mondiale. L'immunothérapie a révolutionné le traitement de certains patients mais dans environ 70% des cas, cette approche s’avère inefficace. Pour améliorer les traitements, il est essentiel de comprendre comment le cancer communique avec notre système immunitaire. Une partie de cette communication se fait via de petites vésicules lipidiques appelées "vésicules extracellulaires", porteuses d’informations génétiques et protéiques. Ces vésicules sont sécrétées par toutes les cellules, mais lorsqu’elles sont sécrétées par les cellules tumorales, elles peuvent moduler la croissance des tumeurs, notamment en interagissant avec la surface des cellules immunitaires ou après capture par ces mêmes cellules. Bon nombre d’études dans ce domaine reposent sur l’utilisation de modèles de culture cellulaire très éloignés d’un contexte physio-pathologique. L’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires, est donc une étape cruciale pour comprendre comment les tumeurs communiquent avec notre système immunitaire grâce à ces vésicules extracellulaires. Notre projet de recherche vise à suivre in situ ces vésicules extracellulaires, afin d'étudier leur capacité à interagir avec les cellules du système immunitaire et à en moduler la fonction, de comparer le devenir de différents types de vésicules extracellulaires émises par les cellules tumorales, et d’analyser le mode d’action de ces vésicules dans les cellules réceptrices. Une dernière étape consistera à moduler in vivo la sécrétion de ces vésicules de tumeurs pour moduler leurs effets sur le système immunitaire. Ces travaux permettront d’analyser le rôle de ce mode particulier de communication entre les tumeurs et le système immunitaire. Ils pourraient ouvrir la voie au développement de futures thérapies anticancéreuses ciblant spécifiquement ce mode de communication. L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau mode de communication entre cellules cancéreuses et système immunitaire.
Bénéfices attendus
Le cancer est la seconde cause de décès dans le monde, malgré les récentes innovations thérapeutiques. Dans le contexte des immunothérapies visant à reprogrammer le système immunitaire contre le cancer, il est essentiel de mieux comprendre les interactions entre les cellules tumorales et le système immunitaire. Ce projet étudie la communication entre les cellules tumorales et les cellules du système immunitaire grâce au développement de nouvelles méthodes de suivi de vésicules extracellulaires. Il a pour objectif d'identifier le type de cellules immunitaires ciblées par les vésicules extracellulaires issues des tumeurs et de comprendre le mode d’action de ces vésicules. Il découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Avant d'envisager toute application clinique ou thérapeutique chez l'Homme, l’étude de ce processus dans un modèle de tumeur in situ chez la souris est une étape cruciale. Nous prévoyons d'atteindre ces objectifs dans les cinq prochaines années. Les résultats que nous recueillerons grâce à ce projet peuvent ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques en identifiant les types de cellules immunitaires ciblées par les vésicules extracellulaires. Notons que ces vésicules s’accumulent dans les fluides corporels, elles peuvent donc être aisément ciblées par des stratégies thérapeutiques basées sur des protocoles d’injection .
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées à tous les animaux vigiles (1 fois par expérience, durée du geste inférieure à 10 sec). Certains animaux sont ensuite traités selon 3 protocoles: soit directement dans l’eau de boisson, soit par injections aux animaux vigiles (2 injections à 24h d’intervalle – durée du geste inf à 10sec) soit par eau de boisson et injections. Certains animaux reçoivent un produit préparé au laboratoire par voie intraveineuse (durée du geste inf à 10sec), et d’autres par voie intra-tumorale, ou un produit commercial par voie intra-tumorale, 2 fois par semaine au long de l’expérience (maxi 9 semaines). Des prélèvements sanguins à raison d’1 prélèvement/sem pendant 3 sem) sont réalisés sur une partie de ces animaux (durée de chaque prélèvement inf 20sec – animaux sous anethésie légère). Les animaux sont observés et le développement de la tumeur est mesuré par pied à coulisse 2 fois par semaine (durée du geste inférieure à 20 sec).
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de l’injection sont limitées à la piqure elle-même : douleur légère immédiate, durée brève. La supplémentation de l’eau de boisson avec de la(Vitamine H, ne devrait pas avoir d’effet sur la quantité d’eau bue par les animaux. Aucun effet délétère n’est attendu y compris en cas de surdosage. Les nuisances attendues lors des injections de « traitement » ou des prélèvements sanguins seront celles liées aux piqures elles-mêmes (douleurs légères immédiates de courte durée)
Devenir
Les animaux seront sacrifiés pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus.
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture, ayant permis la validation des méthodes de suivi des vésicules extracellulaires dérivées de tumeur et de leur mode d’interaction avec les cellules cibles. Le projet, centré sur l’étude d’un mode particulier de communication intercellulaire, nécessite l’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires. A notre connaissance, aucun modèle in vitro (co-culture, organoïde) ou in silico ne peut se substituer à un modèle animal. Le modèle murin est le plus adapté compte tenu de l’organisation de son système immunitaire, proche de celle de l’Homme.
