Oncologie
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Caractérisation du rôle du tronc cérébral dans le signal « glucose-portal »
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées à l'issue pour que leur cerveau, leur foie et leurs tissus gras soient prélevés, 56 souris vont être utilisées dans des procédures dont 40 impliquent un niveau de souffrance sévère, 8 un niveau modéré et 8 se déroulent sous anesthésie sans réveil. Quarante d'entre elles subissent une injection dans le cerveau sous anesthésie, puis quinze jours plus tard la pose d'un cathéter dans la veine porte, avant une perfusion de 24 heures. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent provoquer de la douleur, une hémorragie locale, des troubles neuro-musculaires et des difficultés respiratoires sous anesthésie gazeuse. Il précise que les souris utilisées pour la mise au point sont des animaux de réforme, de toute façon mis à mort en dehors du projet, et affirme que comprendre le dialogue entre l'intestin et le cerveau impose de travailler sur l'"organisme entier".
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de la glycémie, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de sucre (glucose) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. L’intestin est en effet capable de produire du glucose en dehors des repas dans une veine spécifique (veine porte), située entre l’intestin et le foie. La détection de glucose dans cette veine après un repas induit un signal nerveux qui cible le cerveau, et qui en retour, va diminuer la taille du repas suivant. Ainsi, lorsque nous imitons la production de sucre par l’intestin en perfusant du glucose directement dans la veine porte, nous observons une diminution de la prise alimentaire associée à une activation de 3 régions du cerveau, connues pour contrôler la faim. Cependant, les études réalisées jusqu’alors ne permettent pas de déterminer si l’activation de chacun de ces 3 noyaux est nécessaire ou si elle est redondante pour les effets coupe-faim de la production intestinale de glucose. Un des noyaux impliqué dans ces effets coupe faim, le noyau du tractus solitaire (ou NTS), est un centre important d’intégration des signaux provenant du système digestif et est connu pour moduler la prise alimentaire. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer si l’activation de ce noyau est nécessaire à la mise en place de l’effet coupe-faim induit par la production intestinale de glucose. Pour cela, nous étudierons, sur une durée d’un an, si l’inactivation de ce noyau cérébral spécifique (par l’injection d’un virus directement dans le cerveau) annule les effets coupe-faim de la détection de glucose dans la veine porte.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets anti-diabète et anti-obésité ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier précisément quelles régions du cerveau sont indispensables à ces effets bénéfiques. Ils s’intègrent dans une étude plus globale qui cherche à comprendre comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. A plus long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre l’obésité et ses complications.
Procédures
A l’âge de 12 semaines, certaines souris subiront : - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris et sans réveil (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris avec un suivi post-opératoire de deux semaines (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris, puis 15 jours après, une chirurgie sous anesthésie générale permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte d’une durée de 20 minutes/ souris (40 souris). Une semaine après, ces souris subiront une infusion (via le cathéter installé) d’une solution contrôle (20 souris) ou une solution de glucose (sucre) (20 souris) pendant 24h.
Impact sur les animaux
- Les interventions chirurgicales sont susceptibles de provoquer de la douleur. - L’injection du virus peut entrainer une faible réponse immunitaire localisée. - La chirurgie réalisée dans le cerveau peut entrainer des problèmes neuro-musculaires. - Au cours de la chirurgie, l’anesthésie gazeuse peut entrainer des difficultés respiratoires. - La chirurgie peut entrainer une hémorragie locale. - L’injection peut entrainer une légère douleur au niveau de l’abdomen ainsi qu’un stress. Une attention particulière sera portée lors de l’injection pour éviter au maximum toute inflammation du péritoine. Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de raffinements spécifiques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes et analyses des tissus. Le cerveau, le foie et les tissus gras seront étudiés pour déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques de la détection de glucose dans la veine porte préalablement observé sur ces tissus.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la détection du glucose dans la veine porte a des impacts sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-diabète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.
Réduction
La totalité des animaux utilisés dans la procédure de mise au point sont des animaux de réforme, systématiquement mis à mort en dehors de ce projet. Ainsi, l’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux spécifiquement pour cette expérience. Le nombre de souris utilisées pour l’expérience propre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept : Soit au maximum 10 souris par groupe. De plus, différents tissus (cerveau, foie, reins, tissus adipeux, pancréas, …) seront prélevés afin de déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques à court terme induit par le signal glucose portal dans ces tissus. Ces tissus pourront constituer une banque de tissus commune au laboratoire pouvant être utilisés par la suite pour d’autres problématiques relatives à la production intestinale de glucose, notamment en évaluant la stéatose hépatique et le brunissement du tissu adipeux.
Raffinement
Les souris seront accueillies à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Les souris seront hébergées en animalerie conventionnelle avec eau et nourriture ad libitum avec enrichissement. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisées et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Afin de limiter au maximum le risque d’hypothermie pendant la chirurgie, un module permettant de chauffer la boîte à induction de notre appareil à isoflurane va être ajouté. De plus, tout le suivi post-opératoire se fera dans une pièce dont la température sera réglée à 28°C afin de garder les souris à thermoneutralité. La mise en place de ces raffinements nous a permis d’observer une meilleure reprise de poids post-opératoire. Après les chirurgies, un suivi intensif est régulier sera réalisé tous les jours tout au long de l’expérience pour identifier et réduire d’éventuelles souffrances selon une grille de score spécifique. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points particuliers limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort.
Choix des espèces
Le rôle de l’intestin, organe capable de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kit biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, entre 12 et 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes BRGS dans le but d’étudier le développement des lymphocytes B
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Dépourvues de lymphocytes T, de lymphocytes B et de cellules NK par construction génétique, donc incapables de combattre le moindre pathogène, une partie des 540 souris du projet vit en confinement sanitaire strict. Toutes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une irradiation qui détruit leurs cellules souches sanguines, une greffe de cellules par injection dans la queue préalablement chauffée, puis un prélèvement sanguin toutes les quatre semaines, l'irradiation à forte dose pouvant provoquer perte de poids, léthargie et dos courbé faute de reprise de l'hématopoïèse. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever la rate, les ganglions et les autres organes de l'immunité, exploration que le porteur juge "indispensable" pour conclure sur la reconstitution immunitaire.
Objectifs
Le but de ce projet est double. Tout d'abord un objectif fondamental qui sera d'évaluer le rôle de différentes mutations dans le développement et la maturation des lymphocytes B, qui sont les cellules productrices des anticorps. Pour cela, nous allons induire in vitro des mutations précises sur des cellules souches hématopoïétiques murines et injecter ces cellules mutées à des souris receveuses n'ayant plus de cellules souches hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques ayant la capacité de reconstituer tous les composants du système hématopoïétique et immunologique, nous pourrons alors suivre dans les souris l'effet des mutations sur le comportement des lymphocytes B. L'objectif étant de repérer les mutations impliquées dans l'hyperprolifération des lymphocytes B, afin de mieux comprendre les mécanismes ayant lieu dans les lymphomes. Ensuite un objectif plus translationnel avec la mise au point d’une stratégie permettant de faire produire aux lymphocytes B un anticorps choisi, ciblant spécifiquement une protéine exprimée par les cellules tumorales. Ce système permettra alors d’induire une réponse immunitaire spécifique contre les tumeurs. Nous allons donc modifier génétiquement les lymphocytes B ou les cellules souches hématopoïétiques humaines puis injecter ces cellules à des souris immunodéficientes, souris qui ne pourront pas rejeter les cellules humaines. Nous quantifierons alors la production des anticorps dans les souris et implanteront les tumeurs spécifiques des anticorps induits pour évaluer leur capacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Concernant le projet sur les cellules souches hématopoïétiques murines, de nombreux résultats seront attendus sur le rôle des différentes mutations induisant des syndromes lymphoprolifératifs (prolifération excessive des lymphocytes), ceci permettant une meilleure compréhension de la physiologie des lymphomes. Pour le projet sur la production d'anticorps humains, nous testons la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B des anticorps thérapeutiques. Ce projet pourra ensuite être valorisé et potentiellement ouvrir une autre voie dans les traitements d'immunothérapie.
Procédures
Les cellules souches hématopoïétiques murines mutées seront greffées dans des souris ayant reçues une forte dose d'irradiation, ceci afin d'éliminer toutes les cellules souches hématopoïétiques présentes et permettre uniquement à celles injectées de se développer. Dans le cas de la greffe des cellules humaines, l’irradiation sera plus légère car il faut garder des cellules souches hématopoïétiques murines mais juste faire de la place pour les cellules humaines. La greffe des cellules se fera ensuite par injection intraveineuse dans la veine de la queue. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 4 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution immunologique au cours du temps. Enfin des immunisations pourront être appliquées sur les animaux en post-greffe si la reconstitution a été jugé optimale.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection intraveineuse des cellules dans la veine de la queue. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention afin de chauffer leur queue avant l'injection. Un léger inconfort pourra être ressenti à cause de la chaleur et une douleur pourra être ressentie lors de la piqure dans la queue au moment de l'injection. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire afin de repérer tout signe indiquant un inconfort ou une douleur. Des nuisances plus importantes viendront de l'irradiation à forte dose. Le développement d'une immunodépression complète induite par l'irradiation à forte dose peut engendrer un affaiblissement notable de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter une potentielle absence de reprise de l'hématopoïèse (qui devrait être obtenues suite à la greffe des cellules souches hématopoïétiques murines) avec l'apparition de signes de l'immunodépression (perte de poids, léthargie, dos courbé...). L'irradiation à faible dose ne provoque en général aucune nuisance.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution hématopoïètique et immunologique ainsi que sur développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Ces dernières sont en effet capables de se différencier en de nombreux précurseurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse. Ces précurseurs vont ensuite continuer de se différencier soit dans la moelle osseuse soit dans d’autre organes du système immunitaire et ainsi reconstituer un système immunitaire entier et compétent. Il est actuellement possible de différencier des CSH in vitro mais uniquement vers une voie donnée, ce qui permet d’obtenir qu’un type de cellules immunitaires. Aucun modèle ne permet une différenciation complète des CSH. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes ou de souris immunocompétentes irradiées à forte dose reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes de cellules, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux (posture et comportement) par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon les mêmes critères généraux cités précédemment en plus de critères spécifiques: suivi du poids et mesure du score grimace permettant d’évaluer l’état de santé des animaux. Le « score de grimace » correspond a une échelle permettant d’évaluer la douleur chez l’animal, en particulier chez la souris. Si ce score excède 1.5 sur 2, les animaux seront alors euthanasiés. Également si la perte de poids excède 20% du poids de référence alors les animaux seront alors euthanasiés. Si des effets secondaires ou signes d'inconfort non soulagés par l’administration d'analgésiques ainsi que des changements perceptibles (aspect, comportement, poids, isolement dans la cage, déplacements limités) sont observés, les animaux seront alors euthanasiés.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes choisies pour le projet des cellules humaines sont complètement dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK, ce qui permet donc d'éviter le rejet de la xénogreffe de cellules humaines. Ces souris permettent la croissance de nombreuse lignées lymphoïdes humaines et l'utilisation d'effecteurs d'origine humaine. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé́ de prise de xénogreffes. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de l’expression d’un phénotype dommageable car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Le maintien de ces souris en hébergement protégé de type A2 permettra de prévenir tout risque d’infection. Les utilisateurs se muniront d'une combinaison recouvrant tout le corps ainsi que d'un masque chirurgical et d'une 2eme pair de gant. Enfin, les souris seront manipulées sous hotte à flux laminaire. L’expérimentation sera commencée chez des animaux de 5 semaines à 3 mois. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 6 mois.
