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Modulation de l’immunité humorale induite contre l’AAV chez le lapin pour une ré-injection efficace du vecteur AAV.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
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- Oncologie
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- Système immunitaire
10 lapins mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque lapin reçoit deux à quatre injections intraveineuses et jusqu'à quinze prélèvements sanguins sur environ deux mois et demi, avant d'être tué pour analyser la répartition du produit dans ses tissus, dans le but de tester des stratégies limitant la réaction immunitaire aux vecteurs de thérapie génique. Le porteur indique n'attendre aucun effet indésirable notable au-delà d'un possible hématome à l'oreille. Il précise poursuivre des travaux déjà menés sur des primates non humains et des lapins, et écarte les méthodes in vitro comme incapables de reproduire ces conditions biologiques.
Objectifs
Les vecteurs dérivés du virus adéno-associé (AAV) sont actuellement les plus utilisés dans les thérapies par transfert de gènes in vivo pour le traitement des maladies génétiques. Ces vecteurs sont efficaces et bien tolérés. Cependant, leur utilisation en thérapie génique peut être limitée (i) soit en raison d’une immunité pré existante à l’AAV due à l'exposition naturelle de l'homme à certains virus AAV, (ii) soit à une réponse immunitaire déclenchée par l’administration d’un vecteur AAV thérapeutique. En conséquence, un grand nombre de personnes avec une immunité pré existante ne pourront pas bénéficier de la thérapie génique AAV. D’autre part, le traitement est souvent limité à une seule injection de par le déclenchement d’une réponse immunitaire. Dans des études précédentes, chez le primate non humain et chez le lapin, ayant une immunité pré existante pour l’AAV thérapeutique testé, nous avons démontré qu’une enzyme, une endopeptidase, était capable par son action spécifique, de diminuer cette immunité, et donc d’augmenter l’efficacité de l’AAV thérapeutique. Actuellement, l’utilisation d’endopeptidases est le traitement le plus prometteur pour pallier à une réponse immunitaire dans un contexte de thérapie génique. D’autre part, dans une étude récente sur le primate non humain avec une immunité pré existante à l’AAV, nous avons obtenu une première preuve de concept en ce qui concerne une méthode permettant de diminuer le taux d’anticorps dû à l’immunité : méthode dite méthode de déplétion des anticorps par administration d’AAV, nommé "AAV à capside vide" ne pouvant donc pas transférer de gène). L'objectif de cette étude est d'évaluer l'efficacité et la sécurité de ces différentes stratégies : (i)Comparaison entre une injection d'endopeptidase et la méthode de déplétion des anticorps (ii)Comparaison de chacun de ces traitements avec la combinaison des deux traitements
Bénéfices attendus
L'objectif de cette étude est d'évaluer l'efficacité et la sécurité de ces différentes stratégies : (i)Comparaison entre une injection d'endopeptidase et la méthode de déplétion des anticorps (ii)Comparaison de chacun de ces traitements avec la combinaison des deux traitements Ce traitement combiné pourrait être intéressant en thérapie génique, en particulier chez les patients avec une pré immunité forte ou lorsqu’une nouvelle administration du vecteur est nécessaire. Ces 2 stratégies permettraient de diminuer, voire d’annuler 1-soit une pré immunité, ainsi un plus grand nombre de patients pourront bénéficier de de la thérapie génique AAV 2-soit une réponse immune suite à l'administration du vecteur AAV thérapeutique, permettant ainsi la possibilité d'une deuxième injection thérapeutique
Procédures
Un total de 10 lapins sera inclus dans l’étude. Les 10 lapins seront répartis en 5 groupes, à raison de 2 lapins par groupe, et seront soumis aux interventions suivantes : (i)Selon leur groupe d’appartenance, les animaux vigiles auront de 2 à 4 maximum injections intraveineuses/animal au cours de l’étude. Durée de l’intervention : 15 minutes/injection (ii) Tout au long de l’étude, les animaux vigiles seront soumis à des prélèvements sanguins dont le nombre variera de 6 à 15/animal selon leur groupe d’appartenance. Durée de l’intervention : 5 minutes /prélèvement (iii)Selon leur groupe d’appartenance, les animaux seront suivis soit pendant 21 jours, soit 79±3 jours, avant mise à mort par injection intraveineuse, sous anesthésie générale après analgésie préalable. Durée de l’intervention : 10 minutes
Impact sur les animaux
Les différents gestes réalisés sur les animaux vigiles en boite de contention, seront des gestes classiquement appliqués chez le lapin et pas ou peu invasifs : injections par voie intraveineuse et prélèvements sanguins par ponction veineuse. Il n’est donc pas attendu d’effet indésirable. Suite à un prélèvement sanguin, réalisé à l’oreille, un hématome pourrait être éventuellement observé. Les différents produits injectés ont déjà été administrés lors d’études antérieures chez l’animal, et aucun effet secondaire ou indésirable particulier n’a été observé. Au cas où un animal montrerait des signes de stress lors des injections, une anesthésie légère de courte durée serait alors réalisée.
Devenir
Les 10 animaux concernés par cette procédure seront suivis pendant environ 2.5 mois après l’injection du vecteur testé puis mis à mort pour prélèvements de tissus post-mortem. La décision d'euthanasier les animaux à des fins d'analyse post-mortem est prise pour obtenir des échantillons de tissus pour des tests spécifiques, tels que des analyses de biodistribution (la répartition du médicament dans le corps) ou des examens histopathologiques (étude des tissus pour détecter d'éventuelles anomalies). Ces études sont cruciales pour évaluer la sécurité et l'efficacité d'une thérapie potentielle avant d'envisager des essais sur des êtres humains.
Remplacement
Dans une précédente étude chez le lapin avec une immunité pré existante au produit thérapeutique testé, nous avions déjà étudié l'activité de l’endopeptidase, enzyme capable par son action spécifique, de diminuer cette immunité pré existante, et donc d’augmenter l’efficacité du produit thérapeutique. Notre étude faisant suite à cette dernière, nos résultats viendront la compléter. Aussi, nous devons poursuivre avec le même modèle animal, et ne pouvons donc pas avoir recours à des méthodes substitutives, telles que les études in vitro. Par ailleurs, ces dernières ne peuvent pas fournir les informations nécessaires pour comprendre pleinement l'efficacité de cette enzyme dans des conditions biologiques plus complexes et plus proches de la réalité.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude (n=10) a été déterminé sur la base d’études précédentes en thérapie génique. Ce nombre est réduit à son minimum tout en assurant une exploitation possible des résultats. En effet, la constitution de 5 groupes différents permettra d'évaluer l'efficacité et la sécurité des injections d'IdeS par rapport aux injections de capsides vides d'AAV (méthode de déplétion des anticorps) et de les comparer à la combinaison des deux traitements, en présence de niveaux élevés d'anticorps neutralisants anti-AAV.
Raffinement
L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement (techniciens animaliers et vétérinaire). Les administrations expérimentales ainsi que les prélèvements sanguins se dérouleront sans anesthésie. Ces actes étant peu douloureux, aucun protocole analgésique ne sera mis en place d'emblée pour ces actes. Pour favoriser les échanges sociaux entre animaux et favoriser leur bien-être, les lapins seront hébergés en groupe, en box sur résine avec copeaux, durant toute l'étude.