Réduction
1. Les tests in vitro nous ont permis de sélectionner les molécules d’intérêt, réduisant donc le nombre d’animaux à utiliser 2. Nous utiliserons de façon générale 10 souris par groupe expérimental. Ce nombre prend en compte la variabilité intrinsèque à notre modèle, notamment le taux d’obtention de tumeur par injection de cellules tumorales, et permettra l’analyse finale de groupes d’au moins 8 animaux. Il se base aussi sur nos connaissances de nos modèles tumoraux et prend en compte la quantité de matériel cellulaire nécessaire pour les 3 types d’analyses biochimiques post-mortem prévues. Toutes les lignées tumorales génétiquement modifiées seront au préalable validées in vitro.
Raffinement
Les modèles développés pour ce projet nécessitent un minimum d’intervention sur les souris, réduisant le stress et la douleur potentielle. Les souris seront suivies tous les 3 jours pour surveiller leur état général. Une grille de score sera utilisée pour évaluer leur état de manière objective. En cas d’atteinte des points limite tel que décrit dans la grille de score, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Comparé à d’autre modèles animaux, la souris est le modèle de choix pour les recherches en immunologie et cancérologie pour sa proximité avec l’homme, et nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris. Les modèles de tumeurs transplantées sont de plus couramment utilisés chez cette espèce Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 16 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.
Rôle des hormones thyroïdiennes et du récepteur nucléaire TRa1 dans la physiopathologie intestinale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Les souris utilisées sont génétiquement modifiées, et l'une des lignées développe des cancers de l'intestin par mutation d'un gène suppresseur de tumeur. 5 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des hormones thyroïdiennes en injection quotidienne pendant deux jours ou en continu dans l'eau de boisson, et la mise à mort intervient au plus tard huit mois après l'induction tumorale. Le porteur écrit choisir d'interférer le moins possible et, pour cela, de ne pas administrer de traitement contre la douleur, en se limitant à une surveillance quotidienne.
Objectifs
Le but du projet est de réaliser des expériences permettant d’analyser les effets des hormones thyroïdiennes sur la croissance de tumeurs chez la souris. Nous savons par nos travaux antérieurs que ces hormones influent le développement de certains cancers, dont le cancer colorectal. Nous utiliserons des modèles de souris qui nous permettront une analyse détaillée de cette fonction. En parallèle, en collaboration avec des cliniciens nous évaluerons les retombés de nos travaux fondamentaux en clinique.
Bénéfices attendus
Nous serons en mesure d’analyser l’effet des hormones thyroïdiennes sur la croissance tumorale in vivo et de définir l’impact de l'altération de leur récepteur nucléaire dans ce même contexte. Les analyses cellulaires et moléculaires nous permettront d’acquérir des connaissances et de tester des cibles thérapeutiques potentielles pour bloquer la croissance tumorale.
Procédures
Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dont les mutations seront induites expérimentalement et une des lignées de souris développera des cancers dans l’intestin. Pour étudier l’impact de l’hyperthyroïdie sur le développement tumoral les animaux recevront également un traitement aigu avec les hormones thyroïdiennes (une injection par jour, pendant 2 jours) ou subclinique (hormones thyroïdiennes dans l’eau de boisson pendant toute la durée de la procédure). Toutes injections de produits se feront en quelques seconds sur animal vigile.
Impact sur les animaux
La mutation du gène suppresseur de tumeur Apc induit la croissance tumorale dans l’intestin. La cinétique du développement tumoral est bien connue, permettant de maitriser le suivi des animaux et la mise à mort interviendra au plus tard 8 mois après induction tumorale, limitant la taille et l’agressivité des tumeurs. Il est possible que les phénotypes et la vitesse du développement tumorale varie d’un animal à un autre. On choisit d’interférer le moins possible et pour cela de ne pas effectuer de traitement pour soulager la douleur de l’animale, mais on veillera quotidiennement chaque animal. Les injections par voie intra-péritonéale induisent une douleur de classe légère. Elles seront réalisées par des personnes agrémentées et aguerries, mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration. Le traitement avec les hormones thyroïdiennes provoque une hyperthyroïdie légère, qui n’aura pas d’effets majeures.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Notre but est de mener des analyses sur plusieurs tissus (tumeurs et organes) prélevés après la mise à mort de chaque animal.
Remplacement
Nous étudions la physiopathologie intestinale et plus spécifiquement les mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans le maintien de l’épithélium intestinal et les altérations conduisant à la transformation cellulaire et aux tumeurs. Nous utilisons la souris comme organisme modèle pour reproduire chez l'animal des pathologies (cancer) à des fins cognitives et dans le but d’établir une recherche translationnelle. Il est évident que l'animal du point de vue physiologique intégratif est absolument nécessaire pour les observations de base et pour valider leur relevance dans la pathologie étudiée.
Réduction
Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
L'expertise du laboratoire dans l'étude de la physiopathologie intestinale permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et avec des points critiques étroitement surveillés. Durant la durée de l'étude, les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des dans des cages agrémentées disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Les animaux sont surveillés quotidiennement. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif) sera effectué. Des points limites (poids et état de maigreur, contrôle du site d’injection) ont été établis permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.
