Oncologie

22 babouins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit quatre anesthésies profondes de deux heures et 21 prélèvements sanguins sous anesthésie légère, avant une mise à mort sous anesthésie profonde pour prélèvement de plusieurs organes. Hébergés en volière avant le protocole, ils passent la durée de l'étude dans des cages séparées, seulement jointives. L'étude sert à caler la dose d'anticorps polyclonaux développés par une société privée avant l'essai de toxicité réglementaire, et le porteur écrit qu'il est "nécessaire" de valider l'innocuité de cette dose, deux animaux par dose suffisant selon lui à trancher.

Objectifs

Notre société développe des anticorps polyclonaux glyco-humanisés dans le domaine de la cancérologie notamment. Trois anticorps polyclonaux glyco-humanisés nouvellement développés dans le domaine de la cancérologie ont démontré leur efficacité dans des modèles murins précliniques. Des études de toxicité réglementaire sont requises chez le primate non humain par les recommandations réglementaires. En préalable à ces études et dans un souci de réduction du nombre d’animaux à inclure, il est nécessaire de valider l’innocuité d’une dose équivalente à la dose thérapeutique visée. Des prélèvements sanguins réguliers seront effectués afin d’effectuer un bilan cardiaque/musculaire, hépatique/pancréatique, inflammatoire. Les animaux seront observés quotidiennement et soumis à une grille d’observation comportementale, afin d’obtenir un bilan cognitif primaire. Les prélèvements sanguins seront aussi utilisés pour déterminer la pharmacocinétique du produit, conformément aux recommandations réglementaires. Cette étude préliminaire permettra de valider la bonne tolérance de la dose présumée, de mettre au jour d’éventuels points d’alerte qui permettront de prévoir une surveillance accrue et plus exhaustive de ces paramètres, et de limiter l’étude de toxicité réglementaire à un simple groupe à cette dose.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider la tolérabilité d’une dose thérapeutique

Procédures

4 anesthésies profondes par animal (2h) avec prélèvements, et 21 prélèvements sanguins sous anesthésie légère (15 min), euthanasie en fin de projet sous anesthésie profonde

Impact sur les animaux

Les anesthésies profondes de 2h ainsi que les prélèvements de sang multiples sous anesthésie légère peuvent occasioner de l'inconfort, de la confusion et du stress pour les animaux au moment du réveil, pour autant elles permettent de diminuer ces effets d'inconfort, de confusion et de stress pendant les procédures, les rendant ainsi le moins traumatisantes possible pour les animaux par rapport à ces mêmes procédures qui seraient effectuées sur animaux vigiles.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort, sous procédure complète d'anesthésie, en fin de protocole de gravité modérée pour prélèvement multi-organes post-mortem.

Remplacement

Cette autorisation de projet a pour objectif de valider la dose thérapeutique ciblée pour les anticorps polyclonaux 1, 2 et 3, de manière à optimiser l’étude de toxicité réglementaire nécessaire à la constitution du dossier de demande d’autorisation d’essai clinique. Les études pré-cliniques réalisées montrent que les primates non humains et le babouin notamment est l’espèce la plus représentative de l’homme pour l’évaluation de la toxicologie des anticorps car la cross-réactivité cellulaire est comparable.

Réduction

Pour chaque dose, le nombre d’animaux est réduit à son minimum soit 2 par dose, en raison de la variabilité interindividuelle. Le groupe contrôle est partagé pour tous les anticorps testés, toujours dans un objectif de réduction. De plus, le projet est divisé en 2 parties. Dans la partie 1 seul l’équivalent de la dose thérapeutique ciblée chez l’homme sera administrée. La dose forte ne sera pas administrée si une des précédentes doses a provoqué des effets indésirables graves

Raffinement

-De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie générale. Un traitement analgésique leur sera donné si nécessaire en fonction de la procédure. -Les anesthésies et traitements analgésiques donnés aux animaux sont décrits dans les procédures. La fréquence d'observation des animaux est doublée lors des expérimentations et consiste en un examen clinique de l’animal selon une grille de signes notables, signes sévères et un arbre décisionnel -Si des effets indésirables apparaissent dès la première injection, la seconde injection ne sera pas réalisée. -Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur mode de vie en communauté, puis, au cours du protocole expérimental les individus sont hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement du milieu par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Les primates non humains, ici les babouins, représentent des espèces animales de choix comme modèles animaux pré-cliniques, car proches de l’homme de par leur anatomie, leur physiologie, leur métabolisme, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’homme. Les investigations in vivo sur une espèce représentative est un prérequis obligatoire par les autorités réglementaires avant d’envisager un essai clinique chez l’homme. Les animaux seront inclus à un stade jeune adulte, afin de présenter un système immuntaire mature.