Choix des espèces
Dans une précédente étude chez le lapin avec une immunité pré existante au produit thérapeutique testé, nous avions déjà étudié l'activité de l’endopeptidase, enzyme capable par son action spécifique, de diminuer cette immunité pré existante, et donc d’augmenter l’efficacité du produit thérapeutique. Notre étude faisant suite à cette dernière, nos résultats viendront compléter ces premiers résultats prometteurs. C’est pourquoi nous utiliserons la même espèce, le lapin. 10 lapins (Lapin blanc de Nouvelle Zélande) mâles (4 mois, 3-4 kg) seront inclus dans l’étude. Il s'agit de jeunes adultes, matures sur le plan immunitaire notamment, stade essentiel à notre étude.
Rôle de CerS2 dans la modulation de la masse et de la fonction musculaires ainsi que dans l’homéostasie glucidique musculaire et systémique.
- Recherche fondamentale
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- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des tests de tolérance au glucose avec prélèvements sanguins répétés, des tests d'effort où des chocs électriques sont appliqués, des injections de vecteurs viraux dans le sinus de l'œil sous anesthésie et un tatouage, pour étudier le rôle d'une enzyme sur la masse musculaire et l'obésité. Le porteur indique qu'un régime gras peut créer une obésité et une résistance à l'insuline sources d'inconfort, et qu'une souris est retirée du test d'effort au-delà de vingt chocs électriques. Il décrit des essais préalables sur cellules musculaires mais juge l'animal entier "indispensable" pour relier les taux de lipides à la fonction musculaire.
Objectifs
Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques et notamment au cours du vieillissement. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire, la performance physique et l’homéostasie glucidique et ce, chez des animaux adultes jeunes, mais également au cours du vieillissement et dans le contexte de l’obésité et de la thermoneutralité, qui sont des contextes favorisant le développement de la résistance à l’insuline.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires notamment lors de l'obésité et/ou du vieillissement.
Procédures
A l'issue de leur réception, après 15 jours d'acclimatation et durant ce projet, les animaux seront soumis à trois tests permettant d'évaluer leur métabolisme glucidique. Ceux-ci durent moins de 3 heures et nécessitent le prélèvement de 3 à 5 µL de sang via la veine caudale à 9 reprises durant un test. Une mesure de la composition corporelle, entraînant un isolement et une contention dans un tube en plexiglas, causera un inconfort à l'animal qui n'excèdera pas 2 minutes. Cette manipulation sera répétée une fois en fin de protocole pour les jeunes mâles et de manière mensuelle pour les mâles âgés. Les tests d'exploration des capacités musculaires, d'une durée maximale de 5 minutes, vont générer soit de l'inconfort soit du stress. Ce dernier sera diminué par la présence de personnel formé et attentif, par l'entraînement des animaux et par la diminution de l’intensité des chocs électriques, lors du test d'endurance, à la valeur seuil minimale de détection. Les animaux recevront des vecteurs viraux par voie rétro-orbitaire, ceci sera réalisé une seule fois sur animaux anesthésiés ce qui diminuera grandement la douleur, d'autant qu'un collyre anesthésiant sera appliqué en per opératoire. Cette partie des procédures expérimentales n'excède pas 10 minutes entre l'endormissement et le réveil de l'animal. De même, l'identification par tatouage sera faîte sur animaux anesthésiés et une fois en début de protocole, acte rapide (15 secondes environ) et peu invasif.
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés. Un stress lié à l'isolement, même s'il est de courte durée, pourrait être constaté lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance. Un stress lié à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des tests in vivo de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline. Un inconfort pourrait être constaté au réveil des animaux anesthésiés pour l'injection des vecteurs viraux via le sinus rétro-orbitaire ou pour leur identification par tatouage. La mise en régime enrichi en lipides en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance voire à un diabète pourrait engendrer un grand inconfort à l'animal.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.
Remplacement
Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, les perfomances physiques ainsi que l'homéostasie glucide, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.
Réduction
Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages, quantité qui sera augmentée au moment de l'administration des vecteurs viraux. Après l'identification par tatouage, si une inflammation locale ou systémique (encore plus rare que la précédente) survenait, les souris seraient traitées par un mélange antibiotique/anti-inflammatoire. Si cette médication ne suffisait pas elles seraient alors mises à mort. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme ce qui devrait diminuer le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées; elle permettra également de vérifier l'absence de perte de poids qui, si elle excède 20% du poids corporel, entraînerait une mise à mort de l'animal concerné. Le réveil de l'animal, après anesthésie par un mélange isoflurane-oxygène, pour l'injection des vecteurs viraux, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. Enfin, la mesure du test d'exercice en endurance ne sera réalisée qu'une fois en toute fin des procédures, donc avec des animaux habitués à la manipulation et après deux tests à blanc de courte durée. Malgré toutes ces précautions, un animal sera sorti du protocole si le nombre de chocs devient supérieur à 20.
Choix des espèces
L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (3 mois lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) ou âgés (15 mois lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 21-22 mois en fin de protocole) seront utilisés. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes contrôles et les comparer soit à des animaux rendus obèses par un régime nutrionnel approprié ou par modification de leur température d'hébergement ou âgés, pour lesquels une obésité associée à une insulino-résistance peut s'installer et se développer.
Etude de la distribution de canaux endo-lysosomaux dans le cerveau de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie profonde, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris reçoit un analgésique puis un anesthésique avant une perfusion de fixateur dans le cœur, qui permet de prélever le cerveau pour étudier un canal calcique impliqué dans les échanges entre neurones et astrocytes. Le porteur ne signale comme effet indésirable que le stress possible lié à la contention et aux injections. Il affirme qu'une étude sur système in vitro ne serait "pas pertinente" et que la modification génétique requise n'est disponible que chez la souris.
Objectifs
Les interactions neuro-gliales sont essentielles aux activités cérébrales, en particulier dans les régions telles que l’hypothalamus, fortement liées au flux sanguin et régulant des fonctions physiologiques vitales. Les astrocytes contactent à la fois les vaisseaux et les neurones, pour détecter et intégrer les changements sanguins et des activités neuronales. En réponse, les astrocytes génèrent des élévations de calcium qui modulent l'activité des neurones adjacents en sécrétant des modulateurs. Cependant l'origine des élévations locales de calcium restent obscures. Une source de calcium peu explorée est une nouvelle famille de canaux calciques (CC) qui, dans plusieurs systèmes, contrôlent les processus de sécrétion. Les astrocytes présentant des niveaux élevés de ce CC, nous émettons donc l'hypothèse que, dans les astrocytes, ce CC participe aux signaux calciques déclenchant les voies de régulations neurone-astrocytes. En particulier, ces régulations contrôlent l'activité des neurones hypothalamiques modulant ainsi la sécrétion de neurohormones par ces neurones. Ces dernières sont notamment essentielles à la régulation de fonctions vitales telles que la parturition et la lactation. Nos données récentes indiquent que la délétion du CC que nous étudions réduit drastiquement la sécrétion de neurohormones. Nous proposons donc d'étudier si ce CC astrocytaire participent au contrôle des astrocytes sur les fonctions hypothalamiques en se focalisant sur ces régulations neurohormonales.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de comprendre par quels mécanismes les hormones sont libérés par l'hypothalamus et l'hypophyse. Ce projet permettra d'apporter de nouvelles bases expérimentales et conceptuelles qui permettront d'identifier une nouvelle cible pour une stimulation pharmacologique de la libération de neurohormones pour une intervention thérapeutique dans des pathologies neurodéveloppementales où des déficits de neurohormones ont été incriminées.