Choix des espèces
La physiologie intestinale chez la souris est bien caractérisée et la souris reste le modèle animal de choix pour effectuer des expériences de modifications génétiques in vivo qui recapitulent la pathologie humaine. Spécifiquement, nous étudions les mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans le maintien de l’épithélium intestinal et les altérations conduisant à la transformation cellulaire et aux tumeurs. Il s’agit de processus complexes qui impliquent non seulement les cellules épithéliales intestinales mais également les cellules du microenvironnement (stromale et immunitaire). Dans ce cadre, l'animal du point de vue physiologique intégratif est absolument nécessaire. La souris est idéale car les processus précédemment cités sont très conservés entre l'Homme et la souris. Cela a une valeur translationnelle directe. Les souris seront âgées d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur des stades adultes. Nous utiliserons les animaux à des stades différents après altérations génétiques ou traitement hormonale (2 jours, un mois et deux mois), pour étudier les effets à court-terme (2 jours) ou a moyen-terme (un mois) sur l’altération de la physiologie intestinale et son rétablissement (2 mois) après traitement. Nous analyserons également la cinétique de l’induction tumorale dès les stades précoces (un mois et deux mois) jusqu’au développement des lésions précancéreuse et cancéreuses (3,5,6 et 8 mois).
Evaluation de l’éfficacité d’immunotherapies à base de cellules CAR-T innovantes contre cellules tumorales.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Deux injections de cellules tumorales et de cellules CAR-T sous anesthésie ouvrent le protocole, suivies chaque semaine d'une injection dans l'abdomen et de huit minutes d'anesthésie gazeuse pour photographier la tumeur, pendant quatre à six semaines. 5 600 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec un prélèvement sanguin trois semaines après l'injection des cellules CAR-T et des pesées hebdomadaires. La tumeur peut provoquer douleur, mobilité réduite, perte de poids et prostration. Les souris jugées inaptes lors de la constitution des groupes sont tuées aussitôt, les autres au gaz carbonique avant tout point limite, à la fin de la période ou dès que l'objectif scientifique est atteint.
Objectifs
L’immunothérapie, une avancée majeure en médecine, exploite les mécanismes naturels du système immunitaire pour combattre diverses maladies, notamment le cancer. Une approche importante de cette thérapie consiste à isoler des cellules du système immunitaire du patient (les lymphocytes T) et à les modifier génétiquement pour les rendre capables de reconnaitre et cibler des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses. Après culture et expansion en laboratoire, ces cellules modifiées connues sur le nom de CAR-T, sont réintroduites dans le patient, où elles traquent et détruisent sélectivement les cellules cancéreuses, constituant ainsi une approche innovante et un espoir dans le traitement du cancer. En effet, les cellules CAR-T sont désormais un élément essentiel de la prise en charge des patients atteints de cancers, tout comme la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et autres thérapies ciblées. Et pour cause, elles ont démontré des résultats cliniques remarquables dans le traitement des cancers du sang en rechute ou résistants aux traitements classiques, et sont en cours de développement pour les tumeurs solides. Malgré leurs succès, les cellules CAR-T présentent des défis et des limites. Des recherches actuelles visent à améliorer ces cellules en utilisant des manipulations génétiques pour réduire leur toxicité, les rendre plus durables dans le corps et prévenir leur perte d’efficacité anti-tumorale au fil de temps. De nombreux partenaires, faisant appel à notre expertise, s'efforcent à comprendre et à évaluer les conséquences des modifications génétiques spécifiques introduites dans les cellules CAR-T sur leur efficacité dans la lutte contre les tumeurs. Ils cherchent également à étudier comment les cellules CAR-T interagissent avec d'autres traitements potentiels tels que des médicaments ou des anticorps pour contrôler la progression des tumeurs. Pour ce faire, après la conception et la modification génétique de variants spécifiques de cellules CAR-T, nous évaluerons leur réponse anticancéreuse en les caractérisant d'abord dans le laboratoire (in vitro), puis en suivant leur évolution et en étudiant leur fonctionnement dans un modèle ronger (in vivo) greffé avec des lignées cancéreuses d’origine humaine. L’évaluation fonctionnelle in vivo est cruciale pour valider l'efficacité thérapeutique préclinique des différents variants de cellules CAR-T dans le traitement de différents types de cancers chez l'homme.
