Oncologie

Les souris sont tuées quand la lésion de leur coussinet plantaire atteint 10 mm ou se nécrose, les hamsters avant qu'ils n'aient perdu 20 % de leur poids, seuil précédé de prostration et d'isolement dans la cage. 410 souris et 310 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Anesthésiés, ils reçoivent une inoculation de Leishmania, sous la peau du coussinet plantaire pour les souris, avec une lésion qui grossit pendant trois mois et réduit leur mobilité, dans l'abdomen pour les hamsters, chez qui le parasite colonise le foie et la rate. Aucune expérience n'est menée sur eux pour elle-même, ils sont infectés pour que le laboratoire dispose de parasites virulents et de tissus parasités pour ses autres projets, et le porteur écrit que cet effectif "n'exige aucune approche statistique".

Objectifs

Le développement des Leishmanies est complexe et très partiellement élucidé notamment chez les mammifères. Initialement deux populations morphologiquement distinctes ont été distinguées: Un stade de développement ne peut s’établir en dehors des cellules hôtes à l’exception de Leishmania donovani et Leishmania mexicana pour lesquelles il est possible de produire ce stade pouvant se développer en absence de cellules hôtes mammifères. Néanmoins ceux-ci présentent des caractéristiques très différentes de es stades lorsqu’ils sont isolés à partir d’un individu malade. Ce projet permettra de produire un stade de développement de Leishmania major, Leishmania amazonensis, Leishmania tropica, Leishmania infantum et Leishmania donovani et d’avoir accès à des tissus fortement parasités qui pourront être utilisés pour la réalisation des projets scientifiques du laboratoire. En effet ceux-ci sont axés sur la connaissance de la biologie des Leishmanies et de ses interactions avec ses hôtes pour l’identification à terme de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, ce projet propose de comparer différents modes d’administration des parasites ainsi que la faisabilité d’utiliser des mâles et non plus seulement des femelles. La réalisation de ce projet repose sur 4 procédures : (1) et (3) raffinement des modes d’administration des parasites et faisabilité quant à l’utilisation de souris et hamsters mâles pour la production de parasites (2) recours à des souris pour le prélèvement de tissus cutanés et/ou ganglions drainant le site d’inoculation (4) recours à des hamsters dorés pour le prélèvement de leur rate et de leur foie L’inoculation des parasites est réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux sont observés chaque semaine et cette observation est couplée à une mesure du poids des individus. Les animaux sont mis à mort aux points limites définis dans le projet selon les méthodes approuvées.

Bénéfices attendus

Deux bénéfices distincts sont attendus. L’un vise à faire évoluer, si possible, nos modèles expérimentaux pour une amélioration de la santé et du bien-être animal et un raffinement des techniques d’injection. L’autre concerne la connaissance de la biologie des Leishmania et les bénéfices qui en découlent pour la santé humaine et animale. Les parasites du genre Leishmania pathogènes pour l’homme se développent dans deux hôtes distincts, les insectes vecteurs et hôtes, et les mammifères. Le passage d’un hôte à l’autre entraîne une transformation des parasites d’un stade de développement dans l’insecte hématophage à un autre stade de développement dans les cellules des hôtes mammifères et réciproquement. Chez l’homme la multiplication d’un stade de développement au sein des cellules phagocytaires telles que les macrophages provoque à terme la maladie. Aujourd’hui il n’existe toujours pas de vaccination et les traitements actuels sont non seulement toxiques mais deviennent aussi de moins en moins efficaces en raison de l’apparition de parasites résistants au peu de médicaments disponibles. Or les espèces du complexe Leishmania donovani provoquent une leishmaniose viscérale mortelle en absence de traitement efficace tandis que les autres espèces provoquent des lésions cutanées souvent défigurantes à l’origine de stigmatisations sociales importantes notamment chez les femmes. Seule la compréhension du programme complexe de développement de Leishmania pourra nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la génération de nouveaux médicaments et de vaccins, et, pour y parvenir il est primordial d’avoir accès à des parasites virulents purifiés à partir d’animaux infectés. A court terme ce projet nous permet donc de travailler avec des parasites biologiquement pertinents pour toutes nos recherches. A long terme les résultats de nos recherches pourront se traduire en avancées majeures dans la prévention et la chimiothérapie des différentes formes de leishmanioses.

