Oncologie

Un rat qui cumule hypothermie, prostration et plus de 20 % de perte de poids sur plusieurs jours est tué. 600 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour récupérer tissus et sang. Rendus obèses et diabétiques par un régime hypercalorique servi de la sixième à la trente-deuxième semaine de vie, ils reçoivent des composés une à deux fois par jour, subissent cinq prises de sang précédées chacune de six heures de jeûne, l'implantation d'un cathéter dans la veine fémorale, puis une perfusion continue de 210 minutes appelée clamp. La société qui porte le projet dispose déjà d'une plateforme in vitro pour ce type d'étude, mais affirme que ces modèles ne sont pas un miroir assez fiable de la complexité de l'organisme.

Objectifs

Le diabète a touché 8,5% de personnes de plus de 18 ans dans le monde. 90% des personnes diabétiques sont atteintes de diabète de type 2, forme de diabète associé à l’obésité. Le nombre de personnes diabétiques ne cesse d’augmenter. Le diabète a des conséquences dramatiques sur le fonctionnement de certains organes comme le foie, le système nerveux, les reins ou le cœur et certaines de ces conséquences sont mortelles. Le diabète de type 2 se caractérise par deux phases, la phase de résistance à l’insuline où les niveaux plasmatiques d’insuline sont très élevés pour essayer de contrer l’hyperglycémie puis au fur et à mesure les cellules sécrétant l’insuline se fatiguent, ne sont plus capables de répondre et meurent. On parle alors de phase de dépendance à l’insuline. Plus le diabète de type 2 est traité précocement, moins les conséquences sont dramatiques. Ainsi, il est important de développer des thérapies qui ciblent la phase de résistance à l’insuline. Pour se faire, les animaux rendus obèses par l’ingestion d’un régime gras sur plusieurs semaines constituent le meilleur modèle préclinique pour valider ces thérapies. En effet, l’ingestion d’un régime gras chez la souris ou le rat se traduit par la mise en place d’une résistance à l’insuline. La résistance à l’insuline peut être évaluée de différentes manières : en réalisant des tests de tolérance à l’insuline et au glucose mais la technique la plus précise reste la technique dite "clamp" car elle permet la mesure de la sensibilité à l’insuline au niveau des différents organes et de façon bien précise, en utilisant de la radioactivité. Ainsi, au cours de ce projet, des rats seront rendus obèses puis traités ou non par des molécules et leur résistance à l’insuline sera évaluée par des tests de tolérance puis un "clamp".

Bénéfices attendus

Par cette étude, de nouveaux traitements ciblant la résistance à l’insuline et donc les phases précoces du diabète peuvent être trouvés. Ceci permettra d’éviter les complications induites lors des phases avancées du diabète et d’augmenter les taux de survie des patients.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez le rat, un régime hypercalorique sera mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 32 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Cinq prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (avant traitement et 2, 4, 6 et 8 semaines après traitement) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang se fait sur animal vigile et libre de ses mouvements, il est préalablement habitué à ce geste. La prise de sang dure environ 2 minutes par animal, et nécessite que l'animal ait un jeun de 6h. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectués après 6 semaines de traitement, ces tests durent 120 minutes. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. L’implantation d’un cathéter à demeure dans la veine fémorale : la chirurgie est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. Une manipulation de 210 minutes appelée « clamp » est réalisée après 8 semaines de traitement. Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue.

Impact sur les animaux

1 – Un régime hypercalorique sera mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 32 semaines), cela va induire une obésité et un diabète de type 2. Les animaux se déplacent un peu moins mais ils gardent un bon état général. 2 – Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3 - Pour mesurer les consommations alimentaire et hydrique, les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant la durée du traitement, cela est impactant pour les rats qui ont un caractère grégaire. 4 – Les mises à jeun (6h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress, notamment pour des animaux diabétiques. 5 –La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. 6 – La chirurgie (implantation du cathéter fémoral) est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. L’anesthésie et la cicatrisation sont plus difficiles chez un animal diabétique. 7 – Clamp : Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue. Cette manipulation terminale peut être source de stress. 8- Nous mesurerons de nombreuses fois la glycémie par microprélèvement en bout de queue, l'extrémité de la queue sera désinfecté à la vétédine en fin de manipulation. Cependant, du fait du diabète, certains animaux peuvent avoir des complications (queue hypersensible, infection).

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (comptage des radioéléments, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...).