Bénéfices attendus
Bien que les cellules CAR-T, approche thérapeutique en plein essor, offrent des avantages significatifs dans le traitement de certains types de cancer, elles font face à plusieurs défis et limitations. Pour mieux comprendre le fonctionnement de ces cellules, des études expérimentales approfondies et des essais précliniques sont nécessaires Les traitements ciblant spécifiquement les tumeurs avec des cellules CAR-T peuvent parfois entraîner des effets secondaires sérieux, comme une réponse inflammatoire sévère et des problèmes neurologiques. De plus, ces thérapies peuvent être limitées par la durée pendant laquelle les cellules CAR-T restent actives dans le corps, la complexité de l'environnement autour de la tumeur et le manque d'antigènes spécifiques aux tissus cancéreux et n’étant pas exprimés sur les tissus sains du patient. Malgré les avancées dans le développement de différentes générations de cellules CAR-T, les progrès technologiques offrent de nouvelles possibilités pour améliorer encore leur efficacité et leur tolérance chez les patients. Dans le domaine de la recherche sur les cellules CAR-T, les modèles murins de greffes de cellules tumorales humaines sont extrêmement importants. Ils fournissent une plateforme pour étudier différents aspects, tels que la façon dont les cellules CAR-T reconnaissent les cibles tumorales, comment elles s'activent, leurs mécanismes d'action, leur durée d'activité, et comment elles sont tolérées. En recréant des conditions similaires à celles des patients atteints de cancer, ces modèles offrent un environnement expérimental précieux. En outre, ils reproduisent la diffusion et la migration des cellules CAR-T dans tout le corps, contribuant ainsi à une meilleure compréhension des réponses thérapeutiques et des interactions complexes entre cellules dans le contexte du traitement du cancer.
Procédures
Les souris seront soumises à divers actes de manipulation tout au long de ce projet, à savoir : 2 injections uniques de cellules par voie intraveineuse sur animal anesthésié au début de projet (
Impact sur les animaux
La durée de chaque étude inscrite dans ce projet est de 4-6 semaines, en fonction du type de tumeur ciblée et du temps nécessaire à sa croissance. Au cours de cette période, les animaux seront soumis à plusieurs procédures techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress, tels que : injections de cellules tumorales, injection de cellules CAR-T, suivi tumorale par imagerie ou par pied au coulisses, prélèvement sanguin (1 seul prélèvement de sang 3 semaines après l’injection de cellules CAR-T) et des pesées hebdomadaires. Des effets indésirables liés à la croissance tumorale pourraient apparaître : douleur, mobilité réduite, perte de poids, prostration. Cependant, nous avons mis en place des points limites pour minimiser la gêne et l'inconfort des animaux causéx par la présence de la tumeur. En cas de persistance de ces signes l’animal sera mis à mort. Tous les actes techniques sur les souris seront réalisés par du personnel expérimenté et spécialisé dans ces techniques afin de limiter les contraintes subies par l’animal, ce qui garantit leur bien-être tout au long des étapes expérimentales
Devenir
Au début de notre étude, lors de la constitution des différents groupes d’animaux en expérimentation (randomisation), ceux qui ne remplissent pas les conditions requises pour que la tumeur se développe correctement seront euthanasiés immédiatement. L'euthanasie par inhalation de CO2 sera appliquée à tous les animaux de l'étude avant d'atteindre tout point limite éthique, à la fin de la période expérimentale, ou dès que l'objectif scientifique est accompli.
Remplacement
Nous étudions attentivement comment différents modèles de cellules CAR-T, qui sont des cellules immunitaires modifiées pour combattre les cellules cancéreuses, fonctionnent. Pour ce faire, nous effectuons plusieurs tests pour comprendre à quoi elles ressemblent (leur phénotype) et comment elles agissent (leur fonction). Cependant, ces tests ont leurs limites car ils sont réalisés dans des conditions de laboratoire, en utilisant des plaques de culture où les cellules CAR-T sont mises en contact avec des cellules tumorales. Malgré toute l’information qu’il nous apporte, ce système en laboratoire est très simplifié et ne prend pas en compte de nombreux éléments importants qui existent dans le corps humain, notamment l'environnement complexe autour des tumeurs. Pour vraiment comprendre comment ces cellules CAR-T pourraient fonctionner chez les personnes, en l’occurrence chez les patients atteins de cancers, il est nécessaire de les étudier dans un organisme vivant, tel quel un modèle murin, qui reproduit de manière plus réaliste les conditions que l'on trouve chez les humains. En utilisant des souris, nous pouvons confirmer comment les cellules CAR-T agissent et si elles peuvent surmonter les défis rencontrés dans l'environnement autour des tumeurs. Ces défis incluent un réseau complexe de différentes cellules, de signaux moléculaires, de vaisseaux sanguins, et d'autres éléments qui interagissent de manière dynamique et qui peuvent limiter l'efficacité des cellules CAR-T. Ces interactions sont difficiles à reproduire de manière réaliste en laboratoire. En résumé, étudier ces cellules dans des organismes vivants nous aide à choisir les cellules CAR-T qui sont les plus prometteuses pour le traitement du cancer, en éliminant celles qui ne montrent pas d'activité anticancéreuse. Cela nous donne une base solide pour continuer notre recherche et pouvoir apporter ainsi du rationnel scientifique pour le développement des traitements plus efficaces contre le cancer.
