Oncologie

Piégées au verveux, anesthésiées par balnéation, ouvertes pour recevoir dans la cavité abdominale un émetteur acoustique de deux grammes et une puce RFID, puis remises à l'eau au point exact de leur capture : 200 anguilles européennes et 30 silures subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'émetteur posé sur les anguilles porte un capteur qui réagit à l'acide gastrique, de sorte que la digestion d'une anguille par un silure se lise à distance. Aucun poisson n'est tué, et le porteur affirme n'avoir jamais observé de mortalité à court terme lors des marquages précédents. Les 200 individus opérés appartiennent à une espèce classée en danger critique d'extinction, ce que le porteur donne précisément comme raison de vérifier si le silure les prédate.

Objectifs

Ce projet a pour but d’identifier les éventuelles relations trophiques entre une espèce en danger critique d’extinction (l’anguille européenne, statut Union International pour la Conservation de la Nature) et une espèce considérée comme exotique envahissante (le silure glane, classé par le centre de ressource Espèces Exotiques Envahissantes coordonné par l’UICN et l’OFB). L’impact de cette espèce sur d’autres espèces migratrices de la même famille que les anguilles a déjà été mis en évidence, notamment chez les lamproies, les aloses et les saumons. Des relations trophiques entre silure et anguille sont donc possibles, et sont déjà souvent mises en avant par une partie de la société (pêcheurs professionnels et loisirs) mais n’ont pas encore été étayées de manière scientifique et rigoureuse. Ce projet vise donc à vérifier dans un premier temps si les silures prédatent les anguilles, et si oui à quantifier cette relation trophique dans un second temps. Pour répondre à ces objectifs, un suivi en télémétrie acoustique sera réalisé sur des anguilles et des silures. Les anguilles seront équipées avec des marques à capteurs de prédation, capable d’identifier un événement de prédation. Des silures seront aussi équipés avec des marques acoustiques afin de donner des informations sur l’utilisation temporelle des habitats.

Bénéfices attendus

La gestion du silure doit se faire sur la base de faits scientifiques avérés et robustes. Si le silure a un effet important sur les populations d’anguilles, compte tenu du statut critique de cette espèce, il sera nécessaire de prendre en compte très rapidement des mesures afin de limiter l’expansion géographique et démographique des silures. A ce titre, il est attendu de cette étude de délivrer des informations fiables sur : - la réalité d’une prédation des anguilles par les silures ; - ce taux de prédation, le cas échéant. Ces données seront utilisées dans les plans de gestion des poissons migrateurs amphihalins dont font partis les aloses, les saumons, les anguilles, ou les mulets par exemple .

Procédures

Cette étude sera composée de plusieurs volets : - premièrement, un suivi en télémétrie acoustique avec marques à capteurs de prédation sera réalisé sur les anguilles. Ces marques sont des marques de télémétrie classiques (donc programmées pour émettre un signal ultrasonique régulièrement afin de pouvoir suivre les individus marqués dans le milieu) auxquelles un capteur supplémentaire a été ajouté. Ce capteur va réagir avec l’acide présent dans les estomacs des poissons prédateurs et il est donc possible de savoir si le poisson hôte dans lequel la marque a été placée au début a été prédaté ou pas. Les données issues du capteur sont envoyées classiquement par la marque acoustique via des ultrasons, qui sont captés dans le système d’étude par un réseau de récepteurs acoustiques. Sur cette action, 200 anguilles jaunes (plus de 40 cm) seront marquées en 4 lots de 50 individus, en avril, juillet 2024 et 2025. Ces marques seront placées dans la cavité péritonéale par opération chirurgicale sous anesthésie générale. Les marques mesureront 7 mm de diamètre, 1.5 cm de long et pèse 2 g, ce qui en théorie autorise le marquage dès 100 g soit 300 mm environ. Par mesure de sécurité, cette limite a été relevée à 400 mm. Les poissons seront ensuite suivis sur le marais de 2024 à 2026. Ces marques sont encapsulées dans une coque moulé en résine époxy de manière à ce que à l’échelle de la vie d’un poisson, aucun effet de ces marques n’a jamais été observée ou mis en évidence. A l’inverse, de nombreux poissons sont suivis des années sans montrer aucune modification comportementale. Un second émetteur de type RFID (aussi appelé pit-tags) sera introduit dans la cavité en même temps (donc n’entraine aucune manipulation supplémentaire) afin que les anguilles marquées puissent être identifiées facilement par le pêcheur. Ces marques sont de taille très réduite (moins de 2 mm de diamètre pour un dixième de gramme), et leur innocuité sur cette espèce a été déjà et fréquemment démontrée (moulage dans une capsule de verre incassable). - en parallèle, 30 silures seront marqués aussi avec des marques de télémétrie acoustique classiques, sans capteur de prédation, en suivant exactement la même procédure que pour les anguilles. Ce marquage a pour but d’estimer le taux d’occupation du marais par les silures en fonction de la saison et donc ainsi de relativiser une éventuelle prédation.