Mise en place d’un dispositif d’identification par radiofréquence chez le poisson clown
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
Une puce de radiofréquence de douze millimètres de long injectée dans la cavité abdominale : trois poissons clowns nés en captivité subissent cette procédure, déclarée de souffrance modérée, et sont ensuite gardés vivants dans une structure d'aquariologie. Ils sont anesthésiés par balnéation, marqués, puis placés une semaine dans un bassin de 100 litres pour vérifier que les antennes détectent bien la puce. Le porteur reconnaît un risque de complications inférieur à 5 %, comprenant inflammation de l'abdomen, infection, ulcération et perforation d'un organe interne. Ce test doit préparer le marquage de trente poissons clowns sauvages en Polynésie française, dont l'étude en milieu naturel rend selon lui l'usage d'animaux "incontournable".
Objectifs
L'objectif du projet de doctorat est de travailler sur la structure sociale des poissons clowns, qui vivent en symbiose mutualiste avec les anémones de mer. Parmi les traits biologiques généraux communs aux 28 espèces d'anémones, une caractéristique particulière est l'organisation de leur hiérarchie de taille à l'intérieur d'une colonie "classique" composée d'une anémone de mer, d'un couple monogame reproducteur et de zéro à quatre juvéniles immatures non reproducteurs. Néanmoins, d'autres types d'assemblages ont été décrits dans la littérature comme de "grandes colonies", composées de manière atypique d'agrégations de plusieurs anémones de mer dans lesquelles 2 couples au moins et des juvéniles vivent ensemble, que l'on peut trouver principalement au Japon et en Polynésie française. Le terme de "mégacolonie" a été récemment introduit pour décrire toutes les colonies à l'exception des colonies "classiques". L'organisation des mégacolonies remet en cause ce que l'on sait de celle des colonies classiques notamment en ce qui concerne la sexualité et la reproduction, la hiérarchie, les territoires et toutes les interactions entre les individus. Ce projet de thèse vise à étudier l'organisation sociale et spatiale des poissons clowns vivant en mégacolonies en Polynésie française et au Japon, en analysant le statut écophysiologique des populations de poissons clowns et les conséquences sur leur système neuroendocrinien. Dans l'objectif de répondre à la première problématique concernant l'organisation spatiale des poissons clowns, il est nécessaire de pouvoir établir un suivi de leurs déplacements au sein d'un champs d'anémones. Cette problématique sera étudiée sur les mégacolonies de Polynésie française. La turbidité élevée de l'eau à ces endroits et la surface des zones étudiées ne permettent pas un simple suivi de leurs déplacements par l'utilisation de caméras. Afin de récolter des données précises quant à leurs mouvements au sein des territoires, ce projet vise à utiliser un dispositif de télémétrie d'Identification par Radio Fréquence (RFID) avec l'implantation de puces (2,12x12mm) par injection dans la cavité abdominale des poissons clowns adultes. Les mouvements des poissons équipés de puces pourront ainsi être précisément détectés et enregistrés par des antennes reliées à des lecteurs placées au sein du champs d'anémones de mer.
Bénéfices attendus
Acquérir des mesures précises quant aux déplacements des adultes au sein des territoires du champ d'anémones de mer nous permettrait de mieux comprendre la gestion des territoires par les individus, et de mieux comprendre la hiérarchie sociale au sein des mégacolonies de poissons clowns.
Procédures
Une première phase de test est prévue en laboratoire, afin de vérifier la détection de la puce RFID (identification par radio-fréquence) par les antennes. Trois individus poisson clowns (A. frenatus) reproduits et élevés en captivité, seront anesthésiés par balnéation (MS222) et équipés d'une puce RFID et placés dans un bassin de 100L d'eau de mer artificielle en présence des antennes afin d'enregistrer leurs mouvements. Cette expérimentation est prévue sur un intervalle d'une semaine. La deuxième phase du projet consiste à utiliser ce dispositif en milieu naturel sur les mégacolonies en Polynésie française.
Impact sur les animaux
La survie liée à l'injection intra-coelomique de puces RFID est jugée optimale pour des poissons de taille supérieure à 6cm selon plusieurs études scientifiques. Ainsi, aucun individu adulte ou juvénile de taille inférieure à 6cm ne sera considéré dans cette étude. L'emplacement de l'injection dans la cavité intra-coelomique ne gêne pas les mouvements natatoires du poisson. Enfin, l'enveloppe en verre de la puce est conçue pour ne pas se dégrader, il n'est pas nécessaire de retirer par chirurgie la puce à l'issue de l'expérimentation. Même si elles sont rares, des complications post-injection, de l'ordre inférieur à 5%, peuvent survenir avec des degrés de gravités différents (inflammation de l'abdomen, infection, ulcération, perforation d'un organe interne). Tous les actes pré- et post-opératoires sont réalisés de sorte à minimiser les risques de survenue de ces complications. L'absence de ces effets, et plus généralement l'absence de toute indication d'inconfort, seront systématiquement vérifiés par un examen à un et deux jours après l'injection des animaux ayant subi cette procédure, vérification d'absence d'anomalie de l'abdomen (gonflement, infection), vérification que les comportements natatoires sont normaux.
Devenir
Phase 1 : Les 3 individus seront gardés en captivité au sein de la structure d'Aquariologie de Banyuls-sur-mer. Phase 2 : Les 30 individus ayant subi successivement les deux procédures resteront dans leur milieu naturel.
Remplacement
Les mégacolonies représentent une structure particulière ne pouvant pas être reproduites en laboratoire ou modélisées. Afin d'étudier les déplacements des poissons clowns au sein de ce type de structure (deuxième phase), il est indispensable de suivre directement et précisément leurs déplacements en milieu naturel à l'aide d'un système de télémétrie. Ainsi, le modèle animal et en particulier l'utilisation des poissons clowns en milieu naturel est donc le plus prédictif et le plus pertinent pour espérer comprendre ce processus d'organisation sociale. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants par des méthodes alternatives. De fait, l'utilisation du modèle animal est incontournable.
Réduction
Toutes les procédures expérimentales qui seront mises en oeuvre ont été optimisées statistiquement, de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés et prélevés dans la nature tout en obtenant des résultats significatifs (3 individus pour la première phase de test, et 15 couples (soit 30 adultes) pour la mégacolonie durant la deuxième phase en Polynésie Française. L'approche expérimentale choisie est la plus optimale pour enregistrer les mouvements des poissons clowns tout en minimisant l'impact sur leur état physiologique.
Raffinement
Durant la première phase de test, une attention particulière sera accordée au bien être des individus via la présence de personnel compétent 7j/7j pour l'observation et le soin des animaux. Concernant la deuxième phase, pour minimiser tout stress avant anesthésie des poissons en milieu naturel, les animaux ne seront pas sortis de l'eau et seront directement anesthésiés sous l'eau à l'aide d'eugénol. Les deux marquages se feront rapidement en simultané après la capture de l'animal et celui-ci sera relâché près de son anémone de mer et surveillé pendant plusieurs minutes jusqu'à récupération complète de ses fonctions natatoires. Afin de réaliser une intervention rapide et la plus précise possible, la personne compétente réalisera plusieurs injections intra-coelomiques de puces RFID et d'injections sous cutanées d'élastomères en entraînement sur des poissons non vivants récupérés dans le commerce. De plus, la survie liée à l'injection intra-coelomique de puces RFID a été étudiée et jugée optimale pour des poissons de taille supérieure à 6cm. Ainsi, aucun individu adulte ou juvénile de taille inférieure à 6cm ne sera considéré dans cette étude. L'emplacement de l'injection dans la cavité abdominale ne gêne pas les mouvements natatoires du poisson. Enfin, l'enveloppe en verre de la puce est conçue pour ne pas se dégrader, il n'est pas nécessaire de retirer par chirurgie la puce à l'issue de l'expérimentation.
Choix des espèces
Depuis plusieurs années, les poissons clowns sont un excellent modèle d'étude dans les domaines de l'écologie, de l'évolution et du développement. La symbiose établie entre les poissons clowns et leur anémone de mer et en particulier l’organisation hiérarchique de ces poissons représentent un intérêt majeur pour ce projet. La structure particulière en mégacolonie n'ayant été observée jusqu'à présent uniquement chez cette famille, les poissons clowns représentent un modèle de choix pour comprendre l'organisation sociale. Afin de réduire au maximum les effets indésirables mais non délétères de l'implantation d'une puce dans la cavité abdominale d'un individu, seulement des individus juvéniles et adultes de plus de 6cm sont sélectionnés.