Réduction
Dans la première étape de ce projet, nous étudions et vérifions l’activité anti-tumorale des diverses versions de cellules CAR-T face à un ou plusieurs modèles de tumeur, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations sur des souris. Cela signifie que nous essayons de faire le moins d'essais possible et d'utiliser le moins d'animaux nécessaires, tout en faisant en sorte de garantir la fiabilité de nos résultats. Nous considérons également d’autres éléments nous permettant de réduire le nombre de souris en expérimentation, notamment : a) l’analyse de plusieurs groupes d’étude en même temps avec un seul groupe témoin ; b) le suivi de la croissance de tumeurs chez les souris par imagerie spécial (bioluminescence), ce qui permet de réduire le nombre d'animaux étudiés, car les images peuvent être extraites des mêmes sujets au fil du temps sans avoir à sacrifier l’animal pour mesurer la croissance des tumeurs ; c) les types de lignées de cellules cancéreuses que nous utilisons ont été étudiés en détail, ce qui nous permet de déterminer la quantité optimale de cellules à injecter pour que la tumeur se développe, réduisant ainsi le nombre de groupes d’animaux nécessaires pour tester différentes quantités de cellules tumorales.
Raffinement
Les animaux utilisés dans les expériences seront hébergés dans un environnement dédié, appelé zone EOPS, dans des cages par groupes de 5 au maximum, du même sexe, avec suffisamment d'espace pour se déplacer librement et un accès libre à la nourriture et à l'eau. Pour rendre leur habitat plus agréable, nous enrichirons leurs cages en ajoutant de la litière en copeaux de bois stérilisée, une maisonnette en carton pour qu'ils aient un endroit où se cacher, ainsi que des morceaux de papier Kraft ou "Sizzle Pad" qu'ils pourront grignoter pour construire un nid. Un temps d’adaptation d’une semaine minimum sera également respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Pour limiter les effets de stress et de douleur des animaux, les interventions telle que les injections de cellules tumorales et de cellules CAR-T seront réalisées sous anesthésie. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour repérer tout signe de détresse ou de souffrance chez les souris, et des mesures appropriées seront immédiatement prises Pour évaluer leur bien-être, nous utiliserons une grille de notation qui prend en compte leur comportement naturel, leur comportement en réponse à certaines situations, les changements de poids, ainsi que les caractéristiques expérimentales, comme l'apparence et la taille des tumeurs. Si les scores atteignent des seuils critiques préétablis, cela pourrait entraîner l'euthanasie de l'animal. Toutes les personnes impliquées dans ce projet ont les qualifications nécessaires et ont démontré les compétences requises pour manipuler les animaux de manière éthique. Pour suivre la croissance des tumeurs, nous utiliserons principalement une méthode non invasive appelée bioluminescence in vivo sous anesthésie gazeuse. Si nécessaire, nous effectuerons des mesures régulières à l'aide d'un pied à coulisse.
Choix des espèces
Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce animale dont le fonctionnement interne (physiologie) se rapproche le plus de celui de l'Homme ce qui justifie notre choix d'utiliser des souris comme modèle. Les souris présentent une similitude génétique élevée avec les humains, avec 99% de leurs gènes correspondants à ceux de l'homme. Cela signifie que les résultats obtenus lors des études sur les souris sont plus susceptibles de refléter les réponses biologiques humaines. Actuellement, l'utilisation de souris immunodéficientes (agées de 8 semaines), répresent un avantage majeur pour notre approche, en raison de leur déficit immunitaire profond, facilitant ainsi la prise de greffe de cellules immunitaire et de cellules tumorales, toutes les deux d’origine humaine. Ceci offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules CAR-T humaines dans un modèle de souris. En outre, les souris sont des animaux de petite taille, qui se reproduisent rapidement et sont faciles à élever en laboratoire.
Validation d’une nouvelle cible thérapeutique pour lutter contre les cancers du sang (Leucémies)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des souris utilisées a un système immunitaire déficient, ce qui permet de leur greffer des cellules leucémiques prélevées sur des patients. 4 912 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit jusqu'à sept injections intraveineuses et dix injections intrapéritonéales, 3 192 d'entre elles jusqu'à quinze gavages, 1 440 jusqu'à trois ponctions de moelle osseuse dans le fémur et 720 une injection directe dans la moelle. La leucémie provoquée peut entraîner une anémie, une grosse rate et des difficultés de locomotion quand la greffe gagne le cerveau, et le porteur prévoit de tuer l'animal dès l'apparition de signes de souffrance.
Objectifs
Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) représentent les cancers du sang les plus courants de l’adulte, mais elles demeurent très difficiles à traiter avec un taux de rechute élevé et seulement 20% de survie chez les patients agés. Au cours des 40 dernières années, les traitements pour les LAM ayant très peu progresser, il est crucial de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients, notamment après une rechute. Nos recherches ont identifié une nouvelle cible : la SUMOylation, un processus qui modifie certaines protéines. Nous avons réalisé des tests en laboratoire sur des cellules leucémiques, y compris celles résistantes aux traitements existants, ainsi que sur des cellules de patients. Nos résultats préliminaires ont montré que notre traitement ciblant la SUMOylation pourrait être prometteur pour traiter les LAM. Nous devons désormais confirmer ces résultats dans des modèles animaux, plus proches de la réalité clinique, avant de pouvoir envisager des essais sur des patients. De plus, nous avons découvert que bloquer la SUMOylation pouvait stimuler le système immunitaire pour combattre les cellules cancéreuses mais nous devons confirmer ces résultats sur des souris. Enfin, nous explorerons également si notre traitement peut être utilisé en combinaison avec d'autres médicaments déjà utilisés en clinique pour augmenter son efficacité.
