Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude préliminaire de l’efficacité d’une matrice pour la cicatrisation de la muqueuse endo-buccale.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Opérés d'une plaie dans la bouche, 34 rats reçoivent ou non un derme artificiel censé améliorer la cicatrisation, avec des douleurs modérées estimées à 48 heures au minimum et des pansements qui les empêchent de s'alimenter et de boire normalement. Les procédures vont d'un niveau de souffrance modéré à sévère et tous les rats sont tués pour prélever les cicatrices et les examiner au microscope. Chacun subit deux ou trois IRM de deux heures sous anesthésie, une chirurgie de 40 minutes et une intervention supplémentaire pour observer la cicatrisation, avec un risque de saignement, d'infection et de chute de température. Le porteur affirme qu'il ne serait pas éthique de mener cette étude chez l'être humain, parce qu'il faudrait refaire des plaies dans la bouche et imposer des interventions chirurgicales supplémentaires.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier la cicatrisation de plaies dans la bouche. Lorsqu’on enlève une tumeur dans la bouche, si elle est trop grande, il n’est pas possible de fermer le trou par des points de suture. Il est envisageable de laisser la plaie cicatriser toute seule mais cela prend du temps. Nous pouvons aussi prendre du tissu ailleurs dans la bouche ou bien de la peau sur le corps pour fermer la plaie mais encore faut-il que le patient en ait suffisamment, qu’il accepte une nouvelle cicatrice ailleurs, des douleurs supplémentaires et les risques augmentés d’une opération à deux endroits. De plus, il existe dans tous les cas, un risque que la cicatrice se rétracte entrainant une perte de souplesse et une limitation de la mobilité (par exemple pour ouvrir la bouche si c’est au niveau des joues ou pour bouger la langue si c’est sous la langue). A noter que lorsqu’on réalise des greffes, plus celle-ci est fine, plus ce risque de rétraction est grand. C’est pourquoi, il a été créé des feuilles de derme artificiel pour augmenter l’épaisseur des greffes, à intercaler entre la plaie et la greffe. Ce derme artificiel est très utilisé au niveau de la peau mais peu étudié dans la bouche. Ce derme artificiel pourrait être utilisé pour fermer les plaies dans la bouche après avoir enlevé une tumeur, ce qui éviterait de prendre de la muqueuse ou de la peau ailleurs aux patients. Le but de cette étude est d’évaluer si l’utilisation de ce derme artificiel permet une meilleure cicatrisation qu’en son absence et s’il diminue le risque de rétraction. Pour tester cela, nous réaliserons deux plaies dans la bouche de chaque rat (au niveau des joues). Dans un cas, la plaie sera couverte par une feuille de derme artificiel et dans l’autre, elle sera laissée en cicatrisation spontanée. Ensuite, 7 et 28 jours après l’opération, nous évaluerons la qualité de la cicatrice et la quantité de rétraction pour chaque plaie. Cette évaluation se fera à l’œil nu, pour l’évaluation de la présence de rétraction des cicatrices, et au microscope pour évaluer la qualité de la cicatrisation. Durant ce protocole, nous réaliserons une IRM avant et après l’opération, pour évaluer les bénéfices de l'IRM dans le suivi de la cicatrisation. Il s’agit d’un examen non invasif et non irradiant qui pourrait permettre de réaliser un suivi à long terme sans avoir à sacrifier les animaux et donc de réduire le nombre d'animaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet seront d'apporter une preuve que l'utilisation de ce derme artificiel en bouche est mieux qu’une cicatrisation seule, de valider un protocole moins lourd pour le suivi de la cicatrisation en bouche par IRM et de permettre l'utilisation chez l'homme de ce derme artificiel en bouche.
Procédures
Durant ce projet, les animaux auront, 2 ou 3 examens IRM sous anesthésie d’une durée de maximum 2h espacés d’au moins 7 jours, ainsi qu’une chirurgie de 40 min sous anesthésie locale et générale. Une autre intervention sous anesthésie est prévue pour une observation de la cicatrisation prenant environ 10 min.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont des douleurs modérées dues aux plaies dans la bouche. La durée des douleurs est estimée à 48 heures minimum. A cause des pansements dans la bouche, les rats auront du mal à s'alimenter et à boire. Cela pourra entrainer une perte de poids et une déshydratation. Il existe un risque de saignement et un risque d'infection, dans la bouche dûs à la chirurgie. Il existe un risque de diminution de la température des rats dû à l'intervention sous anesthésie générale. Les effets bénéfiques potentiels attendus des greffes de derme artificiel sont une diminution du risque de saignement, une diminution des douleurs par recouvrement de la plaie et des terminaisons nerveuses, une cicatrisation plus rapide et une moindre rétraction des cicatrices et donc moins de limitation de l’ouverture buccale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de récupérer les cicatrices pour l’analyse microscopique. Cela nous permettra de comparer la qualité de la cicatrisation entre avec et sans derme artificiel à une semaine et à un mois.
Remplacement
La cicatrisation ne peut pas être évaluée dans son ensemble en dehors d’un être vivant entier car elle implique un recrutement de cellules au niveau de la plaie qui proviennent du sang, la création de nouveaux vaisseaux sur la plaie et de nouveaux tissus. C’est un processus complexe qui ne peut pas être reproduit dans un milieu artificiel. Il ne serait pas éthique de réaliser cette étude chez l’homme car il faudrait enlever toutes les cicatrices obtenues et refaire des plaies dans la bouche. De plus, les patients auraient des interventions chirurgicales supplémentaires qui impliquent des risques alors que le but est de simplifier la prise en charge actuelle.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires a été estimé par des méthodes statistiques. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous ferons en amont le maximum sur tissu. L’apport de l’IRM pour ce projet permettra de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux, 2 par cage, dans des cages à l’environnement enrichi par des tunnels et des barreaux en bois à ronger. Une période d’acclimatation à nos locaux et aux expérimentateurs sera appliquée. Une anesthésie générale sera utilisée pendant les examens et la chirurgie. Durant les examens IRM, un suivi en temps réel de la respiration et de la température sera effectué. Dès l’apparition d’un signe de douleur, les animaux seront médicalisés. Un suivi quotidien de points limites adaptés au modèle sera effectué.
Choix des espèces
Les rats cicatrisent plus vite que les hommes et ont moins de risque d’infection. Des études sur la cicatrisation en bouche ont déjà été réalisées chez les rats de 250-300g. La souris étant plus petite que le rat, la surface de la joue est trop petite pour réaliser une plaie suffisamment grande pour pouvoir mettre en évidence une différence de rétraction de la plaie entre les deux groupes (avec ou sans greffe de derme).
Edition du genome de poisson zebre par CRISPR-Cas9 en vue de creation de lignees
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Le génome de ces poissons est modifié par CRISPR-Cas9 pour livrer des lignées stabilisées à des laboratoires privés ou publics, clients de la prestation, qui réaliseront ensuite leurs propres expériences. 6 500 poissons zèbres sont utilisés dans des procédures déclarées légères et sévères, ceux qui portent le génotype recherché étant gardés comme géniteurs, les autres tués. Chacun subit une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, et le porteur reconnaît que les modifications génétiques apportées peuvent être physiquement dommageables, occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Il décrit une espèce dont les femelles pondent jusqu'à 200 œufs par semaine et qui atteint l'âge adulte en trois mois, l'élevage d'un grand nombre d'individus étant "aisé".
Objectifs
Ce projet a pour but de créer des lignées génétiquement modifiées par la technique CRISPR-Cas9 sur le modèle poisson-zèbre pour des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Les lignées stabilisées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. En 3 mois il atteint l’âge adulte et est capable de se reproduire. Les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Son développement externe permet la micro-injection et donc facilite les procédures d’édition du génome.