Procédures

Pour les hamsters et les souris les animaux sont : 1) anesthésiés pour pratiquer l’inoculation des parasites. Durée de contention de l’animal pour l’injection intrapéritonélae de l’anesthésique inférieure à 30 secondes/animal et la durée de l’anesthésie varie de 15 à 30 minutes. Le temps d’inoculation sous-cutanée des parasites est de l’ordre de 30 secondes/animal. 2) suivis périodiquement (hebdomadaire, à minima à compter du 2ème mois post-injection des parasites) pour l’évolution de la pathologie. Pour les souris, l’animal est maintenu pendant la mesure puisqu’il doit être tenu immobilisé afin de pouvoir mesurer l’épaisseur du coussinet plantaire, lieu de l’injection des parasites et donc du développement de la lésion. Le temps de la contention/mesure est inférieur à 30 secondes/souris. Pour la procédure de raffinement des voies d’injection, les souris pourront être anesthésiées par voie gazeuse afin de permettre les mesures de taille des lésions. Dans ce cas la durée de l’anesthésie sera réduite à 5-10 minutes. Pour les hamsters, ceux-ci sont uniquement déplacés individuellement dans le pot à peser, la totalité de l’intervention étant également inférieure à 30 secondes/hamster. Pour la procédure de raffinement des voies d’injection, les hamsters seront anesthésiés par voie gazeuse et maintenus ainsi pendant la procédure d’imagerie in vivo qui comporte une injection intrapéritonéale. La totalité de cette procédure est évaluée à 45 minutes/individu.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sur les animaux dépendent de l’espèce de Leishmania inoculée et du site d’injection. Les Leishmania responsables d’atteintes cutanées telles que L. amazonensis, L. major ou L. tropica lorsqu’elles sont injectées dans le coussinet plantaire des souris vont créer localement une réponse immune. Ceci permettra le recrutement des cellules de type macrophage dans lesquelles les parasites vont pouvoir se multiplier et conduire progressivement à la création d’une lésion non nécrosante quand les parasites sont inoculés à certaines souris. Au cours du temps les effets sur les animaux vont passer de silencieux (pas de signe visible) pendant un mois à progressivement symptomatique. Durant cette période la taille de la lésion va augmenter entraînant une réduction de la mobilité dans le cas d’une injection dans les coussinets plantaires mais sans impact sur l’alimentation et l’hydratation car l’expérimentation est arrêtée avant d’atteindre les points limites et donc ce stade (au plus trois mois après l’inoculation). Les espèces de Leishmania viscérales, L. infantum et L. donovani vont colonisées principalement le foie et la rate des hamsters. Dans ce cas aussi la première phase de la maladie est silencieuse et peut durer de 1 à 3 mois. Au-delà, le premier signe clinique de l’évolution de la pathologie est une stabilisation de la prise de poids suivi d’une perte progressive de poids. Cette perte de poids lorsqu’elle atteint 20% (point limite de l’expérimentation) s’accompagne souvent d’une réduction de la mobilité voire de prostration et d’isolement dans la cage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent en effet être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car la fin de la procédure implique la mise à mort des animaux pour réaliser le prélèvement des lésions ou organes internes sources de parasites.

Remplacement

Quatre limitations majeures sont à noter quant à l’utilisation de parasites maintenus uniquement en culture : (1) il n’existe aucune méthode permettant de générer et cultiver in vitro certains stades de développement de L.major, L. tropica, L. infantum et de L. amazonensis, (2) à terme les subcultures in vitro des diverses espèces de Leishmania à certains stades de développement se traduisent par la perte rapide d’une mécanisme indispensable pour s’établir chez l’hôte mammifère, (3) il est présentement impossible d’obtenir un autre stade de développement à partir de L. donovani maintenues in vitro, (4) certaines formes de L. donovani sont différentes de celles provenant de tissus animaux, elles ne s’établissent pas chez les mammifères modèles – hamsters- auxquels ils sont inoculés.

Réduction

Ce projet est avant tout destiné à la production de Leishmania virulents ou de tissus colonisés par les parasites pour permettre la réalisation des différents projets scientifiques du laboratoire. De fait il n’exige aucune approche statistique pour définir le nombre d’animaux à utiliser. Ce nombre est donc estimé en fonction des projets du laboratoire en sachant que les parasites purifiés à partir de chaque animal sont utilisés pour plusieurs types d’expérience qui sont ainsi planifiées en conséquence. Les animaux infectés devant être mis à mort pour la production de parasites ou de tissus infectés, il est donc impossible de les réutiliser.

Raffinement

Les animaux sont placés dans des cages en portoir ventilés, la nourriture et l’eau de boisson sont stérilisées (irradiation ou autoclavage). Tout le matériel utilisé (seringues, aiguilles, instruments de mesure) est stérile ou décontaminé avant contact avec les animaux. L’infection parasitaire étant silencieuse en termes de signes cliniques pendant les 8 premières semaines, souris ou hamsters sont observés tous les jours par le personnel de l’animalerie au moment du changement des cages ou par l’expérimentateur. A partir du 2ème mois suivant l’injection des parasites, les animaux sont également examinés chaque semaine pour l’apparition et le suivi des signes cliniques de la maladie. Pour les souris inoculées avec les parasites qui cible le derme, l’évolution de la lésion au site d’injection est estimée par mesure de l’épaississement du coussinet plantaire ou bien du site d’injection chaque semaine par l’expérimentateur. Lorsque celle-ci atteint une taille moyenne maximale de 10 mm (point limite dans le cas d’une injection dans les coussinets plantaires) ou en cas de nécrose les souris sont mises à mort. En cas de détérioration de l’état général des souris celles-ci seront mises à mort. Dans le cas des hamsters, les animaux sont pesés chaque semaine pour mesurer l’évolution de la leishmaniose. Les animaux sont mis à mort selon la procédure validée avant d’atteindre le point limite (20% perte de poids). Pour ces deux espèces, l’injection des parasites est réalisée après anesthésie légère des animaux. Durant la procédure, en cas de prostration ou difficulté locomotrice un gel d’hydratation pourra être placé dans la cage tout comme les granulés alimentaires. De même, une litière douce à base de cellulose pourra être substituée à la litière traditionnelle. Dans ce projet plusieurs sites d’injection des parasites seront comparés quant à la production en nombre de parasites et la possibilité de travailler sur les tissus parasités. Dans la mesure où aucune différence liée au mode d’administration ne serait mise en évidence, la voie d’inoculation choisie pour toute la durée du projet serait celle respectant au mieux la santé et le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le choix des modèles souris et hamster est lié à la susceptibilité de certaines de ces espèces vis-à-vis des Leishmania. Certaines lignées de souris consanguines dites sensibles permettent le développement de L. major, L. tropica et L. amazonensis dans les lésions localisées au site d’inoculation. Certaines souris sont préférentiellement choisies pour la production de ces parasites car elles développent rapidement des lésions très riches en amastigotes et non nécrosantes. En revanche le modèle souris est peu adapté pour les espèces de Leishmania viscérales telles que L. donovani ou L. infantum, d’où le choix du hamster qui développe une pathologie proche de celle observée chez l’homme et rend possible la production en nombre des parasites à partir de la rate et le foie des animaux infectés. L. major, L. tropica et L. amazonensis seront inoculées à des souris âgées de 5 à 8semaines. L. donovani et L. infantum seront inoculées aux hamsters entre la 5ème et la 8ème semaine soit avant la stabilisation de la prise de poids pour un animal non traité. En effet, l’un des premiers marqueurs révélateurs de l’initiation des dommages systémiques est la stabilisation dans la courbe d’évolution du poids, le second révélateur de la progression des dommages étant une perte pondérale.