Impact sur les animaux

Comme toutes expériences en écologie comportementale, le stress lors des captures doit être pris en compte. Pour cela, pour les anguilles, seuls des verveux (grandes nasses en filet non maillant) seront utilisés pour les captures. Ces engins sont des pièges et non des filets, et disposent d’un volume assez conséquent dans lequel les poissons sont piégés. De plus, ces pièges sont relevés quotidiennement afin de réduire le stress d’une captivité prolongée. Les silures seront aussi capturés avec des verveux mais adaptés à leur grande taille. Ces pièges seront aussi relevés quotidiennement afin de réduire le stress d’une captivité prolongée. Malgré les précautions prises, un problème lors de l’insertion chirurgicale est toujours à envisager. Mais l’expérience de l’équipe et la robustesse des deux espèces (anguilles et silures) nous amène à être très confiants sur l’absence d’effets létaux ou délétères lors du marquage. Sur les marquages précédents, aucune mortalité à court terme n’a jamais été observée sur ces deux espèces. De plus, sur les anguilles, des tests d’effet à plusieurs semaines ont déjà été réalisés et n’ont jamais montré aucune mortalité ni effet délétère. Le marquage chirurgical sera réalisé sous anesthésie générale, qui, dans l’état actuel des connaissances et bonnes pratiques vétérinaires, semble agir aussi comme analgésique chez les poissons.

Devenir

Le principe est de suivre les animaux dans leur milieu naturel et d’observer une éventuelle prédation des anguilles par les silures en utilisant des marques acoustiques à capteurs de prédation qui réagissent avec l’acidité des estomacs. Tous les animaux marqués seront donc replacés dans leur milieu naturel, à l'endroit précis de leurs captures.

Remplacement

L’étude vise à étudier des relations de type Proies-Prédateurs en milieu naturel, il n’est donc pas possible de remplacer les animaux dans cette étude.

Réduction

Cette étude vise à vérifier et à quantifier (le cas échéant) le taux de prédation des anguilles par les silures. La méthode retenue est la télémétrie acoustique avec des marques à capteurs de prédation, capable d’identifier une évènement de prédation. Cette prédation, si elle existe, pourrait être variable en fonction de la saison, les silures étant une espèce plus active au printemps et à l’été. Ainsi, l’étude doit porter sur une longue durée (36 mois) qui pourrait entrainer des pertes d’individus marqués par émigration naturelle. Ainsi, il est nécessaire d’avoir un effectif suffisant. L’ensemble du protocole, dont les nombres d’individus à marquer, a été validé par un comité de pilotage composé de spécialistes français en télémétrie. Le protocole prévoit 4 lots de 50 anguilles, soit 200 anguilles en tout. Ce nombre a été défini par le comité de pilotage en tenant compte de 1 – la taille du site ; 2 – les taux de perte (migration et prédation) attendus ; 3 – le respect de l’espace acoustique (trop d’individus marqués en même temps dans un même espace clos réduit les probabilités de détection). Ce nombre est donc l’effectif minimal qui permettrait de voir si la prédation a effet significatif sur les populations d’anguilles, compte tenu de toutes les limites évoquées ci-dessus. C’est la taille utilisée dans les études précédentes du même genre. Le protocole prévoit aussi le marquage d’un lot de 30 silures. La taille de ce lot est celle classiquement utilisée dans les études du même genre, et permet d’obtenir des données assez robustes pour définir l’utilisation spatio-temporelle d’un habitat par une espèce.