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. D’ailleurs, la société possède aujourd’hui une plateforme in vitro pour y répondre. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les étapes de la procédure seront réalisées sur le même animal. Des étapes de screening sont réalisées afin d’obtenir des groupes homogènes et les animaux ayant les meilleurs critères permettant d’avoir des données fiables et exploitables en fin d’étude et d’éviter de répéter plusieurs fois la dite étude. Nous effectuerons des tests statistiques, le nombre de données par groupe nécessaire pour être statistiquement robuste et donc pouvoir conclure sur l’effet d’un traitement est de 10 en fin de clamp.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rats de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Le bout de la queue des rats sera observé de près car le diabète peut induire des complications au niveau de la cicatrisation. De la vétédine sera appliquée après chaque fin de manipulation. Après la chirurgie, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points limites suivants sur plusieurs jours : hypothermie, prostration, perte de poids >20%, ce dernier serait euthanasié. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de soluté de réhydratation est envisagée (5 ou 10mL/kg). En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Des mises au point de chirurgie "double cathétérisation" permettant d'éviter les multiples mesures de glycémie à la queue sont en cours de discussions.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le rat Sprague-Dawley : Sans régime gras, cette souche de rat possède un poids corporel important et est plus à même à développer une obésité marquée lorsqu’elle est placée sous régime gras. Le rat est une espèce adaptée pour l’étude de la résistance à l’insuline par clamp puisque les données obtenues sont assez homogènes. La chirurgie pour la mise en place du cathéter impacte très peu l'obésité et la résistance à l'insuline. Les animaux sont mis sous régime à partir de 6 ou 8 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Des souriceaux de vingt et un jours sont gavés d'antibiotiques trois jours de suite, mis à jeun six heures, gavés de glucose, incisés à la queue puis saignés huit fois. 100 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 40 nourries cinq semaines d'un régime pauvre en protéines. Chacune est aussi anesthésiée chaque semaine, cinq semaines durant, pour que sa taille soit mesurée. Le porteur répète que le régime "n'induit pas de sensation de faim ni de phénotype délétère" et que les antibiotiques "ne devraient pas avoir d'effet sur le bien-être", pour un protocole qu'il classe lui-même en souffrance modérée.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur à travers le monde. Des études ont montré que le microbiote (ensemble des micro organismes vivant dans un environnement spécifique chez un hôte) des individus mal nourris était sévèrement impacté. Il est également observé une différence de réponse au régime pauvre en protéines en fonction du sexe, avec des bactéries n’apparaissant que chez les femelles. De plus, ces variations étaient reliées à des variations du métabolisme e chez les souris, ainsi qu’une variation de l’apparition de la puberté. Cela incite donc à explorer de façon détaillée l’effet du microbiote sur le métabolisme et la maturation sexuelle afin de déterminer si celui-ci peut expliquer les différences observées entre les sexes. En utilisant un modèle murin de malnutrition protéique, permettant d’étudier la communication inter-organes, l'objectif de ce projet est de caractériser finement le métabolisme et la maturation sexuelle de souris subissant une ablation partielle du microbiote intestinal par un traitement antibiotique

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition dans un contexte juvénile sont encore mal connues, de même que le rôle précis du microbiote intestinal dans les altérations physiologiques associées. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises qui s’opèrent lors d’un régime métaboliquement délétère et d’évaluer le rôle potentiel du microbiote intestinal, qui sera déplété par un traitement antibiotique. Nous pourrons ainsi identifier au cours du projet de futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition au travers d’un traitement adapté basé sur la nutrition et le microbiote.

Procédures

40 souris seront soumises à un régime nutritionnel pauvre en protéines pendant 5 semaines au maximum. Ce régime n’induit pas de sensation de faim (isocalorique d’un régime contrôle) ni de phénotype délétère. 100 souris auront leur taille mesurée toutes les semaines, pendant 5 semaines, sous anesthésie générale. 100 souris seront pesées chaque semaine, pendant 5 semaines, ce qui prend moins d’une minute. 50 souris seront gavées avec de l’eau (souris contrôles) à P21, P22 et P23, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. 50 souris seront gavées avec un cocktail antibiotique à P21, P22 et P23, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. Les antibiotiques ne devraient pas avoir d’effet sur le bien-être des souris. 50 souris auront des antibiotiques de façon continue dans l’eau de boisson, de P24 à P56. Les antibiotiques ne devraient pas avoir d’effet sur le bien-être des souris. 80 souris seront mises à jeun pendant 6 heures. 80 souris seront gavées avec du glucose après les 6 heures de jeûne, suite à une contention. Ce geste dure environ 10 secondes. 80 souris auront une incision sous anesthésie locale à la queue. Ce geste dure environ 1 seconde. 80 souris subiront 7 prélèvements à la queue d’environ 3 µL de sang. Ce geste dure environ 5 secondes. 80 souris subiront un prélèvement additionnel à la queue d’environ 20 µL par prélèvement pour mesurer l’insulinémie. Ce geste dure environ une minute.

Impact sur les animaux

Ce projet ne devrait entraîner que des nuisances modérées sur les animaux. Le gavage des animaux ne devrait entraîner qu’un léger stress lié à la contention et un inconfort mineur lors du gavage. Le marquage des animaux à la patte et la mesure de la taille des animaux de (du jour 21 post natal au jour 56) n’induiront qu’un léger stress lors de l’induction de l’anesthésie. Les pesées et la caractérisation de la maturation sexuelle induiront un léger stress associé à la contention de l’animal. Le traitement antibiotique dans l’eau de boisson a été utilisé dans la littérature et n’engendre ni perte de poids ou d’appétit, ni diarrhées. Le jeûne de 6 heures induit un stress léger sur la souris. Le test de tolérance au glucose induira un stress modéré lié à la contention et au gavage des souris, puis à l’incision d’un bout de queue d’environ 1 mm et au prélèvement de gouttes de sang au niveau de la queue

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires et d’une bactérie probiotique, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle des paramètres étudiés. Chaque groupe expérimental contient 10 animaux. Des tests statistiques appropriés seront utilisés. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Notre protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agréé. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur nous permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif. Les mères pourront être réutilisées pour d’autres procédures.

Raffinement

La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine grâce à une anesthésie légère. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Des points limites suffisamment prédictifs seront établis pour anticiper tout stress et toute souffrance animale. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. Le prélèvement terminal est réalisé sous anesthésie générale, avec une analgésie appropriée. Le traitement antibiotique a été décrit dans la littérature et n’entraîne pas de modification du bien-être animal.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un antibiotique dans une étude nutritionnelle. L'objectif du projet est d'étudier les effets d’une déplétion du microbiote sur le métabolisme et la puberté pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour la croissance, la maturation sexuelle et la maturation métabolique.

Toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes, 3 900 souris vont être utilisées dans des travaux menés en prestation pour des laboratoires privés et publics, avec un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage ou injection cinq à dix jours de suite, ou dans leur nourriture pendant un mois, puis un second composé dans l'eau de boisson qui leur provoque une inflammation aiguë de l'intestin, avec perte de poids et diarrhées. Le nombre, la durée et la voie d'administration des composés immunothérapeutiques sont fixés par le partenaire commercial. Ni analgésique ni anti-inflammatoire ne leur seront administrés, le porteur écrivant que cela biaiserait la réponse observée, et il justifie le recours aux souris par une évaluation à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaitre la fonction de gènes d’intérêts sur le système immunitaire en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale et dans certain cas tester des traitements pour voir l’impact de ceux-ci sur le système immunitaire en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale lorsque la fonction d’un gène est modifiée. En utilisant un système moléculaire inductible à un traitement appelé tamoxifène, nous pouvons réguler l’expression de gènes d’intérêt en les supprimant, ou en les augmentant (surexpression). En effet, ce système permet de contrôler l’expression de gènes dans le temps et l’espace ouvrant ainsi de nouvelles possibilités pour l’étude de la fonction des gènes. Ainsi, nous traiterons avec du tamoxifène des souris génétiquement modifiées pour lesquelles le gène d’intérêt est modulable et nous évaluerons l’effet de sa suppression ou surexpression sur le système immunitaire à l’état basal. Nous évaluerons aussi l’effet de la modulation de ce gène en condition pathologique où nous induirons une inflammation intestinale. Enfin nous évaluerons également l’impact d’un traitement sur le système immunitaire lorsqu’un gène est supprimé ou surexprimé en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative l’impact de la régulation de gène d’intérêt par induction au tamoxifène et/ou l’impact d’un traitement immunothérapeutique en présence ou non d’une inflammation aigüe de l’intestin.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’induction d’un gène cible, par administration d’un premier composé chimique, afin d’évaluer sa fonction sur le système immunitaire de la souris, dans les conditions ou non d’une inflammation aigüe de l’intestin qui sera elle induite par l’administration d’un second composé chimique 1) L’administration du 1er composé peut se faire de différentes manières en fonction du type de gène à moduler, du type cellulaire et/ou tissulaire ciblé et de la demande du partenaire et sur 5 jours minimum (sans jamais excéder 10 jours) par injection et gavage ou sur 1 mois maximum dans l’alimentation : -Par injection : sur souris vigile, la souris sera pesée puis une contention sera réalisée afin de réaliser l’injection (30 secondes par souris). Ou -Par gavage : sur souris vigile, la souris sera pesée puis une contention sera réalisée afin de pouvoir réaliser le gavage à l’aide d’une aiguille de gavage (30 secondes par souris) . Ou -Par alimentation : Les souris seront soumises à un régime alimentaire avec des croquettes au tamoxifène. 2) Des pesées hebdomadaires : sur souris vigiles (10 secondes par souris). Deux collectes de sang : sur souris vigile, une contention sera réalisée afin de pouvoir réaliser le prélèvement (30 secondes par souris). Dans le cas où nous devrons être dans les conditions d’une inflammation aigüe de l’intestin : 3) Suite à l’induction par le 1er composé, les souris seront traitées avec le second composé (sur une durée de 7 jours consécutifs). Le second composé est préparé dans de l’eau de boisson + des pesées quotidiennes sur souris vigiles (10 secondes par souris). Dans le cas où nous devrons traiter les individus avec un composé immunothérapeutique : 4) Les administrations des composés immunothérapeutiques (le nombre, la durée et la voie d’administration sera défini par le partenaire). Suivant la voie d’administration sélectionnée par le partenaire, celles-ci seront réalisés sur souris vigiles (30 secondes/souris) ou sur souris anesthésiées (anesthésie gazeuse courte : 1minute/souris).

Impact sur les animaux

Prérequis : Les tests de toxicité des composés immunothérapeutiques seront effectués en amont par les partenaires. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress tel que : 1) Les administrations du composé n°1 soit par gavages oraux ou injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs minimum (sans jamais excéder 10 jours) ; 2) Des pesées hebdomadaires ; 3) Deux prélèvements de sang (60 à 100μL), Une semaine d’écart entre les prélèvements sera impérativement respectée ; 4) En fonction du projet, un traitement par un second composé dans l’eau de boisson suite à l’administration du 1er composé afin de créer une inflammation aiguë de l’intestin pouvant amener à une perte de poids et des selles molles/diarrhées. 5) Injections de composés immunothérapeutiques par voie sous cutanée, intra péritonéale, intramusculaire, intraveineuse ou gavage.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des organes et à leur analyse.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, l’étude du système immunitaire et le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.

Raffinement

Les animaux en expérimentation seront hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu sera enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un nid compact de lanières de papier Kraft. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et un temps d’acclimatation d’une semaine sera respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de zootechnie formé et qualifié et des points limites seront préalablement établis. En ce sens, une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation. Des points limites seront établis pour chaque observation (valeur maximale de la grille de score) qui entraineront la mise à mort de l’animal s’ils sont atteints. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique. De plus, dans le cas de l’inflammation aigüe de l’intestin, nous étudierons l’impact de la surexpression ou délétion d’un gène dans la modulation d’une inflammation, aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré aux souris.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, la souris est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose de bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons des souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.