Une nécrose humide, creuse ou douloureuse à la palpation sur la tumeur d'une souris déclenche sa mise à mort, comme une tumeur qui atteint la taille limite. 2 112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales, puis jusqu'à trois semaines d'injections combinant chimiothérapie, immunothérapie et molécules ciblant les récepteurs TLR, avec un épisode fébrile possible. Le porteur cherche à retirer la chimiothérapie de ces combinaisons et écrit que l'avantage pour le bien-être des patients "serait alors énorme", à un stade où les résultats restent à établir chez la souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à démontrer l’intérêt d’utiliser des agents qui ciblent des récepteurs de l’immunité (TLR) afin d’induire l’infiltration de cellules immunitaires dans les tumeurs, et ainsi favoriser les réponses aux thérapies anti-cancéreuses. Il est déjà connu que les agents ciblant les TLRs peuvent induire le recrutement de cellules immunitaires dans les tumeurs et ainsi favoriser une réponse immunitaire anti-tumorale. Certains agents ciblant ces TLR sont actuellement utilisés en clinique dans le traitement des cancers. Ces agents sont utilisés individuellement et associés à d’autres thérapies conventionnelles comme les chimiothérapies (drogues anti-cancéreuses) ou les immunothérapies (agents stimulant la réponse immunitaire). Dans ce projet, nous nous proposons d’utiliser ces agents ciblant les TLRs en association et de tester leur capacité à augmenter l’efficacité anti-tumorale des immunothérapies sans l’ajout de chimiothérapies qui sont connues pour induire des effets secondaires.

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude nous pensons pouvoir proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques pour les patients atteints de cancer. L’association des agents ciblant les TLRs devrait permettre le recrutement d’un fort infiltrat immunitaire qui après stimulation pourra éliminer efficacement les tumeurs. L’étude de la composition de l’infiltrat immunitaire permettra une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux dans l’élimination des tumeurs, ce qui est cruciale pour le développement et l’optimisation des thérapies anti-cancéreuses chez les patients. De plus, nous nous attendons à ce que l’association des deux ligands de TLR avec l’immunothérapie induise une efficacité anti-tumorale bien supérieure à celle pouvant être obtenue avec l’association des chimiothérapies à l’immunothérapie. L’avantage en terme de bien être des patients serait alors énorme.

Procédures

Les souris recevront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale. Les traitements reçus par les souris seront : - injection (30 secondes) de chimiothérapies au maximum 1 fois par semaine pendant 3 semaines. - injection (30 secondes) d’immunothérapies au maximum 2 fois par semaine pendant 3 semaines. - injection (30 secondes à 1 minute) de molécules ciblant les TLRs, 2 fois par semaine à raison de 5 injections maximum

Impact sur les animaux

- Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutanée - La contention des souris lors de la mesure de la taille des tumeurs et des traitements pourrait provoquer un léger stress. - Le développement de la tumeur peut générer une gêne au mouvement et donc impacter son état général. - Des nécroses peuvent apparaitre sur les tumeurs. - Les injections intra-péritonéales et intraveineuses répétées pourraient provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les chimiothérapies et immunothérapies administrées sont largement utilisées en préclinique à ces doses et fréquences, et ne devraient pas beaucoup impacter l’état de santé des animaux, au maximum elles peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - Les agents ciblant les TLRs sont également utilisés à des doses déjà bien établies dans les modèles murins. L’injection des agents ciblant les TLRs membranaires pourrait induire un léger épisode fébrile.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences et leur tumeur sera prélevée.

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisée in vitro mais la capacité de nos associations d’agents ciblant les TLRs à pouvoir induire le recrutement des cellules immunitaires dans la tumeur et ainsi à promouvoir l’efficacité anti-tumorale des thérapies conventionnelles ne peut être démontrée que dans un organisme vivant entier.