Procédures
Une perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde sera réalisée sur les animaux pour un prélèvement du cerveau afin de réaliser une étude d'immunomarquage sur le cerveau ainsi fixé. Pour cela, les animaux seront injectés avec un analgésique puis après 30 minutes, les animaux seront injectés avec un anesthésiant pour obtenir une anesthésie profonde avant la réalisation de la perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les seuls effets indésirables potentiels sont lié au stress possible lors de la contention de l'anima l'injection de l'analgésique et de l'anesthésique.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car nous prélevons le cerveau pour des études d'immunomarquages
Remplacement
Le but du projet est de comprendre le rôle du canal CC dans les interactions neurogliales et la sécrétion de l'ocytocine et de vasopressine qui régissent de nombreuses fonctions physiologiques. Dans ce contexte il est nécessaire d'utiliser un tissu nerveux intact afin de déceler les processus physiologiques impliqués. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiologiques et ne serait donc pas pertinent
Réduction
Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, nous avons calculé la taille de chaque échantillon nécessaire pour une analyse statistique.
Raffinement
Les animaux seront injectés par voie intrapéritonéale avec un analgésique puis un anesthésique pour une anesthésie profonde pour que l'animal ne manifeste plus de réflexes aux stimulations avant la réalisation d'une perfusion intracardiaque. Des points limites précoces ont été défini pour prendre en charge un mal être constaté de l'animal
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieur (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standardisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiologique des interactions neurogliales. De plus, la modification génétique indispensable à la réalisation de ce projet est seulement disponible chez la souris (délétion des CCs). Les animaux seront utilisés de p21 à p60, afin de pouvoir comparer nos résultats avec la tranche d'âge pour laquelle la plupart des expériences d'électrophysiologie et d'imagerie calcique sur des tranches d'hypothalamus sont conduites. A ce stade les tranches ex vivo présentent un meilleur taux de survie des neurones et permet une plus grande reproductibilité des résultats.
Implication de l’hypothalamus dans l’altération de l’homéostasie glucidique induite par l’action centrale des triglycérides inter-estérifiés.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 720 d'entre elles. Elles reçoivent des injections d'huile de palme inter-estérifiée dans la carotide, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, et pour certaines des chirurgies dans le cerveau suivies de perfusions et d'un isolement de un à deux mois. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent entraîner perte de poids, prostration ou agressivité, et vise à préciser les conditions de sécurité alimentaire de ces graisses utilisées par l'industrie agroalimentaire. Il décrit des études sur cultures cellulaires menées en parallèle mais juge l'usage de la souris "encore nécessaire" faute de pouvoir reproduire in vitro les échanges entre organes.
Objectifs
La consommation d’aliments ultra-transformés riches en huile végétale hydrogénée est néfaste pour la santé des individus puisqu’elle contribue à l’obésité et au diabète de type 2 (DT2). Afin de remplacer les huiles végétales hydrogénées, l’industrie agroalimentaire commence à utiliser l’inter-estérification des graisses végétales. Des études récentes suggèrent que la consommation de ces graisses inter-estérifiés peuvent altérer l’homéostasie glucidique et donc favoriser le DT2. Il est donc important de comprendre les effets moléculaires de ces graisses inter-estérifiées sur la régulation de l'homéostasie glucidique. Des résultats préliminaires suggèrent que la consommation d’un régime contenant des graisses inter-estérifiées conduit à l’accumulation dans le foie, le tissu adipeux et l’hypothalamus de dérivés lipidiques comme les céramides. les céramides sont connus pour induire une résistance à l’insuline qui favorise l'installation d'un DT2. L'objectif de ce projet sera de déterminer l’implication du métabolisme des céramides dans la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par la consommation de graisses inter-estérifiées. Pour cela, la synthèse des céramides sera inhibée chez des souris (pharmacologiquement ou génétiquement) qui seront soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Les taux de céramides seront analysés par une approche lipidomique. La régulation de l'homéostasie glucidique sera étudiée chez ces souris soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Une analyse transcriptomique des tissus sera réalisée afin d’identifier les gènes dérégulés par les graisses inter-estérifiées. Cette analyses permettra également de caractériser les cibles moléculaires des céramides dans la dérégulation de l'homéostasie glucidique induite par les graisses inter-estérifiées. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du DT2 et ainsi d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Bénéfices attendus
Ce projet identifiera l’implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du diabète de type 2 et permettra d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Procédures
Les souris de la procédure 1 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. Les souris de la procédure 2 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. La moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. L’autre moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Les souris de la procédure 3 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les souris de la procédure 3, il s'en suivra, 28 jours plus tard d'une deuxième chirurgie pour poser un système de pompe et de canule pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires pendant 28 jours d'émulsions contenant les lipides inter-estérifiés d’intérêt. Les souris de la procédure 4 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les procédures 3 et 4, à la fin des expérimentations nous réalisons un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris). Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. 3 jours plus tard nous réalisons un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. S'ajoutent aux nuisances expérimentales, l'isolement des souris des procédures 3 (28 jours pour 360 souris) et 4 (2 mois pour 360 souris).
Impact sur les animaux
Les procédures font intervenir des injections stéréotaxiques dans le troisième ventricule et des perfusions dans le ventricule latéral, chirurgies qui peuvent entrainer des effets indésirables sur les animaux tels qu'une perte de poids, des troubles alimentaires, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crane.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les souris seront mises à mort afin d'évaluer l'incorporation des triglycérides inter-estérifiés depuis la périphérie vers le cerveau. A l'issue des procédures 2, 3 et 4, les souris seront mises à mort afin de collecter les tissus pour réaliser des RTqPCR, des immunohistochomies et des analyses lipidomiques.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. De plus, nous allons effectuer en parallèle de nos études in vivo des études in vitro sur des cultures cellulaires pour disséquer les effets de l'huile de palme interérifiée et identifier les mécanismes moléculaires les relayant.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons commencé des études in vitro sur des cultures cellulaires pour tester les concentrations d'huile de palme que nous pourrons utiliser in vivo. Nous avons aussi réalisé une étude in vivo pour tester les concentrations d'huile de palme inter-estérifiée à utiliser pendant les expériences. Ainsi nous utiliserons le nombre minimum de souris nécessaire à générer des données interprétables. Les échantillons prélevés sur chaque animal permettront de générer un grand nombre d'informations sur des marqueurs moléculaires (métabolites, transcripts, protéines inflammatoires). De plus, grâce aux données de la littérature et aux nombreux résultats obtenus lors de projets précédents (nous travaillons depuis plus de 20 ans sur des modèles murins d'obésité), nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace. En effet les groupes de souris sont générallement très homogènes en terme de tolérance au glucose, données physiologiques ou biochimiques.