Six porcs de cinq semaines reçoivent un virus grippal directement dans la trachée, pour que soit mesuré ce qu'ils exhalent, dans l'intérêt déclaré de la filière porcine et de la santé humaine. Ils subissent ensuite six écouvillonnages nasaux et cent prélèvements d'air, deux par jour et par animal, tous sur animaux vigiles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque une fièvre de quatre jours, une baisse d'appétit, de la toux et des difficultés respiratoires. Tous sont tués pour prélèvement de tissus, et le porteur reconnaît qu'un générateur d'aérosols pourrait produire des particules virales, mais écrit qu'il "ne reproduit pas totalement" l'excrétion naturelle.

Objectifs

Le projet vise à produire des connaissances sur les émissions respiratoires de porcs infectés par un virus Influenza A. Les épidémies provoquées par ces virus transmissibles par voie aéroportée ont des impacts économiques et sanitaires importants pour la filière porcine et sont aussi des enjeux de santé humaine. Le protocole expérimental proposé dans ce projet a pour objectif de caractériser l’excrétion du virus dans les émissions respiratoires des porcs infectés. La charge virale présente dans ces émissions sera évaluée. La distribution de la taille des particules ainsi que la composition biologique et biochimique des aérosols qui transportent cette charge virale seront décrites. Des collectes d’air exhalé, grâce à un banc de prélèvement, seront effectuées sur un lot de 6 porcs. Des analyses physico-chimiques, bactériologiques et virologiques seront effectuées sur ces prélèvements. Conjointement, des écouvillons nasaux et leur analyse virologique permettront de suivre l’infection virale chez les animaux. La phase de collecte se déroulera sur la première semaine post-inoculation, période où l'excrétion virale est maximale.

Bénéfices attendus

Le projet vise à documenter les modalités de diffusion d’un virus influenza porcin, en caractérisant la charge virale dans l’air exhalé ainsi que la taille et la composition des microgouttelettes respiratoires porteuses de virus. Les résultats du projet contribueront à plusieurs aspects. D'une part, il s'agira de mieux évaluer et modéliser les risques d’exposition animale/humaine en cas de foyer détecté dans un élevage. D'autre part, les résultats permettront de proposer des contre-mesures environnementales efficientes pour limiter la propagation du pathogène (ex : adaptation des stratégies de traitement de l’air, préconisations organisationnelles dans les activités, etc.).

Procédures

Les animaux seront soumis à un challenge viral par voie trachéale : acte réalisé en moins d’une minute. Les animaux seront également soumis à 6 prélèvements nasaux par écouvillonnage : acte réalisé en moins d'une minute. Enfin, les émissions respiratoires des porcs seront prélevées à l'aide d'un banc de collecte : 10 minutes de prélèvement en continu pour la collecte de l’ensemble des exhalaisons des porcs auxquelles s'ajoutent 10 autres minutes pour la collecte en continu des aérosols. Au total, 100 prélèvements d'émissions respiratoires seront effectués au cours de cette procédure expérimentale, à savoir 2 prélèvements d'émissions respiratoires par porc par jour de collecte. Ces procédures seront réalisées sur animal vigile.

Impact sur les animaux

L’infection par un virus Influenza A porcin provoque une hyperthermie ne persistant guère plus de 4 jours ainsi qu’une baisse de l'appétit et des troubles respiratoires très modérés (dyspnée, toux, et éternuements) au cours de la première semaine post-inoculation. Aucune symptomatologie sévère n’est attendue lors de cette procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Des prélèvements de tissus (pour recherche virologique) sont prévus à la fin de la procédure, la mise à mort des animaux est donc indispensable.

Remplacement

Une alternative non animale disponible tiendrait à l’aérosolisation du virus influenza avec un générateur d’aérosols. Toutefois, cette technique physique ne reproduit pas totalement le processus naturel d’excrétion et d’aérosolisation qui se produit au niveau de l’organisme de l’animal. Le projet ayant pour objectifs d’étudier la composition physique et biologique des aérosols exhalés par des animaux infectés et de la mettre en relation avec la charge microbiologique, l’utilisation d’une technique produisant des aérosols de manière artificielle et pouvant modifier les caractéristiques des émissions respiratoires n’est pas envisageable. L’expérimentation consistant en la génération naturelle d’aérosols par les animaux, il n'y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal.

Réduction

Le dispositif expérimental, qui repose sur un total de 6 porcs inoculés, a été pensé de manière à minimiser le nombre de porcs utilisés tout en garantissant la fiabilité des résultats. De plus, des études antérieures ont montré la nécessité de regrouper a minima 3 prélèvements individuels pour optimiser la sensibilité analytique et maintenir des conditions de manipulation animale efficace. En limitant la manipulation à 10 min par animal, nous optimisons la qualité de l’échantillonnage des émissions respiratoires tout en minimisant le temps de contention des animaux. Cela nécessite en revanche de cumuler les échantillonnages pour détecter les particules virales dans les exhalaisons pour améliorer la sensibilité analytique. Ainsi, l’expérimentation sur un premier groupe de 3 animaux permettra de constituer un jeu de données initial, et une répétition sur un second groupe de 3 porcs permettra d’étudier la répétabilité de la mesure. L'objectif du projet étant de produire des connaissances sur les émissions respiratoires de porcs infectés par un virus Influenza A porcin, le dispositif expérimental ne comporte pas de lots d'animaux Témoin et les données ne feront l'objet d'aucune analyse statistique du type Cas/Témoin.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d’atteinte d’un des points limites, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus Influenza A porcin. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de cette procédure. Les porcs seront inoculés par un virus Influenza A porcin à 5 semaines d'âge conformément au modèle d'infection appliqué par notre Laboratoire dans le cadre d'expérimentation impliquant ce contaminant.