Bénéfices attendus
Notre unité d’appui et de recherche a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant les modèles poissons zèbres. Les lignées ainsi produites permettront de mieux comprendre la fonction des gènes invalidés (knock-out) ou modifiés (mutations ponctuelles) ou insérés (knock-in).
Procédures
Biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie, de maximum 3 mm², 1 fois par animal. Temps de la biopsie (anesthésie incluse) : environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques apportées peuvent potentiellement être physiquement dommageables pour le poisson, lui occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Le génotypage, qui s’opère par une biopsie de la nageoire caudale, est réalisé rapidement sous anesthésie en balnéation (pas d’injection traumatisante). Le prélèvement n’impacte que temporairement voire pas du tout l’animal grâce à la régénération totale du membre en quelques jours. Parmi les effets indésirables potentiels nous pouvons donc lister : comportement d'aversion pour l'anesthésique, douleur suite à la biopsie si le geste est mal effectué, comportements de stress (tels que la désorientation) suite au réveil ou à la manipulation à l'épuisette.
Devenir
Les animaux présentant le génotype d’intérêt seront gardés en vie et utilisés comme géniteurs. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt seront euthanasiés.
Remplacement
Notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre pour étudier des phénotypes complexes par exemple des modifications du comportement ou des modifications à l’échelle d’organes entiers, l’espèce animale utilisée ne peut donc être remplacée par des expériences sur cellules ou organoïdes.
Réduction
Une attention particulière sera portée à la gestion du cheptel, notamment via un suivi informatisé, afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaires à la création de lignée. Un bon suivi des lignées permet par exemple d’éviter de produire davantage d’individus alors que des juvéniles sont déjà prêts à être utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Comme le poisson zèbre est une espèce grégaire, il est donc placé en groupe dans les aquariums d'élevage. Pendant le moment où les individus sont isolés (génotypage) les aquariums sont enrichis avec des structures ou objets (algues synthétiques, tuyaux de PVC) permettant aux individus de s’isoler temporairement si nécessaire ou de pallier un manque de compagnie (statut temporaire, généralement durant un séquençage pour identification génétique ou lors d’un isolement dû à une lésion observée sur un animal et qui requiert une convalescence). Deux ou trois congénères au phénotype différent visible (long fin ou nacre) seront également ajoutés à l’aquarium afin de limiter l’isolement pendant la période d’isolement qui n'excède pas deux semaines. Les paramètres de la qualité de l‘eau seront surveillés, ainsi que le bien-être et la santé des poissons. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, modification de la pigmentation. Si des signes de douleur sont observés suite à la biopsie, une administration par balnéation de lidocaïne (analgésique) à 2 mg/L sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Il permet l’obtention non invasive et indolore de plusieurs centaines d'œufs par ponte nécessaires à la mutagénèse. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à 3 mois. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle. Pour le génotypage, les biopsies des nageoires sont effectuées sur des individus entre un mois et trois mois.
Identification d’une nouvelle cible thérapeutique pour stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées d'une tumeur sous la peau à l'état vigile, 612 souris reçoivent ensuite trois gavages et trois injections dans l'abdomen, certaines une radiothérapie sous anesthésie générale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses après la mort. Le porteur écrit que le développement de ces tumeurs n'entraînera "ni douleur ni gêne pour l'animal", tout en prévoyant une surveillance quotidienne, une grille de score et des points limites dont l'atteinte déclenche la mise à mort. Dix-huit souris par condition, six par expérience répétée trois fois, servent à éprouver in vivo une cible repérée en culture cellulaire.
Objectifs
L‘arsenal des traitements contre le cancer comprend la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie, c’est-à-dire la manipulation du système immunitaire du patient pour combattre la tumeur. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces contre tous les cancers ou seule une partie des patients répondent au traitement. L’efficacité du traitement dépend souvent de l’implication des cellules du système immunitaire. Ces dernières années, le rôle essentiel d’une population particulière de cellules immunitaires, appelées monocytes, a été mis en évidence. Le but de ce projet est de manipuler ces cellules afin de stimuler les réponses immunitaires contre les tumeurs, et de tester une stratégie thérapeutique permettant d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie.
Bénéfices attendus
Nous avons identifié par des expériences in vitro une nouvelle cible thérapeutique potentielle qui pourrait stimuler les réponses immunitaires dans le contexte du cancer. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances essentielles pour évaluer l’intérêt de cette nouvelle cible thérapeutique dans un système physiologique in vivo. Ce projet permettra également de mieux comprendre l’importance des cellules immunitaires appelées monocytes dans les réponses immunitaires anti-tumorales. Ces avancées seront communiquées à la communauté scientifique dès la fin du projet. A plus long terme, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles applications thérapeutiques chez l’homme, en particulier de nouvelles stratégies pour optimiser l'efficacité des traitements anti-tumoraux.
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée à tous les animaux de ce projet (injection sur animaux vigiles1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inf à 10 sec). Puis les animaux seront ensuite divisés en 2 lots pour recevoir des traitements différents. Les animaux vigiles recevront un traitement par gavage à raison d’une administration par jour tous les 2 à 3 jours (3 administrations au total – durée du geste inf à 10 sec). En parallèle, ces animaux recevront un second traitement par voir intrapéritonéale (directement dans l’abdomen). Les injections seront réalisées sur animaux vigiles à raison d’une administration par jour tous les 2 jours (3 injections au total – durée du geste inf à 10 sec)
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs sous-cutanées au niveau du flanc qui seront mesurées régulièrement. Le développement de ces tumeurs n’entrainera pas de douleur ni de gêne pour l’animal Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non irritants par voie intrapéritonéale (directement dans l’abdomen) (gêne de courte durée),celles liées au gavage oral (gêne de courte durée )
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Après des premières étapes d’analyse et de validation dans un modèle de culture in vitro, nous avons formulé l’hypothèse que notre cible d’intérêt pourrait stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. Cette hypothèse ne peut être testée que dans un modèle in vivo, dans un système physiologique représentant un organisme vivant intégré et autonome tel que la souris. Cette étape est indispensable à la compréhension du processus biologique et à l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’approche proposée dans ce projet. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.
Réduction
Le nombre de souris par condition est de 18 (6 par expérience, répétée 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, selon la différence que l’on souhaite mettre en évidence. Dans notre expérience préalable, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Dans certaines expériences, plusieurs organes seront prélevés post-mortem pour des analyses, ce qui optimise le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement par l'équipe pour l’état général (7j/7). La radiothérapie sera réalisée sous anesthésie générale et les éventuelles douleurs soulagées par des analgésiques. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte des points-limite les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 5 à 7 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Evaluation de la bio distribution de médicaments chez le rat porteur de tumeur cérébrale et évaluation de leur efficacité thérapeutique en combinaison avec la radiothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale leur est implantée, puis la barrière protégeant leur cerveau est ouverte par ultrasons pour y faire passer une chimiothérapie, associée ou non à une radiothérapie, avec deux à cinq interventions par animal pouvant durer jusqu'à deux heures. Le porteur indique que si les traitements ne suffisent pas, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l'étude étant alors interrompue. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthodes alternatives pour réaliser ce travail", alors qu'il décrit dans le même résumé des essais cliniques déjà en cours chez des patients avec les ultrasons, aux résultats qu'il qualifie de très encourageants.