Effets de l’exposition précoce à la musique sur le développement des comportements sociaux chez la caille japonaise
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Exposées pendant quinze jours à de la musique ou à du bruit rose, trois fois quarante-deux minutes par vingt-quatre heures, 96 cailles japonaises subissent des procédures déclarées de souffrance légère. Toutes sont gardées vivantes pour des études ultérieures, le porteur estimant que la procédure ne porte pas atteinte à leur intégrité. L'objet du projet est d'éprouver une hypothèse sur les origines évolutives de la musicalité, en comparant une espèce aux capacités d'apprentissage vocal limitées à des espèces qui imitent les sons. Cinq tests comportementaux sont annoncés, deux en présence de congénères et trois en isolement, dont un mesure l'immobilité tonique, les autres n'étant pas nommés.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans une étude visant à explorer les origines et fonctions évolutives de la musicalité ainsi que les liens entre musique et comportements sociaux. Il existe une théorie selon laquelle la musicalité serait apparue au cours de l’évolution parce qu’elle renforcerait les liens sociaux et la cohésion du groupe. Plusieurs études ont en effet révélé que les activités musicales conjointes favorisent la prosocialité chez les enfants. De plus, écouter de la musique favorise les interactions sociales positives à la fois chez les enfants d’âge préscolaire et chez les oiseaux. Ainsi, la musicalité pourrait avoir émergé au moins deux fois au cours de l’évolution, chez les humains et chez les oiseaux, avec des fonctions adaptatives similaires. Cependant, d’importantes questions demeurent concernant (i) le rôle de facilitation que les capacités d’apprentissage vocal ont pu jouer dans l’évolution de la musicalité, et (ii) les circonstances dans lesquelles la musique influence le comportement social. Dans ce contexte, notre présent projet a pour objectif d'analyser, chez la caille japonaise, l’effet de l’exposition précoce à la musique sur le développement des comportements sociaux. Notre modèle présentant des capacités d'apprentissage vocal limitées, notre étude permettrait ainsi d'affirmer ou d'infirmer le lien entre apprentissage vocal et musicalité.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de l’étude visant à explorer les origines et fonctions évolutives de la musicalité, ainsi que les liens entre musique et comportements sociaux, le projet permettra d’évaluer le rôle de l’exposition précoce à la musique sur le développement des comportements sociaux chez la caille. La comparaison de ces résultats obtenus chez la caille japonaise avec ceux obtenus chez d’autres espèces animales ayant des capacités d’apprentissage vocal plus ou moins développées permettra de déterminer si la musique a ou non des effets plus prononcés sur les interactions sociales chez les espèces ayant les capacités les plus devéloppées. La caille japonaise étant un animal domestique utilisé dans des élevages en captivité, le projet pourrait aussi ouvrir des pistes pour développer l’utilisation de la musique pour favoriser le bien-être et les interactions sociales positives chez les animaux en captivité.
Procédures
Lors de la phase d’exposition à la musique/bruit rose, les individus seront soumis pendant 15 jours à trois stimulations sonores par 24h (42 min*3 = 126 min/24h), d’une intensité d’environ 55 décibels et de fréquences allant de 50 à 20 000 Hz. Les animaux seront soumis à 5 tests comportementaux afin d’évaluer l’effet de la musique sur leurs traits de comportement. Deux tests en présence de congénères d’une durée de 8 et 20 minutes. Trois tests en isolement d’une durée de 3, 4 et 6 minutes. Ainsi, la durée totale de test par individu est de 41 minutes. Les tests sont séparés au minimum de 24h afin de ménager des temps de récupération aux oiseaux.
Impact sur les animaux
Les traitements musicaux sont succeptibles de déranger les animaux. Cependant, nos études précédentes n’ont pas montré un tel dérangement et les stimuli sonores seront diffusés dans l’environnement habituel des oiseaux, à un volume sonore limité et contrôlé à l’aide d’un sonomètre (maximum 55 décibels au niveau de la cage). Le déplacement et l’isolement des oiseaux lors des tests ainsi que leurs expériences lors des tests (environnement nouveau, manipulation pour l’immobilité tonique) sont également susceptibles de les perturber. Cependant ces tests seront de courtes durées (10 minutes maximum) et les animaux seront manipulés par des personnes expérimentées.
Devenir
La procédure n'impliquant pas d'effets portant à l'intégrité des individus, les oiseaux seront tous gardés en vie pour des études ultérieures.
Remplacement
Le projet consiste à observer le comportement d’animaux vivants libres de leurs mouvements et de leurs réactions, ce qui, par essence, exclut tout remplacement par des modèles autres que ces animaux.
Réduction
La taille de chaque traitement (N=32) tient compte de potentielles différentes de réponses comportementales des individus selon leur sexe. La caille japonaise présentant un sexe ratio généralement équilibré, un effet sexe pourra ainsi être testé (16 individus par sexe et par traitement) statistiquement, tout en tenant compte de la forte variabilité interindividuelle inhérente à l’expression comportementale.
Raffinement
Les oiseaux seront hébergés en groupe sociaux dans des cages aménagées de substrat (litière en copeaux de bois) permettant l’expression de bains de poussière. Les cailleteaux étant incapables de réguler leur température pendant les 11 premiers jours de vie, les cages seront équipées de chaufferettes pendant toute cette période. Un suivi de la localisation des cailleteaux sous et autour de la chaufferette permettra de moduler la température en fonction de leur besoin (la chaufferette pouvant être abaissée ou remontée pour adapter la température au sol). La manipulation des oiseaux sera limitée, de courte durée et réalisées par des personnes expérimentées. Les animaux seront soignés et observés tous les jours par un personnel expérimenté. La détection de tout changement de comportement conduira à isoler l'individu afin de l’observer de plus près et de le soigner si nécessaire, l’objectif étant de pouvoir le remettre dès que possible dans ses conditions de vie habituelles.
Choix des espèces
L’un des objectif du projet consiste à comparer l’influence de la musique sur les comportements sociaux chez différentes espèces ayant des capacités d’apprentissage vocal variables. Celles-ci sont connues pour être importantes ches les oscines et les psittacidés. De plus, plusieurs espèces de psittacidés, sont connues pour leur sensibilité à la musique. Au contraire, les capacités musicales semblent plus limitées d’après la littérature chez les gallinacés, dont font partie les cailles. Les cailles étant connues pour avoir des capacités d’apprentissage vocal limitées, nous nous attendons donc à observer chez elles un effet moins important de la musique que chez les espèces capables d’apprentissage vocal par imitation (comme les espèces étudiées par les partenaires du projet). Comparer ces différentes espèces permettra de tester l’hypothèse de l’apprentissage vocal comme prérequis à l’évolution de la musicalité et de mieux comprendre l’évolution de ce trait au cours de l’histoire du vivant. Les oiseaux seront utilisés à différents stades de leur développement depuis le jour de leur éclosion jusqu’à leur maturité sexuelle. Ce suivi permettra de mettre en évidence l’impact de nos traitements sur différentes caractéristiques comportementales qui sont exprimées à différents moments de la vie de l’oiseau.
Elevage de lignées murines transgéniques avec génotypage par méthodes invasives
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Nées de lignées transgéniques entretenues pour alimenter d'autres projets, 50 764 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées de souffrance légère. Entre le septième et le douzième jour de vie, chacune est tatouée aux phalanges ou aux coussinets et subit l'ablation de l'extrémité de la queue pour le génotypage, les deux gestes enchaînés sous contention et sans anesthésie. Le porteur présente le tatouage comme un moyen "de ne pas mutiler les animaux" et retient la biopsie caudale notamment parce qu'elle évite l'anesthésie. 40 000 de ces souris passeront dans d'autres autorisations de projet, les autres sont tuées selon leur génotype, dès le sevrage si aucune utilisation n'est possible, plus tard si elles servent à l'élevage et deviennent trop âgées ou "mauvais reproducteurs".
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Ces animaux sont identifiés par marquage et caractérisés à l’aide d'une biopsie (prélèvement de tissus). Cette demande d'autorisation de projet pour l'identification des animaux et le prélèvement de tissus se justifie par la nécessité de sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes de projet) ; sélectionner les animaux d'entretien des élevages ; sélectionner les animaux pour : • le maintien des compétences, • les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo.
Bénéfices attendus
La biopsie est une étape nécessaire pour déterminer quels sont les animaux dont le profil ADN est pertinent pour mener à bien les expérimentations, dans le but de trouver des thérapies innovantes qui puissent être transposées en recherche clinique. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux de cette DAP seront soumis à deux gestes techniques invasifs qui sont réalisés ensembles: 1/ l'identification par tatouage digital: 1 fois, durée de quelques secondes 2/ biopsie de queue: 1 fois, durée de quelques secondes
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress.
Devenir
A l'issue de cette unique procédure, le devenir des animaux est différent selon leur génotype: a/- ils sont prévus pour expérimentation, formation ou maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP): utilisation continue b/- ils sont sélectionnés pour entretien des colonies, puis mis à mort lorsque trop âgés ou mauvais reproducteurs c/- ils sont utilisés ex vivo, donc mis à mort avant utilisation d/- ils sont mis à mort dès sevrage si aucune utilisation possible au vu de leur génotype e/- ils sont mis à mort à tout moment si atteinte d'un point limite.
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’EU établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’EU. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté à jour de ses formations et qui ont un bon regard sur les points limites découlants de ces gestes. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté en respectant les conditions d’asepsie établies dans l’établissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Ces cages sont enrichies avec des palets de Woodwool qui permettent au souris de nidifier et de se cacher. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère.
Choix des espèces
Au sein de notre EU les équipes de recherche utilisent le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Les animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 de manière à cibler l'orientation des animaux avant sevrage.