Raffinement
Les souris des procédures 3 (360 souris, pendant 28j) et 4 (360 souris, pendant 2 mois) seront exceptionnellement maintenus en cage individuelle afin de contrôler individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (nid, batons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Pour les procédures chirurgicales que nous utiliserons, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les modèles précliniques de souris obèses et insulino-résistantes partagent avec l'humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contôle de l'homéostasie glucidique et de l'adiposité. Le laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur la souris en régime gras et a accumulé un grand nombre d'informations physiologiques et moléculaires qui seront utilisées pour interpréter les résultats obtenus. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du foie grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de plasmides dans la veine de la queue pour déclencher des tumeurs du foie, certaines recevant aussi des molécules anticancéreuses, avec un suivi par imagerie tous les quinze jours. Le porteur affirme que la nuisance de la manipulation reste temporaire et qu'aucun signe de souffrance n'apparaît au stade précoce, tout en reconnaissant que la formation des tumeurs peut provoquer des souffrances. Il décrit des tests in vitro sur cellules et organoïdes de foie mais conclut que la validation chez la souris est "indispensable" pour confirmer l'implication des gènes candidats.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une pathologie complexe, en raison de ses caractéristiques qui influencent son évolution et la résistance au traitement. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de cancérisation est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin qui récapitule le programme du développement du CHC. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de gènes qui coopèrent pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en CHC, ainsi que leur mode de coopération. Pour cela, nous envisageons d'injecter par voie intraveineuse des plasmides, qui s'intégreront dans les hépatocytes (cellules du foie). Ce projet nous permettra de tester l’implication fonctionnelle de nouveaux gènes (seuls ou en combinaison) agissant comme régulateur du processus de cancérisation dans le foie sain. Cette stratégie nous permettra de tester directement l’implication de gènes candidats dans la formation des tumeurs dans un foie sain.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques ainsi que leur mode de coopération entre gènes. L'analyse par imagerie non-invasive permettra de suivre de manière longitudinale la formation, l'évolution et la régression des tumeurs.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides dans la veine de la queue pour une durée inférieure à 5 secondes. Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées, selon les recommandations fournies pour chaque drogue. Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine, pour une durée variant de 2 à 4 semaines). Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1x tous les 15 jours. Chaque séance d'imagerie durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. La nuisance globale de l'ensemble de la manipulation n'est que temporaire (
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (p
Raffinement
L'état de santé des souris sera régulièrement surveillé en fonction de l'évolution des expériences, de la formation des tumeurs. L'évaluation sera réalisée en suivant différents critères : poids, apparence du pelage, comportement animal dans la cage qui traduirait une éventuelle souffrance ou angoisse. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d’hébergement). La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie de manière longitudinale par imagerie non invasive ("photon counting micro computed tomography" et/ou bioluminescence/fluorescence). En cas de souffrance de l’animal, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches uitilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade adulte (2-8 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus adultes, comme la majorité des CHC.
Rôle des tissus adipeux bruns/beiges dans le maintien de l’homéostasie redox systémique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements de sang répétés, des chirurgies d'ablation ou de greffe de tissu adipeux, des expositions au froid à 4°C ou à 30°C et des tests de comportement, pour étudier le rôle des tissus adipeux bruns dans le vieillissement. Le porteur signale comme nuisances la douleur post-chirurgicale, le stress des températures d'hébergement et de l'isolement, et fixe une mise à mort à 20 % de perte de poids. Il décrit le recours à l'animal comme "indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. L'objectif actuel est de promouvoir le vieillissement en bonne santé en déterminant des paramètres biologiques permettant de mesurer et de prédire son évolution. Le métabolisme énergétique est un régulateur clé de la longévité et de l’allongement de la vie en bonne santé. Les tissus adipeux (TA) jouent un rôle très important dans le maintien de l’homéostasie énergétique de l’organisme et leur dysfonctionnement pourrait contribuer à l’altération des fonctions de l’organisme au cours de l’âge. Alors que les TA blancs sont spécialisés dans le stockage et la libération de l’énergie, les TA bruns et beiges (ces derniers résultant de la transformation de certains dépôts de TA blancs en TA de type brun lors de différents stress comme l’exposition au froid) dissipent l’énergie sous forme de chaleur. Alors que leur activité est associée à la santé cardio-métabolique chez l’homme, les mécanismes par lesquels les TA bruns et beiges protègent l’organisme des désordres métaboliques associés au vieillissement restent encore mal compris. Le métabolisme redox correspond à l’ensemble des réactions de transfert d’électrons et constitue ainsi le socle du métabolisme énergétique. Plusieurs travaux ont montré que les adipocytes bruns et beiges sont activés suite à une l'altération de l'état redox cellulaire. Nous posons l’hypothèse selon laquelle les TA bruns et beiges permettraient de gérer des stress redox à l’échelle systémique et ainsi de protéger l’organisme contre les désordres métaboliques associés au vieillissement. Nous utiliserons le modèle murin chez lequel les TA bruns et beiges ont été très étudiés. Nous mesurerons la réponse des souris présentant des TA bruns et beiges activés ou inactivés à des stress redox systémiques en mesurant l’état redox plasmatique en cinétique au cours du stress. Les stress redox seront induits par des injections de métabolites ayant un impact fort sur l’équilibre redox (lactate, pyruvate et glucose). Par ailleurs, le rôle des TA bruns et beiges sur la trajectoire de vieillissement des animaux sera étudié. Le syndrome de fragilité et la perte de fonctions cognitives, indicateurs cliniques d’un vieillissement en mauvaise santé, seront étudiés à l’aide de tests comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’étudier le rôle des TA bruns/beiges dans le maintien de l’homéostasie redox systémique au cours de l’âge. Ces données permettront de mieux comprendre les processus médiés par les TA bruns/beiges qui contribuent à la perte de l’homéostasie énergétique de l’organisme au cours de l’âge et de mettre en évidence des biomarqueurs et/ou des cibles thérapeutiques d’intérêt pour restaurer l’homéostasie énergétique.
Procédures
Dans certaines procédures, des prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles, au maximum 10 prélèvements pendant une heure, juste avant la mise à mort. Dans certaines procédures, une injection sera réalisée sur souris vigiles : soit une seule injection (≤15 secondes par souris), soit une injection par jour pendant 5 jours consécutifs suivi d’une dernière injection 7 jours après. Dans certaines procédures, des procédures chirurgicales (ablation ou greffe de tissu adipeux) seront réalisées sous anesthésie générale, avec deux injections (≤15 secondes par souris) le jour de la chirurgie (analgésique avant et anti-inflammatoire après la chirurgie), puis une injection (≤15 secondes par souris) par jour pendant les deux jours suivant la chirurgie d’un anti-inflammatoire. Dans certaines procédures, les souris seront soumises à des tests comportementaux. Les tests pourront durer de quelques minutes à 45 minutes, la durée dépendra des capacités de l’animal ou sera de 5 à 8 minutes selon les tests.
Impact sur les animaux
Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - des problèmes liés à l’anesthésie, - une perte de poids et une douleur à court terme suite à la chirurgie (ablation de tissu adipeux et transplantation), - le stress lié à l’isolement et à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux températures d’hébergement de 30°C ou de 4°C - le stress lié à la contention nécessaire pour les injections dans la cavité intra-péritonéale. Les souris invalidées génétiquement ne présentent pas de phénotype dommageable dans les conditions standard ainsi que dans les conditions d’hébergement utilisées dans cette étude.
Devenir
Au terme de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Notre projet consiste à étudier la régulation du métabolisme redox systémique par les tissus adipeux bruns et beiges. Bien que des modèles d’organoïdes de différents tissus soient actuellement développés, étudier les interactions métaboliques in vitro entre différents organoïdes présente encore beaucoup de limites. La réalisation de notre projet nécessite un modèle intégré permettant une étude à l’échelle de l’organisme entier, impliquant des échanges entre différents tissus ayant des spécificités bien distinctes. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.