Objectifs
Les gliomes sont des tumeurs cérébrales ayant une incidence de 4 à 5 nouveaux cas par an pour 100 000 personnes. Il s’agit également du deuxième type de cancer le plus fréquent chez l’enfant. Les patients atteints de glioblastome, le plus agressif des gliomes, survivent en moyenne 15 mois après le diagnostic de la tumeur et ce malgré le traitement combinant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. C’est pourquoi il est nécessaire de chercher de nouveaux traitements. La principale limite à l’efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison d'une barrière protégeant le cerveau qui limite le passage de la majorité des médicaments (chimiothérapie ou autres). Récemment, les ultrasons, guidés par l’imagerie de résonance magnétique et associés à des microbulles, ont attiré l’attention en tant que moyen non invasif pour permettre le passage des médicaments dans le cerveau. Dans la première phase du projet, nous étudierons l’efficacité du traitement administré à des rongeurs porteurs de tumeurs cérébrales après l’ouverture de la barrière protégeant le cerveau par ultrasons. Puis nous évaluerons l’efficacité de la combinaison de la chimiothérapie avec une radiothérapie dans le but de réaliser rapidement un transfert vers la clinique de cette nouvelle approche thérapeutique.
Bénéfices attendus
Dans le cas des tumeurs cérébrales, l’espérance de vie des patients est très petite. L’utilisation des ultrasons représentent un espoir majeur pour améliorer l’efficacité des traitements. Des essais cliniques utilisant les ultrasons sont déjà en cours pour améliorer la délivrance de la chimiothérapie dans les tumeurs cérébrales chez des patients. Des résultats très encourageants ont été obtenus. Nous pensons qu’il serait possible d’améliorer encore ces résultats en ajoutant la radiothérapie à la chimiothérapie (délivrée après traitement par ultrasons pour mieux pénétrer dans la tumeur cérébrale). C’est ce que nous souhaitons démontrer dans ce projet.
Procédures
Les animaux seront placés sous anesthésie générale pendant l’implantation des tumeurs et pendant les traitements. Ils recevront également des médicaments anti douleurs si nécessaire. Ils recevront un traitement de chimiothérapie et un traitement de radiothérapie ou la combinaison des deux traitements. Comme c’est le cas pour les humains, les animaux seront suivis par imagerie médicale. Le nombre d’interventions sera de 2 à 5 selon les groupes auxquels les animaux appartiennent. La durée des procédures varie de quelques minutes à 2h maximum.
Impact sur les animaux
L’inoculation de la tumeur peut induire des douleurs. L'utilisation des ultrasons peut provoquer une inflammation du cerveau qui se résorbe au bout de quelques jours. Cette inflammation, qui est un effet normal dû à cette procédure, ne provoque pas de dommages apparents pour l’animal. La chimiothérapie, comme chez l’homme pourra engendrer une perte de poids des animaux d’une durée limitée. La radiothérapie ne devrait pas engendrer d’effets indésirables. Si les traitements ne sont pas suffisamment efficaces, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l‘étude sera alors interrompue.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort pour obtenir un prélèvement cérébral. D’autres organes seront également prélevés dans certains groupes. Différentes analyses seront réalisées sur ces prélèvements. D’autre groupes de rats seront suivis dans le temps pour évaluer l’efficacité des traitements.
Remplacement
Pour améliorer le traitement des tumeurs cérébrales, Il n'existe pas d'autres méthodes qui permettent d’évaluer l’efficacité d’un traitement associant la chimiothérapie et la radiothérapie. En effet, pour mesurer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il est nécessaire d’étudier un organisme vivant. Celui-ci reflète la complexité des tissus sains, de la tumeur, des vaisseaux qui nourrissent la tumeur et du système immunitaire. Il est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le projet que nous proposons permettra de développer un nouveau traitement contre le cancer du cerveau qui pourra rapidement être transféré à l’homme. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour réaliser ce travail.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel qui permet d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum en choisissant par exemple de procéder par étapes pour définir les traitements les plus efficaces avant de les combiner entre eux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères fixés par le ministère qui sont relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux. Toutes les mesures nécessaires seront prises pour réduire au maximum la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous analgésie et anesthésie adaptée. Dans le cas où certains signes seraient observés, un traitement de la douleur sera mis en place. Des points limite qui déterminent les conditions d’arrêt de l’expérience ont été définis.
Choix des espèces
Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain. L’ensemble des animaux sera utilisé à partir de l'âge adulte (6 à 8 semaines pour le rat), car le cerveau du rat adulte est suffisamment gros pour permettre d’obtenir des images IRM assez résolues et de réaliser des irradiations dans de bonnes conditions de préservation des tissus sains.
Impact de l’immunisation contre la réponse anti-virale sur le développement de tumeurs hématologiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris de ce projet portent des modifications génétiques qui les font développer spontanément des lymphomes et des leucémies, avec réduction de l'activité, prostration, poil hérissé et abdomen gonflé parmi les signes attendus. 262 d'entre elles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Cent soixante subissent cinq à sept injections sous la peau et cinq prises de sang à l'état vigile, un lot de quarante allant jusqu'à 43 prélèvements sanguins hebdomadaires, et 90 jeunes souris sont poinçonnées à l'oreille pour le génotypage. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de mettre à mort tous les animaux dès qu'un point limite est atteint, puisque toutes sont exposées au risque de développer un cancer.
Objectifs
L’immunosurveillance est la capacité du système immunitaire à lutter contre les cellules tumorales. Cette immunosurveillance peut être inhiber au cours de la vie, favorisant le développement de tumeur. Des travaux précédent ont montré que dans certaines circonstances des anticorps neutralisant cette immunosurveillance, favorisaient les maladies virales et par conséquent pourraient favoriser le développement de cancers tels que les cancers hématologiques. Ce projet consiste donc à immuniser des souris afin qu'elles produisent ces anticorps neutralisant l'immunosurveillance et de mesurer l'impact de ces anticorps sur le développement plus rapide des cancers hématologiques apparaissant dans les modèles murins utilisés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra potentiellement de décrire un nouveau mécanisme favorisant l’immuno-évasion et le développement de cancers hématologiques et pourra ouvrir une nouvelle perspective de traitement pour les patients atteints de cette maladie. En effet, malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la plupart des patients rechutent avec des tumeurs résistantes.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à de la contention. 160 souris subiront au minimum 5-7 injections sous la peau (qui dureront moins d'une minute sur animaux vigiles), ainsi que 5 prélèvements de sang sur animaux vigiles, qui dureront quelques secondes. Parmi ces 160 souris, 40 souris seront en plus d'abord anesthésiées puis auront une injection intraveineuse qui durera quelques secondes et un prélévement sanguin qui durera moins d'une minute. 40 autres souris auront aussi en plus un prélévement sang hebdomadaire (soit 43 max) qui durera moins d'une minute sur animaux vigiles. 40 autres souris vigiles auront en plus une injection dans la veine de la queue après avoir placer la queue de la souris quelques secondes sous une lampe chauffante. 90 jeunes souris (à J14 minimum) subiront un prélèvement d'oreille par poinçonnage pour le génotypage, à l'état vigile. Le prélèvement durera quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements seront sources de stress et de douleur (inflammation sur le site d'injection), cependant le volume injecté ou prélévé reste faible et l'acte est rapide (inférieur à une minute). Les effets indésirables attendus liés au développement des lymphomes (souffrance modérée) seront la réduction de l’activité, la prostration, le gonflement exacerbé de l'abdomen. Les effets indésirables attendus liés au développement de la leucémie (souffrance modérée) seront la réduction de l’activité, la prostration, le poil hérissé, les yeux plissés ou bridés et un envahissement du sang par les cellules leucémiques.
Devenir
l'ensemble des animaux seront à risque de développer des cancers, il est donc indispensable de mettre à mort l'ensemble des animaux de chacunes des procédures dès qu' un point limite est atteint ou au plus tard au moment définissant la fin des procédures.
Remplacement
Des études préliminaires sur des modèles celullaires ont été réalisées et ont permis à la fois de démontrer l'efficacité de l'immunisation permettant la production des anticorps neutralisant l'immuniosurveillance. En parallèle, des analyses complémentaires ont été et seront réalisées sur des prélèvements de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, les approches in vitro ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.
