Oncologie

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de la bactérie responsable de la tularémie et subissent des prises de température rectale, pour comparer la virulence de mutants bactériens à une souche de référence. Le porteur affirme que l'analyse in vivo est "indispensable" et que les modèles in vitro ne miment pas la complexité des interactions hôte-pathogène. Toutes les souris sont mises à mort pour mesurer la multiplication bactérienne dans leurs organes.

Objectifs

La tularémie est une maladie zoonotique (c'est à dire que se transmet des animaux vers l'homme) qui est fréquente en Scandinavie (pays du Nord de l'Europe: Norvège, Suède, Finlande). Cette maladie se traduit par un syndrome de type grippal (c'est à dire ressemblant beaucoup à une grippe) mais peut évoluer vers des formes sévères voire létales (c'est à dire entraînant la mort). Cette maladie est une maladie infectieuse causée par un microbe (ou microorganisme) et plus précisément une bactérie. Cette bactérie est dite pathogène car elle peut causer une maladie. L'objectif du projet est de valider l'importance de certains facteurs d'une bactérie pathogène dans un modèle murin (i.e. chez la souris) de la maladie. Pour cela des mutants bactériens sélectionnés et validés au préalable dans des expériences in vitro seront testées en compétition avec une bactérie virulente de référence pour déterminer leur virulence dans la souris. L'objectif est de vérifier le role clef des facteurs testés en vue de faire progresser la connaissance sur cette bactérie et sur la maladie et à long terme de les cibler par des médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de faire progresser la connaissance sur une bactérie pathogène qui cause une maladie appelée tularémie. Cette maladie peut tuer des humains et touche une centaine de patients par an en France et beaucoup plus en Scandinavie. A terme ce projet devrait permettre de mettre en place des thérapies innovantes pour lutter contre cette bactérie.

Procédures

prise de température rectale (durée < 1min, 3 fois: jour 0 et 24h, 30h, J0 sous anesthésie gazeuse, 24h-30h animaux vigiles, pour tous les animaux) Injection de bactéries sous la peau (durée < 1 min) sous anesthésie gazeuse (c'est à dire que les souris sont endormies pendant cette procédure), 1 fois à j0 pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

L'injection de bactéries sous la peau sous anesthésie gazeuse est une source potentielle de douleur locale et/ou de stress transitoire (qui ne perdure pas) pour les animaux. Pendant les deux jours d'infection, les souris pourraient resentir les effets de l'infection même si les doses et les temps d'étude devraient limiter les effets indésirables.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour anayse de la multiplication des bactéries dans les différents organes en vue de faire progresser la connaissance sur la bactérie et la maladie qu'elle cause et à long terme de développer des traitements.

Remplacement

L'analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet et valider l'importance des facteurs étudiés dans la virulence de la bactérie. En particulier, les modèles in vitro étudient la réplication de la bactérie dans un seul type de cellule dans un contexte non-inflammatoire et ne peuvent pas mimer la complexité des interactions hôte-pathogène rencontrées lors d'une infection.

Réduction

Les expériences in vivo arrivent en fin de projet après une sélection fine des mutants in vitro de façon à limiter le nombre de mutants à tester in vivo et donc le nombre d'animaux. De plus, la technique utilisée dite "index de compétitivité" diminue la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Finalement, la chronologie des expérimentations a été définie de façon à ajuster et à limiter le nombre d'animaux requis pour obtenir une information fiable.

Raffinement

Nous prévoyons les points de raffinement suivants: 1) anesthésie lors de l'inoculation des bactéries 2) Les points limites sont définis spécifiquement pour ce projet de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux 3) les doses de bactéries inoculées sont non-létales sur la durée de l'expérimentation et ont été choisies avec soin sur la base d'expérimentations passées et de la litérature 4) les signes de fièvre sont suivis régulièrement par la prise de température 5) en cas de fièvre, un analgésique est administré aux souris avec un suivi de l'efficacité du traitement.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé est le modèle standard (car il mime très bien la maladie humaine) dans le domaine (comme en atteste de nombreuses publications scientifiques validées par des pairs) pour tester la virulence de mutants bactériens. Les animaux utilisés seront de 6 à 12 semaines (age adulte pour la souris avec donc un système immunitaire mature).

1 050 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'ablation d'un rein, des administrations répétées de composés jusqu'à deux fois par jour, des prélèvements sanguins, des échographies cardiaques et des séjours en cage métabolique, pour mettre au point un modèle de maladie rénale chronique. Le porteur qualifie la chirurgie d'induction d'invasive et douloureuse et décrit un stress chronique lié aux gestes répétés. Il reconnaît que des modèles in vitro à base de sphéroïdes ou d'organoïdes sont en développement dans la société, tout en concluant à l'usage du rat, la finalité restant le développement de thérapies pour les patients.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques peuvent avoir diverses origines : inflammatoires, insuffisances aigues, associées au diabète, infectieuses, …. Elles ont pour conséquence d’induire une perte de fonctionnalité rénale dont les traitements envisagés actuellement se résument à la dialyse ou la transplantation rénale. De plus, ces maladies peuvent induire des altérations cardiaques graves menant à l’insuffisance cardiaque. L'objectif de ce projet est de développer des modèles mimant les maladies rénales chroniques pour permettre le développement de thérapies moins impactantes pour la vie du patient que celles dont on dispose actuellement.