Evaluation du MALDI-Imaging pour la détection et localisation de marqueurs palustres dans un modèle de neuropaludisme expérimental
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Injectées dans l'abdomen avec Plasmodium berghei, piquées à la queue tous les deux jours pour un frottis, contenues à la main deux à trois minutes par jour pendant cinq jours pour recevoir un traitement, 160 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir du onzième jour, elles peuvent présenter des signes neurologiques comme une paralysie, et sont alors tuées afin de prélever leurs organes. Quatre d'entre elles servent uniquement à entretenir la souche parasitaire par prélèvement sanguin derrière l'œil, avant d'être tuées elles aussi. Le porteur écrit que les points limites ont été fixés de façon à prendre en compte les signes neurologiques "sans compromettre le suivi et l'acquisition des données de recherche", et toutes les souris finissent tuées pour l'analyse de leur cerveau, de leur cœur, de leur foie, de leur rate, de leurs poumons et de leurs reins.
Objectifs
L’objectif du présent projet est d’utiliser, pour la première fois, l’approche innovante du MALDI-IMS pour améliorer nos connaissances sur les mécanismes physiopathologiques d’infections/évolutions palustres en utilisant un modèle murin avec atteinte neurologique. Il est nécessaire de présenter l’approche par MALDI IMS. La spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) permet l'analyse de molécules directement à partir de coupes de tissus, permettant l'étude de la distribution spatiale des composés, qui peuvent être des molécules biologiques telles que des protéines et des peptides, lipides, éléments chimiques, métabolites. Ainsi, la spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est capable de déterminer la distribution de centaines de molécules à la fois directement à partir de coupes de tissus. Puisque les tissus sont analysés intacts sans homogénéisation, les relations spatiales des molécules sont préservées. L’objectif du présent projet est donc d’ouvrir de nouvelles pistes sur la compréhension des infections palustres dans un modèle animal en utilisant pour la première fois l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI ou MALDI-IMS, mais également de faire la preuve du concept de l’intérêt de cette technologie pour évaluer la distribution d’un traitement anti-palustre et notamment déterminer si la molécule thérapeutique co-localise avec la cible parasitaire, et connaitre les conséquences de ce traitement au niveau des lésions neuronales. Enfin, savoir si la molécule thérapeutique est dégradée au niveau central avec la détection de changements métaboliques. Il est également envisagé d’étudier les effets indésirables du traitement tels qu’une activité hors cible et son effet toxique (eg, altération du fonctionnement d’un organe sain). Outre une analyse sur des coupes de cerveaux, le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins seront prélevés pour les analyses en MALDI IMS
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera notre compréhension des partenaires protéiques participant à la formation des obstructions capillaires et il permettra d’identifier des marqueurs protéiques pour le diagnostic précoce d’une atteinte cérébrale. Par ailleurs, il améliorera notre connaissance sur les mécanismes neurodégénératifs de cette atteinte centrale, une analyse spatiale et temporelle de ces marqueurs protéiques semble indispensable. L’imagerie MALDI ou MALDI-IMS est un outil de choix pour répondre à ces attentes. Cette technologie a déjà fait ses preuves pour d’autres pathologies avec atteinte centrale offrant la possibilité d’identifier rapidement et facilement des zones cibles du cerveau ainsi que la bio distribution d’un médicament. La visualisation de la distribution des médicaments dans les tissus a permis d’orienter les chercheurs sur le développement de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de mieux comprendre les mécanismes physio-pathologiques.
Procédures
Il faudra injecter aux souris avec une souche donnant des atteintes neurologiques (injection intrapéritonéale dure moins d'une minute). Les souris seront piquées pour administrer les traitements par voie intrapéritonéale avec contention (prise manuelle) pendant 3 jours consécutifs après détection des premiers parasites sanguins (la contention et la piqure dure entre 2 à 3 minutes). Les souris subiront également des piqures sans contention au niveau de la queue pour les frottis tous les 2 jours (la piqure à la queue dure moins d'une minute). 4 souris subiront un prélèvement sanguin rétro orbitaire afin d'entretenir la souche mais également assurer l'infection des lots expérimentaux (l'ensemble du rétro orbitaire dure environ 5 minutes). Une pesée sera également réalisée en alternance avec les frottis tous les 2 jours (la pesée dure 2 minutes). Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L’apparition des symptômes est importante pour avoir une chronologie des mécanismes cérébraux impliqués.
Impact sur les animaux
L'infection des groupes « infectés » et « infectés traités » entrainera des atteintes neurologiques, et la mort pour les souris concernées. L'administration des médicaments et les infections obligeront les souris à être manipulées, contentionnées - les souris concernées ne seront pas libre de leur mouvement pendant 1 à 2 minutes (pendant 5 jours consécutifs). Le recueil de la goutte de sang pour les frottis entrainera une piqure et une douleur au niveau de la queue pendant 1 minutes tous les 2 jours. La réalisation des lots expérimentaux grâce aux 4 souris entrainera consécutivement l'anesthésie, le prélèvement rétro orbitaire (5 minutes environ) et l'euthanasie de ces 4 souris. La pesée entrainera une manipulation de moins de deux minutes. Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L'infection des souris entrainera également une perte de poids modérée 1 à 2 grammes pendant 2 jours (3 jours après l'infection).
Devenir
L'étude se portant sur la recherche de marqueurs protéiques et tissulaires propre au paludisme, l'ensemble des souris seront euthanasiées
Remplacement
Les objectifs généraux sont de réaliser pour la première fois, des cartes protéiques permettant de visualiser les variations d’expression et d’abondance protéique en fonction de leur localisation in situ mais également suite à l’atteinte cérébrale par une infection palustre, et enfin étudier les conséquences d’un traitement anti-palustre sur ces répertoires protéiques. Afin de mener à bien ce projet, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable. Plasmodium berghei, qui est la souche spécifique du paludisme murin, peut léser, en plus du système nerveux central, un certain nombre d’organes simultanément. La complexité de son cycle ainsi que notre intérêt pour l’analyse de répertoires protéiques, pour une méthode inédite, obligent à l’utilisation d’un modèle animal. Les modèles de cultures cellulaires ne permettront pas de répondre aux objectifs fixés dans le présent projet. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier. Par ailleurs il n’existe pas pour le moment de modèle alternatif complet ou même partiel d’organoïdes, sphéroïdes ou organe sur puce reproduisant la complexité du système nerveux et sa réponse immunitaire face à une infection
Réduction
En accord avec le principe de réduction des effectifs, le nombre de souris par groupe sera calculé par rapport au nombre statistique d’échantillon nécessaire à une analyse en MALDI-MSI (triplicate) tout en tenant compte de la prévalence de la forme neurologique dans ce modèle et de la contribution des deux sexes. Nous avons trouvé un effectif minimum de 6 souris par groupe. Nous prenons 8 individus par groupe infecté pour les deux expériences car si n< 6 l’analyse des données sur les souris restantes ne sera pas possible et demanderait de recommencer la manipulation. Ces nombres ne compromettent pas les objectifs du projet en permettant l’utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
En accord avec le principe de raffinement, les signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement des rongeurs, de manière à limiter l’anxiété des animaux. Des abris, des morceaux de cartons et des éléments à ronger seront placés dans les cages et les souris seront habituées à la manipulation. N’ayant pas trouvé de donnée contraire dans la littérature scientifique sur l’utilisation d’anesthésiant dans le cadre du MALDI MIS toutes les mesures correctives possibles nécessitant une analgésie ou une anesthésie seront utilisée afin de soulager les signes de douleurs. Les animaux sont hébergés en groupe afin de maintenir les interactions sociales. Des points de soin (point of care) et des points limites ont été mis en place afin de prendre en compte les signes neurologiques sans compromettre le suivi et l'acquisition des données de recherche.
Choix des espèces
Afin d’atteindre les objectifs de cette étude, une modèle animal comprenant un parasite du genre Plasmodium et un hôte permissif pour ce parasite afin de développer des atteintes centrales proches du paludisme cérébral humain est indispensable. Ce modèle doit permettre de mettre en évidence les molécules protéiques impliquées dans l’initiation et maintien d’une atteinte parasitaire centrale mais également de l’effet « recovery » du traitement anit-palustre. Le système « souris + P. berghei » est un modèle reconnu pour l’analyse de l’invasion centrale par le parasite ainsi que pour évaluer un composé à activité antipaludique. Nous choisirons des souris C57BL6J pour leur aptitude à développer aussi bien les formes cérébrales que de fortes parasitémies. Les souris C57BL6 seront des individus adultes âgés de 6 à 7 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 8 à 10 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond à l’âge de maturité sexuelle (adulte).
Etude des effets biologiques d’un faisceau d’électrons à haute énergie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
Les souris dont le poids passe sous un seuil de référence, qui présentent des difficultés respiratoires ou une fibrose avancée au scanner sont mises à mort. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Une partie reçoit une irradiation du thorax à 13 ou 15 grays, qui provoque une inflammation pulmonaire pendant un à trois mois puis, en cas de forte toxicité, une fibrose des poumons à quatre ou cinq mois. Les autres reçoivent des cellules tumorales sous la peau de la patte, avec des risques de dermite, d'ulcération et de nécrose cutanée, pour comparer un nouveau faisceau d'électrons de haute énergie à un faisceau témoin en vue de son intégration dans de futures machines de radiothérapie.
Objectifs
La radiothérapie induit des effets secondaires qui affectent la qualité de vie des patients atteints de cancers. Pour améliorer les traitements de la radiothérapie et limiter ses effets secondaires, nous explorons de nouvelles méthodes d’irradiation comme la radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. Afin de pouvoir explorer son potentiel clinique, nous caractériserons dans ce projet les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie en étudiant d’une part, les toxicités qu’elle pourrait induire, et d’autre part, son pouvoir à éliminer les cellules tumorales.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons déterminé le potentiel clinique d’une nouvelle méthode de radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. En cas de résultats positifs, cette nouvelle méthode pourrait être intégrée, aux futures machines de radiothérapie et permettre une amélioration des traitements par radiothérapie (i.e. moins d’effets secondaires) pour les patients atteints de cancer.