Réduction
Au regard de la bibliographie, compte tenu de la variabilité interindividuelle observée dans le contexte de vieillissement et de la variabilité de certaines mesures que nous effectuerons, des groupes de 10 souris par condition seront formés afin de mettre en évidence des différences statistiques. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit au minimum pour obtenir dans chaque groupe étudié un nombre d’individus suffisant pour réaliser les tests statistiques et avoir des données fiables. Mettre moins d’animaux dans chaque groupe serait prendre le risque de devoir refaire ces expériences pour pouvoir obtenir des différences significatives entre les différents groupes. Pour comparer deux groupes, des tests paramétriques ou non paramétriques en séries non-appariées seront réalisés ; pour des comparaisons multiples, des tests appropriés avec post-tests seront utilisés. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour les analyses métaboliques (par spectrométrie de masse et résonnance magnétique nucléaire) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques (mesures d’activités enzymatiques par exemple). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation et pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Par ailleurs, chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et de partager les prélèvements le cas échéant.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …), ainsi que surveillées et pesées une fois par semaine par une personne impliquée dans le projet. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle pour minimiser toute douleur. Les chirurgies seront réalisées par le personnel compétent et un suivi post-opératoire sera réalisé une à deux fois par jour. Les points limites sont : perte de poids (20% par rapport au poids initial), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique jugé par le zootechnicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance. Une grille de score comprenant les différents points limites a été établie et dès lors que le score atteindra une valeur de 9 sur 12, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et du vieillissement et dans lequel la biologie des tissus adipeux bruns et beiges a été particulièrement bien étudiée. De plus, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients et des défauts d’utilisation de certains métabolites dans les tissus adipeux. Enfin, la cinétique du vieillissement est bien décrite chez la souris, et cette espèce permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (2 à 3 ans) que celle du rat (2 à 3.5 ans) ou encore du cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris contrôles et présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients à différents âges (2, 5, 12 et 24 mois) afin de caractériser le rôle des tissus adipeux bruns et beiges dans le métabolisme et dans la mise en place de la fragilité et du déclin cognitif au cours de l’âge. Ces âges ont été sélectionnés grâce à des données qui montrent des changements progressifs et spécifiques à chacun de ces temps dans différents organes. La réponse des souris présentant des défauts d’utilisation de certains métabolites sera évaluée chez des souris jeunes âgées de 2 mois. L’exposition à 30°C sera réalisée chez des souris de 2 mois, soit pendant 2 mois (temps efficace pour inactiver les tissus adipeux bruns et beiges), soit pendant 16 mois (pour étudier les conséquences à long terme sur la fragilité et le déclin cognitif des animaux). L’exposition à 4°C sera réalisée chez des souris âgées de 4 ou 18 mois, afin de déterminer si l’âge impacte la capacité de réponse des animaux au froid. L’ablation du tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 2 mois tandis que la greffe de tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 18 mois (du tissu adipeux brun de souris âgées de 2 mois sera greffé).
Elevage d’animaux avec un phénotype dommageable.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
4 910 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour l'élevage de lignées au "phénotype dommageable", surtout des souris immunodéficientes ou issues de croisements transgéniques. Elles subissent une biopsie de l'oreille pour le génotypage et un hébergement stérile strict, une rupture de stérilité pouvant, selon le porteur, les contaminer jusqu'au décès du fait de leur immunodéficience. Les souris dont le génotype n'a pas d'intérêt sont tuées, les autres gardées pour la reproduction ou pour entrer dans d'autres procédures. Le porteur décrit ces lignées transgéniques comme des modèles "unanimement validés" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne recrée la complexité du système immunitaire.
Objectifs
L’objectif du projet est d’élever des animaux au sein d’une plateforme animalière agrée, en particulier des souris, avec des phénotypes dommageables. Ces animaux sont, pour la majorité, des souris immunodéficientes qui sont utilisées dans nos projets de recherche. Ces souris sont dépourvues totalement ou partiellement de système immunitaire adaptatif. Ces animaux ayant un phénotype dommageable peuvent être aussi des souris issues du croisement de deux souches de Souris transgéniques. La surveillance du bien-être des lignées au cours de l’élevage exigera des contrôles quotidiens et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Ces animaux issus du croisement de deux souches de souris transgéniques seront utilisés dans des modèles communs : les modèles d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, d’arthrite, de maladies chroniques de l’intestin, d’inflammation cutanée et pulmonaire. Enfin, les modèles expérimentaux de cancérogénèse sont des modèles de greffe de tumeurs murines ou humaines comme les leucémies, différentes lignées de cancer du côlon ou du pancréas. Ces différents modèles permettent d’adresser un mécanisme d’action, ou des approches thérapeutiques avec des produits biologiques humains. Aujourd’hui, il n’y a pas de données scientifiques publiées sur ces croisements. Les données obtenues avec des nouvelles lignées permettront d’enrichir les données scientifiques dans les modèles étudiés. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable au cours de la génération de ces lignées transgéniques dans nos conditions d’hébergement. Ce n’est que lors de nos expérimentations suite à l’injection de tamoxifène qu’un caractère dommageable sera observable ou non. Si un phénotype dommageable apparait, nous définirons des points limites et une intention particulière sera porté au bien-être animal.
Bénéfices attendus
L’elevage de ces animaux au sein de notre animalerie est bénéfiques pour les animaux et donc nos expérimentations. Les animaux, lorsqu’ils seront utilisés dans nos expériences, seront déjà habitués aux conditions environnementales de l’animalerie, ainsi qu’aux soigneurs et aux expérimentateurs Ce qui pourra limiter très fortement le stress de ceux-ci.
Procédures
L’animal présentant un phénotype dommageable suite au croisement des 2 souches de souris transgéniques pourra ressentir, du fait de son statut génétique, une douleur, une souffrance, une angoisse ou un risque d’infection . La surveillance du bien-être de chaque animal au cours de l'expérience exigera des contrôles quotidiens de routine et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Des conditions d’hébergement pour ces élevages seront strictes dans des portoirs ventilés avec de la litière autoclavée ainsi que des poches d’eau stérile. Tout ceci est mis en place afin de maintenir les animaux en bonne santé et de veiller au bien-être des animaux. Hormis le change des animaux, l’autre intervention sur ces animaux sera une biopsie d’oreille servant à vérifier le génotype des animaux et servant également à l’identification des animaux pour un bon suivi de l’élevage.
Impact sur les animaux
Concernant les animaux immunodéficients, les conditions d’hébergement strictes permettent de maintenir les animaux en bonne santé. Dans le cas où une rupture de la stérilité aurait lieu, les animaux pourraient être contaminés par des micro-organismes opportunistes qui seraient pathogènes pour ces animaux. Du fait de leur immunodéficience, ces animaux subiraient de graves effets indésirables qui se manifesteraient par une inactivité, une perte de poids pouvant aller jusqu’au décès. Pour les modèles CreLox inductible, les phénotypes dommageables des souris obtenus sont difficile à prévoir à l’avance Le bien-être animal sera évalué selon les principes suivants : Des données seront recueillies durant au moins 2 cycles de reproduction après la génération considérant la lignée stable (après 2 générations) avec un nombre d’animaux scientifiquement et statistiquement justifiés (jamais moins de 14 animaux issus d’au moins 2 portées/pontes différentes) en prenant en compte le sexe sur le phénotype : à défaut 7 mâles et 7 femelles. Les observations seront faites à un âge représentatif et un génotype pertinent. Les animaux contrôles seront de même fond génétique que les lignées générées.