Bénéfices attendus

Seuls la dialyse ou la transplantation rénale sont envisagées pour traiter ces maladies rénales. Ce sont des traitements lourds qui impactent de façon importante la vie du patient. Ainsi, il est nécessaire de trouver de nouveaux axes thérapeutiques pour éviter d’arriver à ces thérapies relativement lourdes. La mise en place de ce type de modèle préclinique le permettra. De plus, des thérapies ciblant les conséquences au niveau du cœur peuvent être également testés.

Procédures

1 – l’induction de l'insuffisance rénale aigue : La chirurgie consistant à retirer un rein se déroule en plusieurs étapes et dure 1h30. 2 - Les composés à tester/de référence seront administrés jusqu’à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutannée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié (pendant maximum 2 semaines). L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. 3- Des prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (quelques jours avant la chirurgie, puis 24h, 48h et 72h après la chirurgie et une fois par semaine pour les projets chroniques ) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. 4 - Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies et des mesures de pression artérielle sur animal anesthésié en début et fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration du rein (GFR) en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang.)

Impact sur les animaux

1 – l’induction d'une insuffisance rénale aigue : cette chirurgie est invasive et douloureuse pour l’animal. En induisant la pathologie, une différence de production d’urine peut être attendue. De la même façon, une différence de prise hydrique peut être attendue. 2 - Les prélèvements de sang peuvent engendrer des hématomes, les sites de prélèvements seront observés de près. La mesure de débit de filtration du rein nécessitant une anesthésie isoflurane et une injection intraveineuse à la veine caudale entraine des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. L'echographie et la mesure de la pression artérielle sont non invasives mais nécessite une anesthésie légère, le reveil des animaux sera surveillé de près. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal. 3 – Les traitements : le geste de traitement, i.e. gavage, injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, réalisé à répétition génèrent un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé : apathie, prostration, agressivité, etc.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le rein, paramètres métaboliques et de fonction rénale dans le sang...)

Remplacement

L’insuffisance rénale aigue pourrait être étudiée à partir de culture de cellules rénales in vitro mais le modèle est discutable car il ne mime par réellement l’organisation cellulaire du rein. Des modèles in vitro à partir de système sphéroïde ou organoïde sont en cours de développement au sein de la société.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. D’autre part, nous réduisons le nombre d’animaux du groupe de rats sains (non néphrectomisés).

Raffinement

Lors de la chirurgie et en post-chirurgie, des stratégies analgésiques locales et systémiques seront utilisées pour réduire la douleur. L'animal est placé sur tapis thermorégulé avec sonde rectale de température avec mesure instantanée de la température corporelle, garantissant le maintien de l'animal à 37°C pendant la chirurgie. Un concentrateur à dioxygène est couplé à l'appareil à isoflurane pour favoriser la respiration des animaux anesthésiés. Les rats seront hébergés par deux pour respecter les normes d’hébergement compte-tenu du poids et puisque le rat est un animal social. De l’enrichissement est également ajouté dans les cages d’hébergement afin de répondre aux différents besoin des rats. Une double litière pourra être déposée en fond de cage pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. Après la chirurgie, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids, comportement) par les personnes qui ont réalisé la procédure et la SBEA. Après la chirurgie et jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif de la zone opérée ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé par le personnel qui a réalisé la procédure chirurgicale et la SBEA. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points suivants : hypothermie, prostration, perte de poids >20%, ce dernier sera euthanasié. En raison de l’évolution rapide de la pathologie, les animaux seront visités de façon biquotidienne et des mesures d’approches et de préhension seront adaptées pour ne surprendre et stresser l'animal. En cas de déshydratation, un gel d'hydratation peut être ajouté ou une injection sous cutanée de solution saline peut être envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques. Une phase d'habituation sera réalisée pour la mise en cage à métabolisme pour limiter le stress de l'animal. De la même façon, la prise hydrique sera monitoré plusieurs fois par semaine.

Choix des espèces

L’utilisation de rat permet d’étudier à la fois le pan rénal et le pan cardiaque de façon robuste. De plus, les traits de la pathologie sont comparables à ce qui est observé chez l’homme. Les animaux utilisés seront étudiés à l’âge adulte afin que la maturation de leur physiologie (hormonale, immunitaire) soit stable et garantir une homogénéité des résultats.

2 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent notamment une séparation maternelle quotidienne de trois heures pendant les trois premières semaines de vie, l'injection d'un composé perturbant la puberté, des prélèvements vaginaux quotidiens et jusqu'à seize prélèvements sanguins par coupure de la queue. Le porteur décrit la séparation maternelle comme une "situation de fort stress pour la mère et les petits" et reconnaît que les prélèvements répétés génèrent douleur et stress. Il affirme que l'animal vivant "ne peut être remplacé" faute de conserver le lien cerveau-gonades et qu'il n'existe "pas d'autre méthode ni de modèle alternatif" pour étudier l'âge de la puberté.