30 rats mâles adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit huit injections dans la veine de la queue, deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis enchaîne une semaine de tests, activité locomotrice spontanée sur cinq minutes, mémoire immédiate sur dix minutes, deux mesures d'anxiété de cinq minutes chacune et une mémoire de travail évaluée trois matinées de suite. L'objet est d'observer si des vésicules produites par des cellules de foie en culture exposées à des polluants alimentaires provoquent anxiété et troubles de la mémoire, les biomarqueurs et les cibles thérapeutiques annoncés relevant de l'espoir que le porteur formule. Sur le remplacement, il indique avoir remplacé les animaux non-humains par des hépatocytes en culture pour produire les vésicules, et affirme que leur effet sur le cerveau ne peut pas l'être.

Objectifs

La stéatohépatite non alcoolique est une maladie chronique qui concernerait plus de 200 000 personnes en France chaque année. Elle correspond à une accumulation de graisses dans le foie sous forme de gouttelettes lipidiques associée à une inflammation. En dehors des altérations purement hépatiques, ces stéatoses peuvent aussi être reliées à des troubles cérébraux (anxiété, stress et dépression). Des études ont conduit à évaluer l’exposition aux polluants environnementaux comme facteur favorisant la progression de cette maladie du foie. Les polluants qui seront étudiés ici sont présents dans l’alimentation et en raison de leurs propriétés lipophiles, ils s’accumulent dans le foie et le cerveau, où ils peuvent générer des troubles de l’anxiété et des altérations cognitives. L’exposition à ces polluants modifie également la quantité et les caractéristiques des petites vésicules produites par le foie, vésicules qui peuvent perturber le fonctionnement d’autres cellules de l’organisme. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons chez le rat adulte les conséquences hépatique et cérébrale de l'injection de ces vésicules libérées et isolées à partir de cellules de foie en culture et exposées à des conditions enrichies en gras et aux polluants étudiés.

Bénéfices attendus

Nous espérons ainsi identifier de nouveaux biomarqueurs d’exposition et/ou d’effets des polluants choisis ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques en étudiant le rôle des vésicules dans la progression de cette maladie du foie et le lien avec de possibles atteintes cérébrales. Cette étude devrait nous permettre : d’étudier l’impact au niveau du foie et du cerveau de l’administration de ces vésicules chez des rats.

Procédures

La seule intervention pouvant être à l’origine de mal-être est l’injection des vésicules à la veine de la queue, injection qui sera répétée 8 fois pour chaque animal tout au long des 4 semaines de traitement. Chaque animal sera donc injecté 2 fois par semaine pendant 4 semaines consécutives. Les tests comportementaux seront quant à eux effectués sur une période d’une semaine, entre 8h et 13h. Un premier test consistera à évaluer l'activité locomotrice spontanée de l’animal durant 5 minutes. La mémoire immédiate de l’animal sera également testée pendant une durée de 10 minutes. Deux tests complémentaires, chacun d’une durée de 5 minutes seront réalisés pour évaluer le niveau d'anxiété des animaux. Un dernier test se proposera d'évaluer la mémoire de travail des animaux. Il sera réalisé sur 3 jours consécutifs pendant 5 minutes par matinée. Ainsi chaque animal effectuera un à deux tests par jour pendant une semaine.

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables identifiés attendus sont les suivants : stress de contention lié à l'injection des vésicules extracellulaires ainsi que le stress lié à l’introduction de l’aiguille dans la veine caudale . D’après les éléments de la littérature et l’expérience des porteurs du projet, aucun des tests comportementaux prévus ne provoque des signes de mal-être chez les animaux.

Devenir

Une fois les tests comportementaux réalisés, les animaux seront mis à mort et les tissus d’intérêts à l’étude seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Nous avons remplacé l’utilisation d’animaux pour la production des VE par des hépatocytes en culture soumis à un environnement enrichi en graisse et/ou en polluants environnementaux. Cependant, l’impact de ces vésicules sur les fonctions du foie et du cerveau (activité, anxiété, mémoire de travail) ne peut pas être évalué sur des cellules de foie isolées, ni remplacé.

Réduction

Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet dans des conditions de réalisation acceptables garantissant ainsi le bon déroulement de l'expérimentation, la prise en charge adaptée des animaux de façon à garantir au mieux leur bien-être et une exploitation statistique satisfaisante des résultats. Le nombre de 27 animaux prévu a été déterminé pour une puissance statistique fixée a priori de 0,90, des effectifs égaux dans les 3 groupes expérimentaux (n=9/groupe) et la variation estimée la plus sensible dans l'ensemble des mesures effectuées. A ce nombre, nous nous laissons la possibilité d’ajouter 1 individu supplémentaire par groupe de manière à pallier à une éventuelle atteinte de seuils critiques irréversibles. Soit un total de 30 animaux au maximum (n=10 par groupe).