Réduction

Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, les croissances tumorales seront réalisées sur des groupes de 8 souris. Nous répèterons l’expérience 1 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques, comme nous avons déjà pu le déterminer dans des expériences antérieures. Pour l’analyse de l’infiltrat immunitaire intra-tumoral, les groupes seront alors réduits à 5 souris par groupe, l’expérience sera renouvelée 1 fois afin d’atteindre une puissance satisfaisante pour l’analyse statistique. L’analyse de l’infiltrat immunitaire sera réalisée sur 8 groupes uniquement, ceux associés aux immunothérapies ne seront pas ajoutés, leurs rôles étant déjà connus. La mise en évidence de l’importance du système immunitaire dans l’efficacité des associations thérapeutiques ne sera étudié que dans les 3 modèles où nous aurons déterminé les meilleures efficacités thérapeutiques et avec les 6 groupes les plus représentatifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour tous les animaux, une semaine d’acclimatation sera respectée avant le début de l’expérimentation. Ces animaux seront habitués aux gestes techniques (contention, injections…) avant toute expérimentation. Les injections se feront au même moment de la journée, pour perturber au minimum le cycle des souris, l’injection des cellules tumorales se faisant sous anesthésie générale. Les souris immunodéficientes seront hébergées sous couvercle filtrant pour éviter les risques d’infection. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude, la fréquence de surveillance étant augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux tels qu’une perte de poids, des modifications du comportement, l’apparition de nécroses sur les tumeurs ou d’une période de fébrilité. En cas de changement de comportement ou d’apparence physique, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas d’apparition de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront euthanasiées. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant. En cas d’épisode fébrile de plus 24h post-injection du composé ciblant les récepteurs, les souris recevront 1 injection d’un analgésique toutes les 12h jusqu’à disparition des symptômes (le maximum retrouvé étant de 48h dans de très rares cas). Lorsque la tumeur atteint une taille limite, en cas de perte de poids ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Dans un premier temps, nous utiliserons des souris immunocompétentes permettant l’implantation de cellules cancéreuses murines syngéniques. Afin de déterminer l’implication du système immunitaire dans l’effet anti-tumoral de nos combinaisons thérapeutiques, nous utiliserons alors des souris immunodéficientes. Les animaux devront avoir au moins 8 semaines pour que leur système immunitaire soit mature.

Immunodéficientes pour que des cellules tumorales humaines s'y développent sans rejet, 52 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses dans le sang, développent des métastases pulmonaires avec perte de poids et difficultés respiratoires possibles, puis passent jusqu'à seize cycles d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie gazeuse. Une partie subit en plus quatre anesthésies de quarante-cinq minutes en quatre jours consécutifs, une autre reçoit un anticorps couplé à un métal radioactif. Toutes sont tuées pour analyser les tissus, dans un projet qui vise un sous-type de cancer du rein représentant 5 % des cas.

Objectifs

Le rein est un élément central dans la régulation de l'homéostasie. Ils filtrent le sang et produisent un certain nombre d’hormones capitales dans la régulation de la tension artérielle. Le cancer du rein est un problème majeur de santé publique avec ~400 000 nouveaux cas par an dans le monde. Ce projet vise à cibler une protéine, initialement décrite comme participant au développement du cerveau, dans un sous-type de cancer du rein, dit chromophobe. En effet, cette protéine est spécifiquement exprimée par les cellules de la tumeur primaire et des métastases de cancer du rein chromophobe. Nous prendrons l’avantage du développement au laboratoire d’un anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt couplé à un métal radioactif, technique appelée radiothérapie interne vectorisée. Cette technique permet soit de détecter des métastases par imagerie nucléaire ou de cibler thérapeutiquement les cellules tumorales sous l’effet des rayonnements ionisants. Ces candidats médicaments seront testés sur un modèle tumoral murin.

Bénéfices attendus

Les cancers du rein chromophobe sont une maladie rare. Elle ne touche que 5 % des cancers du rein. Actuellement, ce sous-type de cancer du rein fait l’objet de très peu de recherche et par conséquent les perspectives thérapeutiques de ces patients sont pauvres. Par ailleurs, les patients métastatiques n’ont quant à eux aucune perspective thérapeutique, puisqu’ils reçoivent le traitement de référence des autres sous types de cancer du rein. Ce dernier n’a jamais montré d’efficacité thérapeutique dans leur pathologie. Ainsi, notre projet pourrait permettre de développer la première stratégie thérapeutique spécialement dédiée au cancer du rein chromophobe et apporter un espoir à ces patients métastatiques pour qui l’issue est aujourd’hui fatale.

Procédures

Dans ce projet, les animaux recevront tous une injection intraveineuse des cellules tumorales (2 minutes), puis au cours du suivi longitudinal hebdomadaire, ils seront au maximum soumis à 16 cycles d’imagerie (Injection d’un traceur et une anesthésie gazeuse à l’isoflurane durant l’acquisition 10 minutes). Ensuite, certains animaux recevront une injection intraveineuse du composé pour l’imagerie sous anesthésie gazeuse (détection des métastases). Ces derniers seront ensuite soumis à 4 anesthésies gazeuse de 45 minutes pour l’imagerie nucléaire (4 jours consécutifs). Une autre partie des animaux recevront une injection intraveineuse du composé thérapeutique sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux développeront des métastases pulmonaires. L’apparition de ces métastases peut être associé à une perte de poids et à des problèmes respiratoires.