Objectifs

La puberté est une étape cruciale du développement qui permet d’assurer le maintien des espèces par la reproduction sexuée. Cette période se caractérise par l’acquisition de caractères sexuels secondaires et dépend de l’activation de neurones localisés dans une région spécifique du cerveau : l’hypothalamus. Une fois activés, ils sécrètent dans le sang une neurohormone : la GnRH ou gonadolibérine et sont donc appelés neurones GnRH. Cette sécrétion de GnRH est l’élément déclencheur de la maturation des gonades et de la puberté. L’activation des neurones GnRH, jusque-là en dormance, est donc une étape clé dont le moment est finement régulé. En général, la puberté débute entre 8 et 13 ans chez la fille, et entre 9 et 14 ans chez le garçon. Cependant, certains enfants souffrent de dysfonctionnement du développement cérébral altérant l’activation des neurones GnRH et entrainant une puberté qui survient trop précocement (puberté précoce centrale) ou bien qui ne démarre pas. Les causes de ces altérations sont encore largement méconnues. Notre projet a pour objectifs d’identifier les mécanismes permettant de contrôler l’activation des neurones GnRH et leurs perturbations lors de troubles de la puberté. Pour cela nous utilisons tout d’abord des approches in vitro sur des cultures de cellules neurales humaines reproduisant des mutations retrouvées chez des enfants atteints de troubles pubertaires soit des cellules directement issues de ces patients. Néanmoins, cette approche n’est pas suffisante car elle ne permet pas une observation intégrée. L’analyse in vivo de l’activité du système GnRH chez la souris est donc nécessaire afin de déterminer 1/ l’impact de l’environnement et 2/ le rôle des gènes mutés identifiés chez les patients, sur le fonctionnement des neurones GnRH, l’initiation de la puberté et les capacités reproductives. Ce projet permettra in fine de comprendre les mécanismes d’activation des neurones GnRH et le rôle combiné des gènes et de l’environnement sur l’âge de la puberté. Les résultats apporteront des données précieuses sur le contrôle par le cerveau de la reproduction et plus généralement renforcera nos connaissances du développement cérébral durant l’enfance.

Bénéfices attendus

Les capacités de reproduction s’acquièrent lors de la puberté, un moment clé du développement qui permet la transition de l’enfance à l’adulte. Il existe différents troubles pubertaires dont les répercussions peuvent être variables : allant de l’altération de l’âge de la puberté (précoce ou retardée) avec des retombées importantes sur la croissance et la psychologie de l’enfant, à des atteintes plus graves conduisant à l’infertilité. Nombreuses de ces atteintes ont pour origine un défaut du développement cérébral et plus précisément touchent le fonctionnement des neurones GnRH. Pour la plupart les causes et les mécanismes de ces dysfonctionnements restent incertains. Notre projet se base sur une approche multifactorielle (environnement externe et génétique) et interdisciplinaire alliant recherche clinique et fondamentale. Il permettra 1/ de développer des modèles murins reproduisant des troubles de la puberté similaires à ceux observés chez l’enfant 2/ d’identifier des facteurs génétiques et environnementaux important pour la puberté et la reproduction et 3/ de déterminer les mécanismes d’activation des neurones GnRH et ainsi de mieux contrôler la puberté et le moment de son initiation. Puisque la mise en place des neurones GnRH et leur activation font parties du développement cérébral, nos découvertes pourront apporter des connaissances plus larges et précieuses pour la compréhension du neurodéveloppement et de ces atteintes lors de pathologies neurologiques. Ce projet aura des retentissements importants dans le domaine de la santé publique puisqu’il y a une baisse de l’âge de la puberté depuis le milieu du 19ème siècle dont les causes restent incomprises. De nombreux facteurs semblent pouvoir être impliqués, le surpoids, les perturbateurs endocriniens et l’adoption. Notre projet permettra d’apporter des réponses cruciales sur les rôles de ces différents paramètres sur le développement cérébral et l’initiation de la puberté. Il est important de souligner que notre projet aura des impacts multiples et interdisciplinaires. En effet, plusieurs études ont montré que les pubertés précoces chez la femme sont plus souvent associées à la survenue de pathologies communes chez l’adulte telles que le cancer du sein ou le diabète, suggérant qu’il puisse exister des mécanismes communs. Ce projet pourrait ainsi identifier ces mécanismes et participer à la mise en place d’actions de prévention.