Procédures
Dans une première procédure, 3 lots d’animaux seront irradiés avec une nouvelle méthode de radiothérapie et ils seront ensuite suivis par scanner pour petit animal. Ils seront anesthésies pendant 5 à 10 minutes pendant l’irradiation et environ 5 minutes pour chaque scanner mensuel. Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée aux animaux vigiles constituant 3 lots d’animaux : - 1 premier lot ne subira aucun autre geste technique - 1 second lot sera anesthésié en vue d’être irradié avec le faisceau contrôle sur les tumeurs implantées en sous cutanées. La durée de l’anesthésie sera de 2 minutes par animal - 1 troisième lot sera irradié avec le faisceau d’intérêt sur les tumeurs implantées en sous cutanées. L’anesthésie durera entre 5 et 10 minutes.
Impact sur les animaux
Pour l’étude de la toxicité sur tissu sain, les animaux, ayant reçu une irradiation thoracique, développeront une phase d’inflammation pulmonaire(1 à 3 mois post-irradiation) qui évoluera après 4 ou 5 mois vers une fibrose pulmonaire en cas de forte toxicité radio-induite (dose de 13 et 15 Gy). Suite au développement de la fibrose, une perte de poids des animaux pourra être observée. Pour l’analyse de l’efficacité antitumorale, les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée au niveau de la patte développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. L’injection de cellules tumorales provoquera une douleur et gêne de courte durée. Les potentielles toxicités cutanées (dermites, ulcération, nécrose) à court terme induites par le traitement seront évaluées par une grille de score adaptée
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Des modèles in vitro (i.e lignée de cellules en culture) existent et sont utilisés dans le cadre d’études préliminaires des effets radiobiologiques d’un faisceau d’irradiation. Des études préliminaires ont été réalisé avec certains de ces modèles au laboratoire et nos résultats préliminaires sont encourageants (lignée de cellules tumorales/modèle ex vivo de coupes d’organe mis en culture. Cependant, ces modèles restent simples et ne permettent pas de prendre en compte la complexité du développement des toxicités induites par la radiothérapie chez le patient, ce qui nécessite le recours à l’animal
Réduction
Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études pilotes ont été réalisées sur un autre faisceau d’irradiation (faisceau contrôle) au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour évaluer les effets radiobiologiques du nouveau faisceau. De la même manière, des études pilotes utilisant des tumeurs greffées sous la peau nous ont permis d’évaluer les temps optimaux d’irradiation post-greffe ainsi que les doses de traitements adaptées 2-Dans le cadre de l’étude des effets secondaires de la radiothérapie dans le poumon, le bras contrôle avec notre faisceau se base sur des données déjà acquises par le laboratoire ce qui nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé pour avoir une puissance statistique suffisante lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications pulmonaires par imagerie scanner permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombres d’animaux utilisés pour cette étude. Les tests statistiques adaptés seront utilisés pour étudier la « survie sans complication » des animaux dans le cadre de l’étude sur le tissu sain. Pour la partie tumorale, des tests seront réalisés pour l’étude de la survie avant qu’un point de limite éthique soit atteint.
Raffinement
Pour la procédure d’évaluation des effets secondaires de la radiothérapie, plusieurs critères seront pris en compte : 1-Le poids des animaux sera suivi de manière hebdomadaire dans la période de 1 à 4 mois post-irradiation (i.e. pendant la phase de pneumopathie). Ensuite, de 5 à 7 mois post-irradiation, le poids des animaux sera suivi de manière bi-hebdomadaire (en début et fin de semaine) afin de surveiller les potentielles pertes de poids. Les animaux pour lesquels le poids sera inférieur au poids limite de référence seront mis à mort pour éviter toutes souffrances. 2-Si des difficultés respiratoires et/ou un isolement sont observés, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. 3-Le suivi scanner sera également un point majeur de notre évaluation du développement de effets secondaires. Si un animal présente des signes de fibrose avancée sur les images scanner, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. Pour la procédure d’évaluation de la réponse antitumorale sur un modèle de tumeurs sous cutanée, plusieurs critères seront pris en compte : 1-La taille de la tumeur sera un élément important et déterminant pour assurer le bien-être de l’animal. Le poids des animaux et la taille de leurs tumeurs seront évalués de manière bi-hebdomadaire. 2-De potentielles lésions cutanées peuvent survenir dans la zone d’irradiation de la tumeur. Une grille de score spécifique mise en place lors d’études pilotes et antérieures permettront d’évaluer le grade de ces lésions et limiter les douleurs chez l’animal (mise en place de traitements antalgiques ou mise à mort de l’animal si stade trop avancé) Pour les deux procédures, une anesthésie générale ainsi qu’une contention physique sur un support adaptée sera réalisée au moment de l’irradiation pour éviter tout inconfort et douleurs des animaux. Aucune douleur n’est attendue au moment de l’irradiation dans ces conditions. Les animaux seront hébergés dans des conditions standards
Choix des espèces
La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique pertinent pour la radiothérapie car les réponses moléculaires et cellulaires (e.g. fibrose radique) des tissus murins à l’irradiation sont comparables à celles observées chez l’Homme ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines à 10 semaines Les organes étudiés sont alors matures, limitant les potentiels biais expérimentaux induits par l’irradiation d’organes à des stades de maturation différents. De plus, les animaux adultes supportent également mieux l’anesthésie et l’irradiation.
Caractérisation du comportement de tétée chez le nouveau-né de souris modèle d’une maladie rare en comparaison avec des contrôles et rôle du système ocytocinergique dans ce comportement.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des souriceaux nouveau-nés reçoivent sous la peau un antagoniste de l'ocytocine qui perturbe leur tétée, puis sont tués deux à trois heures plus tard. 496 souris vont être utilisées dans ce projet sur le syndrome de Prader-Willi, 280 dans des procédures déclarées de souffrance légère et 216 de souffrance modérée, avec séparation des souriceaux de leur mère pendant quatre heures pour standardiser leur motivation à téter. Le porteur qualifie chaque injection de nuisance de moins de trois secondes, sans revenir sur le trouble de la tétée qu'il attend de l'atosiban, et les effectifs annoncés dans son texte, 504 souriceaux et 40 femelles, dépassent les 496 individus déclarés dans le tableau des gravités. Les souriceaux sont tués pour le génotypage et la conservation d'organes, les 40 femelles reproductrices le sont parce qu'elles auront environ huit mois et cinq portées derrière elles.
Objectifs
Ce projet porte sur la compréhension des déficits de tétée chez des souris modèles d’une maladie rare chez l’homme (le syndrome de Prader-Willi, SPW) et le rôle d’une hormone, l’ocytocine (OT), comme effet thérapeutique. En effet, il a été montré que l’ocytocine est impliquée dans l’initiation ou le maintien de l’activité de tétée, qu’il y a un dysfonctionnement de cette activité chez les souris modèles Magel2 et que l’administration d’ocytocine rétablit une activité de tétée normale chez ces souris modèle. Ces études précliniques sur souris modèle ont engendré des essais cliniques chez des bébés atteints du SPW qui ont montré une stimulation de l’activité de tétée en présence d'OT. Des travaux précédents suggèrent enfin que chez la souris, l’effet de l’ocytocine est différent entre la première tétée et les tétées suivantes. Les objectifs de ce projet sont donc de caractériser 1) les déficits physiologiques et comportementaux de tétée chez les souriceaux mutants à la naissance, lors de la première tétée et après la première tétée, 2) comment une tétée normale peut être restaurée chez les souriceaux mutants après une administration exogène d’OT juste après la naissance et 3) comment un antagoniste de l’OT peut perturber la tétée chez des souriceaux contrôles. Dans cette étude, nous utiliserons 40 femelles contrôles qui seront réutilisées 3 voire 4 fois pour générer des portées de souriceaux, à l’aide de 10 mâles contrôle et 10 mâles Magel2 au phénotype contrôle (allèle maternel muté mais silencieux). Au total 504 souriceaux et les 40 femelles adultes seront inclus dans une des 4 procédures expérimentales de ce projet.
Bénéfices attendus
Les 3 objectifs permettront d’identifier les altérations sensorielles ou motrices lors de la tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi chez l'homme (SPW), d’identifier le rôle de l’ocytocine (OT) dans la tétée, d’argumenter l’intérêt d’utiliser l’OT dans le traitement de déficit de succion, de définir les conditions optimales pour traiter les souris modèles du SPW. Cette étude aura des retombées sur le traitement des patients PW.
Procédures
Les injections intrapéritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance malgré la durée très courte de cette intervention (
Impact sur les animaux
Les injections IP d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance (durée inférieure à 3 secondes). Les injections sous cutanée d’ocytocine ou d’atosiban sur souriceaux à P0 et P2, et le tatouage des souriceaux de la procédure 1 à P6 peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance (durée inférieure à 3 secondes). Concernant les injections d’atosiban (antagoniste de l’ocytocine) elles peuvent en plus provoquer une perturbation de la séquence de tétée (latence de saisie de la tétine, intensité et durée de la tétée) sachant que les animaux sont euthanasié 2-3 heures après l’injection.
Devenir
L’ensemble des souriceaux utilisés dans ce projet (procédure 1-2-3) seront euthanasiés car des prélèvements post-mortem seront réalisés pour le génotypage et la conservation d’organes potentiellement impliqués dans les mécanismes d’action de l’ocytocine. Les 40 femelles allaitantes servant de support à l’étude du comportement de tétée des souriceaux seront euthanasiés dans la mesure ou elles auront environ 8 mois en fin d’étude et auront eu déjà 5 portées.