Réduction
Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=262) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables pour la cinétique de développement des différentes tumeurs hématologiques. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (incidence des tumeurs, analyse phénotypique des tumeurs, analyse de marqueurs sanguins).
Raffinement
L'élevage des souris génétiquement modifiées pouvant développés des tumeurs spontanément sera adapté et limité dans le temps afin de limiter l'apparition de ces tumeurs. Les transfert de cellules seront précédés d'une anesthésie qui limitera la douleur des souris. La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux en générant le moins de stress possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 3x/semaine. Au fur et à mesure de l'apparition des tumeurs hématologiques et des mises à mort des animaux, des souris se retrouveront isolées dans les cages. Ces animaux recevront un enrichissement supplémentaire (coton et igloo pour nidification, morceau de bois)
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études de développement de cancers hématologiques car c'est un modèle proche de la pathologie humaine qui reproduit les caractéristiques histologiques. De plus, un modèle vivant est indispensable pour l’étude de de la répônse immunitaire sur le développement tumorale. Les souris utilisées seront toutes des souris adultes permettant ainsi un bon développement du système immunitaire. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris.
Analyse de la dynamique cellulaire chez l’amphibien Xenopus Laevis
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Injectées d'hormone dans les sacs lymphatiques la veille de la ponte, les femelles xénopes sont laissées au repos cinq mois avant d'être stimulées de nouveau. Les mâles, eux, sont tués pour prélever leurs testicules et féconder les œufs hors du corps. Sur 170 xénopes utilisés dans des procédures déclarées de souffrance légère, 70 sont réutilisés et 100 tués, pour étudier des enzymes impliquées dans la migration cellulaire, le porteur décrivant une espèce qui fournit "beaucoup de matériel d'étude" avec peu d'animaux mis à mort. Il ne mentionne comme effet indésirable que des nausées et des vomissements en cas de dose hormonale trop forte, et affirme que la stimulation de la ponte ne met pas en danger le bien-être des femelles.
Objectifs
La migration cellulaire est essentielle à de nombreux phénomènes physiologiques tels que le fonctionnement normal du système immunitaire, la cicatrisation des plaies ou encore le développement embryonnaire. De plus, la migration cellulaire est impliquée dans des processus pathologique comme la dissémination des cellules cancéreuses (métastases). Le projet vise à mieux comprendre comment les cellules adaptent des capacités migratoires et comment cette migration est ensuite régulée via des interactions entre cellules ou via des informations présentes dans l’environnement des cellules. Le projet porte particulièrement sur le rôle d’enzymes de la famille des métalloprotéases matricielles (MMPs). Ces enzymes sont exprimées et sécrétées par de nombreux types cellulaires au cours du développement et chez l’adulte. Elles sont principalement connues pour permettre aux cellules de modifier la matrice extracellulaire et faciliter ainsi la migration et l’invasion. Toutefois, ces enzymes sont aussi détectées à l’intérieur des cellules. Elles ont de nombreux substrats non-matriciels. Enfin, elles présentent des fonctions indépendantes de leurs capacités enzymatiques. Ces fonctions annexes restent peu ou pas caractérisées. Le projet a pour objectif de mieux définir ces fonctions non-canoniques des MMPs et de valider leurs importances physiologiques de façon expérimentale in vivo dans un modèle amphibien, le Xénope.
Bénéfices attendus
A court termes, le projet permet d’obtenir des informations cruciales sur le mode de fonctionnement des MMPs in vivo et leurs rôles sur l’initiation et le contrôle de la migration cellulaire. Ce projet a déjà donné lieu à plusieurs productions scientifiques dans lesquelles nous avons démontré des rôles précoces des MMPs en amont de l’acquisition du phénotype migratoire notamment via la régulation de la polarité cellulaire et/ou le contrôle de l’expression de gènes régulant la transition épithélium-mésenchyme. A long terme, les informations recueillies sur le rôle des MMPs chez l’embryon permettra d’affiner les analyses d’échantillon pathologique (biopsie de tumeur) et contribuera à la mise au point de protocole permettant de moduler leurs activités dans le cadre des pathologies (cancers, fibroses).
Procédures
Stimulation des femelles : La ponte des femelles d'amphibien doit être stimulée par injection d'hormone. Une injection au niveau des sacs lymphatiques est pratiquée la veille du jour de ponte. Cette procédure est suivie d'une période de repose de 5 mois (20 semaines) à l'issu de laquelle les femelles peuvent être à nouveau stimulées. Stimulation des mâles : Les mâles d'amphibien sont injectés au niveau des sacs lymphatiques. Les mâles ainsi injectés sont fertiles pendant quatre semaines. Les testicules sont prélevés chirurgicalement.
Impact sur les animaux
La stimulation de la ponte par injection hormonale peut entraîner des nausées et vomissements si la dose est trop forte et si les animaux injectés sont nourris le jour de l'injection.
Devenir
Le prélèvement des testicules requiert l’euthanasie préalable. La stimulation de la ponte ne met pas en danger le bien-être des femelles, elles sont donc gardées en vie le plus longtemps possible.
Remplacement
Le contrôle de la migration cellulaire est impliqué dans de nombreux phénomènes physiologiques (immunité, cicatrisation) et des pathologies comme le cancer et les inflammations chroniques. Nos objectifs scientifiques (analyse de la migration des cellules) et nos stratégies expérimentales nécessitent de travailler sur des cellules animales dans des systèmes qui permettent des manipulations in vivo et in vitro. Le choix est fait d'utiliser un animal modèle (Amphibien/Xénope) qui fournit beaucoup de matériel d'étude (oeufs fécondés) avec un nombre limité d'animaux mis à mort comparativement aux modèles mammifères
Réduction
Les embryons de Xénopes sont obtenus par fécondation in vitro à partir de testicules prélevés sur des mâles mis à mort. Les testicules sont conservés en milieu de culture, au froid, pendant deux semaines ce qui permet de féconder les pontes de 4 à 8 femelles. Afin de réduire le nombre d’animaux mis à mort, nos études sont complétées par l'utilisation de lignées cellulaires de souris et d'embryons précoces de poulet qui ne nécessitent aucuns animaux mis à mort. A activité scientifique constante, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés de 40% par rapport aux projets de recherche précédents.
Raffinement
Afin de réduire la manipulation des animaux nous avons modifié le protocole de stimulation des femelles par rapport aux projets de recherche précédents. Elle s’effectue désormais en une seule injection la veille de la ponte au lieu de deux injections à 5 jours d’intervalle. Par ailleurs, avant injection les femelles sont pesées afin d’ajuster au mieux la dose d’hormone nécessaire. Cette pesée permet également un suivant sanitaire. Enfin, pour éviter les risques de nausées et de vomissements les animaux sont mis à jeûn le jour de l'injection.
Choix des espèces
Le choix du Xénope est justifié de par la possibilité d'obtenir un grand nombre d'ovocytes (1000 oeufs pondus par femelle) sans mettre à mort les femelles, par opposition à la souris notamment. Par ailleurs, nous avons choisi comme population cellulaire modèle les cellules de la crête neurale. Ces cellules utilisent un programme de développement qui est ensuite réutilisé de façon opportuniste lors des cancers. Ceci en fait un modèle extrêmement pertinent du point de vue physiologique. Cependant, cette population de cellules n'existe que chez les vertébrés ce qui exclut un remplacement du Xénope par un organisme "inférieur" comme la drosophile. Les femelles et mâles sont achetés et utilisées à maturité sexuelle. Ensuite à partir des oeufs fécondés obtenus, nous travaillons uniquement sur des embryons entre les stades 2 cellules et 3 jours de développement (avant acquisition de l'autonomie).