Procédures

Ce projet vise à déterminer le rôle de l’environnement et des gènes dans l’âge de la puberté et la reproduction. 4 facteurs seront testés : l’injection d’un composé qui perturbe le fonctionnement des régions cérébrales impliquées dans la puberté et la reproduction, la séparation maternelle et deux mutations génétiques. Les interventions seront réalisées sur des groupes d’animaux différents : -Injection unique ou deux injections espacées de 5h à 6h d’un composé qui perturbe la puberté à 8 jours après la naissance -Séparation maternelle quotidienne pendant 3h de 1 jour après la naissance à 21 jours de vie -Manipulation, observation et pesée quotidienne de 8 jours après la naissance jusqu’à l’âge adulte : Analyse de l’âge de la puberté. Ces manipulations n’excèderont pas 5 min par animal. Pour les femelles, dès l’ouverture vaginale (environ 30 jours après la naissance), des prélèvements vaginaux seront réalisés tous les jours jusqu’à l’âge adulte (environ 60 jours après la naissance). -Mise en accouplement durant 8 semaines -Prélèvements sanguins répétés à partir d’une coupure unique de l’extrémité de la queue préalablement analgésiées (lidocaïne en crème), puis massage (10 à 30 s / prélèvement). 16 prélèvements sanguins pour dosages hormonaux a différents temps, espacés de 20 à 60 min. Ce groupe sera soumis à une injection unique d’un composé activant les sécrétions hormonales, répétée deux fois à 15 jours d’intervalle. -Prélèvements rapide de queue (un prélèvement unique fait à 6 jours après la naissance)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, différents effets nuisibles sont à prévoir : La séparation maternelle prévue est une situation de fort stress pour la mère et les petits. Les souris pourront ressentir un état de stress lié à la manipulation quotidienne par l’expérimentateur lors des mesures anatomiques (pesée, vérification de l’ouverture vaginale, de la séparation préputiale) Les souris pourront ressentir de l‘inconfort et stress durant les prélèvements vaginaux Une douleur légère de courte durée sera induite lors du prélèvement d’un bout de queue pour identifier la nature génétique des souris La coupure unique de l’extrémité de la queue lors des dosages hormonaux répétés pourra également être source de stress et d’inconfort. L’absence de cicatrisation lors d’une série de 16 prélèvements permet d’éviter la douleur lors des prélèvements répétés. Le volume total prélevé est très faible (moins de 3% du volume sanguin total) et aura été récupéré entre les deux séries espacées de 15 jours. La deuxième série qui a lieu après 15 jours de récupération, se fera sur une queue cicatrisée donc plus sensible ce qui pourra générer de la douleur et du stress lors de la première et unique incision.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à différents temps afin de pouvoir prélever les tissus en fin de procédure et analyser les cellules et leur fonctionnement. Cela permettra de mieux comprendre le rôle de l’environnement et des gènes sur le développement après la naissance des cellules cérébrales et l’impact sur l’âge de la puberté.

Remplacement

La puberté est un processus physiologique complexe et progressif qui débute lors de l’activation de neurones localisés dans le cerveau. Une fois activés, ces neurones sécrètent une neurhormone qui va agir au niveau des gonades. En réponse les gonades sécrètent des hormones stéroides sexuelles qui excercent en retour un effet sur le cerveau. Il s’agit d’une boucle cerveau-hormones-gonades dont le terme est la maturation totale de la fonction de reproduction. Afin de comprendre les rôles des facteurs environnementaux et génétiques sur la puberté, l’animal vivant ne peut être remplacé, car cela necessite de conserver le lien entre le cerveau et les gonades. Ce projet est mis en place pour apporter une analyse complémentaire et indispensable aux études in vitro réalisées dans l’équipe, à partir de lignées de cellules humaines et de cellules neurales produites à partir de cellules prélevées chez les patients. Il permettra de faire le lien entre les mécanismes purement cellulaires décrits in vitro et l’effet sur la physiologie de l’animal. L’ensemble de ces résultats apportera des données cruciales pour la compréhension des mécanismes d’initiation de la puberté et la contribution des gènes et de l’environnement sur l’âge de la puberté et la reproduction. Il n’y a pas d’autre méthode ni de modèle alternatif.

Réduction

LLe projet a été établi de manière à limiter au strict nécessaire le nombre d’animaux. Pour cela, les études in vivo font suite à des analyses préliminaires in vitro (culture cellulaire) qui certifient l’intérêt de l’utilisation de l’animal. Les expériences pour chaque procédure, seront réalisées séquentiellement et seules les expériences préalablement réalisées sur un groupe restreint d’animaux (124 souris) et qui montrent une altération de la puberté ou de la reproduction, seront reconduites pour une analyse plus poussée des mécanismes. Pour cela, une partie du projet utilise des souris génétiquement modifiées, dont le fond génétique est contrôlé et homogène avec des souris contrôles provenant des mêmes croisements que les souris mutées. Cela permet de réduire la différence de résultats entre les individus, donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer des modifications significatives. En utilisant les mêmes animaux dans différentes expérimentations au cours d’une procédure (les animaux utilisés pour l’observation anatomique, la détermination de la puberté et l’étude des capacités reproductives seront également utilisés pour l’analyse des tissus, des cellules et des molécules), nous augmentons les mesures multiples sur un seul animal et réduisons le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. La taille de l’échantillon est basée sur des études précédentes réalisées dans le domaine et tient compte : de la variabilité entre les différents individus et au sein du même animal ainsi que de la baisse d’effectif en cours de procédure (euthanasies expérimentales). Cet échantillon permet d’obtenir en fin de procédure un nombre d’animaux suffisant, en accord avec les études précédentes, pour une analyse statistique fiable.