Remplacement
Nous travaillons sur la physiologie et la physiopathologie de la tétée qui est altérée dans la majorité des maladies neurodéveloppementales et en particulier dans une maladie rare chez l’homme (le syndrome de Prader-Willi, SPW). Il n’y a, à ce jour, aucune alternative à l’utilisation de mammifères pour conduire ce type d’étude. La stratégie de l’équipe a consisté en particulier à travailler sur des modèles humains dans un cadre thérapeutique et des modèles souris (Magel2) en fonction des questions posées (faisabilité expérimentale) afin d’apporter le maximum de réponses pour comprendre les mécanismes mis en jeu en situation normale et pathologique et, ainsi, mieux traiter les patients atteints de ces troubles précoces de la succion.
Réduction
L'utilisation de souches murines fixées génétiquement permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisés. Les tests comportementaux présentent par nature une variabilité interindividuelle importante, encore plus avec les souriceaux à la naissance ou à P2. Nous utiliserons des femelles qui ont déjà donné naissance à au moins une portée, pour favoriser le comportement maternel et ainsi optimiser le taux de survie des souriceaux. Notre importante expérience pour ces tests depuis plus de 10 ans, appuyée par des tests de Puissance montre qu’il est généralement nécessaire d’utiliser des effectifs de 15-20 animaux par groupe pour valider la démarche statistique, en particulier pour les variables analysées à l’aide de test paramétrique ou non paramétriques en fonction de la normalité de distribution des données. Une réduction du nombre d’animaux expérimentés sera dépendante des résultats que nous obtiendrons et qui conditionneront l’intérêt ou non de pratiquer les expériences proposées en procédure 3 avec injection l’OT. Le fait de ne pas distinguer les souriceaux mâles et femelles dans nos analyses (les travaux antérieurs ne montrent pas d’effet sexe sur le comportement de tétée entre P0 et P2) nous permet de diminuer de moitié le nombre de portées étudiées.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages enrichies avec du matériel de nidification (dôme et coton) et la présence d'objets (cylindre carton). Le bien-être et la bonne santé des animaux adultes est évalué quotidiennement via l'observation de leur aspect (poil hirsute, position voutée, yeux fermés) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation, ou déplacement la pointe des pattes). Les souriceaux qui réaliseront le test de saisie seront isolés de leur mère pendant 4h (afin de standardiser leur motivation à téter). Pendant les 4 heures de séparation de leur mère les 4 souriceaux seront déposés dans un bac approprié, avec une partie de la litière et du nid de la cage maternelle (pour maintenir les odeurs maternelles) et en posant ce bac sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Sachant que seul 4 petits par portée seront testés, la mère reste dans la cage avec n-4 souriceaux (n étant le nombre de nouveau-nés), ce qui permet de diminuer le stress éventuel de la mère. Lors des injections sur les souriceaux à P0 et P2 et lors du tatouage des animaux de la procédure 1 à P6, un antalgique local sera appliquée sur la peau 5 minutes avant le test pour diminuer la sensation de douleur.
Choix des espèces
Cette étude sur les mécanismes neurophysiologiques du comportement de tétée, nécessite d’évaluer des paramètres de comportement de tétée ainsi que des paramètres neuroanatomiques, donc d’étudier des mammifères, mais aussi d’avoir la possibilité de travailler sur des modèles d’animaux modèles de maladies rares chez l’homme (ici souris Magel 2 modèle du syndrome Prader-willi chez l’homme). A ce jour, les rongeurs sont les animaux les plus adaptés à ce type d’étude. Nous étudions l’activité de succion des souriceaux le jour de la naissance (P0) avant et après la première tétée pour mesurer d’éventuels troubles de ce comportement chez les animaux mutants, ainsi qu’à P2 puisqu’il a été montré qu’à ce stade, ces animaux sont les plus discriminants et les plus sensibles au contexte sensoriel (ici l’apport d’OT sur les muqueuses faciales) au cours de la tétée. Nous suivons également un lot de souriceaux durant les premiers 10 jours de vie (observation et prise de poids).
Etablissement et maintien de modèles précliniques en oncologie (poumon, foie, pancréas, rein vessie, prostate et mélanome)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Un taux de prise de greffe de 2 % pour la prostate, 9 % pour le rein, 18 % pour la vessie : 27 500 souris nude vont être utilisées dans des procédures déclarées de souffrance légère, toutes tuées à l'issue, pour établir et entretenir des tumeurs humaines greffées sous leur peau. Chacune reçoit un fragment de tumeur prélevé sur un patient au cours d'une intervention de cinq minutes sous anesthésie, puis le volume tumoral est mesuré au pied à coulisse chaque semaine. Le porteur écrit qu'aucune nuisance particulière n'a été rapportée dans ce type d'expérimentation et que la greffe ne génère pas de douleurs particulières, tout en indiquant que la mise à mort finale sert aussi à "soulager les douleurs éventuelles". Les souris choisies ont cinq à six semaines pour que leur système immunitaire soit encore immature, condition de la prise de greffe, et les lignées tumorales ainsi entretenues seront proposées à des laboratoires publics et privés.
Objectifs
Actuellement, les cancers sont la 2ème cause de mortalité dans le monde avec 19,3 millions de cas pas an/monde, et 10 millions de décès en 2020 an/monde. Dans ce projet, nous nous intéressons à plusieurs cancers, dont la majorité fait partie des cancers qui intéressent plus particulièrement notre laboratoire, à savoir ceux du poumon, du foie, du pancréas, du rein, de la vessie et de la prostate et le mélanome (6,3 millions de cas par an/monde, 3,9 millions de décès par an/monde). Ces cancers sont des pathologies pour lesquelles de nouvelles options thérapeutiques doivent être impérativement développées. La réalisation d'études précliniques nécessite l'utilisation de modèles animaux reproduisant fidèlement les caractéristiques des tumeurs humaines et notamment l’hétérogénéité entre les individus et au sein même de la tumeur. La validation préclinique d'un nouveau traitement passe donc par l'utilisation d'un vaste panel de modèles porteurs de tumeurs aux caractéristiques moléculaires variables. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales en culture qui, d'une part ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ et d'autre part, ne permettent pas de reproduire le microenvironnement tumoral dont le rôle dans le développement tumoral et la réponse aux traitements n'est plus à démontrer. Ainsi, les modèles animaux s'avèrent indispensables pour cette problématique préclinique. L'approche par xénogreffe chez la souris nude de tumeurs humaines obtenues au moment de la chirurgie, apparaît comme le modèle expérimental prédictif de la réalité clinique le mieux adapté aux études en oncologie, et ce sont ces modèles que nous nous proposons de développer dans ce projet.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à développer des modèles précliniques pertinents pour les tests thérapeutiques de molécules nouvelles ou en repositionnement. Ces modèles pourront être utilisés en interne au sein de notre Unité, ou en externe pour le public ou le privé. Les retombées de notre projet ont donc des implications potentielles très importantes pour la clinique, et permettront ainsi d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement de ces cancers. Du fait que les patients deviennent généralement résistants aux thérapies anti-tumorales classiques, il y a un besoin urgent de découvrir, de développer et valoriser de nouvelles alternatives thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients notamment aux stades avancés. Ils permettront également d’appréhender les mécanismes de résistance aux thérapies, qui sont souvent un frein au développement de thérapies efficaces, et qui sont en grande partie dues à l’hétérogénéité tumorale, que les autres modèles, cités plus haut, ne peuvent pas reproduire.
Procédures
Les animaux recevront un implant tumoral sous-cutané au cours d’une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. L'expérimentation durera 5 minutes. Le volume tumoral sera suivi par mesure hebdomadaire à l’aide d’un pied à coulisse électronique.
Impact sur les animaux
Comme il s’agit de greffer des petits morceaux de tissus tumoraux, il est possible qu’il y ait une douleur au site d’incision, et une infection au point de suture. Une inflammation au site d’injection est aussi possible. Par ailleurs, la xénogreffe étant située en haut du dos, elle n’engendre aucune gêne de déplacement des animaux et ne génère pas non plus de douleurs particulières ; Les modèles de xénogreffes dérivées de patients (PDX, pour Patient-Derived tumor Xenografts) existent depuis quelques décennies, pour virtuellement tous les cancers, et ils sont développés par de nombreux laboratoires publics comme privés, en France, en Europe et à travers le monde, sans que des nuisances particulières aient pu être reportées. Aucun impact sur le comportement n’a été non plus répertorié dans ce type d’expérimentations.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expérimentations afin de collecter un maximum de tissus afin de procéder à des analyses complémentaires et soulager les douleurs éventuelles.
Remplacement
Le cancer se caractérise par une grande variabilité cytogénétique entre les individus et hétérogénéité au sein même de la tumeur. La réalisation d'études précliniques fiables nécessite l'utilisation de modèles reproduisant fidèlement ces caractéristiques des tumeurs humaines. Or, les modèles d'étude se basant sur les lignées cancéreuses clonales ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. De même, pour les systèmes de culture 3D en cours de développement qui ne permettent pas encore d’obtenir des résultats projetables à l’homme. Par conséquent, aucune méthode de remplacement pertinente n'existe à ce jour. Il est donc indispensable d’utiliser le modèle de xénogreffe de tumeur de patients, seul capable de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine.
Réduction
Les taux de prise de xénogreffe en primo-implantation pour chaque type tumoral (indiqué chapitre 3.3.2.2 sont : Poumon, 29% ; Foie, 38% ; Pancréas, >50% ; Rein, 9% ; Vessie, 18% ; Prostate, 2% : Mélanome, 27%, pouvant légèrement différer suivant les sources bibliographiques et les caractéristiques des tumeurs utilisées). Notre volonté est de pouvoir disposer et proposer entre 30 et 40 modèles PDX par type de cancer. Un large panel est nécessaire pour tenir compte de l’hétérogénéité tumorale, qui est très important dans les réponses disparates aux thérapies existants, en repositionnement et très probablement aux thérapies émergentes à venir. Par conséquent, nous estimons devoir récupérer environ 50 tumeurs par an pour chaque cancer, soit un total d'environ 350 tumeurs (environ 1750 tumeurs sur 5 ans). Il s’agit donc d’un nombre minimal d'animaux nous permettant d'une part d'optimiser la prise de greffe et d'autre part d'obtenir assez de matériel à la fois pour le maintien du modèle et les analyses/expériences éventuelles ultérieures. Par ailleurs, étant limité par la quantité de matériel biologique, le prélèvement initial (issu du patient) sera greffé au maximum sur 10 souris (entre 2 et 10 souris). Pour l'entretien du modèle, du passage 2 au passage 10 ; 5 souris par passage et par modèle sont suffisantes pour atteindre l'objectif du projet. En conclusion, 27500 animaux seront requis pour la durée du projet. Nous avons ainsi réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les différentes étapes du projet. Le but étant d’établir des modèles stables, aucune analyse statistique n’est nécessaire à cette étape. Ces modèles serviront aux tests thérapeutiques par des laboratoires publique et/ou privées ainsi que par notre laboratoire.