Devenir
Les animaux dont le génotypage n’est pas d’intérêt, seront euthanasiés. A l’inverse, les animaux ayant un génotypage d’intérêt seront conservés, soit pour continuer les élevages, soit pour rentrer dans une procédure d’expérimentation.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes lors de greffes ou de thérapies anti-cancéreuses. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées à l’aide de modèles de culture cellulaire, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste. L’élevage des animaux est réalisé à la demande des expérimentateurs. En fonction de la procédure concernée, le nombre d’animaux par groupe est défini de façon à obtenir une différence statistique (Tests paramétriques et non-paramétriques) en fin d’expérience en ayant pris en compte les animaux nécessaires (couples parents et portées non utilisées) et la toxicité associée à chaque modèle. A cause des variabilités inter‐animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et donc la nécessité de répéter inutilement l’expérience. Si un phénotype dommageable est observé avec ces souches, le nombre d’animaux utilisé dans nos expériences sera adapté en conséquence (dimunition du nombre d’animaux par groupe).
Raffinement
L’élevage des animaux au sein de l’animalerie est réalisé dans des conditions strictes de stérilité et de suivi. Les Souris sont hébergées dans des cages en portoirs ventilés, ce qui assure une non contamination par des pathogènes pouvant être présents dans l’air ambiant des pièces d’hébergement. Les cages contenant la litière sont autoclavées préalablement au change. L’eau de boisson est distribuée via des poches d’eau stériles à usage unique. Le change des animaux est réalisé sous hotte de change, le transfert des animaux de la cage sale à la nouvelle est réalisé à l’aide d’une paire de pince trempée dans l’alcool permettant au maximum de limiter les risques de contamination entre les cages. Entre chaque cage le soigneur désinfecte ses gants. Les animaux sont suivis quotidiennement par les soigneurs afin de prendre en charge les animaux pouvant montrer des signes de mal être et ainsi protéger ces congénères. Ce suivi accru limite aussi le risque de propagation potentielle de pathogènes.
Choix des espèces
La Souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’Homme, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques cellulaires. Les modèles transgéniques utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. Tous les animaux produits seront utilisés dans différentes procédures autorisées dans notre établissement. Ces animaux seront utilisés soit à partir de 8 semaines pour renouveler les couples reproducteurs, soit pour être utilisés dans les différentes procédures et cela à partir de 5 semaines. Cinq semaines est l’âge à partir duquel les animaux peuvent subir une greffe de cellules hématopoïétiques humaines ou de tumeurs sans alterer leur croissance et leur bien-être.
Étude de la machinerie de synthèse des protéines chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
128 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie profonde, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris reçoit un antalgique puis une anesthésie profonde, avant l'ouverture de la cage thoracique et une perfusion cardiaque qui fixe les tissus, pour étudier la composition des ribosomes dans différents organes. Le porteur indique n'attendre qu'un léger stress et une légère douleur liés aux injections. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité de travailler sur "organisme entier", les protéines identifiées devant ensuite être étudiées in vitro.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale. Il vise à élucider les mécanismes complexes qui régissent l’expression des gènes, un processus essentiel dans le fonctionnement cellulaire. Les ribosomes, les machines moléculaires qui synthétisent les protéines, jouent un rôle central dans ce processus. Historiquement, les ribosomes ont été décrits comme étant identiques dans toutes les cellules. Cependant, des études récentes ont mis en évidence une grande hétérogénéité dans la composition des ribosomes et ont émis l’hypothèse de l’existence d’une multitude de ribosomes différents, décrits comme ribosomes “spécialisés”, chacun avec une activité spécifique. Afin d’étudier ces ribosomes “spécialisés” dans différents organes (le foie, le cerveau ou la rate par exemple) et comprendre leur fonctionnement, nous avons mis en place une approche innovante permettant de déterminer la nature des différentes protéines qui les composent. Nos premiers résultats obtenus dans des cellules en culture, nous ont permis de mettre en évidence près de 600 protéines qui se lient directement aux ribosomes. Cela ouvre de nouveaux champs de recherche pour la compréhension des mécanismes fondamentaux du fonctionnement cellulaire qui sont contrôlés par les ribosomes. Actuellement, nous souhaitons étendre notre étude en caractérisant la composition de ribosomes spécialisés dans différents organes chez la souris. Pour cela, nous avons généré une souris qui nous permet de marquer tous les ribosomes de chaque cellule et de les purifier. Cette lignée de souris est viable et n’a pas de phénotype dommageable. Elle n’a pas non plus d’immunodéficience connu ou de phénotype immunologique. Pour effectuer nos analyses, nous devons fixer les tissus (aussi appelés organes) avec un produit chimique chimique afin de stabiliser les interactions entre les ribosomes et les protéines qui interagissent avec eux. . Nos résultats indiquent que si la fixation des organes récupérés a lieu après la mise à mort des souris alors la fixation n’est pas homogène et cela introduit des biais expérimentaux dans l’analyse de la composition des ribosomes. Pour réaliser des analyses fiables, les organes seront donc fixés sur les animaux sous anesthésie profonde sans réveil. Les tissus seront ainsi figés avant la mise à mort des animaux. Cette procédure garantit que les interactions entre les ribosomes et d'autres protéines restent inchangées, reflétant ainsi la situation réelle dans les cellules vivantes.
Bénéfices attendus
La réalisation de notre projet aura des apports importants pour la connaissance fondamentale sur les rôles spécifiques des ribosomes spécialisés présents dans chaque organe et permettra d’ouvrir une nouvelle voie de recherche afin de caractériser le rôle fonctionnel de l’interaction entre certains détecteurs de virus et les ribosomes, dans le cadre de la réponse immunitaire innée. En outre, les protéines identifiées comme associées aux ribosomes spécialisés dans les différents organes seront une ressource d’intérêt pour des chercheurs dans différents domaines de la biologie.
Procédures
Tous les animaux de notre protocole seront soumis aux interventions suivantes : changement d'animalerie 7 jours avant le début des expériences, injection sous-cutanée pour la livraison d’antalgiques : 1 fois par animal 30 minutes avant l'injection d'anesthésiques, durée de l’injection : 10 secondes puis 1 injection dans l'abdomen pour anesthésie profonde : 1 fois par animal, durée de l'injection : 10 secondes ; puis la cage thoracique sera ouverte par chirugie (temps de l'intervention 5 minutes) et une perfusion cardiaque sous anesthésie profonde (durée de la mise en place de la perfusion : 5 secondes, temps de perfusion : 12 minutes.
Impact sur les animaux
Cela entrainera donc un léger stress dû au changement d'animalerie, un léger stress dû à la contention puis une légère douleur due aux injections de l'antalgique et de l'anesthésique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort puis les organes d'intérêt seront prélevés afin d’analyser les ribosomes spécialisés et de les comparer entre les différents organes.
Remplacement
L’objectif de ce projet étant de connaitre les partenaires des ribosome in vivo et de comparer la liste de ces partenaires entre plusieurs organes il est nécessaire de travailler sur organisme entier. Les protéines identifiées dans notre étude pourront ensuite être validées et leur fonction cellulaire étudiée dans des modèles cellulaires in vitro.
Réduction
Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base de données préliminaires. Le nombre d'animaux dans chaque lot a été réduit au maximum et sera composé de 8 souris contrôles non transgéniques et de 8 souris transgéniques.