Raffinement

Plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors des captures et des marquages. La capture se fera avec les engins les plus adaptés pour limiter les blessures des espèces concernées, ainsi que leur stress. Les pièges seront relevés tous les jours afin de limiter le temps de captivité. La pose des marques télémétriques s’effectuera sous anesthésie générale en balnéation, avec entretien par flux continu et ajustement si nécessaire de manière à maintenir la stabilité de l’anesthésie tout au long de l’intervention. Les animaux seront placés en réveil dans un bac d’eau oxygéné jusqu’à récupération complète avant relâche dans le milieu naturel. En même temps, un second émetteur, passif (RFID) et de plus petite taille, sera aussi introduit dans chaque individu afin que le pêcheur titulaire du droit de pêche sur le marais puisse vérifier que les individus péchés par la suite lors de son activité professionnelle ne soit pas des individus suivis. Cette marque sera placée au même endroit que la marque acoustique. En cas de capture d’un individu marqué, le pêcheur aura l’obligation de le remettre immédiatement à l’eau. Après marquage, chaque individu est gardé dans un bac de réveil jusqu’à dissipation totale des effets de l’anesthésiant, puis remis à l’eau à l’endroit exact de la capture.

Choix des espèces

L’anguille européenne est une espèce animal en danger critique d’extinction. Toutes les mesures visant à alléger les pressions subies par cette espèce doivent donc être mises en place de manière rapide. Les espèces exotiques envahissantes, et notamment le silure, sont une pression déjà identifiée sur certaines espèces migratrices comme les lamproies, les saumons et les aloses. L’impact sur les anguilles est donc possible et cette étude servira à démontrer l’effet (ou non) des silures sur les anguilles. L’étude portera sur les anguilles jaunes, le stade sédentaire de croissance des anguilles européennes, et sur les silures adultes de plus de 3 ans (30-40 cm). L’impact du silure sur la phase migratrice des anguilles (anguilles argentées) a déjà été réalisé. Ce projet vise quant à lui à étudier l’impact sur la phase de croissance sédentaire.

848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'abdomen et un prélèvement de sang sous anesthésie, puis développent des lésions intestinales bénignes, effet recherché par le protocole. Le bénéfice annoncé tient à la découverte éventuelle de marqueurs précoces du cancer colorectal, quand l'atteinte est provoquée dès le départ chez chaque animal. L'effectif de 848 n'est rattaché à aucun calcul, le porteur indiquant seulement s'appuyer sur des données antérieures et vouloir engager de petits groupes pour abandonner vite les pistes non concluantes.

Objectifs

Le cancer colorectal (CCR) reste un problème majeur de santé publique malgré les progrès réalisés ces dernières années. De ce fait, il est urgent de développer des outils permettant un suivi précoce de patients à risque, permettant la mise en place de traitements adaptés minimisant l’évolution des lésions précoces en lésions cancéreuses. A ce titre, ce projet se focalisera sur les mécanismes biologiques impliqués dans l’initiation tumorale, l’élucidation de ces derniers pouvant aboutir à de nouvelles cibles thérapeutiques ou aider au dépistage. Plusieurs études ont montré le rôle critique de certaines cellules tapissant l'intestin dans la mise en place d’une réponse immunitaire dérégulée, pouvant potentiellement favoriser l’initiation tumorale. L’objectif de ce projet est de découvrir comment ces cellules peuvent dialoguer avec le système immunitaire et favoriser l’inflammation. Nous nous focaliserons sur le rôle d'une classe de molécules messagères particulières de l’inflammation. Notre stratégie expérimentale visera à comparer la fréquence d’initiation de lésions intestinales bénignes dans des souris pour lesquelles un gène responsable de la production de ces molécules sera inactivé ou non.

Bénéfices attendus

Nous attendons des résultats prometteurs, permettant une meilleure compréhension des toutes premières étapes de la mise en place d'un environnement inflammatoire dans le tube digestif, connu comme facteur augmentant le risque de développement de lésions précancéreuses. A ce titre, ce projet peut avoir des bénéfices en termes de découverte de biomarqueurs précoces (à visée préventive et diagnostique).