Nourries six mois d'un régime enrichi en sucres et en graisses, isolées quarante-huit heures en cage de calorimétrie puis vingt et une heures en cage d'actimétrie, 72 souris enchaînent rotarod, grip test, marche en équilibre sur planche à trous et open field de trente minutes. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et courent jusqu'à l'âge de dix-huit mois. Le porteur qualifie ces tests de non invasifs, tout en reconnaissant que le régime enrichi peut mener à une obésité et que l'isolement répété stresse les animaux. Toutes sont tuées à la fin, pour analyse histologique et moléculaire de leurs tissus.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la locomotion et le métabolisme chez des souris qui semblent résistantes à la prise de poids. En effet, nous avons développé un modèle de souris avec une perte d’expression d’un gène spécifique, et à notre surprise ces animaux sont résistants à la prise de poids. Des analyses complémentaires montrent une masse musculaire normale mais une non-accumulation de la masse graisseuse dans ces animaux à l’âge d’un an. Nous souhaitons donc explorer plus en avant ce phénotype, notamment via des analyses longitudinales de la composition corporelle, du métabolisme, de l’activité locomotrice et de la calorimétrie de ces animaux, complété par des analyses sanguines, et ceci à la fois en diète normale ou enrichie en lipides. Nous espérons que cette approche nous permettra de mieux comprendre la résistance à la prise de poids dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de l’activité locomotrice et du métabolisme.

Procédures

1 – Les prélèvements sanguins requièrent moins d'une minute. 2 – L’analyse de la masse corporelle se fera par qNMR, qui est une analyse non-invasive d’une durée de 1 minute. 3 - L’analyse du métabolisme se fera par des tests de Calorimétrie indirecte, qui se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles pendant 48 heures. 4 – De même, un test d'actimétrie réalisé aux âges de 6 et 12 mois nécessite de placer les souris dans des cages individuelles pour une durée de 21h. 5 – L’analyse de la locomotion des animaux se fera par une batterie de tests non invasifs réalisés sur une durée de 3 à 4 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice chez des souris résistantes à la prise de poids, et ceci via des tests classiques et non invasifs. Nous souhaitons aussi analyser les paramètres biochimiques de ces souris et ceci via un prélèvement d’une faible quantité de sang. Ces analyses peuvent induire des contraintes décrites ci-dessous : -Une partie de l’étude du métabolisme se fait chez des animaux avec une diète enrichie en sucres et en lipides, ce type de régime peut conduire à la longue à une obésité avec ces problèmes associés (difficulté à se déplacer, etc.). Nous allons donc restreindre ce régime enrichi en sucres et en lipides à une période de 6 mois. - L’étude de l’actimétrie et l’étude du métabolisme nécessitent des tests se déroulant dans des cages d’hébergement individuelles, conduisant donc à un isolement des animaux pendant 21 heures (actimétrie) ou 48 heures (métabolisme). Toutefois ce test est de courte durée et une fois terminé, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement). - Concernant les prélèvements sanguins, ceux-ci peuvent entrainer un stress et/ou éventuellement à une légère douleur. Les animaux seront donc anesthésiés quelques minutes avant le prélèvement sanguin.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris d’une maladie humaine génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de la locomotion et du métabolisme. Enfin, nous espérons que l’analyse de ce modèle murin permettra de mieux comprendre la faiblesse musculaire et la perte de poids de noter maladie d’intérêt.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, et compte tenu de notre projet d’analyser deux conditions (souris contrôle ou souris sans notre gène d’intérêt) sous deux types de nourriture (normale ou enrichie en lipide), nous estimons que l’étude de 72 animaux sur 3 ans est nécessaire.

Raffinement

Afin de limiter la prise de poids des animaux, le régime enrichi sera limité à 6 mois. De plus, les prélèvements sanguins à la veine temporale superficielle se feront sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après le prélèvement sanguin (changement du comportement : akinésie, prostration, paralysie, non réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure de prélèvement seront arrêtés si ces points limites sont atteints. Enfin, les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Néanmoins, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Toutefois, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, ca66chexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience sera stoppée.

Choix des espèces

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude du métabolisme. Nous allons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice par des tests non invasifs sur 72 souris adultes, et ceci sur une période de 6 mois pour l'étude du métabolisme, à 18 mois pour l'étude de la locomotion, Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la perte de force et de la prise de poids des animaux.

Un quart seulement des souriceaux de chaque portée porte la mutation recherchée, et ceux dont le second gène est invalidé meurent le premier jour de vie. 4 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à six échocardiographies sous anesthésie gazeuse, six injections dans l'abdomen, six tests de force et six passages sur tapis roulant, plus une biopsie de génotypage et des transports vers un centre extérieur. Celles qui portent la première mutation développent une cardiomyopathie et peuvent, dès neuf semaines, perdre du poids et adopter une posture anormale, pendant que le porteur décrit la création de ces modèles comme une étape "nécessaire" à un traitement qui n'existe pas.

Objectifs

Les maladies dues à un défaut de production d’énergie, sont de maladies génétiques très rares et incurables. Ces maladies peuvent se manifester à tout âge et peuvent affecter plusieurs types d'organes en même temps. Les mutations du notre gènes d’intérêt n 1 et 2, codant des protéines essentielles pour la production d'énergie dans nos cellules, provoquent des maladies affectant le cerveau et le cœur. Comme ces maladies affectent les cellules qui ne se divisent pas, la culture cellulaire ne peut pas aider à comprendre comment le dysfonctionnement mitochondrial affecte le fonctionnement des organes affectés et le développement de la maladie. Ainsi, un modèle animal doit être utilisé pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies. Nous avons décidé d'utiliser les souris comme modèle parce que les souris sont plus proches de l’humain et la physiologie mitochondriale chez l’homme et la souris sont très similaires. Nos objectifs sont les suivants : - Création et étude d'un modèle de souris pour l'étude du développement des maladies associées au gène d’intérêt 1 et 2. La création de ces deux modèles animaux et la compréhension du développement de la maladie mitochondriale sont des étapes nécessaires à la mise au point d'un traitement efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira des modèles murins pour les maladies mitochondriales et permettra de découvrir leurs mécanismes pathologiques. Ces deux points sont des étapes essentielles pour le développement d'un traitement pour ces maladies encore incurables.