Rôle des récepteurs Toll-like dans l’inflammation, l’autoimmunité et le syndrome métabolique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Pour comprendre comment un récepteur de l'inflammation contribue à l'obésité et aux maladies auto-immunes, 56 souris sont nourries jusqu'à l'obésité pendant toute la durée du protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune passe 48 heures isolée de ses congénères en cage calorimétrique et une heure et demie sous anesthésie pour une imagerie. Toutes seront tuées pour prélever leurs tissus, le porteur jugeant leur mise en liberté inconcevable du fait de leur modification génétique. Des points limites gradés et un arbre décisionnel sont prévus, et le porteur précise qu'aucune analgésie n'est prévue dans ce protocole.
Objectifs
L'obésité est un problème majeur de santé publique dans le monde entier, lié aux maladies auto-immunes et à l'inflammation chronique, mais les mécanismes sous-jacents sont inconnus. Les récepteurs de l'inflammation jouent un rôle essentiel dans la conduite des réponses immunitaires et ont été identifiés comme contribuant à l'obésité et aux maladies auto-immunes chez la souris et l'homme. Le ciblage de ces récepteurs pourrait constituer une nouvelle approche thérapeutique de l'obésité et des maladies inflammatoires. Ce projet vise à comprendre comment ce récepteur contribue à l'obésité et aux maladies auto-immunes et à tester l'hypothèse selon laquelle le contrôle de la fonction de ce récepteur peut prévenir leurs effets néfastes. Le projet explorera le métabolisme énergétique, la répartition des masses grasses et maigres et la fonction cardiaque chez la souris ne possédant plus ce récepteur.
Bénéfices attendus
L'obésité est liée à un risque plus élevé de troubles auto-immuns et inflammatoires, qui ont tous deux augmenté de manière significative dans les pays occidentaux. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles stratégies de prévention et de traitement. Les modèles murins d'obésité et de lupus induits par l'alimentation ont permis de comprendre le rôle d'un récepteur de l'inflammation dans les maladies auto-immunes et l'obésité. D'autres études animales sont nécessaires pour comprendre les mécanismes exacts impliqués dans l'autoréactivité et durant l'obésité. Nos études permettront de mieux comprendre la contribution d'un récepteur de l'inflammation à l'obésité et aux maladies auto-immunes et pourraient déboucher sur de nouvelles approches en matière de prévention et de traitement, réduisant ainsi le fardeau social et économique de ces troubles.
Procédures
Les animaux passeront 48 h en cage calorimétrique. Aucun risque particulier n'est associé à cet examen non invasif. L’IRM sera réalisée sur l’animal anesthésié, c’est un examen non invasif, l’examen dure environ 1h30, les risques sont liés à l’anesthésie. Les animaux seront manipulés quelques minutes chaque semaine lors des mesures de masse. De plus ils seront soumis à une alimentation les rendant obèses durant toute la durée du protocole.
Impact sur les animaux
Les animaux seront manipulés une fois par semaine pour la prise de poids. Ils seront passés en cage calorimétrique durant 48 heures et seront donc isolés de leur congénères. Pour l'imagerie, les animaux seront anesthésiés, ce qui est une source de nuisance. Enfin le régime est destiné à rendre les animaux obèses, ce qui sera également une source de nuisance.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à l'issue de la procédure pour prélever post-mortem différents tissus. Etant donné que nous travaillons sur des souris génétiquement modifiées, leur mise en liberté est inconcevable.
Remplacement
Il n'existe à l'heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l'impact de l'obésité induite. Les systèmes organoïdes au niveau immunitaire et intestinaux sont insuffisants, face à ces contraintes notre projet nécessite un organisme (souris) vivant entier. La souris est un donc modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l'homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques d'une lignée de souris transgéniques pour TLR7. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique des souris. Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, à l'aide les tests statistiques, entre les groupes. Le nombre d'animaux sera de 6 à 10 par génotype.
Raffinement
Un délai d'acclimatation minimum de 8 jours sera assuré. Les animaux seront hébergés en cage de 4 pour les mâles et les femelles, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton, du coton, des rondins de bois à ronger, une roue d'activtié…. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle pour une durée inférieure à 24h, avant d'etre replacé avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme et permet d’avoir accès à des modifications génétiques contrôlées. Les animaux seront âgés d’environ 8 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.
Traitement thérapeutique de tumeurs hépatiques induites par le virus de l’hépatite B grâce à des vecteurs lentiviraux vaccinaux
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Greffées sous la peau avec des cellules tumorales sous anesthésie, vaccinées une à deux fois dans le muscle, parfois traitées par lenvatinib administré par la bouche, 8 532 souris voient leur tumeur mesurée au pied à coulisse tous les trois à quatre jours pendant un mois. Les procédures sont déclarées légères à modérées, avec des ulcérations, des tremblements, de la prostration et l'arrêt du toilettage parmi les effets attendus de la croissance tumorale. Les souris dont la tumeur régresse complètement sont suivies quatre mois puis exposées de nouveau à des cellules tumorales. Aucune ne sort vivante, le porteur écrivant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées, ni replacées, ni adoptées, la stimulation immunitaire provoquée par la greffe biaisant toute autre étude.
Objectifs
Les cancers sont caractérisés par la prolifération incontrôlée de cellules. Le système immunitaire joue un rôle majeur dans le contrôle de cette prolifération notamment grâce aux réponses cellulaires impliquant, entre autres, des lymphocytes T aux propriétés lytiques. L’utilisation d’une vaccination thérapeutique fondée sur des vecteurs lentiviraux, connus pour induire cette catégorie de lymphocytes T, pourrait être particulièrement efficace dans le contrôle de la prolifération tumorale. En revanche, et en prévision d'une expérimentation clinique, ces vecteurs se doivent d’être non-intégratifs (VLNI). Lors du cancer du foie lié au VHB, les cellules tumorales expriment certaines protéines du VHB comme l’enveloppe, la capside ou la protéine HBx. L’objectif de ce projet est d’utiliser des VL exprimant ces protéines ou fragments de protéine du virus de l’hépatite B comme vaccin thérapeutique chez la souris. Suite à la vaccination, nous espérons obtenir une réponse immunitaire qui conduirait à l’éradication des tumeurs exprimant ces mêmes antigènes. Les vaccins candidats avec une activité anti-tumorale seront ensuite évalués en association avec les traitements actuels des patients avec cancer du foie lié au VHB en prévision d’un essai clinique chez l’homme.
Bénéfices attendus
Le virus de l’hépatite B est la cause avérée de 50% des cancers du foie chez l’homme. Les traitements actuels (chirurgie, irradiation, traitements immunomodulateurs) ne permettent au mieux qu’une légère augmentation du temps de survie. Chez l’homme, le développement de ces tumeurs s’accompagne de réponses immunitaires inefficaces. Grâce aux VLNI nous espérons pouvoir potentialiser ces réponses et détruire les cellules tumorales. Si nous parvenons à une élimination totale des tumeurs, un nouveau projet sera déposé afin d’évaluer notre candidat vaccin dans un modèle orthotopique. Cela permettrait d’envisager son utilisation pour induire un traitement des foyers primaires chez l’homme en parallèle à d’autres traitements immunothérapeutiques.
Procédures
Les procédures comprennent une injection en sous cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (5min), une à deux vaccinations intramusculaires (quelques secondes) et éventuellement une injection intrapéritonéale d’anticorps (quelques secondes) et ou une injection per os de Lenvatinib (quelques secondes) (procédure 8). La surveillance de la croissance tumorale sera suivie pendant 3 à 4 semaines. Certains animaux seront soumis à une injection de vecteur lentiviral en intramusculaire (quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront une légère douleur au moment de l'injection intramusculaire du petit volume de vaccin. L'injection de cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie. Au niveau de la croissance tumorale, les modèles sont largement décrits et les effets adverses de la croissance sont connus et seront monitorés : lésions cutanées, ulcération, capacité au déplacement des animaux, modification du comportement (isolation, tremblement, prostration, absence de toilettage).