Bénéfices attendus
Les LAM sont des cancers au pronostic sombre. Ce projet a pour objectif d’étudier une nouvelle approche thérapeutique consistant à cibler la SUMOylation, un processus qui modifie certaines protéines, seule ou en combinaison avec d'autres molécules déjà utilisées en clinique. La validation préclinique effectuée dans le cadre de ce projet constituera une étape essentielle au développement clinique de ces nouvelles molécules.
Procédures
En fonction de la procédure dans laquelle ils seront impliqués, les animaux pourront subir : 1- Injection intraveineuse à la veine caudale sur animaux vigiles à l’aide d’un tube à contention (durée de la procédure : 1 minute): l’ensemble des animaux inclus dans ce projet (soit 4912 souris) seront soumis à des injections en I.V., au maximum 7 fois au cours de leur vie 2- Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles (durée de la procédure : 30 secondes): l’ensemble des animaux inclus dans ce projet seront soumis à des injections en I.P., au maximum 10 fois au cours de leur vie 3- Gavage sur animaux vigiles (durée de la procédure : 30 secondes): cette intervention concernera un maximum de 3192 animaux (en fonction des combinaisons de molécules sélectionnées pour la suite du projet au cours de la procédure 1) et sera réalisée au maximum 15 fois au cours de la vie de l’animal 4- Prélèvement de moelle osseuse en intra fémoral (durée de la procédure : 2 minutes) : cette intervention concernera 1440 animaux qui seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée. Ce geste sera réalisé au maximum 3 fois au cours de la vie de l’animal et au minimum à 4 semaines d’intervalle. 5- Injection orthotopique dans la moelle osseuse en intra fémoral (durée de la procédure : 2 minutes) : cette intervention concernera 720 animaux qui seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée. Ce geste sera réalisé une seule fois au cours de la vie de l’animal. 6- Prélèvement de sang à la veine caudale (durée de la procédure : 1 minutes): Cette intervention concernera au maximum 2208 animaux et sera réalisée au maximum 7 fois (50µl de sang) au cours de la vie de l’animal et au minimum à 14 jours d’intervalle. L’ensemble de ces gestes étant parfaitement maîtrisés par le personnel amené à intervenir dans ce projet, les durées d’interventions sont très courtes ce qui limite le stress et l’inconfort des animaux.
Impact sur les animaux
La greffe de cellules leucémiques chez la souris peut induire l'apparition de symptômes tels que l'anémie, la splénomégalie ainsi que des difficultés de locomotion lorsque la greffe se localise dans le cerveau.
Devenir
Dans la mesure où nous induisons une pathologie chez l’animal qui peut induire des nuisances, les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure ou dès lors qu'un des animaux présentera des signes de souffrance.
Remplacement
Nos recherches ont montré en laboratoire l'importance de la SUMOylation, un mécanisme qui modifie les protéines, dans les Leucémies Aigues Myéloïdes (LAM), notamment en tant que cible potentielle pour des traitements. Maintenant, pour confirmer si ces observations pourraient être applicables en clinique dans le futur, nous devons nécessairement tester ces molécules sur des animaux de laboratoire dont le système immunitaire est déficient et qui portent des cellules cancéreuses de patients pour évaluer l’efficacité de nos traitements sur un organisme vivant complet plus proche de la réalité clinique. De plus, étant donné que le TAK possède des effets sur le système immunitaire, nous devons également vérifier ces résultats sur des animaux de laboratoire ayant un système immunitaire normal, pour comprendre comment celui-ci pourrait contribuer à l'efficacité du traitement contre le cancer. Si nos résultats se confirment dans ces tests, cela ouvrirait de nouvelles pistes pour traiter les patients atteints de LAM.
Réduction
Nous utilisons des cellules leucémiques luminescentes pour suivre l’évolution du cancer à l’aide d’une caméra adaptée dont nous disposons au laboratoire. Quand cela sera possible, nous utiliserons cette méthode pour suivre la progression des tumeurs. Cela nous permettra d'utiliser beaucoup moins d'animaux pour nos expériences. De plus, nous utiliserons un logiciel de calcul de statistiques qui permet d'optimiser nos groupes expérimentaux, avec un maximum de 8 souris par groupe. Cela nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés tout en étant certains que nos résultats restent fiables.