Devenir

Tous les animaux seront tous mis à mort pour analyser les tissus.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous cherchons à voir si notre molécule pourrait être utilisable pour la détection et le ciblage thérapeutique de métastases de cancer du rein chromophobe. Afin de tester l’effet de notre molécule sur des métastases, nous utilisons des modèles animaux, car il n’existe pas d’autre solution pour générer des modèles de métastases autrement que par des expériences in vivo. Seul un organisme complexe permet de récapituler les caractéristiques physiques et biologiques que l’on retrouve chez le patient (accessibilité du traitement au cellules tumorales, notamment).

Réduction

Afin de réduire considérablement nos effectifs, nous avons choisi d’utiliser une approche de suivi longitudinal par imagerie. De plus, le nombre d’animaux a été déterminé par des approches statistiques nous permettant de répondre à notre question biologique.

Raffinement

Méthodes utilisées pour réduire la douleur : La plupart des interventions sur les animaux seront réalisés sous anesthésie gazeuse (anesthésie générale et analgésie). De plus, nous utiliserons le suivi longitudinal par imagerie pour suivre l’apparition des foyers métastatiques. De la sorte, nous serons dans la capacité d’arrêter la procédure avant l’apparition de signes cliniques. Par ailleurs, nous avons mis en place un scoring pour les points limites afin de prendre en charge les animaux présentant un signe de douleur (analgésie ou mise à mort si scoring trop élevé).

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Procédure 1 à 3 : 3: La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules. Au début du projet, Les animaux sont âgés de 6 à 8 semaines car la prise tumorale est meilleure à cet âge.

Gavés une fois d'une dose de pyréthrines ou de pipéronyl butoxide diluée dans de l'huile végétale, après quatre heures de jeûne suivies de six autres, 50 rats Wistar mâles passent 72 heures en cage métabolique individuelle pour que leurs urines et leurs fèces soient recueillis à huit reprises. La procédure implique un niveau de souffrance modéré, et c'est le séjour en cage métabolique et le jeûne de dix heures qui la classent ainsi, non la substance testée. Le projet vise à décrire pour la première fois le devenir des pyréthrines chez un mammifère, préalable annoncé à une biosurveillance humaine. Tous les rats restent vivants et sont ensuite réutilisés en travaux pratiques d'enseignement, sans que le RNT dise ce qui leur arrive à ce stade, ni pourquoi seuls des mâles sont utilisés au-delà de la mention de "recommandations en vigueur".

Objectifs

L'étude des expositions alimentaires aux résidus de pesticides est un réel enjeu de santé publique. En étudiant comment les substances circulent dans notre organisme, sont transformées et sont éliminées (toxicocinétique) et en développant des méthodes pour mesurer ces produits de transformation (métabolites), on peut mieux estimer les risques liés à l'exposition. Les Pyréthrines sont des produits utilisés en agriculture biologique, fabriqués à partir de fleurs de pyrèthre de Dalmatie ou de certains chrysanthèmes. Leur mécanisme d’action cible le système nerveux des insectes, mais peut aussi être toxique pour les poissons. Aucune étude sur le devenir des pyréthrines chez les mammifères n'est disponible. Seule une étude réalisée chez l’Homme rapporte la présence de deux métabolites pouvant être ceux des pyréthrines. Ainsi cette étude a pour objectif de confirmer que ces deux métabolites identifiés sont bien spécifiques à l'exposition aux pyréthrines et d’en étudier la toxicocinétique, ce qui n’a jamais été réalisé. Cette étude représente une étape préliminaire au développement de méthodes de biosurveillance aux pyréthrines chez l’Homme, que ce soit pour les professionnels de l’agriculture ou la population générale. D’autre part, le Pipéronyl Butoxide (PBO) est une substance qui, lorsqu'elle est combinée avec des insecticides, les rend plus puissants en empêchant les insectes de s'en débarrasser facilement. Le PBO est le plus souvent utilisé avec les pyréthrines et les pyréthrinoïdes (dérivés synthétiques des pyréthrines). Ce projet vise également à évaluer la toxicocinétique du PBO chez le rat car à ce jour peu de données sont retrouvées dans la littérature scientifique (1 seule étude disponible ne permettant pas de caractériser les métabolites). Une meilleure connaissance de la toxicocinétique du PBO permettra d’identifier les métabolites formés et de mettre au point leur dosage. Les deux substances étudiées ici présentent des dangers potentiels pour la santé humaine telle des affections des systèmes endocriniens, nerveux et reproducteur. Il est donc primordial pour la prévention de la santé de l’ensemble de la population de mieux connaître leurs toxicocinétiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la toxicocinétique et de caractériser les métabolites des Pyréthrines et du PBO. A notre connaissance, la toxicocinétique des pyréthrines n'a jamais été décrite dans la littérature. Celle du PBO n'a été réalisée que dans une seule étude mais elle n'a pas permis de caractériser les métabolites. Une meilleure connaissance de ces paramètres permettra d'adapter les mesures de prévention pour la santé des populations.