Devenir
Le développement des tumeurs étant irréversible, les animaux seront mis à mort dans toutes les expérimentations selon les points limites établis. Si les souris ne présentent plus de tumeur grâce au traitement, elles seront suivies pendant quatre mois, puis seront à nouveau exposées à des cellules tumorales (procédure 6). Si les animaux atteignent une régression totale de la tumeur, les animaux seront mis à mort au bout de 90 jours maximum après la fin du traitement car ils ne peuvent pas être réutilisé pour d’autres expérimentations. La stimulation du système immunitaire induite par l’implantation de la tumeur peut induire des biais importants pour toutes autres études. Par conséquent, tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats vaccins dans le but de les transposer chez l’homme. Ces études impliquent nécessairement une phase d’expérimentation animale du fait de la complexité de la réponse vaccinale et anti-tumorale au niveau d’un organisme entier. La souris est un modèle de prédilection pour ce type d’étude par rapport aux autres animaux de par sa facilité d’élevage, de l’existence d’outils permettant une analyse en détail du système immunitaire et des corrélats pouvant être réalisés avec les tumeurs chez l’homme. Cette étape constitue également une preuve de concept requise par les agences réglementaires de santé en vue d’une application chez l’homme, en complément des études réalisées in vitro. C’est pourquoi aucun système cellulaire isolé ne peut être utilisé pour remplacer la recherche sur les animaux.
Réduction
En s’appuyant sur des résultats antérieurs obtenu par notre groupe, la littérature et une approche statistique, il a été possible d’anticiper le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables et répétables sur les différents paramètres de l’étude. Pour calculer la taille des groupes de souris injectées par les vecteurs, nous avons utilisé les moyennes et écart-types d’expériences antérieures. La sélection rapide des meilleurs candidats VLNI dans un premier temps permettra de poursuivre leur caractérisation avec un minimum de groupes et donc d’animaux.
Raffinement
Selon notre expérience antérieure, l’injection de LV n’induit aucun signe clinique chez les souris mais l’implantation de tumeurs peut induire une gêne modérée, qui sera contrôlée au cours des expériences. Le site d’injection (flanc droit) a été choisi pour avoir un impact minimal sur les capacités motrices de l’animal et assurer un suivi visuel simple et régulier (tous les 3-4 jours) du développement de la tumeur (mesure de la taille de la tumeur au pied à coulisse) et une prise de décision rapide en cas d’apparition d’un trouble chez l’animal. Si un point limite est atteint, la souffrance des animaux sera abrégée par leur mise à mort. Si les signes cliniques de souffrance sont légers mais néanmoins présents (perte de poids inférieur à 10%, poils hérissés, inactivité), plusieurs mesures seront prises : ajout de gel hydrique, réhydratation sous cutanée, chauffage des cages, amélioration de l’enrichissement.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est proche du système immunitaire humain. Il existe de nombreux modèles de tumeurs qui peuvent être utilisés chez la souris pour tester nos candidats vaccins. De plus, des études précédentes montrent que les vecteurs lentiviraux sont immunogènes chez la souris et de nombreux outils sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire. Les expériences envisagées requièrent des animaux avec un système immunitaire fonctionnel. Il est admis qu’à partir de l’âge de 6 à 7 semaines, le système immunitaire des petits rongeurs est considéré comme mature et que les réponses immunitaires induites peuvent être considérées comme comparables à celles induites pendant la durée de vie d’adulte.
Evolution de nos protocoles de transfert d’embryons et d’insémination de sperme par voie chirurgicale afin de raffiner la prise en charge de la douleur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Rats : 28
Pour valider un protocole antidouleur que le service pourra ensuite appliquer en routine à ses chirurgies de transfert d'embryons, 20 souris et 28 rats vont être utilisés, 20 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 28 un niveau léger. Les rates reçoivent quatre injections, une pour synchroniser leur cycle, une d'analgésique, une d'anesthésique et une dernière pendant leur sommeil. La moitié des femelles subit en plus une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes, l'autre moitié seulement l'anesthésie, puis toutes mettent bas et leurs petits sont comptés avant que mères et portées ne soient tuées, faute de pouvoir être réutilisées dans les activités de service de l'établissement. Le porteur écrit aussi que toute femelle chez qui une douleur ou un inconfort serait détecté sera mise à mort, dans un projet dont l'objet déclaré est la prise en charge de la douleur.
Objectifs
L'objectif du projet est de valider une nouvelle prise en charge de la douleur (administration de médicaments anti-douleur et anti-inflammatoire) lors de nos chirurgies de transfert d'embryons et d'insémination de sperme afin de raffiner nos procédures actuelles. L'utilisation de ces molécules et dans cette chronologie définie autour de la chirurgie doit être validée comme n'ayant aucun effet nocif sur la gestation et la mise bas afin de la passer en routine chez nous.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont d'améliorer la prise en charge de la douleur liée à la chirurgie de transfert d'embryons ou d'insémination de sperme sur nos rongeurs (rats et souris) et donc raffiner nos techniques. Le bien-être animal est une préoccupation majeure au sein de nos activités. Un animal qui ne souffre pas à des rendements plus fiables et plus reproductifs, ce qui impacterai également le R de Réduction. Donc sur ce projet on envisage d'impacter favorablement les R de raffiner et réduire.
Procédures
Les rates recevront une injection, sous simple contention rapide de 5 secondes, afin de synchroniser leur cycle pour devenir mères ou mères porteuses. 4 jours plus tard, les animaux recevrons une injection d'antidouleur sous simple contention rapide de 5 secondes, puis 40 minutes plus tard, ils seront anesthésiés par une autre injection, là encore sous simple contention rapide de 5 secondes. Une fois endormis, la moitié des animaux prévus vont passer en petite chirugie de transfert d'embryons sous anesthésie, alors que l'autre groupe, sera simplement anesthésié, sans aucune procédure invasive supplémentaire. La chirurgie dure environ 5 minutes. Juste après la chirugie, pendant que les animaux dorment encore, afin de limiter le stress, elles recevront un réhydratant et un anti-infammatoire en injectable. Ainsi, une rate recevra un total de 3 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie et 4 injections au total. Pour la souris, elle recevra 2 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie au total.
Impact sur les animaux
Le geste technique d'injection sous contention est un acte qui peu être un peu stressant pour l'animal, mais il ne dure que quelques secondes (environ 5 secondes) et est peu douloureux. Les animaux restent sous surveillance après leurs diverses injections, afin d’observer aucune apparence physique externe de souffrance. Les points de surveillance sont les suivants : rougeur, gonflement, traces de griffures si l’animal se gratte au niveau du site d'injection. Les animaux opérés (acte chirurgical) restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante. Les points de surveillance post-opératoire sont : l’apparence de l’animal, son comportement (prostré….), l’aspect du site de chirurgie (rongeur, gonflement, écoulement, automutilation….)
Devenir
Les femelles gestantes doivent mettre bas et nous devons comptabiliser le nombre de petits pour l'analyse de notre projet. Elles seront ensuite mises à mort, puisque nous ne pouvons pas réutiliser ces femelles dans le cadre de nos activités de service. Il en est de même pour les portées.
Remplacement
Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour l'analyse de l'effet des molécules antalgiques et anti-inflammatoires sur le bon déroulement de la gestation in vivo et la mise bas afin de raffiner nos protocoles chirurgicaux de transfert d'embryons et d'insémination de sperme.