Raffinement
Les souris seront hébergées au maximum par groupe de 5 animaux par cage afin de limiter stress et angoisse et bénéficieront d'au moins 2 enrichissements/cage (coton et cabane). Lors du change, effectué de façon hebdomadaire par le même zootechnicien, la cabane et une partie du nid seront conservés afin de garder les odeurs des animaux dans la cage propre et ainsi limiter le stress. Dans les pièces de stabulation, nous diffusons des sons de nature (oiseaux, rivière, forêt) afin de limiter les variations sonores entre le jour et la nuit dans le but de réduire le stress des animaux. Pour les animaux en cours d'expérimentation et qui sont manipulés plusieurs fois par semaine, nous ajouterons une roue d'exercice par cage comme enrichissement supplémentaire, ainsi que de l’aliment et de l’eau en gel afin de favoriser l’hydratation des animaux et d’agrémenter leur alimentation. Au cours des procédures nécessitant une anesthésie, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane 2,5%. Concernant les procédures pouvant induire de la douleur (injection intra-fémorale), une analgésie à la Buprénorphine 0.05mg/kg en sous-cutané 30 minutes avant l’injection puis 12h post-injection sera administrée. Afin de réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement, y compris les weekends, et les signes de souffrance (perte excessive de poids, hyperactivité, isolement, hérissement des poils, dos voûté, difficulté de locomotion) seront recherchés et seront répertoriés dans la grille de scoring jointe en annexe. En fonction du score obtenu, l’animal sera maintenu sous simple surveillance, surveillance accrue (2 fois/jour) ou immédiatement euthanasié.
Choix des espèces
En vue d'une utilisation clinique future, seule une étude pré-clinique menée in vivo chez la souris permettra de valider la SUMOylation comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des LAMs. Le modèle murin est particulièrement pertinent pour la réalisation notre projet. Nous utiliserons des modèles de souris immunodéprimées et immunocompétentes. En effet, les modèles immunodéprimés permettent de greffer aisément des cellules de patients et de récapituler la pathologie humaine chez la souris afin de tester l'efficacité anti-tumorale de nos molécules. Par ailleurs, il existe déjà des modéles syngéniques de LAM chez la souris qui nous permettrons d'évaluer le rôle du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale induite par l'inhibition de la SUMOylation. Les animaux utilisés auront entre 6 et 8 semaines. Ce niveau de développement permet une greffe efficace des cellules humaines et permet d'effectuer des expériences à long terme, en particulier dans le cas des patient-derived xenografts (Pdx) qui peuvent nécessiter jusqu'à 6 à 8 mois pour se développer.
Recherche d’un traitement pour une maladie neurologique rare MCOPS12.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Chaque souriceau est amputé d'une phalange par patte entre le septième et le dixième jour après la naissance, pour l'identifier et le génotyper en une seule opération. 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gavées chaque jour pendant quatre semaines ou injectées dans l'abdomen, puis soumises à des tests de locomotion en environnement nouveau et de coordination des membres. Le porteur écrit pourtant que les expériences réalisées ici "ne sont pas douloureuses" et qu'elles consistent uniquement en des études comportementales. Toutes sont tuées à la fin pour récolter le matériel biologique qui complétera les résultats de comportement.
Objectifs
Des mutations d’un récepteur de la vitamine A sont à l’origine d’une maladie neurologique rare (MCOPS12) responsable de symptômes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodéveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostic vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations. Les souris mutantes présentent des symptômes moteurs similaires (n’affectant pas fondamentalement la vie des animaux qui peuvent marcher et se redresser sans aucun problème) à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle de ce récepteur dans le développement et dans la fonction du striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire ce récepteur contrôle le développement d’une sous-population de neurones, alors qu’à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une autre sous-population de neurones. Notre objectif est de prévenir et/ou de normaliser les symptômes moteurs et cognitifs en modulant l’activité de ces neurones afin de prévenir leur mort et/ou leur dysfonctionnement pour éviter l’apparition des symptômes. Les effets liés au mode d’administration des traitements seront contrôlés grâce à un traitement supplémentaire avec une solution saline, pour s’assurer qu’aucun effet observé ne soit en réalité que le résultat du stress causé par l’administration des composés. Nous avons donc 6 traitements différents à tester.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait apporter de nouvelles pistes de traitements pour la maladie sur laquelle nous travaillons. En effet, notre objectif est de prévenir l’apparition et/ou réduire des symptomes moteurs et cognitifs grâce aux différents traitements que nous allons utiliser en empêchant la perte de certains neurones responsables de ces symptomes, ou en régulant leur activité. Si un ou plusieurs traitement(s) montre(nt) des effets bénéfiques, nous pourrions envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les patients.