Raffinement
Le raffinement sera assuré par un enrichissement des cages pour le confort des animaux (des bâtons à ronger pour limiter les querelles ; des carrés de coton pour une nidification ; des igloos, permettant le jeu et le repos). Les souris seront nourries et hébergées en groupe ; elles ne seront séparées qu'en cas de comportement agressif avec induction de plaies. Nous diminuerons la douleur et l'angoisse liées à la xénogreffe en opérant sous anesthésie générale, avec une anesthésie locale au site d’implantation, et en appliquant une analgésie péri- et post-opératoire. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la xénogreffe et pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. De plus, nous avons établi des points limite qui mettront fin à l’expérimentation en cas de souffrance et d’inconfort des animaux.
Choix des espèces
Les pathologies cancéreuses en général se caractérisent par une grande variabilité cytogénétique (variation de l’ADN des cellules tumorales) entre les individus et sont généralement hétérogènes au sein même de la tumeur. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales qui ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. Par ailleurs, les modèles expérimentaux in vitro ne prennent pas en compte le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. Ainsi, malgré le développement de cultures 3D dont la mise en place reste difficile, les modèles animaux s'avèrent donc indispensables pour la recherche translationnelle en oncologie. Le modèle expérimental décrit dans ce projet nécessite l'utilisation d'animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d'un tissu étranger. Les greffes seront réalisées sur des souris jeunes âgées de 5 à 6 semaines afin d’avoir un système immunitaire encore très peu mature, permettant d’assurer une prise de greffe optimale.
Etudes Pharmacologiques visant à demontrer l’innocuité, l’immunogenicité et l’éfficacité d’immunothérapies anti-cancéreuses chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe implante une tumeur sous la peau du flanc sur animal vigile, puis mesure cette tumeur deux à trois fois par semaine pendant qu'elle grossit, avec gêne à la mobilité, frottement, ulcération et nécrose possibles. Le porteur écrit qu'aucun dommage majeur n'est attendu, les produits testés étant déjà évalués chez l'être humain dans un essai clinique qu'il référence. Ces études servent à compléter des dossiers réglementaires auprès de l'ANSM et de la FDA, puis une demande d'autorisation de mise sur le marché.
Objectifs
Le Projet est une étude Préclinique de Pharmacologie expérimentale. Il a pour principal but de valider le mécanisme d'action de différents candidats Immunothérapeutiques via l'étude de l'activité antitumorale et de la réponse immunitaire induite sur souris porteuses de tumeurs. Nos candidats immunothérapeutiques seront administrés sous forme de cellules à récepteur antigénique chimérique (CAR), peptidique ou sous forme d'anticorps. Ces candidats seront spécifiques de différents antigènes de tumeurs déterminés par des études de recherche cognitive.
Bénéfices attendus
Ce projet de Pharmacologie s'inscrit dans une phase de développement préclinique de différents candidats immunothérapeutiques destinés à lutter contre les différentes formes de cancer chez l'Homme. Ces études, nous permettront la complétion de dossiers réglementaires pour obtenir l'accord de l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM (France) ou FDA (US)) pour évaluer l'efficacité de nos candidats immunothérapeutiques dans des phases cliniques sur des patients atteints de cancers. D'autre part elles seront constitutives d'une partie du dossier de demande d'autorisation de mise sur le marché (AMM). En effet, ces produits d'immunothérapie devront répondre à des normes internationales de qualité scientifique et clinique qui seront étroitement évaluées par les autorités de santé pour la délivrance de l'AMM.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à une procédure comprenant l'identification (animaux vigiles, 1 fois, 1 minute/animal), des pesées (animaux vigiles, 2 à 3/semaine, 1 minute/animale), des traitements (animaux vigiles, en injection sous cutanée, intrapéritonéale ou intraveineux en fonction du produit testé et du schéma de traitement qui est à déterminer : dose unique ou dose répétée), d'implantation de tumeurs sous cutanées (animaux vigiles, 1 fois, 1 minute/animale) et de mesures tumorales (animaux vigiles, 2 à 3 fois/semaine, 1 minute/animale). Pour certaines études, un suivi de la réponse dans le sang pourra être envisagé. Pour cela un prélèvement de sang périphérique sera effectué à la veine retro-mandibulaire. En fonction de la cinétique, au maximum une fois par semaine en respectant les volumes autorisés : 0.5% du poids de l'animal pour un intervalle d'une semaine, 0.75% pour 2 semaines et 1% pour 3-4 semaines. Les animaux seront ensuite mis à mort pour le prélèvement de sang et organes en point finale pour les évaluations pharmacologiques ex vivo.
Impact sur les animaux
Les agents thérapeutiques utilisés au cours de ce projet ayant déjà montré leur innocuité chez la souris sont en cours d'évaluation chez l'Homme (NCT05672459). De ce fait, aucun dommage majeur / effet indésirable lié au traitement n'est attendu dans le cadre de nos études. Cependant, une nuisance qui sera surveillée et contrôlée par le suivi et le respect des points limites, peux intervenir après injection de cellules tumorales et développement de la tumeur en sous cutanée sur le flanc de la souris (gêne à la mobilité lors du grossissement de la tumeur, frottement ulcération et nécrose). Il est important de noter que l'expérimentation animale sera utilisée de manière rationnelle et selon les réglementations en vigueur qui garantissent un traitement éthique de l'animal de laboratoire (application des 3R), avec pour objectif le raffinement, la réduction de l'utilisation de l'animal de laboratoire ou son remplacement par des modèles in vitro (ou autres) lorsque cela est possible.
Devenir
En fin d'étude les animaux seront mis à mort et certains organes (rate, poumons, foie, ganglions, sang, cerveau, tumeurs) seront prélevés pour des études de Pharmacocinétiques et de Pharmacodynamie.
Remplacement
Dans un premier temps, les différents candidats immunothérapeutiques feront l'objet d'une sélection et d'un développement préclinique in vitro, sur divers modèles cellulaires, afin de confirmer leur fonctionnalité. Par la suite, les modèles murins ayant leurs propres limitations pour les études de toxicologie sur des cibles humaines, des méthodes in vitro et/ou ex vivo seront mises en place avec l'utilisation notamment de culture 3D organoïdes, cellules primaires humaines ou banque de protéines d'expression sur modèles cellulaires.
Réduction
Chaque étude fera l'objet d'une rédaction de protocole expérimental, afin de garantir l'optimisation des expériences. L'optimisation du nombre d'animaux : entre 5 et 10 souris par groupe seront utilisées pour évaluer et interpréter l'efficacité antitumorale des différents candidats. La réduction des répétitions inutiles et optimisation du nombre d'animaux contrôles entre les différentes expériences réalisées dans les mêmes conditions. Les critères d'optimisation du nombre d'animaux contrôles vont dépendre du design de l'expérience (nombre de groupes expérimentaux) et des résultats des expériences précédentes / antérieures. La réduction du nombre d'animaux ne devra néanmoins pas se faire au dépend de la fiabilité des résultats. Lorsque cela est possible, et principalement pour les souris provenant de fournisseurs agréés, l'utilisation d'animaux homogènes (même sexe, même âge, même état sanitaire) sera privilégiée. Cette précaution sera prise afin de réduire autant que faire se peut la variabilité d'un individu à l'autre. Le nombre d'animaux utilisé dans les études a été déterminé pour permettre une étude statistique non paramétrique. Pour les études qui impliquent la comparaison de 2 groupes nous utiliserons un test de Mann-Whitney et pour les études impliquant des comparaison multi-groupes, nous utiliserons un test de Kruskal-Wallis avec correction de Dunn.
Raffinement
Utilisation des mesures de raffinement suivantes chaque fois que possible : - Procédures non invasives - Assurer les soins pré-, per- et postopératoires adéquats - Recours à l'anesthésie / analgésie - Application des points limites établis préalablement - Utilisation des procédures d'euthanasie appropriées - Utilisation de litière chirurgicale pour limiter les frottements/blessures/ulcérations de la tumeur lié à la litière - Utilisation de portoirs et cages ventilées - Enrichissement du milieu (maison, matériel de nidification) - Désinfection à l'aide de désinfectant iodé - Application d'Aluspray en aide à la cicatrisation
Choix des espèces
Les différents candidats immunothérapeutiques seront d'abord évalués par des tests cellulaires in vitro pour confirmer leur fonctionnalité et leur innocuité. Néanmoins, il n'existe pas actuellement de tests de remplacement ou d'alternatives à l'utilisation d'animaux de laboratoire pour étudier la réponse immunitaire et l'efficacité antitumorale. Ces deux critères sont essentiels et critiques pour évaluer le potentiel thérapeutique réel des immunothérapies développées. Aujourd'hui, la souris est le principal modèle utilisé / étudié en recherches anticancéreuses et en immunologie. Pour notre projet, nous utiliserons des modèles de souris, dans lesquelles de nombreux modèles de tumeurs ont été isolés / développés et sont parfaitement caractérisés. Souris adultes entre 5 et 10 semaines : âge compatible avec le monitoring d'une réponse immunitaire et l'implantation de cellules tumorales en sous cutanées ou injection intraveineuse.