Raffinement
Les souris utilisées dans notre projet n’ont pas de phénotype dommageable. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée). Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, la perfusion des souris sera réalisée sous anesthésie profonde. Aussi, des antalgiques seront administrés aux souris avant l’anesthésie afin d’éviter d’éventuelles douleurs liées à la procédure de perfusion. Pendant toute la durée de l’anesthésie profonde, les animaux seront placés sur un tapis chauffant, afin de limiter les risques d'hypothermie, et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d'éviter les risques de sècheresse oculaire. En cas de problème non anticipé lors de la perfusion intracardiaque, la souris sera immédiatement mise à mort par dislocatoion cervicale.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier la composition des ribosomes notamment dans les cellules du système immunitaire présentes dans les organes du système immunitaire car il permet d’avoir accès à suffisamment de matériel biologique pour pouvoir réaliser des analyses biologiques. Par ailleurs, le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir réaliser, à terme des expériences d’infection par divers virus dans des animaux génétiquement modifiés afin de valider nos premiers résultats obtenus sur des lignées cellulaires. Nous utiliserons dans notre projet des animaux adultes afin d’étudier les fonctions des ribosomes dans des conditions physiologiques chez l’adulte.
Étude de la modulation de l’inflammation aiguë par induction de la senescence.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour une partie et sévère pour la majorité, 192 sur 228. Elles reçoivent des injections du vaccin anticovid de Pfizer pour induire des cellules sénescentes, puis des lipopolysaccharides ou une irradiation gamma pour déclencher une inflammation aiguë. Le porteur indique que ces agents peuvent provoquer un choc septique, de la fièvre, des tremblements et une prostration entre 15 et 48 heures après le traitement. Il affirme que la sénescence et l'immunité impliquent trop d'organes pour être reproduites en culture, ce qui rend selon lui le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
En vieillissant, l’organisme accumule des cellules potentiellement toxiques appelées « cellules sénescentes » ou CS. Leur impact sur le corps réduirait l’espérance de vie en favorisant l’apparition de différentes pathologies liées à l’âge. Il est généralement considéré que leur délétion diminuerait les comorbidités associées au vieillissement. Néanmoins, il a également été montré que la délétion de certains types de CS est néfaste pour certains organes, en particulier si les CS concernées font partie du système vasculaire. Leurs rôles et fonctions restent donc largement incompris et controverse. Ces CS s’accumulent soit lentement tout au long de la vie, soit au contraire apparaissent massivement à la suite d’un stress induit par une pathologie. Dans les 2 cas, il semble que ces cellules sénescentes puissent impacter le système immunitaire et notamment avoir des propriétés anti-inflammatoires. Des résultats récents laissent entendre que les cellules immunitaires sénescentes pourraient ainsi inhiber l’inflammation aiguë. L’objectif de ce projet est de déterminer si l’induction de la senescence a des effets protecteurs contre l’inflammation aiguë, permettant ainsi de diminuer les dommages tissulaires qui lui sont généralement associés. Pour répondre à cette question, nous utiliserons des modèles murins ou nous induirons, dans un premier temps l'apparition des CS en exposant nos souris au vaccin anticovid BNT162b2 de Pfizer. Puis, dans un second temps, nous exposerons les souris à des agents biologiques (lipopolysaccharides ou LPS) et physiques (rayonnement gamma) induisant une l’inflammation et des dommages cellulaires. Nous rechercherons ensuite dans les tissus de ces souris des signes de dommages cellulaires issus de l’inflammation aiguë.
Bénéfices attendus
L'inflammation et la détérioration des tissus qui lui est associée est une pathologie grave. Elle peut être causée par plusieurs facteurs, notamment une infection bactérienne ou virale, des maladies auto-immunes, plusieurs maladies associées au vieillissement comme le diabète ou des interventions cliniques comme la radiothérapie. L'inflammation est causée par une réponse incontrôlée ou prolongée du système immunitaire qui finit par produire des lésions tissulaires. Si nous pouvons trouver une nouvelle façon de contrôler ce processus, comme l’induction de cellules immunitaires sénescentes, nous pouvons établir de nouveaux protocoles pour combattre certains des symptômes les plus agressifs de certaines maladies comme l’infection par le SRAS-CoV-2 (covid) ou la septicémie. De plus, cela peut offrir une protection aux personnes qui subissent une radiothérapie pendant un traitement contre le cancer, en évitant les effets secondaires qui en découlent induits par les dommages tissulaires produits par l'irradiation. En outre, les patients atteints d'une maladie auto-immune comme le lupus peuvent être traités pour réduire ou retarder les symptômes de la maladie. En résumé, les bénéfices que la société recevra de ce projet pourraient avoir un impact sur la vie de nombreuses personnes.
Procédures
Injection intraperitoneale (maximum de 2 par souris, necessite quelques secondes), Irradiation (1 seule, necessite quelues minutes).
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable particulier n’est attendu dans la premiere des cinq procédures, sauf l’injection intrapéritonéal nécessaire pour traiter les souris avec le vaccin BNT162b2. En effet, celui-ci a déjà été testé sur différentes espèces animales aux doses indiquées sans compromettre le bien-être animal, et est couramment utilisé sur des patients humains lors d’essais cliniques dans différents pays. Trois procédures nécessiterons des injections IP de lipopolysaccharides. Les LPS sont de puissants agents inflammatoires pouvant notamment induire un choc septique, de la fièvre et une baisse de la pression artérielle. Nous attendons donc à une possible détérioration de l’état sanitaire de la souris entre 15 et 20 heures après l’injection de LPS. Cela pourrait se traduire par une prostration, des tremblements et une apathie de la souris. Afin de pouvoir intervenir rapidement et limiter au maximum leur souffrance si les souris atteignent un point limites, elles seront suivies au moins une fois par heures de 15H à 24H apres le traitement. Deux procédures nécessitant une exposition ont des rayons gamma induiront des symptômes similaires, mais décalé de 24 à 48H dans le temps.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
La senescence et le système immunitaire sont des processus impliquant une communication entre de nombreux tissu et organes différents, il est ainsi impossible de mimer leur interaction en culture cellulaire ou a l'aide d'un ordinateur. Pour ce projet, le recours à l’animal reste donc indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux proposés à utiliser au cours de ce projet a été déterminé pour garantir une population représentative permettant d'effectuer une analyse statistique valide.
Raffinement
Ce projet nécessite d’exposer nos modèles animaux à des traitements qui impacteront leur bien-être. Pour limiter au maximum leur souffrance, les souris seront suivies par les expérimentateurs à l’aide de fiches de scores adaptées aux procédures expérimentales qu’elles subiront, et permettant d’identifier précocement les animaux en souffrances. En effet, tant les signes de mal-être que leurs cinétiques d’apparition varieront suivant qu’on injecte des LPS ou qu’on expose les souris a des rayons gamma. Ces fiches comprennent des points limites qui correspondent à un score maximum prenant en compte les différents paramètres (comportement, état général, neuromusculaire, poids) et seront remplies tout au long de l'expérimentation. On notera en particulier un suivi chaque heure dans le cas des injections de LPS entre 15 et 24 heures post-traitement. Un soin particulier sera aussi apporté au suivi de leurs poids : une baisse de poids ≥15% par rapport au poids de la précédente pesée ou de ≥25% par rapport à la pesé avant traitement entraîneront une mise à mort. D'autre part, nous avons prévu un suivi sanitaire journalier par les membres de l’équipe (expérimentateurs + personnelles techniques). Nous nous assurerons que les souris ont un accès ad libitum a l’eau et la nourriture, qu’elles puissent satisfaire les besoins propres à leur espèce (abris pour souris, papier utilisable pour se faire un nid, petit bout de bois à ronger), litière en copeaux de bois. De plus, par souci de respect de la hiérarchie de l’espèce, les groupes expérimentaux seront formés au moment du sevrage et conservés intacts.