Raffinement

Afin de prévenir tout mal être des animaux utilisés dans cette étude, ils seront quotidiennement monitorés par les membres qualifiés de l’animalerie pour s’assurer de leur bien-être. Tout comportement anormal est directement communiqué à la personne responsable du projet ou personnel formé participant au projet, qui fournira l’ensemble des soins nécessaires en concertation avec l’équipe vétérinaire. Les animaux seront également monitorés quotidiennement par les expérimentateurs confirmés responsables du projet et connaissant bien le modèle murin. Les animaux en cours d’expérimentation auront un double suivi : une surveillance quotidienne visuelle à heure fixe et une surveillance plus approfondie avec grille d’évaluation adaptée à l’âge de l’animal. Cette grille permettra d’évaluer par des critères objectifs le bien-être animal et de décider, en cas de souffrance s’il est préférable pour l’animal d’être euthanasié. Les protocoles expérimentaux ont été mis au point afin de prendre toutes les mesures nécessaires pour atténuer et à minimiser la douleur, la souffrance ou le stress subis par l’animal, ils incluent des périodes d’habituation, un renforcement positif, l’utilisation de crème analgésique et de produits anesthésiants. Ils permettront d’assurer le bien-être animal au cours de cette étude. Pour limiter le stress lié aux manipulations, les animaux seront préalablement habitués et seul l’expérimentateur ayant réalisé l’habituation sera en charge de réaliser les mesures. Afin de réduire le stress lié aux prélèvements sanguins et permettre l’habituation des animaux à cette procédure, une friandise pour rongeur de 2g morcelée au préalable en 16 petits morceaux sera apportée aux animaux après chaque prélèvement. Il n’y a pas de conséquence digestive. Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi (sopalin, maisons en plexiglas autoclavable rouge) pour minimiser leur stress.

Choix des espèces

A ce jour, la souris est le modèle mammifère le plus propice aux modifications génétiques. L’ensemble des modèles mutants et transgéniques indispensables à la faisabilité du projet ont déjà été développé, ce qui permet de faciliter et accélérer de façon considérable la réalisation du projet. Il existe une grande littérature sur la physiologie de la puberté et le fonctionnement des neurones de l'hypothalamus chez la souris contrôle. Cela permet d’avoir des références de comparaisons indispensables à l’étude, qui limiteront les besoins expérimentaux et le nombre d’animaux. Le laboratoire a une grande expertise dans le modèle murin et les travaux précédents de l’équipe ont ainsi permis d’identifier des gènes responsables troubles pubertaires et de comprendre les mécanismes impliqués. Les nombreuses collaborations de l’équipe avec des chercheurs travaillant sur la souris permettent de faciliter l’étude et d’assurer son accomplissement éclairé par le partage de connaissances et d’expertises. L’ensemble du projet est axé sur l’étude d’un phénomène développemental, qui justifie l’utilisation de souris à différents âges après la naissance. La puberté se fait relativement rapidement chez la souris autour de P30 chez la souris femelle et P40 chez le mâle. Enfin la durée de gestation relativement courte (environ 20 jours) et la facilité d’accouplement en fait un modèle de choix pour l’étude des capacités reproductives.

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Placées en marge d'un faisceau d'irradiation cinq jours par semaine pendant sept semaines, elles reçoivent des anesthésies répétées, un suivi par bioluminescence et un traitement par gavage, puis sont hébergées jusqu'à dix-huit mois pour observer l'apparition de cancers secondaires. Le porteur estime que 168 souris suffisent mais en prévoit le double "en cas de problème", et signale que le composé administré est toxique pour certaines cellules sanguines. Il indique avoir mené des études préalables sur cellules mais affirme devoir passer à l'animal pour vérifier ces mécanismes dans un organisme entier doté d'un système immunitaire.

Objectifs

Plus de la moitié des cancers sont traités par radiothérapie, seule ou en combinaison avec de la chimiothérapie ou de la chirurgie. Les radiations utilisées pour le traitement créent des cassures sur les deux brins de la double hélice d’ADN qui sont létales pour les cellules cancéreuses. Bien que les techniques de radiothérapie soient de plus en plus précises, les rayonnements touchent toujours des cellules saines à proximité de la zone traitée ce qui induit des effets secondaires. Certains sont immédiats, comme une réaction inflammatoire, d’autres sont beaucoup plus tardifs, avec un risque de développement d’un second cancer. Les seconds cancers sont extrêmement rares mais souvent sévères, avec un taux de survie à 5 ans compris entre 10 et 40%. Comme ils se développent de nombreuses années après la radiothérapie initiale, ils concernent principalement des personnes ayant souffert d’un cancer durant leur enfance ou leur vie de jeune adulte. Il est donc important et urgent de comprendre les mécanismes responsables du développement de ces cancers afin de pouvoir mieux prévenir leur formation. Lors d’études précédentes réalisées sur des cultures de cellules, nous avons montré que les cellules saines en bordure de zone traitée, recevant uniquement de très faibles doses de rayonnements, subissent aussi des cassures de l’ADN mais seulement sur un brin, ce qui n’est pas létal pour les cellules, mais induit leur sénescence prématurément ce qui se traduit entre autres par un arrêt de prolifération. Puis, quelques rares de ces cellules sénescentes évoluent vers un état pré-tumoral. L’objectif de ce projet est de vérifier les résultats obtenus in vitro dans un organisme complexe, la souris. Il s’agit d’un projet multi-site qui se déroulera au sein de deux établissements utilisateurs identifiés comme EU 1/2 et EU 2/2.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes responsables du développement des seconds cancers post-radiothérapie. Les résultats seront publiés dans une revue scientifique internationale à comité de lecture. La compréhension de ces mécanismes pourrait doter la clinique de marqueurs prédictifs de risque d’apparition des seconds cancers que pourraient être les marqueurs de sénescence et de cassures simple-brin l’ADN. Des traitements préventifs ciblant les cellules sénescentes pourraient ensuite faire l’objet d’essais cliniques.