Raffinement

Les animaux qui seront achetés pour ce projet seront maintenus et élevés selon les conditions d’élevage habituelles en accord avec les contraintes fixées par la réglementation, placés à 2 par cage selon les dispositions réglementaires dans des portoirs ventilés avec des buchettes et frisure de papier kraft comme enrichissement. Leur comportement sera surveillé afin de s'assurer de l'absence de mal-être ou de comportement agressif entre les animaux. En ce qui concerne les injections à la veine caudale, la douleur sera contrée par badigeon avec un anti-douleur local et le stress induit par le tube de contention sera réduit par une habituation d'une durée d'une semaine.

Choix des espèces

Des rats adultes mâles ont été choisi pour être plus représentatif de la réalité humaine où les hommes présentent un taux d’incidence de stéatohépatite deux fois plus élevé que les femmes. Les animaux entreront dans l’étude à l’âge de 6 semaines et seront acclimatés à leur nouvel environnement pendant 8 à 10 jours. A ce stade ils auront atteint leur maturité sexuelle et sont donc considérés comme jeune adulte, ce qui est représentatif du profil de la population touchée.

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, dépourvue des défenses qui lui permettraient de rejeter les cellules tumorales qu'on lui greffe. 8 172 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Éveillées, elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous la peau du flanc, puis des traitements deux fois par semaine jusqu'à l'atteinte du point limite, environ trois semaines pour les groupes non traités, et pour certaines quatre injections directement dans la tumeur dès qu'elle atteint 100 mm3. Leur mort permet les analyses post-mortem, le porteur revendiquant la nécessité de valider dans "un organisme dans son intégralité" des observations qu'il a d'abord obtenues sur lignées cellulaires.

Objectifs

Les immunothérapies anti-tumorales visent à détruire les cellules cancéreuses en stimulant ou en réorientant le système immunitaire (SI). Ces traitements sont prometteurs et permettent déjà de guérir des patients, mais certaines tumeurs échappent au SI et il est essentiel d’améliorer ces approches. Les lymphocytes T tueurs sont des cellules essentielles pour l’immunité anti-tumorale. Pour fonctionner, elles ont besoin de reconnaître un peptide (appelé néoantigène - néoAg), exprimé par les cellules cancéreuses. Identifier les mécanismes de production de néoAgs et des stratégies pour moduler leur expression est un enjeu central de la recherche en immunothérapie. Les chercheurs ont longtemps cherché des néoAgs provenant de gènes codants, dérivant de mutations acquises par les cellules tumorales pendant le développement du cancer. Mais ces mutations sont souvent spécifiques à chaque patient, et donc difficiles à cibler. Il faut donc trouver d’autres sources de néoAgs. On parle souvent du rôle des gènes dans le développement de pathologies humaines, mais ils représentent seulement 2% du génome. On a longtemps pensé que le reste du génome (dit silencieux) ne s’exprimait pas. Plusieurs études récentes ont montré que le génome silencieux peut s’exprimer dans les tumeurs et favoriser leur destruction par le système immunitaire. L’inactivation de gènes impliqués dans « la mise sous silence » du génome silencieux permet son expression et conduit à une meilleure reconnaissance des tumeurs par le SI. Ils sont donc des candidats prometteurs pour le développement de thérapies. Il reste cependant beaucoup à comprendre sur la nature exacte de la régulation de ce génome silencieux et c’est le but de ce projet. Le premier objectif est d’identifier des gènes participant à sa « mise sous silence ». Le deuxième est de cibler ces gènes pour améliorer la réponse immunitaire anti-tumorale. Le troisième est de déveloper un traitement pour spécifiquement réveiller une partie du génome silencieux codant pour un néoAg pour améliorer les réponses immunitaires anti-tumorales. L’objectif général du projet est de comprendre les mécanismes de régulation du génome silencieux pour mieux instruire l’établissement de protocoles d’immunothérapie.

Bénéfices attendus

Il est essentiel de noter que la très grande majorité des cancers développent des mécanismes très efficaces qui inhibent la réponse immunitaire. Un enjeu actuel de la recherche en immunothérapie est d’identifier des mécanismes de productions de néoantigènes (qui seraient des nouvelles cibles) par les cellules tumorales et d’établir des traitements ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet. Ces expériences vont permettre de mieux caractériser le ou les mécanismes de régulation du génome silencieux dans les cellules tumorales. En effet, certains éléments du génome permettent de produire des protéines spécifiques de la tumeur et capables d’augmenter la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur et non les tissus sains. Par ailleurs, ce projet cherche à mettre en place un protocole permettant d’augmenter l’expression de ces néoantigènes afin de pouvoir les utiliser dans des stratégies thérapeutiques pour améliorer de manière large la réponse des cancers à l’immunothérapie.

Procédures

Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées à des souris par voie sous-cutanée au niveau d’un des flancs, sur animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une deuxième procédure, après l’injection de cellules tumorales (identique à la 1ère procédure), les animaux seront traités par injection sur animaux vigiles 2 fois par semaine (durée du geste inférieure à 10sec), jusqu’à l’atteinte du point limite (environ 3 semaines pour les souris recevant les tumeurs sans traitement) ou pour un maximum de 60 jours (si les tumeurs sont rejetées). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une troisième procédure, les animaux seront injectés par voie sous-cutanée au niveau du flanc (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dans une quatrième procédure, des cellules tumorales seront injectées sur les animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dès que les tumeurs atteignent environ 100mm3, le traitement sera injecté dans la tumeur des animaux vigiles à raison de 4 injections tous les 4 jours ( durée du geste inférieure à 10 sec). Un des groupes d’animaux sera également injecté en intraveineuse 24h avant le début du traitement.