Procédures

Les animaux recevront des injections de substances (les injections durent moins d’une minute), et un seul prélèvement sanguin sous anesthésie (d’une durée de 5 min).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis aux nuisances suivantes : injection de substances par voie intrapéritonéale et prélèvement sanguin, générant un stress et une douleur de manière ponctuelle. L'effet indésirable est le développement, à terme, de lésions intestinales bénignes.

Devenir

Les individus seront euthanasiés et utilisés pour prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Les questions posées dans le cadre de ce projet (interactions entre types cellulaires et organes différents) impliquent l’utilisation de modèles murins reflétant au mieux la physiologie d’un point de vue intégrée. La réponse aux questions soulevées dans ce projet ne peut en aucun cas être abordée par un seul modèle de substitution.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini en nous appuyant sur les données précédemment obtenues, afin de nous permettre d’obtenir des données interprétables. Notre stratégie pour réduire le nombre d’animaux consistera à engager de petits groupes d’individus, nous permettant de valider ou d’invalider nos hypothèses de travail le plus rapidement possible. Si une de nos pistes de travail ne s’avère plus pertinente, les expériences associées seront abandonnées, réduisant de fait le nombre d’animaux engagés en procédures.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale consiste à analyser les individus à des temps très précoces, pour minimiser la mise en place de l'initiation de lésions intestinales, et demander un suivi de ces derniers lors des changes hebdomadaires. Afin de réduire au maximum la douleur et l’angoisse que certaines procédures pourraient engendrer chez les animaux, les animaux seront traités avec des anesthésiques et des analgésiques. Une stratégie de suivi adaptée sera mise en place pour le devenir des animaux (grilles de scores), incluant des points limites suffisamment prédictifs.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif et immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet sont d'excellents modèles pour induire l'apparition de lésions intestinales, récapitulant leur développement chez l'homme. Les animaux seront étudiés entre 6 et 20 semaines d'âge, dès lors que le système digestif est mature.

Greffées d'une tumeur en sous-cutané, 2 500 souris passent des séances de radiothérapie de cinq à cinquante minutes sous anesthésie gazeuse, et reçoivent des médicaments par gavage, en intrapéritonéal, en intraveineux ou en sous-cutané, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit qu'aucun effet secondaire dû à la radiothérapie n'est attendu et qu'aucun analgésique ne sera donc employé, tout en prévoyant la mise à mort par dislocation cervicale des animaux prostrés, désorientés, amaigris ou présentant une nécrose au point d'injection. L'équipe dispose d'un appareil rare en France et traite à ce titre les souris de collaborateurs et de sociétés privées qui font appel à ses services. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur indiquant qu'ayant reçu un traitement et des cellules cancéreuses elles ne peuvent servir à une autre étude.

Objectifs

L’objectif des projets nécessitant de la radiothérapie préclinique est de développer l’association de la radiothérapie avec d’autres traitements anticancéreux de types chimiothérapie, thérapie ciblée, nano médicaments ou encore immunothérapie dans le but d’améliorer l’efficacité. Ces projets nécessitent d’optimiser les schémas d’association (traitement administrés en même temps ou en décalée et dans ce cas déterminer le laps de temps optimal entre l’administration du médicament et la radiothérapie) et les fractionnements (dose et nombre de séances) optimums de la radiothérapie afin de pouvoir proposer en essai clinique les combinaisons de traitements les plus efficaces. Notre équipe possède un appareil de radiothérapie tridimentionnelle guidée par l’image permettant de délivrer des traitements par radiothérapie similaires à ceux délivrés pour les patients. Ce type d’installation et de savoir-faire restent rares sur notre territoire Français et unique dans un rayon de 300km autour de notre site géographique. C’est pourquoi des collaborateurs ou sociétés privées, évaluant des combinaisons à base de radiothérapie, font appel à nos services pour délivrer des traitements de radiothérapie sur leur souris. Ce projet a été évalué et validé par le comité scientifique de notre établissement.