Procédures

Ce projet se déroule en une procédure multi-étapes et multi-sites. Après acclimatation d’au moins 1 semaine, l’ensemble des animaux (168 souris) seront endormies par anesthésie gazeuse (2min) afin de tondre une partie de leur pelage au niveau du dos (10 sec) et seront mises en contact via l’application d’un gel d’échographie sur leur peau avec un fantôme qui sera irradié (84 souris) ou non irradié (84 souris) (durée de l’irradiation 68 sec). Les irradiations seront réalisées 5 jours par semaine pendant 7 semaines dans l’EU 2/2. Au cours de et après les irradiations, les souris seront suivies par bioluminescence à raison de 1 fois par semaine les 3 premiers mois puis 1 fois par mois. Pour cela, les 168 souris seront transportées vers l’EU 1/2 où elles recevront une injection d’anesthésiques (30 sec) puis, une fois endormies, une injection de luciférine (30 sec). Après la lecture, les animaux seront réveillés par une injection d’un agoniste des anesthésiques (30 sec ; durée totale de l’anesthésie : 30 min) puis seront retransportées vers l’EU 2/2. Après la fin des irradiations, l’ensemble des souris seront transférées définitivement vers l’EU 1/2, 84 souris recevront un traitement sénolytique et 84 souris recevront un placebo par gavage (durée 30 sec ; 5 jours de traitement / placebo puis 2 semaines de repos puis 5 jours de traitement / placebo). Les souris seront ensuite hébergées sans autre manipulation que les contrôles de leur état et de la bioluminescence (1 fois par mois) jusqu’à 18 mois après les irradiations. En fin de procédure, les souris seront étudiées via une analyse par PET-Scan (anesthésie gazeuse, durée 15min) dans l’EU 1/2 puis seront mises à mort. Pour résumer : Seules les anesthésies gazeuses pour la tonte et les irradiations seront réalisées dans l’EU 2/2. Pendant la période d’irradiation, les souris seront hébergées dans l’EU 2/2. Les actes réalisés dans l’EU 1/2 sont les suivants : anesthésies gazeuses pour la tonte (après la période d’irradiation, anesthésie par injection pour la lecture de bioluminescence (avec injection de luciférine) + injection d’antisedan pour le réveil des animaux, gavage avec le sénolytique (2x5 jours avec une pause intermédiaire de 2 semaines) et anesthésie gazeuse pour la réalisation du PET-Scan avant mise à mort des animaux. Nous prévoyons le double d’animaux, pour pouvoir refaire tout ou partie la procédure et ce, uniquement en cas de problème.

Impact sur les animaux

Les souris n’étant pas directement irradiées (elles seront placées en marge de la zone irradiée), les effets potentiels liés à une irradiation directe (comme les brûlures) ne s’appliquent donc pas aux animaux. Le transport de l’EU 2/2 vers l’EU 1/2 peut engendrer un stress chez les animaux. Pour la lecture de la bioluminescence, les animaux subiront une anesthésie par injection. Le gavage des animaux étant un geste maitrisé par les expérimentateurs, seul un stress au moment de la contention pourra éventuellement être ressenti par les souris. Cependant, le sénolytique utilisé lors du gavage est connu pour avoir un effet toxique sur les mégacaryocytes (Souers et al., 2013). Pour remédier à ce problème, le traitement sera délivré par intermittence, 5 jours de traitement, une pause de deux semaines puis de nouveau 5 jours de traitement.

Devenir

A la fin de la procédure, en raison des traitements qui auront été réalisés sur les animaux et de la nécessité de prélever et d’analyser les organes, l’ensemble des souris seront mises à mort.

Remplacement

Nous avons déjà répondu à l’injonction de remplacement en réalisant des études préalables utilisant des cellules en culture. Nous avons ainsi pu montrer que les radiations touchant les cellules saines situées en bordure d’une zone irradiée induisent des dommages à l’ADN (des cassures simple-brin) qui s’accumulent et de la sénescence cellulaire. Ces résultats ont été publiés dans une revue scientifique internationale à comité de lecture. Cependant, nous ne pouvons pas affirmer que ces évènements (cassures simple-brin de l’ADN, sénescence et cellules sénescentes qui entrent de nouveau dans le cycle cellulaire) auront lieu dans des cellules incluses dans un organisme, avec notamment un système immunitaire qui pourrait éliminer les cellules sénescentes. C’est pourquoi, même si nous avons commencé par remplacer l’expérimentation animale par des études in vitro, nous devons maintenant procéder à des études chez l’animal.