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Pour les expériences d’injections de cellules tumorales ou des traitements, il est attendu une douleur directe associée à l’utilisation d’une aiguille. Pour le prélèvement de sang, il est attendu une douleur légère liée à la réalisation (gène de courte durée). En ce qui concerne les injections intratumorales, nous utiliserons un format de traitement utilisé en routine pour traiter des patients par injections locales. Aucune inflammation n’est attendue après ce traitement, mais les souris peuvent ressentir de la douleur pour un temps limité après l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour des analyses post-mortem

Remplacement

Les lignées tumorales ont d’abord été étudiées in vitro (marqueurs de surface, croissance). Dans le cas des traitements visant à manipuler spécifiquement l’expression de néoantigènes dérivant du génome silencieux, des expériences ont été réalisées in vitro dans les lignées cancéreuses, nous savons donc qu’elles réagissent à ce traitement. Le projet est aussi avancé que possible, cependant des tests in vivo sont maintenant nécessaires pour comprendre le rôle de ces lignées sur la réponse immunitaire dans un contexte physiologique entier. En effet, dans le cas des lignées cellulaires déficientes pour des gènes de régulation, nous allons analyser la présence de cellules immunitaires entre les conditions déficientes et contrôles grâce à un prélèvement de sang.

Réduction

Lorsque cela est possible, afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés, les études sont réalisées au préalable sur des lignées cellulaires in vitro, modifiées pour les gènes d'intérêt. Nous pouvons ainsi tester un nombre important de paramètres, puis passer aux modèles animaux uniquement quand le projet est aussi avancé que possible. Cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Néanmoins, il est nécessaire de valider ces observations dans le contexte d'un organisme dans son intégralité plus physiologique. Le nombre d'animaux par groupe est défini à l'aide d'un outil statistique.

Raffinement

Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte des points limites. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés 2 à 3 fois par semaines pour leur état général et pour mesurer la taille de la tumeur.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes. Enfin, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantables disponibles.

Tuées au cours d'une chirurgie de perfusion du foie dont elles ne se réveillent pas, 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines portent un foie ou un système immunitaire humanisé, construit à partir d'hépatocytes humains ou de sang de cordon. Avant l'opération elles reçoivent pendant deux à trente semaines un régime gras et sucré, occidental hypercalorique ou déficient en choline, destiné à provoquer une stéatose ou une fibrose du foie, puis des candidats médicaments par gavage ou injection dont le porteur admet que certains peuvent être toxiques pour le foie. Il passe en revue lignées cellulaires, hépatocytes humains isolés, cellules souches et organoïdes, écarte chacun d'eux et conclut que la souris humanisée constitue un modèle "indispensable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments sur la fonction hépatobiliaire et d’isoler les différentes populations cellulaires hépatiques (= du foie) par une perfusion in situ du foie, chez des souris saines et pathologiques. Deux pathologies seront ciblées : le modèle de stéatose hépatique d’origine métabolique (maladie du foie gras) et le modèle de fibrose hépatique. Pour ce faire, nous pourrons travailler chez différentes souches de souris immunodéficientes (diminution de l’état d’immunité de l’organisme) ou immunocompétentes (≠immunodéficience, capacité normale de l’organisme à se défendre contre une infection). Les souris pourront présenter un système immunitaire humanisé à l’aide de cellules souches issues de sang de cordon humain ou de cellules sanguines provenant du sang périphérique humain (PBMC), et/ou un foie humanisé à l’aide d’hépatocytes humains. Les tests fonctionnels pourront être réalisés et nous permettront d’évaluer directement au niveau de l’organe les effets de molécules à visée thérapeutique, administrées préalablement et/ou au moment de la perfusion, mais également leur métabolisation. Par ailleurs, l’isolement des différentes populations cellulaires hépatiques par cette méthode nous permettra non seulement de déterminer les effets cellulaires des candidats médicaments, mais aussi de congeler ou de mettre en culture des cellules pour une utilisation ultérieure (essais in vitro, transplantation chez de nouvelles souris).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’établir les effets fonctionnels de molécules à visée thérapeutique sur le foie, ainsi que leur métabolisation par cet organe, dans des modèles pathologiques d’intérêt. Par ailleurs, ce projet nous permettra d’isoler différents types cellulaires hépatiques en vue de leur utilisation ultérieure. L’utilisation de souris humanisées dans ce contexte permettra l’obtention de données particulièrement pertinentes, en offrant un modèle préclinique se rapprochant de la physiologie de l’espèce cible, l’Homme.