Procédures

-échocardiographie (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -injection intra-péritonéale (1 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -grip-test (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -treadmill (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris); biopsie pour génotypage: (1 min par souris; 1 fois par souris )

Impact sur les animaux

Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 1 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront une cardiomyopathie.. À partir de 9 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 2 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront maladie neurologique et meurent le premier jour de vie. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant le test comportementaux, pendant l’échocardiographie, pendant l’injection intra péritonéal et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort, pour analyser les tissus.

Remplacement

L’objectif de notre projet est d’étudier la pathophysiologie des maladies mitochondriales. Pour cette raison l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. La préparation des cultures cellulaires primaires, pour l'étude du rôle moléculaire des protéines codées par notre gènes d’intérêt, aide à réduire le nombre d'animaux utilisés mais ils ne peuvent malheureusement pas remplacer l'utilisation du modèle animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies mitochondriales et sur de méthodes et analyses statistiques. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.Nous utiliserons des méthodes statistiques comme des tests t de Student et Anova en fonction des groupes d’animaux comparés.

Raffinement

Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiées tout en réduisant les vibrations et le bruit.

Choix des espèces

Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement proches des humains. La physiologie mitochondriale et la tissu-spécificité des fonctions mitochondriales chez l’homme et la souris sont très similaires. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge (nouveau-nés, souris juvéniles et juvéniles adultes). Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 3 semaines et plus.

Enfermées sept jours d'affilée en chambre respiratoire pour mesurer le méthane qu'elles émettent, 4 brebis de réforme vont être utilisées dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré. Le projet teste une eau de boisson enrichie en nanobulles d'oxygène, censée gêner les microbes producteurs de méthane du rumen. Le porteur écrit que cette mesure n'entraîne "aucune souffrance ni douleur", ce que la gravité modérée déclarée dans le même document contredit. Le devenir des brebis dépend d'une évaluation administrative en cours : si l'innocuité des nanobulles n'est pas établie, elles seront tuées par précaution, sinon leur replacement sera soumis à l'avis de la structure de bien-être animal.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de tester l’effet d’une eau de boisson enrichie en nanobulles d’oxygène sur la production de méthane entérique chez l’ovin. Cet essai servira de preuve de concept. Les microbes producteurs de méthane (méthanogènes) sont très sensibles à l’oxygène et notre hypothèse de travail est que les nanobulles d’oxygène inhiberont l’activité des méthanogènes.

Bénéfices attendus

La diminution de l’empreinte carbone des ruminants par une solution innovante d’utilisation facile sur le terrain, y compris au pâturage, peu coûteuse et facilement acceptable par les utilisateurs et la société.

Procédures

Au cours des 7 jours d'expérimentation, les animaux seront dans des chambres respiratoires semi-ouvertes.

Impact sur les animaux

Les animaux entreront en chambre respiratoire pendant 7 jours consécutifs pour la mesure des émissions de méthane. Cette mesure n’entraîne aucune souffrance ni douleur chez l’animal qui est libre de mouvement dans une surface de 3,3 m2 qui est supérieure aux normes de bien être (2 m2). Les chambres respiratoires semi-ouvertes sont disposées côte à côte avec de larges parois translucides qui permettent aux animaux de se voir, de s’entendre et de percevoir les odeurs, ce qui diminue le stress lié à l’isolement.

Devenir

L’innocuité de l’utilisation de nanobulles dans l’eau de boisson est en cours d’évaluation par les autorités compétentes. Si elle ne peut être établie, en application du principe de précaution, les animaux seront mis à mort. Sinon, leur replacement sera soumis à l’avis de la SBEA.

Remplacement

Ce type d’étude a déjà été réalisé in vitro et nécessite une validation chez l’animal.

Réduction

D'après notre expérience reconnue dans le domaine de la mesure des émissions des gaz à effet de serre par les ruminants, le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables en termes d'émissions de méthane en chambre respiratoire avec un écart entre groupes de ~30% est de 4 par lot. Chaque animal sera son propre témoin. Nous utilisons le nombre minimal d’individus pour cette étude de preuve de concept très peu contraignant pour les animaux.

Raffinement

Cette mesure n’entraîne aucune souffrance ni douleur chez l’animal qui est libre de mouvement dans une surface de 3,3 m2 qui est aménagée avec caillebotis pour assurer un confort de couchage et la bonne évacuation des effluents. Les chambres respiratoires semi-ouvertes sont disposées côte à côte avec de larges parois translucides qui permettent aux animaux de se voir, de s’entendre et de percevoir les odeurs, ce qui diminue le stress lié à l’isolement.

Choix des espèces

Pour cette étude nous avons besoin des animaux avec un rumen fonctionnel (des agneaux après sevrage ou des ovins adultes). Nous utiliserons des brebis de réforme car en fin de vie productive. Il n'y a pas de préférence de sexe pour l’objectif de l’étude, par contre tous les animaux seront du même sexe. Comme indiqué au-dessus, nous utiliserons des femelles de réforme. On s’attend à une diminution minimale de méthane d’environ 30%. Cette amplitude de diminution est facilement détectable en chambre respiratoire. Le nombre de 4 animaux est suffisant au vue de la précision des mesures pour cette preuve de concept.