Réduction

Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous nous sommes tout d’abord basés sur les données de la littérature pour connaitre la fréquence de développement de cancers spontanés et de cancers radio-induits (dans la zone d’irradiation) chez les souris. Ces données montrent une différence très nette entre fréquences des cancers spontanés et des cancers induits par la radiothérapie. Par ailleurs, nous nous sommes basés dans un second temps sur les expériences préliminaires réalisées par le laboratoire concernant l’apparition et le suivi de sénescence également sur les souris p16-Luc. Les analyses montrent qu’il nous faudrait 42 souris par lot (avec au total 4 lots), soit un total de 168 souris. En cas de problème, nous prévoyons le double pour pouvoir refaire les manipulations (uniquement si nécessaire), soit un total de 336 souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages d’une animalerie thermiquement et hygrométriquement régulée, avec un éclairage alternant jour/nuit. Elles auront accès à l’eau et à l’alimentation à volonté. Leurs cages seront équipées d’une litière et de produits d’enrichissement. Pour les manipulations liées à la tonte, à l’irradiation et au suivi de la bioluminescence, les animaux seront anesthésiés afin de réduire leur stress (anesthésie gazeuse ou chimique). Les manipulations des animaux (mise en cage, anesthésie, irradiation, mise à mort) seront réalisées par un personnel qualifié. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance nécessitant l’arrêt des procédures et leur mise à mort. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparence reportés dans une grille standard permettant d’établir un score à ne pas dépasser. Tout animal dépassant ce score sera exclu du protocole d’irradiation et mis à mort.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée en radiobiologie et cancérologie dont la génétique et la manipulation sont bien maitrisées en laboratoire. De plus, nous utiliserons une souche de souris transgénique (p16-Luc : insertion de la luciférase dans le gène p16) qui permet d’analyser facilement les cellules sénescentes sur animaux vivants par bioluminescence permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le sénolytique qui va être utilisé a déjà été testé avec succès chez la souris. Enfin, en lien avec notre problématique, la souris est connue pour développer des cancers lorsqu’elle est soumise à des irradiations. Nous utiliserons des souris adultes jeunes ayant atteint leur taille maximale, soit âgées de 10 semaines. L’acquisition de la taille adulte permettra de placer toujours la souris de la même manière en contact avec le fantôme irradié. La sénescence cellulaire survient avec l’âge. C’est la raison pour laquelle nous utiliserons des souris jeunes pour être le moins possible parasité par la sénescence survenant spontanément avec l’âge.

3 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections, des gavages pouvant causer des fausses routes et, pour une partie, une castration chirurgicale, les traitements aux glucocorticoïdes pouvant entraîner une fonte musculaire et une perte de poids de 20 %. Le porteur étudie le rôle controversé des glucocorticoïdes dans le cancer de la prostate résistant à la castration. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les échanges entre cellules tumorales et cellules voisines.

Objectifs

Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez l’homme dans le monde et la seconde cause de mortalité par cancer. Il s’agit d’un cancer dépendant des androgènes, une hormone, qui, en se fixant à son récepteur favorisent la prolifération des cellules cancéreuses prostatiques. Ainsi, les cancers de la prostate localement avancés et métastatiques sont traités par des anti-androgènes aussi appelée castration chimique afin de bloquer toute activation de la voie de signalisation des androgènes. Cependant, bien que ce traitement soit efficace durant les premiers mois, la majorité des patients rechutent et progressent vers un cancer résistant à la castration. Les glucocorticoïdes, une autre hormone qui se lient aux récepteurs des glucocorticoïdes, sont utilisés avec succès en combinaison avec les anti-androgènes depuis de nombreuses années, car ceux-ci atténuent les effets secondaires et potentialisent les traitements anti-androgène. Toutefois, l’utilisation des glucocorticoïdes dans le traitement du cancer de la prostate, est devenu un sujet controversé car le récepteur aux glucocorticoïdes pourrait également jouer un rôle dans la progression de la tumeur. Nos données préliminaires obtenues à l’aide des modèles murins de cancer de la prostate vont dans ce sens et montrent que : - Le récepteur des glucocorticoïdes est présent dans les cellules cancéreuses et les cellules avoisinantes - Le récepteur des glucocorticoïdes est important dans l’initiation du cancer de la prostate. Il devient donc urgent de mieux caractériser le rôle des glucocorticoïdes dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la castration.

Bénéfices attendus

Actuellement, le traitement de référence du cancer de la prostate localement avancé et métastatique consiste à bloquer toute activation de la voie de signalisation du récepteur des androgènes par déprivation androgénique. Cependant, après 12 à 18 mois, la plupart des patients rechutent et développent une résistance à cette thérapie. De plus, des glucocorticoïdes sont administrés aux patients ayant un cancer de la prostate afin d’améliorer leur qualité de vie (contrôle de la douleur / diminution des effets secondaires lors de la déprivation androgénique). Toutefois, de plus en plus de données suggèrent que l’administration de glucocorticoïdes pourrait stimuler la croissance tumorale. Ainsi, il s’avère important de mieux comprendre l’impact des glucocorticoïdes dans le développement du cancer de la prostate et la résistance à la déprivation androgénique. Cette étude est importante afin de définir le rôle favorable ou défavorable d’un traitement aux glucocorticoïdes sur le développement du cancer de la prostate.