Procédures

Afin d’induire la stéatose, les régimes suivants pourront être administrés ad libitum pendant 2 à 30 semaines avant perfusion : - Diète enrichie en graisses et en sucre - Diète dite « western » (régime occidental hypercalorique) - Diète déficiente en choline (export des lipides du foie) et/ou méthionine (régulation de l’expression des gènes) L’administration de composés de recherche pourra être réalisée préalablement à la perfusion hépatique par voie entérale (gavage, incorporation dans l’alimentation ou dans l’eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire). L’administration des thérapies pourra également être réalisée directement pendant la perfusion, par incorporation dans la solution de perfusion, ou sur les cellules isolées. Une chirurgie sous anesthésie générale sera réalisée sur les souris afin de perfuser le foie. Une seule chirurgie sera réalisée, sa durée minimale sera de 10min, le temps nécessaire à la mise en place de la perfusion. Le temps maximal sera fonction de l’objectif de la perfusion. Pour un isolement de cellules, il faudra compter environ 45min ; pour les tests de composés à visée thérapeutique, le temps sera adapté au cas par cas selon les données disponibles de pharmacocinétique/pharmacodynamique et de métabolisation hépatique de la molécule.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par les procédures préalables à la perfusion du foie (par ex. perte de poids en réponse à un régime). Par ailleurs, les composés médicamenteux expérimentaux administrés pourraient potentiellement exercer des effets secondaires hépatotoxiques (toxiques pour le foie) qui pourraient provoquer des nuisances. Chez la souris vigile, la douleur peut se manifester, entre autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux sont mis à mort car la procédure de perfusion du foie est terminale et ne permet pas leur réveil. Les animaux sont également euthanasiés avant la fin d’étude s’ils ont atteint les point limites éthiques prédéfinis ou sur demande du vétérinaire d'établissement.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de lignées cellulaires hépatiques existent, leur utilisation est limitée car ils ne permettent actuellement pas de refléter l’environnement hépatique avec le niveau de fidélité et de complexité nécessaire à une évaluation fiable et pertinente des effets d’un composé à visée thérapeutique, de ses potentiels effets secondaires et de sa métabolisation. Les hépatocytes humains fraîchement isolés, qui seraient le modèle le plus pertinent, bien que ne représentant qu’une seule population cellulaire, se dédifférencient rapidement après isolement et ne se maintiennent pas en culture. Les lignées cellulaires immortalisées ou dérivées de cellules souches pluripotentes induites en laboratoire (IPS), quant à elles, sont sujettes à des dérives génétiques et à l’activation d’oncogènes (gènes dont l'expression favorise la survenue de cancers). Enfin, les systèmes plus complexes et multicellulaires, tels que les organoïdes (culture de cellules en 3D) dérivés de cellules souches hépatiques, sont complexes à obtenir et présentent une variabilité liée au donneur de cellules souches. Par ailleurs, ces systèmes ne permettent actuellement pas de rendre compte du niveau de complexité fonctionnelle de l’organe et des interactions entre les multiples populations cellulaires présentes dans le foie (hépatocytes, cellules non-parenchymateuses, cellules du système immunitaire, …). À l’heure actuelle, la souris, et à plus forte raison la souris humanisée, constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total maximum de 2 500 souris sera utilisé sur une période de 5 ans, permettant de mener 50 études de 50 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques. Par ailleurs, l’isolement de cellules hépatiques permettra, d’une part, leur cryoconservation pour de futurs essais in vitro et, d’autre part, leur mise en culture, sous forme d’organoïdes. Ces techniques participeront à la réduction du nombre d’animaux utilisés pour les futures études.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires (type gel nutritif enrichi en électrolytes et vitamines) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (perte de poids), si leur utilisation n’est pas amenée à biaiser les résultats scientifiques de l’étude. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de coton. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées à la présence humaine régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids. Enfin, un protocole d’anesthésie-analgésie raffiné sera mis en place pour la conduite de la procédure de perfusion.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, âge de première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.

Gavées tous les jours pendant un mois avec un glucocorticoïde de synthèse, une partie des 960 souris de ce projet développe la fonte musculaire que l'étude cherche à décrire. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et incluent aussi des injections répétées dans l'abdomen et un test d'agrippement, avec un risque de fausse route et d'irritation de la gorge lié au gavage. Le porteur affirme vouloir "anticiper toute souffrance inutile" et écrit dans la même rubrique n'avoir prévu ni anesthésie ni analgésique, tous les actes se faisant sur animal vigile. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour des analyses moléculaires et histologiques, les animaux perdant plus de 20 % de leur poids en une semaine étant retirés du lot et tués avant.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés (mutés) dans le muscle squelettique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs (ci-après EU1 et 2 par souci de simplicité). Les animaux seront produits et élevés dans l'EU1. La mutation sera induite dans l'EU1 ou dans l'EU2 s'il s'avère que le personnel de l'EU1 n'est pas disponible. Les autres traitements seront réalisés dans l'EU2 afin que nous puissions suivre l’évolution des animaux. En effet, notre équipe travaille sur ces modèles depuis de nombreuses années et peut ainsi anticiper les dommages occasionnés. Par ailleurs, les animaux seront déjà présents dans l'EU2, à laquelle les membres de l'équipe ont accès, afin d’effectuer des tests d'agrippement, évitant ainsi un nouveau stress généré par le transfert. S’il s’avère que les membres de l’équipe ne sont pas disponibles, les traitements pourront être réalisés dans l'EU1 afin de ne pas gâcher de groupe.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.

Procédures

Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en triplicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues de traitement ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant lors d’études comparables. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Les traitements aux glucocorticoïdes durant de longue période peuvent entrainer une fonte musculaire, c’est pourquoi nous prendrons soin d’exclure les animaux ayant perdu plus de 20% de leur poids corporel en une semaine. De plus, le gavage répété peut conduire à des fausses routes et une irritation de la gorge pouvant impacter la prise alimentaire que nos pesées régulières nous permettrons d’observer rapidement. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.

Un niveau de douleur jugé trop élevé déclenche la mise à mort anticipée, seuil que le porteur fixe au moyen d'une grille de score. 1 020 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue après un prélèvement sanguin intracardiaque. Une tumeur leur est greffée dans le rectum sous anesthésie générale, suivie de deux injections de chimiothérapie sur animal vigile, d'un gel immunostimulant administré par l'anus et d'un suivi par imagerie deux fois par semaine, la tumeur pouvant provoquer ulcères, douleurs et occlusion du côlon. Les groupes comptent vingt souris parce que le porteur anticipe 20 % d'échecs de greffe et jusqu'à 40 % de morts sous chimiothérapie seule, de sorte qu'il en reste dix à analyser.