Réduction
Notre activité est connue et il existe bon nombre de données témoins, ainsi, nous avons juste besoin de faire des groupes expérimentaux. Un bonne analyse bibliographique a été faite pour ajuster au mieux le protocole antalgique choisi avec le vétérinaire. Le projet se fera en 2 parties. La première partie (groupe 1) consiste uniquement à valider le fait que les molécules et doses choisies n'altèrent pas le bon déroulement des gestations et mises bas, sur les femelles gestantes mais qui n'ont pas subies de chirurgie. Seulement si cette étape est validée, nous passerons à la phase 2 (groupe 2, avec chirugie de transfert d'embryons). Nous avons choisi un effectif de 10 femelles pour chaque groupe et pour chaque espèce afin d'obtenir des résultats de comparaison fiables.
Raffinement
Du gel oculaire est placé systématiquement sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée de l’animal. De plus, les animaux anesthésiés sont placés sur une plaque chauffante pour pallier à toute déperdition de chaleur liée à l’anesthésie. Les animaux opérés restent en observation jusqu’à leur complet réveil en bonne forme, dans leur cage placée sur une platine chauffante à 37°C. Les animaux sont hébergés en cages ventilées dans des conditions adéquates pour l'espèce. Des enrichissements (nids et quelques croquettes dans le fond de la cage pour les souris et nids + bois et balles à ronger + croquettes dans le fond de la cage pour les rats) sont mis à disposition dans la cage des futures mères lors de leur convalescence et gestation. Comme il s'agit ici d'un test, si une douleur ou un inconfort est détéctée, la femelle sera mise à mort pour lui éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les rongeurs sont de petits mammifères à reproduction rapide qui sont très largement utilisés par la communauté scientifique. Ils sont de très bons modèles expérimentaux puisque 99% de leurs gènes présentent un gène homologue chez l'Homme. Nous voulons des mère porteuses, il nous faut donc des femelles en âge de procréer donc entre 10 semaines et 6 mois (pour les 2 espèces).
Etude du rôle de l’acide rétinoïque dans la différenciation des cellules germinales chez le foetus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Gavées deux fois par voie orale sous contention de moins de trente secondes, des souris femelles gestantes sont ensuite tuées pour que leurs fœtus soient prélevés, puis tués à leur tour. 440 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur conclut que la mise à mort des femelles gestantes et de leurs fœtus fait qu'ils ne souffrent pas. Il ajoute qu'aucun ne peut être gardé en vie, réutilisé, adopté ni replacé, les testicules des fœtus mâles étant l'objet même de l'étude, consacrée au rôle de la vitamine A dans leur formation.
Objectifs
La vitamine A est essentielle au développement embryonnaire de tous les mammifères mais son rôle reste à définir dans les différents tissus. Pour agir pendant le développement embryonnaire, la vitamine A est transformée par des enzymes en un métabolite actif qui se fixe ensuite sur des récepteurs nucléaires qui relayent son effet biologique. Les cellules dans lesquelles la vitamine A ne doit pas agir fabriquent d’autres enzymes qui dégradent ce même métabolite. Afin d’étudier et de comprendre le rôle de la vitamine A dans la différenciation des cellules constitutives du testicule chez la souris, nous proposons de comparer des fœtus normaux à des fœtus porteurs de mutations dans les gènes codant les enzymes qui transforment et qui dégradent la vitamine A, ainsi que dans les gènes codant les récepteurs nucléaires, aux étapes clés de la formation du testicule (entre les jours 14.5 et 18.5 post-fécondation).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de comprendre l’action de la vitamine A et de ses récepteurs nucléaires dans les différentes étapes de différenciation des cellules constitutives de testicule. En découvrant comment la vitamine A agit sur ces évènements chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour mieux diagnostiquer (et éventuellement traiter) des pathologies du testicule ou des cas d'infertilité chez l’Homme, qui sont en augmentation constante dans le monde. Comprendre le rôle de la vitamine A dans le testicule au cours du développement peut également fournir des pistes pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux, à condition de bien caractériser et comprendre au préalable tous les mécanismes mis en jeu dans un modèle expérimental comme la souris.
Procédures
Les souris femelles gestantes sont traitées par gavage oral pour permettre la mutation (recombinaison). Il s’agit de deux contentions simples qui durent moins de 30 secondes chacune. Les souris sont ensuite euthanasiées. Après prélèvement (quelques secondes), les fœtus sont euthanasiés.
Impact sur les animaux
La nuisance subie par les femelles gestantes est limitée à la contention et l’administration de substance par gavage. Le gavage oral est utilisé en routine au laboratoire et nous possédons l’expertise requise pour cette expérimentation. Les doses de solution de gavage sont déterminées pour n’induire aucun effet indésirable lié directement à l’ingestion. Immédiatement après le gavage, tout signe de fausse route (par exemple suffocation) sera suivi de la mise à mort immédiate de l'animal. A ce jour, nous n'avons jamais rencontré ce problème. Dans le cadre de ce projet, les femelles gestantes et les foetus sont euthanasiées, de sorte que les femelles gestantes et les foetus ne souffrent pas.
Devenir
Tous les animaux décrits dans ce projet (femelles gestantes et fœtus) sont euthanasiés. Les femelles gestantes sont euthanasiées pour permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées, adoptées ou replacées. Les fœtus sont euthanasiés pour les analyses moléculaires ou sur coupes histologiques. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés, adoptés ou replacés.
Remplacement
Le testicule est formé de diverses cellules qui ont toutes un rôle essentiel pour la différenciation des cellules germinales. A l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de reproduire in vitro les conditions nécessaires à la formation d’un testicule. En effet, les techniques de culture cellulaire ou d’organoïdes ne permettent pas d'appréhender le développement dynamique du testicule, qui nécessite vascularisation, contexte tridimensionnel et interactions endocrines/paracrines. Par conséquent, l'emploi d’un modèle animal comme la souris récapitulant toutes les étapes complexes de ce processus de développement, est indispensable. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
La stratégie des accouplements fait en sorte que parmi des fœtus obtenus, une moitié possède le génotype contrôle pour les allèles conditionnels et l’autre moitié possède le génotype mutant pour les allèles conditionnels. Relever les jours d’accouplement permet d’anticiper la date de mise à mort des femelles gestantes et de prévoir les dissections des fœtus. Utiliser à la fois les fœtus mâles et les fœtus femelles est impossible, puisque nous étudions le testicule. Les nombres de fœtus requis sont calculés au plus juste pour satisfaire aux exigences en matière de qualité des résultats obtenus et à la robustesse de leur validité statistique.
Raffinement
Les étapes expérimentales mises en œuvre engendrent une douleur minime aux femelles gestantes. La qualité de la contention permet d’assurer un gavage efficace et rapide, limitant le stress et la douleur imposés à l’animal par la procédure. Le personnel est formé à cet effet. Les solutions sont amenées à la température ambiante pour limiter l’inconfort de la femelle. Le bien-être des animaux est surveillé tous les jours et toute altération du comportement (souffrance, angoisse) est immédiatement discutée avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) pour prendre les mesures correctives nécessaires (soins, analgésie, euthanasie, le cas échéant). Les animaux seront hébergés par quatre dans des cages comportant différents types d’enrichissement tels qu’un tunnel de transfert et suffisamment de fibres pour la construction de nids afin de leur permettre d'exercer les activités spécifiques à leur espèce.
Choix des espèces
De par sa petite taille, ses nombreuses ressemblances génétiques et physiologiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, la souris est un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Par ailleurs, le développement embryonnaire normal du testicule est décrit très en détail ce qui en fait un modèle de choix. Nous utilisons une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée. Tous les modèles génétiquement modifiés permettant d’étudier la fonction des gènes d'intérêt dans le testicule fœtal des souris sont déjà à notre disposition. Les femelles gestantes sont euthanasiées à différents moments du dernier tiers de la gestation, de sorte que la période de développement du testicule fœtal qui nous intéresse soit couverte.