Procédures

Après 7 jours d’acclimatation à l’animalerie, les rats seront placés en cages métaboliques pendant 24h afin de les acclimater à la cage métabolique. Au 8ème jour, les rats seront mis à jeun pendant 4 heures puis une dose de pyréthrines ou de PBO leur sera administrée en une seule fois par gavage (durée du geste : 15 à 20 s). La substance d'intérêt sera diluée dans un volume d’huile végétale adapté selon le poids du rat. Le jeûne sera maintenu pendant 6 heures supplémentaires après le gavage. La durée de mise à jeun de 10 heures au total permet d’éviter la variabilité interindividuelle de l'absorption de substances en raison d'une consommation alimentaire variable d’un individu à l’autre. L’eau sera disponible à volonté durant cette période de jeûne. Après le gavage, les rats seront replacés en cages métaboliques pendant 48 heures, afin de pouvoir recueillir les fèces et urines à 30 minutes, 1 heure, 3 heures, 6 heures, 9 heures, 12 heures, 24 heures et 48 heures, ceci dans le but d’étudier la vitesse d’élimination des substances et des métabolites identifiés.

Impact sur les animaux

Ce protocole nécessite un séjour des rats de 72 heures en cage métabolique (24h d'acclimatation à la cage métabolique et 48h pour l'étude et le recueil des fèces et urines). L'acclimatation de 24h en cage métabolique est nécessaire dans le cadre de notre étude pour ne pas influencer les excrétions d'urines et de fèces qui seraient liés au stress lié à la mise en cage métabolique juste après le gavage des animaux. De plus, une mise à jeun pour une durée totale 10 heures (4 heures avant et 6 heures après le gavage) est nécessaire afin de diminuer la variabilité inter-individuelle d'absorption. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Devenir

50 rats Wistar seront utilisés lors de cette étude et soumis à une procédure de gravité modérée. Tous les rats seront maintenus en vie à la fin de la procédure et seront réutilisés pour d'autres projets (enseignement/travaux pratiques).

Remplacement

L'étude de la toxicocinétique des Pyréthrines et du PBO ne peuvent pas être évaluées sur des cellules ou tissus isolés car il est nécessaire d’étudier la réponse d’un organisme entier à ces substances. De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports en pyréthrines et PBO en phase d'exposition ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres.

Réduction

Le nombre d’animaux s’appuie sur les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques relatives aux études de toxicocinétique chez les rongeurs. Ce protocole utilise trois doses de Pyréthrines afin d'assurer des résultats scientifiques fiables et robustes tout en utilisant un nombre total d'animaux minimal. Selon une évaluation statistique et ce qui a été décrit dans la littérature scientifique concernant la toxicocinétique du PBO seul et des pyréthrines seules, un nombre minimal de sujets nécessaires a été estimé à dix rats par groupe afin de pouvoir visualiser une différence statistique entre les groupes. Ce protocole n’utilisera que des rats mâles, des animaux de sexe féminin ne seront pas utilisés. Le choix du sexe est fait en fonction des recommandations en vigueurs.

Raffinement

Ce protocole ne fait appel qu'à des procédures légères ou modérées. Les rats seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Les rats seront nourris avec un régime standard qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ils seront hébergés dans des cages à 25°C et 30-50% d’hygrométrie, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, avec une alternance jour/nuit de 12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum, sauf pendant la période de jeûne. Les rats seront traités selon les règles éthiques de l’expérimentation animale. L’ensemble du projet est mené par un personnel compétent en expérimentation animale qui maîtrise parfaitement les gestes techniques nécessaires. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts définis. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi comme préconisé par les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques. De plus, le modèle de rat Wistar correspond à l'espèce la plus pertinente et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse de façon durable et sans qu'il soit possible de la soulager. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour ce genre d’étude. De plus, l'étude sur le Pipéronyl Butoxyde a été réalisée sur un modèle de rat. Réaliser cette étude dans des conditions similaires permettra de comparer et d’enrichir les données décrites dans la littérature scientifique avec l’analyse des résultats de cette étude. Les rats seront âgés de 6 semaines pesant environ 250g au démarrage de l'étude. Les rats seront âgés de 7 semaines à la fin de l'étude. L'âge des animaux s'appuie sur les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques relatives à l'étude de la toxicocinétique chez les rongeurs. Suite à une décision de l'équipe, les rats utilisés dans cette étude sont le plus jeune possible afin de pouvoir être réutilisés sur un autre projet (enseignements/travaux pratiques).