Objectifs

La radiothérapie combinée à la chimiothérapie est chez le patient actuellement, le traitement de référence des cancers du rectum avant la chirurgie. Cependant, la radiothérapie est associée à d’importants effets secondaires (Incontinence urinaire, incontinence fécale...). Des travaux publiés récemment suggèrent que la chimiothérapie seule pourrait être une alternative à ce protocole de traitement. Cependant la guérison complète après traitement médical, qui permet alors d'éviter la chirurgie, est inférieure à 20%. La survie globale à 10 ans, liée à la récidive généralisée du cancer, est de 50%. En parallèle, il est démontré que l’immunothérapie améliorait la réponse du traitement sur des modèles de cancer colorectal. En effet, l’activation de l’immunité permettrait de majorer l’effet des traitements des cancers du rectum. C’est pourquoi nous souhaitons évaluer l’effet d’une immunothérapie locale associée à la chimiothérapie dans le cancer du rectum en remplacement de la radio-chimiotherapie. Pour valider notre hypothèse, nous souhaitons mettre en place un modèle de cancer du rectum chez la souris, et associer à la chimiothérapie une immunothérapie locale par administration intra rectale de notre immunogel. L'efficacité du traitement sera étudiée en suivant la croissance tumorale des tumeurs par imagerie optique et en échographie, en suivant la survie des souris, et en étudiant la réponse immunologique.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de définir et valider l’immunochimiothérapie pour améliorer le taux de guérison et diminuer le risque de développement de métastases du cancer du rectum. L’amélioration de cette guérison après traitement médical serait un argument en plus permettant d'avoir moins recours à la chirurgie. Le non recours à la chirurgie du rectum après une réponse complète aux traitements médicaux est au coeur des essais cliniques actuels sur les traitements du cancer du rectum, car elle permet de diminuer la morbidité et les séquelles liées à la chirurgie. Les résultats de cet essai préclinique pourront aboutir au design d’une étude clinique incluant l’immunothérapie locale aux standards de traitement du cancer du rectum chez l'Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure de greffe tumorale en début de chaque procédure, correspondant à une injection intra rectale de cellules tumorales. Cette injection se fera une fois par procédure et sera réalisée sous anesthésie générale. Pour le suivi de croissance tumorale par imagerie bioluminescente 2 fois par semaine, les souris seront anesthésiées par inhalation de gaz. Elles recevront également à ce moment une injection intrapéritonéale de luciférine. Les chimiothérapies administrées pendant le projet seront injectées vigile par voie intrapéritonéale. Les souris traitées recevront 2 injections de chimiothérapie. Les souris traitées par notre gel recevront une injection de gel par l'anus sous anesthésie générale. En cas d'échec de cette voie, le gel sera injecté directement dans la tumeur, par voie anale, sous anesthésie générale également. En cas de douleur au cours du projet, les souris recevront une analgésie par injection sous-cutané d'antalgique. Au moment de leur mise à mort, un prélèvement sanguin intracardiaque sera effectué. Ce prélèvement sera effectué sous sédation profonde par une injection intrapéritonéale de médicaments anesthésiants. Les souris seront par la suite mises à mort sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La greffe de tumeur orthotopique pourrait être responsable de douleurs (ulcères, lésions) et de perte de poids. Les chimiothérapies incluent dans cette étude, peuvent entrainer chez l’Homme des mucites, des troubles du rythme cardiaque, des neuropathies périphériques. Les signes généraux de douleur, d’asthénie, de diarrhées ou de troubles de la mobilité seront particulièrement surveillés chez la souris après injection. De par sa localisation, on peut supposer que la tumeur pourrait-être responsable d’occlusion du côlon, malgré l’absence de description dans la littérature. Nous serons donc particulièrement attentifs à des signes de gonflement de l’abdomen, en plus des signes d’altération de l’état général.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mises à mort à l'issu de chaque procédure pour prélèvement et analyse anatomopathologique

Remplacement

Nous avons préalablement évalué par des expériences in vitro plusieurs formulations de gel pour ne tester chez l’animal que les formulations finales. A la suite de ces expériences in vitro, notre modèle doit maitenant être appliqué à l'animal pour tendre vers une approche clinique chez l'Homme. La modification de l'environnement de la tumeur, qui est particulièrement riche et complexe chez l'Homme et sur modèle animal, est la cible de notre traitement et ne pourrait être évalué uniquement in vitro.

Réduction

Le projet a été consciencieusement pensé et élaboré afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Le nombre d’animaux doit être de 12 souris par groupe pour les expériences qui présentent une faible variabilité. Cependant, pour l’étude de l’efficacité, nous nécessiterons l’utilisation de 20 souris par groupe car les expériences présentent une variabilité importante particulierement lié aux reponses à la chimiothérapie. Ce nombre est calculé selon notre expérience et la littérature et en tenant compte de la variabilité interindividuelle. En effet, il est nécessaire de prévoir 20 animaux par groupe pour avoir des données statistiquement analysables car d’après notre expérience la prise tumorale pour la tumeur primaire et secondaire est de 80% et sa mortalité de 8%. La mortalité à distance de la chimiothérapie seule est de 40% dans la littérature. Considérant cela, il restera, dans le pire des cas, 10 animaux par groupe ce qui permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. De plus, l'utilisation de l'imagerie optique et plus ou moins de l’échographie nous permet de réaliser en temps réel le suivi de l’évolution tumorale. Ces techniques non invasives nous permettront ainsi de réduire au maximum le nombre d'animaux.