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer l’efficacité des traitements en optimisant des combinaisons innovantes, en utilisant des médicaments de divers types et en déterminant les meilleurs schémas de combinaisons (administré en même temps ou en décalé, doses totales de Radiothérapie et le nombre de séance de radiothérapie…). Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de sélectionner les schémas de combinaisons les plus prometteurs en terme d’efficacité sans induire de toxicités chez les petits rongeurs. Ceux-ci pourront être sélectionnés pour le développement d’essais cliniques. Les autres candidats, moins prometteurs, seront écartés et ne seront pas utilisés dans de futures études.

Procédures

- Développement des tumeurs : Injection sous cutanée de la tumeur (une seule fois). Le développement de la tumeur prend environ 10 jours à partir de la date d'injection. -Les médicaments (chimiothérapie, immunothérapie, thérapie ciblée ou nanoparticules) seront administrés: par voie orale (utilisation d’une canule spécifique permettant l’administration du médicament directement dans l’estomac) ou en intrapéritonéale (injection) sur des animaux non anesthésié ; ou en intraveineuse ou sous cutanée sur des animaux sous anesthésie gazeuse (Isoflurane 2%)- Les animaux seront traités par Radiothérapie sous anesthésie gazeuse (Isoflurane 2%). Ces séances pourront durer entre 5 minutes et 50 minutes selon la technique utilisée. - Des animaux pourront avoir une imagerie IRM sous anesthésie gazeuse - Des prélèvements de sang pourront être réalisés (au niveau maxillaire) sous anesthésie gazeuse (volume maximum prélevé et fréquence selon les recommandations de l’annexe 1). - Après euthanasie des prélèvements d’organes/tumeurs pourront être réalisés.

Impact sur les animaux

Aucun effet secondaire ou nuisance dû à la Radiothérapie n’est attendu. Concernant les médicaments qui seront combinés à la radiothérapie, nous utiliserons des doses n’ayant pas induits de toxicités dans des études précédentes in vivo ou études préliminaires (in vitro, par essais de cytotoxicité). Cependant, une attention particulière sera donnée sur une potentielle apparition de nécrose au niveau du site d’injection en intraveineux ou en sous cutanée des molécules associées.

Devenir

Etant donné que les animaux auront reçu un traitement et une injection de cellules cancéreuses, ils ne pourront être utiliser pour une autre étude. Ainsi, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des médicaments, utilisés en combinaison avec de la radiothérapie, ne peut se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’étude sur animaux. De plus, pour l’étude d’association avec des médicaments modulant le système immunitaire (immunothérapies) nous sommes dans l’obligation de travailler avec des animaux immunocompétents. Enfin, il est largement décrit dans la littérature que l’effet de la radiothérapie dépend du niveau d’oxygénation de la tumeur (hétérogène uniquement en clinique et sur le modèle animal) et du microenvironnement tumoral qui est l’ensemble des cellules constituant la tumeur (cellules cancéreuses, cellules des vaisseaux sanguins, cellules immunitaires…). Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour ces études. Toutefois des études préalables des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permettront de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT).

Réduction

Pour l’évaluation de l’efficacité d’une combinaison (un médicament et une radiothérapie), il sera nécessaire de traiter 4 groupes d’animaux (contrôle-véhicule ; médicament évalué (chimiothérapie, thérapie ciblée, immunothérapie, nanoparticule…) ; radiothérapie seule ; combinaison médicament +radiothérapie. Nous prévoyons d’évaluer ces efficacités avec 8 animaux par groupe pour les modèles de tumeurs d’origine humaine qui seront greffées sur des souris immunodéficiences et 10 animaux par groupes pour les modèles de tumeurs d’origines murines qui seront greffées à des souris immunocompétentes. Ces effectifs tiennent compte de notre expérience sur la variabilité observée pour ces différents modèles de cancers et permettent de pouvoir conclure à une potentielle supériorité des combinaisons en utilisant des tests statistiques validés.