Production et élevage de modèles pathologiques rongeurs induits par une alimentation spécifique.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 5000
Rendus obèses et diabétiques par un régime riche en matières grasses avant même le début de toute expérience, 10 000 souris et 5 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le protocole tient à peu de chose, une pesée pour tous et un ou deux prélèvements sanguins pour moins d'un pour cent d'entre eux, le reste étant les signes cliniques que l'alimentation installe. Le porteur décrit un service, ces 15 000 rongeurs étant produits en fonction des "besoins stricts de chaque scientifique" et expédiés à qui les commande. Ceux qui ne partent pas sont tués, un animal "non standard" ne pouvant pas passer d'un projet à un autre si les spécifications diffèrent.
Objectifs
Dans le but d’étudier certaines maladies, il peut être nécessaire d’induire une modification de métabolisme et/ou de paramètres physiologiques en modifiant le régime alimentaire des animaux. Par exemple, une alimentation riche en matières grasses a été liée à un grand nombre de maladies, dont l'obésité, les maladies métaboliques et inflammatoires. Ce projet vise à produire des modèles animaux pathologiques avec des modifications physiologiques induites par l’alimentation dans le but de répondre aux attentes des chercheurs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont le développement pour la communauté scientifique d’un modèle diabétique/d’obésité permettant de mieux comprendre et étudier ces phénomènes pathologiques qui touchent à la fois l’humain et l’animal, et de chercher des traitements à ces maladies et leurs comorbidités.
Procédures
Microprélèvements (moins de 1% des animaux, durée du geste : environ 1 minute), prise de sang (moins de 1% des animaux, durée du geste : environ 2min), pesée (100% des animaux, durée du geste : environ 30 secondes par souris et 1 minute par rat). Un animal subira 1 seule pesée et au maximum deux prélevements sanguins pendant l’étude.
Impact sur les animaux
Signes cliniques associés à l’obésité et au phénotype diabétique, stress et douleur associés aux prélèvements sanguins, stress associé à la pesée, stress associé à la contention.
Devenir
Les animaux sont mis à mort car il s’agit d’animaux non standards, suivant un protocole de nourissage et de prise de poids spécifiques aux attentes des scientifiques. On ne peut pas réutiliser les animaux d’un projet pour un autre projet à moins que les spécifications soient identiques ou les animaux sont expédiés chez le scientifique.
Remplacement
Ces modèles pathologiques sont issus de mécanismes complexes avec des processus de régulation impliquant l’ensemble de l’organisme. Ils permettent d’observer les conséquences des pathologies dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques et qui ne peuvent être remplacés par aucune méthode alternative.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et à prendre les deux sexes. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal afin d’adapter les traitements et de diminuer la morbidité et mortalité éventuelle.
Raffinement
Les animaux ont accès à de l’enrichissement dans leurs cages (mouchoirs et frisure de carton). Les animaux sont manipulés avec des méthodes à faible stress (manipulation par le corps). Afin de limiter le stress lors des prises de sang, dès que possible, les microprélèvements sont favorisés au lieu de prise de sang. Des points limites spécifiques et précoces ont été définis et seront appliqués.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces très utilisées en recherche. Ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables. Ce sont les espèces qui permettent à la communauté scientifique de réaliser un certain nombre d'études en recherche et développement grâce aux données historiques et à leur connaissance de ces modèles animaux. Stade adulte compte tenu que l’aliment est donné aux animaux après sevrage (généralement à 6 semaines), comme le demande le modèle pathologique.
Effet de la qualité de la lumière et de la couleur du bac d’hébergement sur la pigmentation de la seiche
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Élevées sans aucune cachette sous une lumière colorée de 3 000 lux douze heures par jour, 240 jeunes seiches européennes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique qu'il ne peut pas enrichir les bacs, un abri permettant aux animaux d'échapper à la lumière et ruinant du même coup l'expérience. Toutes sont tuées par refroidissement progressif, dix à quinze minutes entre l'anesthésie sous six degrés et la mort sous quatre, pour prélever et fixer leurs tissus. Parmi les bénéfices annoncés, le projet doit "optimiser les conditions d'élevage et d'hébergement" d'une espèce dont le porteur précise que les standards restent en cours d'élaboration.
Objectifs
Parmi les animaux aquatiques, les céphalopodes montrent des capacités de camouflage complexes et uniques. Le camouflage est permis par les motifs colorés qui sont dynamiques et changeants. Les couleurs sont dues aux pigments contenus dans les chromatophores, organes dont l’activité est contrôlée directement par le cerveau, permettant ainsi des modifications rapides des motifs. Notre espèce est la seiche européenne dont le développement et les premiers mois de vie se déroulent en milieu côtier. La pigmentation de la peau par les chromatophores a lieu dès la phase embryonnaire et les motifs se complexifient après éclosion, en lien avec les facteurs environnementaux directs, comme la lumière et le fond sur lequel elles vivent. Ce projet a pour objectif de tester différents facteurs comme l’effet d’un éclairement de “couleur” différente et la couleur du bac sur le niveau de pigmentation des animaux au cours de leur développement après éclosion. Par une expérimentation conduite sur des juvéniles de seiche, nous déterminerons si la “couleur” différente de la lumière d’éclairement et la couleur du bac modifient 1) les régulations moléculaires en lien avec la synthèse des pigments et 2) la couleur générale adaptée au fond et au type de lumière. Ce projet permettra une meilleure connaissance des adaptations et des effets des changements environnementaux sur le cycle de vie de ces animaux marins, il permettra d’élaborer des hypothèses évolutives et fonctionnelles sur l’influence du facteur couleur du bac et couleur de la lumière au cours du développement, chez l’embryon et chez le juvénile après éclosion. Ce projet permettra également d’optimiser les conditions d’élevage et de maintien des juvéniles Des caméras situées au-dessus des bacs permettent d’évaluer l’intensité de pigmentation des juvéniles en expérimentation par acquisitions d’images.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’identifier si la couleur de la lumière et la couleur du bac sont des facteurs importants dans le contrôle de la mise en place de la pigmentation. L’approche par l’expression des gènes permet de tester les régulations moléculaires mises en place par l’animal face à son environnement et de les corréler avec la pigmentation observée (plus ou moins foncée) et son comportement de camouflage. Il a été montré chez des poissons que la “couleur” d’éclairement et la couleur du bac entrainaient des différences de pigmentation. Nous avons observé une pigmentation plus importante des jeunes seiches élevées sur bac de couleur noire et nous souhaitons confirmer ou infirmer cette observation. Tester chez la seiche l’ effet éventuel de la “couleur” de lumière et de la couleur du fond permettrait d’apporter des éléments de réponse à la mise en place et la régulation des motifs colorés, qui conditionnent chez l’adulte la qualité du camouflage. En plus de mieux comprendre les facteurs conditionnant la mise en place des motifs colorés, ce projet permettra d’optimiser les conditions d’élevage et d’hébergement et le bien-être animal de cette espèce pour laquelle les standards d’élevage sont en cours d’élaboration.
Procédures
Les animaux sont soumis à des éclairages différents (photopériode de 12h de lumières et 12h de nuit). Les animaux ne subissent aucune intervention avant leur mise à mort. Lorsqu’ils sont retirés des bacs à l’épuisette, ils sont immédiatement transférés dans un récipient. La mise à mort dérogatoire par le froid amène progressivement les animaux vers une anesthésie (
Impact sur les animaux
Trois prélèvements manuels à l’épuisette d’une durée de 10 à 20 secondes sont prévus par aquarium sur toute la durée de l’expérimentation, ce qui peut occasionner un stress passager. En l’absence de cachettes, on ne peut exclure que l’éclairement appliqué avec une intensité peu élevée d’environ 3000 lux et le type de couleur d’éclairement puissent occasionner une nuisance.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus. Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique la mise à mort des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréversibles (pas de survie après prélèvement des organes/tissus d’intérêt).
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à comprendre la mise en place chez la seiche des motifs colorés qui constituent un élément fort du comportement de camouflage. Le développement requiert l’implication des organes du système nerveux (entre autres) qui contrôle ces éléments cutanés. Il s’agit donc d’un projet nécessitant un organisme entier intègre. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle
Réduction
La mise en place de collecteurs (support de ponte artificiel) relevés tous les jours dans le milieu naturel permet de récolter le nombre d’œufs nécessaires pour réaliser cette expérimentation en s’affranchissant de la conservation d’un stock de géniteurs en laboratoire. Il n’y a donc pas de maintenance de géniteurs sauvages. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Expérimentalement et statistiquement, le nombre de 10 animaux par groupe est un minimum afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique.
Raffinement
Les juvéniles éclosent dans leur aquarium d’origine (où ont été déposés les œufs); ils ne sont donc pas déplacés. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée (petites crevettes et mysis sp.) deux fois par jour (matin et après-midi). L’acquisition de données relatives à la pigmentation des animaux est réalisée sur photos prises par une caméra directement installée au-dessus du bac afin de limiter l’intervention humaine. Les rations sont réévaluées quotidiennement pour adapter la quantité d’aliment distribué à la biomasse de l’aquarium. Il n’est pas possible d’ajouter un enrichissement physique sous la forme de cachettes diverses (pièces en plastique) car cela contrecarrerait les objectifs du projet en permettant aux animaux de ne plus être sous l’influence de la lumière. L’éclairement est appliqué sur une période de 12h ; l’intensité de l’éclairement est d’environ 3000 lux grâce à la mise en place d’un variateur permettant la modulation de l’intensité. La mise en route ou l’arrêt de l’éclairement s’effectue sur une période de 30 min. Le bien être des animaux est évalué quotidiennement par une feuille de suivi permettant de quantifier l’expression de points limites en expérimentation.
Choix des espèces
Les céphalopodes sont les seuls mollusques possédant des capacités cognitives et des comportements élaborés. La seiche européenne pond des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, il n'y a pas de larves chez les seiches et les juvéniles se développent en 2 mois maximum ce qui permet de réaliser des observations. Les individus du projet sont des juvéniles après éclosion, pour évaluer la pigmentation et son contrôle nerveux, l’animal étant en lien direct avec les facteurs environnementaux.