Procédures
La technique d'identification utilisée dans notre EU est la phalangectomie. Celle-ci permet d'identifier les animaux et également de les caractériser génétiquement en une seule étape. L’identification sera réalisée entre les 7è et 10è jours postpartum conformément aux recommandations de la CNREEA. Cependant des méthodes alternatives sont en développement afin de remplacer la phalangectomie par une autre méthode moins invasive. 3 traitements pharmacologiques visant à prévenir les symptômes et le traitement contrôle avec de la solution saline se feront sur des cohortes de 4 groupes distincts d’animaux porteurs ou non d’une mutation et âgés de 4 semaines. Tous les traitements se feront par voie orale (gavage des animaux, 15 secondes par traitement) pendant 4 semaines, à raison d’un traitement par jour. Nous utiliserons 12 animaux par groupe et par traitement (12 x 4 x 4), soit 192 mâles et 192 femelles = 384 animaux au total. 2 traitements pharmacologiques visant à atténuer les symptômes et le traitement contrôle avec de la solution saline se feront sur des cohortes de 4 groupes distincts d’animaux porteurs ou non d’une mutation et âgés de 10 à 25 semaines (adulte). Tous les traitements se feront par injection intrapéritonéale (5 secondes par traitement, 12 animaux traités/groupe à 0.2 et 2 mg/kg) et le traitement contrôle (solution saline) (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 120 mâles et 120 femelles = 240 animaux au total. Ensuite, des tests comportementaux non aversifs que chaque animal passera une seule fois : test 1 = 30 minutes, évaluation de la locomotion induite par la nouveauté, test 2 = 3 x 5 minutes, évaluation de la coordination des membres, test 3 = 32h, évaluation de l’activité locomotrice, test 4 = 30 minutes, évaluation des réflexes, test 5 = 30 minutes, évaluation de la mémoire. Un délai minimum de 1 jour sera respecté entre chaque test afin de diminuer l’effet du stress sur les résultats obtenus. Les mêmes cohortes recevront une seconde dose de traitement et s'en suivra les mêmes tests à des fins de réduction et pour évaluer la meilleure dose dans l'efficacité du traitement dans l'atténuation des symptômes. La moitié des animaux de chacun des 6 traitements (pharmacologique + contrôle) = 312 animaux (156 mâles et 156 femelles), sera ensuite utilisée pour réaliser des analyses cellulaires. L’autre moitié sera utilisée à des fins d’analyses moléculaires.
Impact sur les animaux
Les phalangectomies réalisées entre le 7e et 10e jour postpartum comme recommandé par le CNREEA provoqueront une douleur de durée légère. Elles seront limitées à une seule phalange par patte pour ne pas compromettre la préhension que les animaux exercent avec leurs pattes. Les autres effets indésirables ne dépasseront pas la gêne occasionnée par le gavage des animaux. En effet, les tests comportementaux effectués ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive et un léger stress sont à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables majeurs. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement. Amendement : Les injections intrapéritonéales des traitements, et du mélange anesthésie/analgésie lors des perfusions intracardiaques, peuvent provoquer une légère douleur à l'animal ainsi qu'un stress. De plus, nous injecterons une seconde dose des traitements sur les mêmes cohortes expérimentales, espacée d'une semaine
Devenir
L’ensemble des animaux utilisé sera mis à mort afin de récolter le matériel biologique pour des analyses cellulaires et moléculaires qui compléteront les résultats obtenus en comportement.
Remplacement
Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique de la signalisation calcique et de la neurotransmission ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.
Réduction
Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues à la suite du test Openfield (le moins discriminant des tests effectués ici) ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée. De plus, nous n’utiliserons qu’un seul groupe d’animaux traités avec le vehicule (contrôle). En effet, les différents traitements seront préparés et administrés de la même manière, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux contrôle. Enfin, la réalisation de la procédure numéro 2 dépendra des résultats obtenus dans la procédure numéro 1. En effet, nous n’utiliserons la seconde procédure uniquement si les résultats de la première procédure ne sont pas concluants. En effet le caractère moins séléctif de la seconde molécule, permettra de moduler la signalisation calcique plus largement.
Raffinement
En vue de RAFFINER les procédures les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses et effectuées par des personnes compétentes et qualifiées (formations conception et chirurgie des rongeurs). Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans traitement préalable de composés pharmacologiques à des doses faibles. Les molécules pharmacologiques sont utilisées à des doses qui permettent simplement de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Ces cinq traitements ont déjà été utilisés aux mêmes doses, sans causer de souffrance chez les animaux. Les traitements par gavage seront réalisés par des expérimentateurs formés à l’aide de canules souples afin d’éviter toute lésion interne. Les animaux seront surveillés méticuleusement tous les jours à l'occasion des traitements et un suivi de poids sera réalisé 2 fois par semaine (le mardi et le vendredi) pour contrôler leur bien-être. En cas de mal être de l’animal sera exclu de l’étude et un examen vétérinaire sera immédiatement réalisé. Amendement : Différentes injections intrapéritonéales seront réalisées lors des procédures expérimentales 4 et 5 d'une part pour administrer les traitements pharmacologiques, et d'autre part pour administrer le mélange anesthésie/analgésie. En effet, les perfusions intracardiaques seront réalisées sous anesthésie générale par injection intrapéritonéale d’un mélange anesthésie/analgésie afin d’éviter aux animaux tout ressenti douloureux. Les injections intrapéritonéales sont peu douloureuses également. A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort après une anesthésie sans réveil par exsanguination par un manipulateur expérimenté en minimisant le stress animal.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle des mutations d’un gène dans la mise en place et la progression d’une maladie neurologique progressive rare, les performances comportementales et les fonctions des signalisations calcique, dopaminergique et glutamatergique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans un premier temps des animaux de 4 semaines afin d’observer les changements de comportements des animaux à la suite des traitements, avant même l’apparition de des symptômes. Dans un second temps, nous utiliserons des animaux âgés de 10 à 25 semaines afin d’observer les changements de comportements des animaux à la suite des traitements visant à réduire les symptômes moteurs et cognitifs.