Raffinement

Les séances de radiothérapie seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de maintenir les animaux immobile et de réduire leur niveau de stress. Après une séance de radiothérapie, les animaux sont réveillés sous lampe chauffante pour prévenir toute hypothermie puis replacés dans leur cage. La douleur associée à cette procédure ne nécessitera donc pas l’emploi d’analgésique. Aucune toxicité n’est attendue suite à la radiothérapie délivrée et les doses utilisées des médicaments associées seront celles utilisées usuellement en préclinique, n’ayant pas induit de toxicité dans des études précédentes réalisée sur souris, ou dans des études vitro (sur des cellules en culture) de cytotoxicités. Cependant, si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), ou si une nécrose est observées au niveau du site d’injection des médicaments, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Durant leur hébergement, les souris seront maintenues dans des cages ayant une surface adaptée pour accueillir 8 à 10 individus. L’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront données à volonté. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage permettant la formation de nids.

Choix des espèces

Le modèle de souris est parfaitement approprié car les expérimentations sur culture cellulaire ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme complet, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. En oncologie, la plupart des modèles expérimentaux de cancers humains sont développés chez la souris. Dans le cas d’étude avec de l’immunothérapie, la souris porteuse de tumeurs d’origine de souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire anti-tumoral. La formation de tumeurs dans des souris homogènes (même type de souris) permet de travailler avec un nombre d’animaux relativement réduit et de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Pour ce projet nous prévoyons de traiter 2500 souris porteuses de tumeurs pour une durée de 5 ans (500 souris par an). Les animaux seront utilisés à un âge minimum de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire mature pour les souris immunocompétentes et un poids corporel d’au moins 18-20 g afin d’avoir une pharmacocinétique des médicaments homogène.

Le nombre d'injections et de prélèvements dépend du protocole de chaque étude commandée, sans qu'aucun chiffre ne soit avancé. 1 280 animaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, cochons, chèvres, moutons, bovins, équidés, lapins, camélidés, poules, dindes et autres oiseaux, répartis en général par groupes de huit. Le porteur estime que 80 % d'entre eux seront tués et 20 % réutilisés, avec 90 % de réutilisation pour les lamas, et reconnaît ne pas pouvoir savoir à l'avance combien seront gardés en vie, cela dépendant des groupes de traitement et de l'accord des autorités. Il annonce des réactions locales possibles, gonflements ou abcès, et une conception "cross over" par laquelle les mêmes animaux reçoivent successivement plusieurs produits à tester après une période de repos.

Objectifs

Les études de pharmacocinétique permettent d'étudier le devenir d'une substance active contenue dans un médicament par exemple après son administration dans l'organisme. Elles permettent notamment de déterminer les paramètres pharmacocinétiques suivants : absorption, distribution, métabolisme et élimination d’un composé, soit dans le sang, soit à d’autres emplacements, et elles sont souvent employées lors des étapes de découverte ou de sélection de candidats du programme de développement d’un médicament. Les études de bioéquivalence ont pour objectif, quant à elles, d'obtenir des paramètres pharmacocinétiques permettant la comparaison de la biodisponibilité d’une substance active entre deux ou plusieurs formulations et/ou entre deux ou plusieurs voies d'administration.

Bénéfices attendus

- Obtenir les informations nécessaires pour le développement de nouveaux médicaments et définir in fine les modalités d'administration du médicament, à savoir la voie d'administration, la dose et le rythme d'administration.- Contribuer à une meilleure compréhension des phénomènes physicochimiques, biochimiques, métaboliques impliqués dans le devenir du médicament dans l'organisme, de sa durée de « vie » et d'action, de ses interactions potentielles.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d'interventions : des injections et des prélèvements biologiques (sanguins ou autres). Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin ou autre prélèvement biologique. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements, possibilité d'observation chez les animaux de réactions locales (gonflement, abcès...) et/ou générale (augmentation température, perte de poids, diminution de l'activité...) après les administrations.