30 porcs en croissance vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 18 tués à l'issue et 12 renvoyés en élevage jusqu'à l'abattoir. Douze d'entre eux passent une heure sous anesthésie générale pour recevoir deux cathéters dans la veine jugulaire et un capteur de température dans un muscle, puis vivent quatre semaines en loge individuelle, alors que le porc vit normalement en groupe. Ils subissent 78 prélèvements de sang, soit 6 % de leur volume circulant, et une exposition à la chaleur dont le porteur écrit qu'elle peut provoquer une hyperthermie grave au-delà de 41,5 °C. L'ensemble sert à valider des capteurs présentés comme une alternative aux prises de sang, le porteur qualifiant cette étape d'"indispensable" pour raffiner les pratiques d'élevage face aux canicules.

Objectifs

Le projet vise à décrire et comprendre la complexité des mécanismes d’adaptation individuelle du porc en croissance face à un stress thermique qui simule ce qui se passe au cours d’une vague de chaleur estivale. Les constantes physiologiques d'un animal sont dépendantes de mécanismes de régulation interne qui permettent aux cellules de l'organisme d'utiliser les éléments apportés par l'alimentation et la boisson tout en maintenant les équilibres hydriques et électrolytiques dans une gamme permettant aux cellules et aux organes de fonctionner correctement. Les éléments qui jouent un rôle important dans ces régulations sont notamment le glucose (sous l'action de l'insuline) et les cations comme le sodium. Le glucose est l'un des principaux nutriments énergétiques apportés par l'aliment sous forme d’amidon puis libéré des tissus où il est stocké transitoirement sous forme de glycogène entre les repas. Le sodium est un élément important pour équilibrer l'eau dans les cellules (équilibre osmotique) et permettre le fonctionnement des muscles ; une variation de sa concentration peut traduire un trouble de l'hydratation (suite à l'élévation de la température ou à une hyperglycémie marquée par exemple). Or l'amplitude de variations des paramètres physiologiques et la latence avant le retour à l'équilibre sont très différentes d'un individu à l'autre, en fonction de sa capacité à s'adapter ou non à une modification de son environnement (type d'aliment, stress thermique, etc...). Il s’agit ainsi de mettre en relation des données fournies à haute fréquence de mesures par de nouveaux capteurs biologiques avec les variations de plusieurs paramètres sanguins mesurés par des prélèvements sériés pour évaluer la synchronisation des différents évènements métaboliques et physiologiques durant les cycles jour et nuit. La signification biologique des variations sera interprétée en relation avec le type de modifications de la température ambiante (thermoneutralité ou température élevée) et de la prise alimentaire (fréquences des repas, quantité ingérée), et au regard de données comportementales mesurées chez les mêmes animaux (vidéos de l’activité physique et d’abreuvement, accéléromètres embarqués sur les animaux, paramètres de visites aux automates d'alimentation, prélèvements ponctuels de salive pour mesurer le niveau de stress).

Bénéfices attendus

Les connaissances acquises sont de nature à nous permettre de mieux comprendre la synchronisation des différents évènements métaboliques (concentrations circulantes des molécules) et physiologiques (température interne) au regard des réponses adaptatives, afin de raffiner les pratiques en amont pour minimiser les conséquences d'évènements dégradant le bien-être de l'animal. En outre, les variations des composantes physiologiques de l’adaptation de l’animal sont difficiles à évaluer à des échelles de temps rapprochées sans procédures invasives et contraignantes pour l'animal et exigeantes en main-d'œuvre pour les expérimentateurs. Valider la pertinence des mesures obtenues avec des capteurs métaboliques et physiologiques sur un éventail restreint de molécules cibles constitue une étape indispensable pour analyser les états physiologiques en réponse aux modifications de conditions environnementales ou de pratiques et les conséquences sur le bien-être animal, et en fournissant une alternative à la technique invasive de prélèvements sanguins qui fait actuellement référence chez le porc.