Etude du rôle d’Arhgef18 dans la biologie endothéliale chez la souris_Amendement
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à des âges échelonnés de six jours à treize semaines. Les nouveau-nés reçoivent trois injections en trois jours, les adultes une injection intrapéritonéale par jour cinq jours par semaine pendant deux semaines, puis un prélèvement rétro-orbitaire et des mesures répétées de pression artérielle à la queue. Le porteur rattache ce travail sur une protéine des parois vasculaires à la prise en charge de l'anévrisme intracrânien, responsable selon lui de 36 000 hémorragies par an dans l'Union européenne, bénéfice qu'il situe à long terme. Aucun calcul n'appuie le chiffre de 420 souris, le porteur indiquant seulement que l'expérience de son équipe permettra d'en réduire le nombre.
Objectifs
La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.
Bénéfices attendus
La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.
Procédures
Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes. Procédure 5: 1 injection intrapéritonéale à 6 jours d'âge. L'injection dure moins d'une minute par animal
Impact sur les animaux
Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.
Devenir
Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Lot 7 : utilisés pour la procédure 5 pour analyse de la perméabilité vasculaire à 6 jours. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.
Remplacement
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Réduction
Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.
Raffinement
Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).
Suivi comportemental d’une population de crapaud commun au niveau d’une route équipée de passages à amphibiens
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Anesthésiés, pesés, mesurés, sexés, puis micropucés sous la peau en moins d'une minute de contention, 500 crapauds communs sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent d'entre eux reçoivent en plus une peinture fluorescente sur le ventre, et trente un écouvillonnage du mucus. L'objectif déclaré est d'évaluer si les tunnels et les parois de guidage installés le long d'une route départementale permettent aux crapauds d'atteindre leurs mares de reproduction sans se faire écraser. Tous sont relâchés, mais le porteur prévoit la mise à mort des individus capturés trop blessés ou trop maigres, ainsi que de ceux qui ne retrouvent pas un comportement normal après deux heures d'observation.
Objectifs
Les amphibiens ont un cycle de vie complexe, composé d’une phase aquatique (reproduction et stade larvaire) mais aussi d’une importante phase terrestre généralement forestière qui constitue la plus grande partie du cycle de vie. Si la première phase est très étudiée, les connaissances sur la phase terrestre sont en revanche plus limitées, du fait de la difficulté de suivre des individus en déplacement. L’étude portera sur une population de crapaud commun dont les habitats terrestres et aquatiques se situent de part et d’autre d’une route départementale. Cette route a été récemment équipée de paroi de guidage et de tunnels de manière à faciliter l’accès des crapauds aux mares et limiter les risques d’écrasements routiers. Le projet a pour but la conservation de cette population en agissant sur l’amélioration de la connectivité des habitats occupés par l’espèce. L’objectif est d’évaluer le comportement des crapauds communs au voisinage de la route : fonctionnalité des dispositifs de guidage, attractivité et franchissabilité des tunnels. La méthodologie proposée implique l’implantation de micropuces sous la peau des crapauds, ainsi que l’installation de systèmes de détection des puces au niveau de 2 tunnels afin de caractériser le comportement des crapauds et mettre en œuvre le cas échéant des mesures complémentaires pour améliorer leur efficacité (attractivité et franchissabilité). Le suivi sera réalisé sur deux années minimum et jusqu’à 5 ans pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales et tester d’éventuelles mesures correctives. Si le quota d’animaux marqué n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante.
Bénéfices attendus
Cette étude devrait permettre de mieux connaître le comportement des crapauds communs au niveau des tunnels lors de la migration de reproduction ainsi que les déplacements retour après reproduction, encore peu décrits. Les résultats permettront de mettre en évidence les blocages éventuels des animaux, les risques d’écrasements routiers ou encore la mauvaise efficacité des tunnels. Des aménagements seront alors envisagés pour améliorer ces dispositifs et leur efficacité sera évaluée en appliquant le même protocole de marquage et de suivi.
Procédures
Après anesthésie et analgésie et un temps d’attente de 5 minutes, les animaux seront mesurés pesés, et sexés puis une micropuce sera injectée sous la peau de 500 crapauds. Un marquage temporaire à l’aide d’une peinture fluorescente sera appliqué sur le ventre de 100 crapauds et un écouvillons permettra de recueillir un peu de mucus sur 30 individus. Ces interventions nécessiteront de maintenir les crapauds pendant 1 minute.
Impact sur les animaux
La probabilité d’apparition d’effets indésirables voire de mortalité des individus à la suite d’un stress dû à la capture, à la manipulation lors de la biométrie et au marquage ne peut être réduite à zéro. Cependant ces risques restent faibles : l’espèce cicatrise bien et la bonne formation des opérateurs mène à un risque quasi-nul de complication post-marquage.
Devenir
Tous les individus capturés puis marqués seront relâchés pour l'étude de leur comportement in situ.
Remplacement
Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du comportement d’amphibiens sauvages doit obligatoirement être réalisée in situ sur les espèces cibles. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants au niveau de la zone de capture. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes. Peu de données existent quant aux comportements des crapauds communs entre leurs habitats terrestres et aquatiques. On ne peut donc pas se référer à la littérature ni avoir recours à des avis d’expert pour évaluer des comportements théoriques attendus pour cette espèce : une expérimentation in situ reste indispensable.
Réduction
Les captures et marquages sont prévus sur deux ans (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus tiennent compte de la densité d’individus lors des derniers comptages en 2022 et sont un minimum (250 individus / an ; règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des comportements. L’effectif a été déterminé en prenant en compte les risques de mortalité post-opératoire (très limités en respectant les préconisations de tailles minimales), la possibilité de perte de la puce (peu probable mais possible dans les semaines / mois suivant l'implantation), la possibilité que les crapauds ne rentrent pas dans les tunnels ou traversent au niveau d’un tunnel non équipé d’antennes de détection. En outre, les risques de mortalité naturelle (prédation, maladie, écrasement routiers) ne sont pas à exlure. L’effectif prévu tient compte de ces phénomènes, pour garantir un minimum d’enregistrements au niveau des dispositif de détection fixes (a minima 50 individus détectés par tunnel). Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale in natura, en-dehors des statistiques descriptives (taux d’entrée, taux de franchissement, refus, durée moyenne de déplacement, taux de survie apparent) et des statistiques sur le temps d’induction moyen de l’anesthésiant et le temps de réveil moyen des animaux.
Raffinement
Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Les animaux seront capturés dans des seaux percés enrichis de litière humide et seront stockés dans un bac sombre jusqu’au marquage également enrichi de terre/litière humide/abris. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, d’infections visibles ou de troubles du comportement) seront marqués, les autres seront soit relâchés sans marquage, après stabulation, soit mis à mort si les signes cliniques observés (blessures profondes, signes marqués d’infection, maigreur excessive) nécessitent une mise à mort compassionnelle. La taille des micropuces sera adaptée à la taille de l’animal et seuls les crapauds de taille suffisante seront marqués pour supporter la micropuce. Le matériel d’injection sera désinfecté et les opérateurs porteront des gants non poudrés. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre un anesthésiant-analgésique sera appliqué au niveau du point d’injection 5 minutes avant injection. L’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage, l’expérience du personnel permet de réduire le temps global de manipulation à moins d’une minute. Le comportement après marquage sera contrôlé pendant 20 à 30 minutes, avant remise en liberté, de manière à déterminer l’atteinte de points limites : léthargie ou réticence à se déplacer, changement dans la démarche. En cas de difficulté à recouvrer un comportement normal ou en cas de changement significatif de comportement, la phase d’observation sera prolongée pendant 2 heures maximum avant mise à mort.
Choix des espèces
Le but est d’étudier le comportement du crapaud commun au cours de sa migration entre son habitat forestier et ses habitats de reproduction (mares), de manière à assurer sa conservation ; ainsi le remplacer par une autre espèce n’est pas envisageable. Seuls les crapauds adultes seront étudiés, car ils correspondent aux individus en migration de reproduction.