Devenir

En fonction de l’étude et des groupes de traitement, des animaux seront mis à mort afin de respecter le principe de précaution conformément à la législation. En fonction de l’étude et des groupes de traitement, des animaux pourront être gardés en vie si la réglementation l’autorise. Exemple pour un vaccin : sauf indication contraire des autorités, en fonction des groupes de traitement, les animaux ayant reçu un produit disposant d’une autorisation de mise sur le marché ou les animaux du groupe témoin (sans traitement, eau physiologique...) seront gardés en vie. Il n'est pas possible de savoir à l'avance exactement le nombre d'animaux qui seront mis à mort ou gardés en vie puisque c'est dépendant des groupes de traitement, de l'accord des autorités etc. Les nombres ont été estimés de la manière suivante : on a considéré pour chaque espèce sauf les lamas que 80 pourcent des animaux seraient mis à mort et 20 pourcent réutilisés. Pour les lamas, nous avons estimé 90 pourcent réutilisés et 10 pourcent mis à mort.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour atteindre les objectifs de ce projet et ainsi obtenir toutes les informations sur le devenir d'une molécule après administration dans l'organisme. Il est nécessaire de réaliser les molécules dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ce passage sur le modèle animal est donc indispensable dans les étapes de découverte ou de sélection de candidats du programme de développement d’un médicament.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum. En moyenne 2 groupes de 8 animaux sont inclus par étude. Le nombre d'animaux sera déterminé en fonction des besoins pour répondre aux objectifs fixés pour chaque étude. La réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sera respectée. Dans le but de réduire ce nombre, un design en « cross over » pourra être utilisé. Les animaux pourront recevoir les différents traitements à tester après avoir eu une période de repos. Ce design permet d’utiliser moins d’animaux et de supprimer les variabilités individuelles.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi. Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et de l'enrichissement compensatoire. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour ces études doit être l’espèce cible des produits utilisés. Ainsi, selon le produit, les bovins, les porcins, les ovins, les caprins, les équins, les volailles (poules, dindes, canards), les lapins et les camélidés seront choisis. De la naissance à l’âge adulte selon le produit utilisé et l’âge recommandé pour celui-ci. Les animaux inclus seront représentatifs de la population cible du produit testé.

2 710 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections de traitement et douze injections d'un traceur luminescent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour des prélèvements post-mortem. Greffées en sous-cutané ou en intraveineux avec des cellules tumorales de myélome, ces souris immunodéprimées subissent des séances d'imagerie sous anesthésie et des prélèvements sanguins, les tumeurs pouvant se nécroser, s'ulcérer au point d'injection ou gêner leurs mouvements. Les retombées annoncées, moins de toxicité pour les patients grâce à une meilleure pharmacocinétique, restent au futur, et le porteur affirme que l'animal reste "inévitable" à ce stade et que "l'animal entier" est "nécessaire".

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est une tumeur maligne caractérisée par une infiltration de la moelle osseuse. La survie à 5 ans de patients atteints de MM est de 48,5 % et malgré l'introduction de médicaments immunomodulateurs et d'inhibiteurs du protéasome, de nombreux patients présentant des caractéristiques à haut risque ont toujours de faibles taux de survie. Malgré des avancées importantes dans les stratégies thérapeutiques ces dernières décennies, le myélome multiple reste incurable. La surveillance de la progression maligne et de la récidive de la maladie après le traitement est un défi central pour améliorer les résultats des patients atteints de MM. Les objectifs du projet sont de développer de nouveaux nanotransporteurs pour la délivrance de molécules d’intérêts à visés thérapeutiques dans le cadre de traitement anti-cancéreux notamment dans le myélome multiple. Ces nanotransporteurs auront également la capacité d’être couplées à des molécules pour le dépistage ou le suivi du développement tumoral par imagerie chez l’Homme. Nos expertises pluridisciplinaires à l’interface entre la chimie et la biologie, nous permettent de développer des nanotransporteurs aux caractéristiques physico-chimiques divers (polymérique, lipidique et inorganique de tailles variables). Ces molécules synthétiques pourront encapsuler des agents thérapeutiques tels que des peptides, des chimiothérapies, des protéines. Les nanotransporteurs seront couplés à des molécules thérapeutiques et fonctionnalisés pour le ciblage des cellules cancéreuses ou de son environnement direct afin d’améliorer l’efficacité et la spécificité du traitement. Ils pourront également être utilisés pour l’amélioration de la sensibilité, du suivi des tumeurs et du diagnostic. Cette première partie du projet consistera à identifier via des études pharmacocinétiques sur souris saines les nanotransporteurs proposant les meilleures propriétés cinétiques ainsi que la biodistribution la plus adéquates en fonction de l’utilisation souhaitée (traitement, imagerie). Dans un second temps, nous évaluerons précliniquement sur un modèle de tumoral de myélome murin l’efficacité thérapeutique de ces nouvelles molécules formulées en nanotransporteurs.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanotransporteurs dans l’arsenal thérapeutique et diagnostic actuel du myélome. La comparaison des différentes nanotransporteurs ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanotransporteurs sur le ciblage actif, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanotransporteurs pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer chez l’Homme grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