Procédures

•Dans un premier temps, 1760 souris seront identifiées (3 minutes par souris) et injectées en intrapéritonéale pendant 5 jours (3 minutes par souris) afin d’inactiver le gène d’intérêt. 1, 3, 6, 9, et 12 mois après l’inactivation du gène, les souris seront traitées avec des glucocorticoïdes, soit en intrapéritonéale (3 minutes par souris) ou per os (4 minutes par souris) (ou placebo respectifs) en fonction de la molécule pendant 14 et 30 jours maximum. Leur mise à mort est directement prévue après ces traitements. •Dans un second temps, 1280 souris seront identifiées (3 minutes par souris) et injectées en intrapéritonéale pendant 5 jours (3 minutes par souris). 640 souris seront castrées chirurgicalement et 640 seront uniquement ouvertes sans castration (groupe contrôle (Sham)) (3 mois ou 9 mois après inactivation du gène d’intérêt). Cette intervention dure environ 10 minutes pour chaque souris.7 jours après opération : les souris castrées ou non seront traitées avec glucocorticoïdes, soit en intrapéritonéale (3 minutes par souris) ou per os (4 minutes par souris) (ou placebo respectifs) en fonction de la molécule pendant 14 et 30 jours maximum. Leur mise à mort est directement prévue après ces traitements.

Impact sur les animaux

Les souris de cette étude sont exposées à des nuisances : lors de leurs gavages, des différentes injections ainsi que lors de la chirurgie et le développement d’une tumeur. En effet, les souris sont sujettes à un stress physique lors de la contention, et des lésions et/ou douleurs lors des différentes procédures. Le grossissement de la tumeur peut également générer un inconfort qui sera contrôler par palpation de la prostate et observation de l’apparence générale de la souris. Des effets indésirables peuvent également être observés lors de ces différentes manipulations : - Le gavage peut conduire à des fausses routes. - La chirurgie peut induire une hémorragie en cas de mauvaise ligature des artères et une infection post opératoire. - Les injections peuvent entrainer une infection. - Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de poids de 20%, qui par conséquent pourrait altérer le bien-être des animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure expérimentale définie dans ce projet, l’ensemble des souris seront euthanasiées selon une cinétique définie que nous utilisons habituellement au laboratoire. La prostate sera alors collectée pour y effectuer l’ensemble des analyses nécessaires à la bonne mise en oeuvre du projet de recherche.

Remplacement

Notre projet de recherche vise à comprendre le rôle des glucocorticoïdes le développement du cancer de la prostate et la résistance aux traitements utilisés actuellement. Les communications entre les cellules avoisinant la tumeur comme par exemple les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses prostatiques jouent un rôle crucial dans le développement et la progression du cancer de la prostate. A noter que le récepteur aux glucocorticoïdes est exprimé dans les cellules cancéreuses prostatiques mais également dans les cellules avoisinant la tumeur. Ceci implique donc qu’un traitement aux glucocorticoïdes agit sur les deux compartiments cellulaires. A ce jour, aucun modèle ne permet d’étudier une telle complexité in vitro. C’est pourquoi, notre projet nécessite d’utiliser un modèle in vivo afin que l’ensemble de ces facteurs soient pris en compte.

Réduction

Le nombre de souris nécessaires pour nos expériences a été déterminé de façon à obtenir des résultats publiables et significatifs à l’aide de tests statistiques adaptés en fonction des expériences réalisées. En effet, il n’est pas rare d’observer une forte hétérogénéité entre des souris du même groupe. Par ailleurs une étude pilote sera réalisée afin d’éviter d’utiliser un protocole d’injection de glucocorticoïdes non adapté, et ne nous permettant pas d’apporter de conclusion. Notre expertise en expérimentation animale nous a permis de définir au mieux le nombre d’animaux qui sera utilisé pour cette étude. De plus, de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, lorsque cela sera possible, une même prostate sera utilisée pour plusieurs expériences (par exemple, recherche de différents marqueurs biologiques sur une même prostate).

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Tous les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés par l'expérimentateur et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler l’apparence générale de la souris, sa posture et son comportement tout au long de leur vie. Concernant la partie chirurgicale, les souris subiront une anesthésie générale et recevront des médicaments antalgiques afin de prévenir l'apparition de douleurs. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. Afin d’analyser le bien-être animal, les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité et palpation abdominales. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

A ce jour, la souris représente un modèle de choix pour notre étude en raison de : -Temps de gestation court, nous permettant d’avoir de larges cohortes contribuant à l’obtention de résultats significatifs. -L’histologie de la prostate murine et humaine est similaire. -Notre modèle de cancer de la prostate chez la souris présente la même cinétique de développement tumoral que celle observée chez l’homme (lésions pré-cancéreuses dont certaines seulement évoluent en adénocarcinomes). -Le système immunitaire chez la souris est proche du système immunitaire chez l’homme, ce qui est crucial pour la mise en oeuvre de notre projet d’étude. -Les voies de signalisation et gènes exprimés dans la prostate sont similaires chez l’homme et chez la souris. Les animaux utilisés seront adultes. Les traitements pour induire la mutation se feront à 8 – 10 semaines d'âge et les animaux seront mis à mort comme indiqué après 1 mois, 3 mois, 6 mois, 9 mois et 12 mois. Cette cinétique est importante pour étudier le rôle des glucocorticoïdes à tous les stades de la maladie. Concernant la partie castration, uniquement deux temps de cinétique ont été choisis, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés (un temps précoce et un temps plus tardif).