Procédures

* Opérations chirurgicales sous anesthésie générale (durée =1 heure) pour équiper les animaux de deux cathéters veineux et d'un capteur de température interne. Douze animaux sont concernés. * Tranquilisation à dose préanesthésique (durée = 15 min) pour la pose de capteurs physiologiques en intradermique. Dix-huit animaux sont concernés (12 animaux expérimentaux et 6 animaux utilisés dans des tests de design d'un des capteurs). * Prélèvements de sang en cinétique : 1/ après ingestion d'un repas (durée totale de 4 heures), nous allons réaliser une cinétique de prélèvements 2 fois pendant l'expérimentation. Pour chaque cinétique, 15 prélèvements de 2,5 mL seront effectués; et 2/ durant un nycthémère (24 h), nous allons réaliser une cinétique de prélèvements 2 fois durant l'expérimentation également. Pour chaque cinétique, 24 prélèvements de 2,5 mL seront effectués. Au toal, ces prélèvements de sang via un petit tuyau inséré dans la veine jugulaire, correspondent à 6 % du volume circulant prélevé sur chaque porc. Douze animaux déclarés dans la demande d'autorisation de projet sont concernés. * Prélèvements de salive : 2 prélèvements/jour 5 fois pendant l'essai à l'aide d'un tampon à mâcher (durée du prélèvement = 2 min). Douze animaux déclarés dans la demande d'autorisation de projet sont concernés.

Impact sur les animaux

Tous les porcs seront hébergés dans des loges individuelles durant 4 semaines, constituant une contrainte pour un animal vivant habituellement en groupe. Ce logement est strictement nécessaire pour obtenir un corpus de données individuelles (comportement alimentaire, prise de sang sériées, mesure en continue de la glycémie, etc..). L’implantation intramusculaire du capteur de mesure de la température interne et l’insertion de deux petits tuyaux souples (cathéters) dans la veine jugulaire s'effectuent sous anesthésie générale (mélange gazeux). Cette anesthésie et la phase de réveil constituent en soi une nuisance pour l’animal, de même que la phase de cicatrisation qui suit l’opération. Nous ne pouvons pas totalement exclure la survenue d’une infection locale liée à la présence et à l'utilisation du cathéter. La présence d'aiguilles sur les deux capteurs placés en intradermique (1 aiguille de 10 mm pour le capteur glycémique, plusieurs microaiguilles de 2 800 µm de hauteur et 600 µm de diamètre pour le capteur de conductimétrie) peuvent entraîner une gêne pour l’animal lors de ses mouvements. Les capteurs métaboliques sont sécurisés sur l’encolure de l’animal par une bande adhésive, ce qui peut entraîner une gêne. Les prélèvements de sang et de salive étant réalisés par du personnel compétent dans le cadre de procédures où les points limites sont définis et où des observations quotidiennes sont faîtes sur les animaux, nous ne nous attendons pas à des nuisances particulières liées aux prélèvements. Enfin, une nuisance attendue est liée à l’exposition des porcs à la chaleur, sans pouvoir totalement exclure la survenue d’une hyperthermie grave (>41,5°C pour la température interne).

Devenir

Les porcs (n=12) ayant subi une opération chirurgicale ne pourront pas être réintégrés dans le troupeau. Ils seront euthanasiés à la fin de l'expérience. Les porcs utilisés pour optimiser le design du capteur de conductimétrie (n=6) seront également euthanasiés pour pouvoir examiner l'état de leur derme après implantation du capteur. Les porcs non opérés (12 porcs) servent de témoins pour valider l’absence d’effets négatifs de l’opération sur le comportement; s'ils ne sont pas utilisés comme remplaçants d’un des animaux expérimentaux en cas d’atteinte d’un point limite, ils seront replacés dans un bâtiment d'élevage dédié, et conduits selon des pratiques d'élevage standards jusqu'au stade de commercialisation (environ 115 kg de poids vif). Il n'y a pas de réutilisation de ces animaux à des fins scientifiques..

Remplacement

Le porc est l'espèce cible de ce projet qui vise à étudier les mécanismes de régulation des constantes physiologiques face aux défis posés par des changements dans l'environnement et vis à vis de variations de son état de bien-être. Il n'est pas possible d'étudier les variations des paramètres métaboliques et physiologiques au regard des modifications comportementales, sans utiliser des porcs de génotype conventionnel (Large White x Landrace x Piétrain) utilisés actuellement dans les élevages commerciaux. Cela permettra ensuite d’objectiver les actions à mettre en place en élevage, et au bénéfice de la santé des porcs et de leur bien-être. L'utilisation d'animaux vivants est nécessaire pour rendre compte de processus biologiques extrêmement dynamiques et sujets à une large variabilité entre individus, face aux variations de la température ambiante. Le remplacement n’est pas possible car l’utilisation d’animaux est inhérente au type d’étude (stratégies individuelles d'adaptation des porcs aux impacts du changement climatique).