Pour la mise en place des modèles tumoraux, les animaux seront soumis à une injection sous cutanée ou intra veineuse de cellules tumorales d'une durée

Impact sur les animaux

Certaines molécules envisagées sont en essais cliniques et leurs effets indésirables sont donc connus. Les nuisances dues à leurs utilisations peuvent être les suivantes : une perte de poids, un œdème, une tachycardie, une dyspnée, une hypotension, un syndrome de réponse respiratoire systémique (SIRS) ou une pneumonie (inflammation de la couche mince de tissu située entre les sacs alvéolaires). Les nuisances identifiées sur souris implantées avec des cellules tumorales sont l'apparation d'une tumeur dont la taille va augmenter si ce n'est dans les groupes traités avec les nouveaux médicaments qui s'ils sont efficaces devraient réduire la taille de ces tumeurs. En évoluant la tumeur pourrait présenter une apparence de nécrose ou s'ulcérer au lieu d’injection ou génêr l'animal dans ses mouvements. Les transporteurs de médicaments testés ont pour but d’améliorer la délivrance des traitement directement dans l’environnement tumoral par leur fonctionnalisation et de ce fait, d’en réduire les effets secondaires et en potentialisant leurs pouvoirs thérapeutiques.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement et analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro déterminant la spécificité de ciblage et la cytotoxicité des nanotransporteurs ont été préalablement réalisé afin de remplacer une partie des expérimentation in vivo. Cependant à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. Un modèle de greffe orthotopique est notamment important car même s’il demande un suivi tumoral par imagerie (sous anesthésie) il reste plus représentatif du microenvironnement du myélome (cancer du sang) ; l’animal entier est donc nécessaire. En effet, la pharmacocinétique des groupes de traitement cités ci-dessus et la toxicité systémique (toxicité qui affecte tout l’organisme) ne peut être déterminées que in vivo. Cette étude préclinique, visera à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanotransporteurs pour le traitement du myélome multiple et d’y intégrer les paramètres environnementaux inhérent à un organisme entier.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été calculé mathématiquement et les résultats entre les groupes d’animaux seront comparés avec des tests statistiques adaptés et robustes permettant de mettre en évidence l’effet des traitements testés sur la croissance des tumeurs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible. L’étude de toxicité sur souris saine ainsi que de biodistribution servent d’études pilotes avec un nombre restreint de groupes qui conditionnera la suite du projet, le nombre annoncé est donc un nombre maximum d’animaux pour l’étude complète de 5 nanotransporteurs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la cellule bien-être (ex : bâton à ronger, coton pour faire un nid permettant à l’animal d’exprimer des comportements naturels). Les animaux observeront une période d’acclimatation après réception. Un tunnel dans la cage et/ou une habituation à la contention (2-3x par semaine sur au moins 1 semaine) sera réalisée avant chaque procédure afin de minimiser le stress due à la contention lors des injections ou à leur manipulation. Toutes les manipulations susceptibles de générer de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Chaque animal est étroitement suivi dès lors qu’il entre dans l’une des procédures (2 à 3 fois par semaine) afin d’identifier les signes de stress, de douleur le plus précocement possible. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin de soustraire l’animal à toute forme de souffrance en interrompant la procédure. Les données seront intégrées à l’aide d’une grille d’évaluation (état de stress, niveau de douleur, taille de tumeur, etc.) et l’animal pris en charge selon le score obtenu.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Dans le domaine de la cancérologie , la greffe de cellules tumorales ne peut être réalisée avec succès que sur des souris immunodéprimées adultes afin d'éviter tout phénomène de rejet de la greffe de cellules tumorales ce qui permet ensuite de suivre la croissance tumorale au cours diu temps et d'évaluer l'impact de candidats médicaments sur cette croissance.