472 souris vont être utilisées et toutes tuées pour conserver leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 230 chirurgies stéréotaxiques d'injection virale ou de pose de fibre optique. Chaque animal opéré passe ensuite sept jours seul en cage, puis subit un enregistrement électrophysiologique de l'hippocampe pouvant durer une heure. Le protocole prévoit aussi 84 souris exposées à un biberon d'éthanol toutes les vingt-quatre heures pendant six semaines, 80 immobilisées quinze minutes en contention et 360 soumises cinq jours durant à des tests de reconnaissance des émotions avec enregistrement de leurs vocalisations ultrasonores. Le porteur qualifie la contention de "stress psychogène modéré" et prête à l'exposition à l'alcool des effets "positifs de type anxiolytiques, relaxant et euphorisants".

Objectifs

L’OMS raporte que 5% de décès dans le monde peuvent être attribués à l’abus d’alcool. Le fléau sociétal et de santé publique que repésente l’alcoolisme motive la recherche de facteurs de risques génétiques et environnementaux, dans le but de développer des interventions thérapeutiques plus efficaces. Des études génétiques chez l’Homme ont permis de montrer un lien entre une modification du gène des récepteurs nicotiniques de type α5 et la probabilité de développer une dépendance à l’alcool. Malheureusement, le lien causal entre cette altération génétique et l’alcoolisme est difficile à étudier chez l’homme. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de cette altération dans la consommation d’alcool, la gestion des émotions et comportements sociaux, à l’aide de lignées de souris exprimant la même altération génétique que l’Homme. Afin de connaitre les conséquences de cette altération génétique sur l’activité neuronale, nous enregistrerons la réponse à la stimulation des neurones situés dans les régions du cerveau impliquées dans la reconnaissance des émotions. Enfin, dans le cas ou des déficits sont observés chez les animaux porteurs de la modication génétique, nous tenterons d’améliorer le déficit socio-émotionel en corrigeant, par thérapie génique, l’altération génétique du récepteur α5 dans le cerveau de souris. Ce même traitement pourrait aussi régulariser leur consommation d’alcool.

Bénéfices attendus

Bien que des études génétiques chez l’Homme aient montré un lien entre une modification du gène responsable de l’expression des récepteurs nicotiniques de type α5 et la probabilité de développer une dépendance à l’alcool, les mécanismes à l’origine de cette vulnérabilité demeurent inconnus. Or, il existe différentes formes (ou types) d’alcoolisme associées à des comportements émotionnels et sociaux différents voire opposés, par exemple à une hyperanxiété ou une hypoanxiété. Chez l’Homme, il est très difficile de déterminer si ces traits comportementaux et émotionnels sont dus à la consommation d’alcool, ou s’ils correspondent à des traits de personnalité qui préexistent, voire facilitent cette consommation. A ce jour, les traitements ne prennent généralement pas en compte les différents types alcooliques, ce qui pourrait expliquer au moins en partie le taux de rechute élevé (80 à 90% selon les études). L’un des principaux intérêts de notre projet est donc de mieux comprendre la relation entre les traits comportementauxs socio-émotionnels et la consommation d’alcool, en permettant de dissocier les effets de la consommation chronique d’alcool du profil de personnalité préexistant. De façon importante, ces traits sont aussi fortement liés au sexe, par exemple les profils hyperanxieux sont principalement observés chez les patients de sexe féminin, à l’inverse l’hypoanxiété et l’émoussement émotionnel sont principalement observés chez les patients de sexe masculin. Pour cette raison, nous comparerons les réponses comportementales et neuronales de souris mâles et femelles. Ainsi, l’apport éventuel de notre projet pourrait se situer à plusieurs niveaux. Premièrement, en prenant en compte les profils émotionnels et non simplement le niveau de consommation, il pourrait aider à comprendre les mécanismes par lesquels une mutation des récepteurs a5 induit un risque de dépendance à l’alcool. Si le lien entre profils socio-émotionels et risque de dépendance à l’alcool est observé chez l’animal, cela permettrait de tester certaines interventions thérapeutiques, qu’elles soient pharmacologiques ou psychologiques, pour adapter les traitements de façon « personnalisée » chez l’Homme. De nouvelles stratégies pharmaco et/ou psychothérapeutiques prenant en compte le profil socioémotionnel des patients pourraient ainsi se révéler beaucoup plus efficaces pour faciliter l’arrêt de la consommation d'alcool, voire de diminuer les risques de rechute.

Procédures

Les animaux seront soumis à : • La chirurgie stéréotaxique d’injection de virus et/ou d’implantation de fibre optique (geste réalisé sous anésthesie générale avec suivi analgésique), dure environ 30 minutes (n=230). • L’enregistrement de l’activité electrophysiologique dans l’hippocampe (geste effectué sur animal anesthesié) pendant une période maximale de 60 minutes (n=230). • L’activation neuronale via photostimulation optogénétique sur animal vigile pendant 3 minutes lors d’une session par animal (n=82). • L’exposition volontaire d’un biberon contenant une solution d’éthanol toutes les 24 heures pendant 6 semaines (n=84). • Un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores pendant 5 jours à raison de 10 minutes par jour (n=360). • Un stress de contention sur animal vigile pendant 15 minutes, geste effectué une seule fois (n=80). • Un isolement en cage individuel