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum statistique en fonction des mesures effectuées. Chaque porc est son propre témoin durant les deux périodes expérimentales (thermoneutralité et chaleur), ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires (ANOVA intra-porc avec l'effet répété du temps pour comparer les valeurs à thermoneutralité ou en période de température chaude). Outre la bibliographie sur la variabilité des constantes physiologiques et métaboliques, un précédent projet sur la validation de capteurs glycémiques a permis de confirmer qu'un nombre de 10 à 12 porcs est optimal pour prendre en compte les échecs de fonctionnement du cathéter ou du capteur.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi très proche par les techniciens en expérimentation animale formés à l'éthique. La surface des loges (2 m²) permet à l'animal d'avoir une activité minimale et les loges offrent la possibilité d'interactions entre porcs grâce à des ouvertures faites dans les séparations entre deux loges. Dans chaque loge, des jouets (toile, étoile...) et d'autres dispositifs d'enrichissement (ex. chaine) seront placés et régulièrement renouvelés afin de limiter l'ennui. Toute intervention potentiellement douloureuse ou stressante sera réalisée par du personnel habilité, formé et expérimenté et les animaux seront suivis de manière rapprochée dans les minutes et heures qui suivent l’intervention. L’utilisation d'un capteur de température placée en intramusculaire nous permet de limiter les interactions entre les expérimentateurs et les animaux et le stress engendré par la prise de température manuelle par thermomètre rectal, tout en améliorant la qualité de la mesure obtenue (fréquence et précision). Dans le cadre de prélèvements répétés de sang, le recours à un cathéter veineux permet de réduire significativement le niveau de stress de l’animal, comparativement à celui induit par un prélèvement de sang obtenu à l’aide une aiguille plantée dans la jugulaire et nécessitant la contention de l’animal par un dispositif de contention nasale. Les prélèvements de sang au cathéter jugulaire sont réduits au volume nécessaire pour les dosages de constantes métaboliques (2,5 mL/prélèvement) pour une cinétique avec 15 points de prélèvements après un repas test (1 point avant le repas, 14 points durant les 4 h qui suivent le repas). Durant le nycthémère complet, on prélèvera le même volume de 2,5 mL toutes les heures, soit 24 prélèvements. Ainsi, un volume total de 100 mL de sang sera prélevé la première semaine expérimentale et à nouveau 100 mL la deuxième semaine expérimentale. Cela correspond à environ 6% du volume sanguin total à l'issue de l'expérimentation, en considérant qu'il y a 65 mL de sang /kg de poids vif. L'utilisation de salivettes pour des prélèvements journaliers de salive pendant la période de stress thermique permet aussi de réduire le stress et la manipulation de l'animal grâce à une habituation au dispositif pendant la période d’adaptation. Les capteurs métaboliques ont pour objectif d'obtenir un grand nombre de données (toutes les 2 à 5 min) en continu pendant 5 jours mais sans avoir à manipuler l'animal.

Choix des espèces

- Le porc ne peut pas être remplacé par une espèce modèle compte tenu de la spécificité de ses réponses de thermorégulation (le porc ne possède pas de glandes sudoripares actives) face à un stress thermique. - Le porc est l'espèce cible du projet qui vise à trouver une méthode alternative pour étudier les évolutions des constantes physiologiques face aux défis posés par les modifications de son environnement ou les évolutions des pratiques d'élevage. Il n'est pas possible d'étudier les évolutions des taux sanguins de métabolites ou ions au bénéfice de la santé et du bien-être du porc en élevage, sans utiliser des porcs de génotype conventionnel. Les effets mesurés résultent de processus biologiques extrêmement dynamiques qui ne peuvent pas être reproduits sur des cellules en culture in vitro. Ces processus sont également sujets à de larges variations entre individus, nécessitant de les objectiver sur des sujets vigiles capables de se déplacer. - Nous avons choisi de travailler sur le porc en croissance car ce stade représente la plus grande partie des effectifs animaux au sein d'un élevage de porc et est connu pour être très sensible à la chaleur. Nous travaillerons sur des animaux avec un poids vif de 50-60 kg ce qui correspond au poids vif moyen des porcs en élevage commercial. Techniquement, le poids de 50-60 kg environ est idéal en termes de manipulation et de volume de sang disponible (prélèvements représentant au maximum 6% de son poids vif sur les 13 jours d'expérimentation).