Raffinement

Nous nous attacherons à réduire au maximum la souffrance des souris. Nous utiliserons l’imagerie optique, non invasive et non traumatisante, pour évaluer l’efficacité du traitement. L’implantation des tumeurs, ainsi que l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Une grille d'évaluation de la douleur adaptée à ce projet a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera la mise a mort anticipée de l'animal. Chez la souris anesthésiée, tout signe de douleur (mouvement soudain, vocalisation) induira un arrêt de la procédure, une analgésie et une nouvelle induction de l’anesthésie. Une surveillance du volume tumoral 2 fois par semaine et du poids tous les 2-3 jours sera assurée après les implantations de tumeurs. Après l’anesthésie, la souris sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post interventionnelle et post examen d’imagerie. Plus généralement, un animal peut être isolé de ses congénères s’il y a présence de blessures. Les blessures seront le cas échéant désinfectées à la vetedine. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé dans la littérature pour les études de vaccination antitumorales. De plus, une première preuve de concept a été réalisée avec cette espèce, cela est donc plus cohérent pour la poursuite de nos expériences. Nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines car leur système immunitaire est adéquat et suffisamment développé à cet âge-là.

640 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à trente-cinq injections dans l'abdomen sur animal vigile et passant jusqu'à quatre semaines isolée en cage calorimétrique. Une partie porte une mutation qui reproduit la progéria humaine, avec chute des poils, disparition de la graisse sous-cutanée et rides, ce que le porteur déclare sans effet sur leur bien-être. Les prises de sang se font également sur animal vigile, l'anesthésie modifiant la protéine étudiée, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le bénéfice avancé, valider une piste thérapeutique contre une maladie qui tue les enfants atteints vers treize ans, reste au conditionnel, tandis que les injections et l'isolement sont, eux, programmés.

Objectifs

La progéria est une maladie qui reste indétectable à la naissance, mais elle commence à se manifester très tôt, souvent dès la première année de vie. Les enfants affectés présentent des signes qui évoquent un vieillissement prématuré et accéléré, tels que la rareté des cheveux (alopécie), une peau fine, ridée, dépourvue de graisse, ainsi que des ongles peu développés. Par ailleurs, ces enfants connaissent une croissance lente, des problèmes osseux et musculaires, et un retard dans la pousse des dents. Ils souffrent également de douleurs articulaires et font face à des problèmes cardiovasculaires, mais il est important de noter que leurs capacités intellectuelles ne sont généralement pas affectées. Malheureusement, le pronostic de cette maladie est très sombre. Le décès survient en général entre l'âge de 6 et 20 ans, principalement à cause de problèmes cardiovasculaires, comme l'athérosclérose, une dégénérescence des artères, des crises cardiaques ou des accidents vasculaires cérébraux. L'espérance de vie des enfants atteints de cette maladie se situe aux alentours de 13 ans. Nous souhaitions démontrer que, dans des modèles de souris appropriés, l'inhibition d’une protéine par différentes méthodes (neutralisation de la protéine par des anticorps monoclonaux de haute affinité ou par des auto-anticorps polyclonaux), pourrait retarder le vieillissement prématuré dans des modèles murins de la progéria de Hutchinson-Gilford.

Bénéfices attendus

La progéria provoque un vieillissement prématuré du patient. L'espérance de vie des enfants atteints de cette maladie se situe aux alentours de 13 ans. C’est pourquoi il est important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet nous permettra de valider dans plusieurs modèles précliniques une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter la progéria.

Procédures

Un prélèvement de quelques millimètres à l’oreille sera effectué sur les animaux pour génotypage à raison de quelques secondes par animal effectuée sur animal vigile. Les souris transgéniques développant un syndrome de progéria de type Hutchinson-Gilford présentent un phénotype clinique très semblable à la progéria humaine comme par exemple l’alopécie (accélération de la chute des poils), la perte du gras sous-cutanée, ou encore les rides sans que cela n’affecte le bien-être des animaux ou implique de soin ou de suivi spécifique au modèle. Les symptômes n’apparaissent qu’aux alentours de la dixième semaine. Toutes les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales (injection au niveau de l’abdomen de quelques secondes) (entre 4 et 35 au maximum sur animal vigile) et à un isolement (pour un maximum de deux fois deux semaines soit un total de 4 semaines) en cage calorimétrique. Les prélèvements sanguins (quelques secondes par prélèvement, volume de prélèvement relativement faible pour analyse moléculaire) seront effectués sur animal vigile (anesthésie modifiant les paramètres de la protéine étudiée). A l’issue de la période de maintien ou en cas d’atteinte de points limites, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Les sites des injections ou des prélèvements sanguins pourraient s’infecter. Les manipulations ainsi que le passage en cage calorimétrique pourraient stresser les animaux. Toutes les souris seront soumises à un prélèvement de quelques millimètres à l’oreille, à des injections intrapéritonéales, à des prélèvements sanguins et à être isolées (pour un maximum de 2 fois deux semaines) en cage calorimétrique. Ces injections et ces prélèvements sanguins entrainent un stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d'injection ou de prélèvements. Les isolements peuvent être une source de stress. Les souris transgéniques développant un syndrome de progéria de type Hutchinson-Gilford présenteront un phénotype clinique très semblable à la progéria humaine comme par exemple l’alopécie (accélération de la chute des poils), la perte du gras sous-cutanée, ou encore les rides sans que cela n’affecte le bien-être des animaux ou implique de soin ou de suivi spécifique au modèle.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude macroscopique et systémique de la progéria.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 640 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de 20 souris (10 femelles et 10 males) pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général des animaux sera suivi. Le poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces, seront appliqués afin de limiter la douleur des animaux à leur minimum. Il y aura une vigilance accrue si les animaux ont les mi-clos ou fermés ou s’ils sont isolés. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.