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à : • La chirurgie stéréotaxique d’injection de virus et/ou d’implantation de fibre optique (geste réalisé sous anésthesie générale avec suivi analgésique) qui dure environ 30 minutes (n=230). Cette procédure induit une perte de poids légère et transitoire normale (1-2j) et une douleur modérée qui répond bien à une injection sous-cutanée d’AINS (INFLACAM©) efficace pendant plus de 12h. • L’enregistrement de l’activité électrophysiologique de deux régions du cerveau : le CA1v et CA1d pendant une période maximale de 60 minutes (n=230). Ce geste est effectué sur animal en anesthésie générale profonde. • L’activation neuronale des voies BLA-CA1v via photostimulation optogénétique sur animal vigile pendant 3 minutes lors d’une session par animal (n=82). Ce geste peut générer éventuellement une anxiété légère qui n’est pas systématique (Feliz-Ortiz et al, 2015). • L’exposition volontaire d’un biberon contenant une solution d’éthanol toutes les 24 heures pendant 6 semaines (n=84). Ce traitement, qui dépend d’un choix libre de l’animal, génère plutôt des effets psychopharmacologiques et physiques positifs de type anxioloytiques, relaxant et euphorisants. • Un test de reconnaissance des émotions avec enregistrement des vocalisations ultrasonores pendant 5 jours à raison de 10 minutes par jour (n=380). Induit un stress léger, comparable au stress induit par de nombreux tests comportemntaux considérés comme faiblement stressants. • Un stress de contention sur animal vigile pendant 15 minutes, geste effectué une seule fois (n=80) et considéré comme un stress psychogène modéré auquel les animaux s’habituent. • L'isolement en cage individuelle pendant les 7 jours qui succèdent aux chirurgies stéréotaxiques: Cet isolement est prévu pour éviter que les animaux se blessent entre eux lors de la phase de cicatrisation post-opératoire. Au bout de 7 jours les animaux seront replacés en hébérgement collectif en respectant les mêmes compositions de cage qu'avant les chirurgies (n=230).

Devenir

A la fin des procédures les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde pour la conservation des tissus (cerveau), qui seront analysés ultérieurement.

Remplacement

Le projet étant basé sur la reconnaissance des émotions chez la souris et sa relation avec la consommation d’alcool, il n’est pas possible à ce jour de remplacer l’utilisation d’animaux par une autre approche. En revanche, les effectifs peuvent être optimisés en remplaçant les tests indépendants par l’utilisation d’une batterie de tests longitudinaux qui permet d’optimiser le recueil des données pour chaque animal. Ceci implique d’une part de choisir, sur la base de la littérature et de résultats préliminaires, des tests ne modifiant pas le comportement à long terme; et d’autre part d’espacer ces tests dans le temps. Ainsi, deux tests à court terme réalisés en séquentiel divisent par deux l’effectif total sans impacter significativement les résultats.

Réduction

En plus de l'utilisation de batteries de tests (voir ci-dessus), des études pilotes avec un petit nombre de sujets (n=4-5) permettront de déterminer si les effets justifient l'application d'un protocole complet, ce qui peut réduire de façon importante l'effectif total. Ce nombre n’est pas suffisant pour garantir un effet statistique solide mais il permet de décider, sur la base de statistiques descriptives, de compléter l’expérience à 10 animaux par groupe qui est l’effectif minimum nécessaire pour une significativité acceptable avec les tests statistiques paramétriques d’analyses de moyenne et de variance.

Raffinement

Toutes les dispositions permettant de préserver le bien-être des animaux seront prises: anesthésie générale pour l'opération, traitement post-opératoire anti-inflammatoire préventif. Par ailleurs l'ensemble des animaux est maintenu dans des conditions d'environnement enrichi, avec à disposition un matériau pour construction de nid. Après chaque intervention chirurgicale (classe modérée) les animaux seront isolés afin d’éviter tout risque de blessures ou de souffrance. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens formés en expérimentation animale (niveau appplicateur) qui informent le concepteur/expérimentateur immédiatement lorsque que des dispositions doivent être prises en cas de signe de souffrance. L'atteinte des points limites entraine l'application du protocole de réponse en fonction du score défini dans chaque procédure. Il faut noter que les tests sociaux utilisés, en permettant aux animaux d’interagir librement de façon quotidienne pendant la durée des expériences, peuvent être considéré comme un enrichissement. L’ensemble des expérimentateurs/soigneurs intervenant sur les animaux a suivi une formation à l’expérimentation animale (niveau 1 ou 2).

Choix des espèces

La souris représente une espèce de référence pour l’étude du système nerveux central chez les vertébrés supérieurs. L’organisation du système nerveux murin permet une extrapolation raisonnable des résultats obtenus chez la souris à l’espèce humaine. Par ailleurs, la souris est une espèce qui peut être manipulée génétiquement, fournissant des outils essentiels à la compréhension des mécanismes neurobiologiques et des mécanismes neuronaux impliqués dans de nombreuses maladies et déficits cognitifs. Grâce aux modèles transgéniques, il est aussi possible de relier les données de la génétique humaine des maladies à l'altération de molécules/récepteurs spécifiques dont la fonction peut être analysée avec des modèles précliniques de ces maladies. Par exemple, l'implication de mutations des récepteurs cholinergiques nicotiniques dans la dépendance à l’alcool peut être étudiée à l'aide des souris dépourvues (α5KO) de certains de ces récepteurs et à des souris exprimant un polymorphisme génétique humain (α5KI) qui sont utilisées dans le projet présent. Les animaux seront utilisés au stade âge adulte mature (3–6mois). Cet âge constitue une période de stabilité durant laquelle on considère que le développement est achevé et les effets liés au vieillissement minimum.