Choix des espèces
Il s’agit d’une étude exploratoire et innovante avec l’utilisation de modèles murins récents qui n'existent pas chez d'autres espèces. La souris, qui est l'animal le plus largement utilisé en recherche fondamentale, est particulièrement bien connue à tous les niveaux, a un cycle de reproduction court permettant une optimisation dans la sélection des génotypes d’intérêts. Notons également que cette espèce est facilement manipulable. La sénescence est un phénomène complexe impliquant plusieurs types cellulaires, voire plusieurs organes différents, comme le prouve sa composante immunitaire. Elle correspond à un processus impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, qui nécessite une étude au niveau de l’organisme entier. Les souris seront des adultes de 2 mois.
Collecte de sang frais d’ovins pour la mise en culture des bactéries exigeantes et pour la caractérisation des populations cellulaires immunes en Infectiologie animale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
30 moutons vont être utilisés comme donneurs de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prises de sang de quinze minutes, quatre à six fois par an, pour produire des milieux de culture au sang et caractériser des cellules immunitaires, sans infection sur l'animal. Le porteur indique que la contention peut provoquer un léger stress et un hématome, et que les animaux restent dans le troupeau, tués plus tard en fin de carrière et "valorisés". Il affirme qu'aucun milieu de substitution ne permet la croissance de l'agent de la tuberculose bovine, ce qui rend selon lui le sang de mouton non remplaçable.
Objectifs
C'est une procédure de production de géloses ou collecte de sang frais de mouton en continu réalisée pour les recherches en Sante animale. Les principaux objectifs du projet sont : 1) Produire les géloses au sang frais de mouton pour l’étude de Mycobacterium bovis, l’agent de la tuberculose bovine ; 2) Etudier et caractériser les populations immunitaires circulantes (macrophages, monocytes, neutrophiles, lymphocytes...) chez le modèle ovin dans un contexte infectieux comme par exemple la toxoplasmose ou la néosporose et 3) étudier les bactéries pathogènes exigentes et analyser in vitro leurs caractéristiques propres dont les facteurs de virulence (adhésion, pénétration cellulaire....). Nous confirmons que cette demande d'autorisation de projet ne tient compte que des prélèvements de sang sur tubes ou sur poches nécessaires à faire pour étudier les agents infections ou leur réponse immunitaire in vitro. Aucune infection ne sera réalisée in vivo. Les donneurs sont nos ovins de l’élevage.
Bénéfices attendus
Les projets de recherche des scientifiques ou autres partenaires ont pour but d’améliorer les connaissances sur la physiopathologie des maladies infectieuses comme par exemple la tuberculose bovine. Ces projets permettront d’identifier des biomarqueurs d’intérêt pour le diagnostic, de caractériser les populations immunitaires induites dans le cadre de la vaccination ou de traitements médicamenteux/alternatifs.
Procédures
Réalisation de prise de sang pour tube ou poche : entre 4 et 6 fois par an sur des animaux différents. Durée 15 min.
Impact sur les animaux
La prise de sang nécessite une contention de l’animal et peu engendrer un léger stress, ainsi qu’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement.
Devenir
Les animaux font partis de l’élevage ovin de l'établissement utilisateur, qui fournit une partie des ovins pour l’expérimentation. Pour les donneurs de sang, il y a deux possibilités : 1) soit des animaux en fin de carrière qui seront euthanasiés et valorisés lors du renouvellement du troupeau, 2) soit de des animaux plus jeunes, qui eux seront maintenus au sein du troupeau jusqu’à la fin de carrière et permettront ainsi d’assurer le renouvellement du troupeau. Dans les deux cas, il y a un replacement soit sur un an pour les fins de carrière (courte), soit maintenue au sein du troupeau plusieurs années (longue).
Remplacement
A ce jour, il n’y a pas de milieu de substitution pour la croissance de l'agent infectieux de la tuberculose bovine, nous ne pouvons donc pas remplacer le sang pour la préparation de nos géloses, de même que pour caractériser les populations cellulaires de l’immunité.
Réduction
Nous optimisons toutes nos productions et mutualisons les analyses entre nos projets afin de réduire au maximum nos besoins. Le nombre d’animaux inclus dans le protocole a été déterminé grâce à l'expérience réalisée en 2012 et en 2018. Dans cette étude, l'effectif est de 30 ovins sur 5 ans pour produire le sang nécessaire pour la production des géloses ou la caractérisation des populations cellulaires immunitaires, tout en respectant la règle du bien être-animal. Il n'y aura pas d'analyses statistiques réalisées sur cette étude
Raffinement
Il y aura un enrichissement social (vie en groupe) et de structure (mise en place de paille, de pierre de sel et hébergement en stabulation conventionnelle pour petits ruminants. Un point de compression est appliqué lors du prélèvement sanguin pour accentuer le gonflement de la veine et faciliter sa visualisation puis, après retrait de l’aiguille, sur le site de ponction, afin d’éviter les risques d'hématome (2-3 min). Des granulés sont distribués après chaque prélèvement (récompense positive).
Choix des espèces
C’est à partir de sang frais de mouton qu’a été mis au point le milieu de croissance pour les bactéries. Les ovins correspondent à l’espèce cible de nombreuses pathologies ovines, telles que la toxoplasmose ou la néospore, afin de caractériser leur réponse immunitaire induite Pour la production de milieux de culture, des ovins de fin de carrière seront utilisés pour la fourniture de sang. Pour la caractérisation des cellules immunitaires, ce sera des ovins d'âge variable en fonction de l'agent pathogène étudié.
Antibiorésistance et infections invasives à méningocoques – Étude dans un modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris reçoit une greffe de peau humaine sur le dos sous anesthésie, puis une injection de méningocoques qui déclenche une septicémie, évoluant selon le porteur d'une baisse d'activité vers la prostration puis la mort. Elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées car greffées et infectées, et sont tuées à la fin de chaque procédure. Le porteur décrit son modèle humanisé comme "le seul et unique" reproduisant ces infections chez la souris, pour étudier la résistance de la bactérie aux antibiotiques.
Objectifs
Les infections invasives à méningocoques sont causées par le méningocoque, une bactérie pathogène à Gram-négatif responsable de méningites et de chocs septiques. Ces infections restent malheureusement encore trop souvent létales malgré l’existence d’un traitement antibiotique. En effet, in vitro dans une boite de pétri, la bactérie est très sensible aux antibiotiques. Cependant, in vivo dans le corps humain, cette bactérie résiste aux traitements antibiotiques efficaces in vitro pour des raisons encore inconnues. L’objectif de ce projet est d’étudier les causes de cette antibiorésistance et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pour la contrer.
Bénéfices attendus
Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est à ce jour le seul et unique modèle murin permettant de reproduire chez la souris les grandes caractéristiques des infections invasives à méningocoques observées chez l’homme, à savoir la fixation et la multiplication des bactéries sur la paroi des vaisseaux sanguins entrainant le déclenchement d’une septicémie. A court et moyen terme, ce projet nous permettra : • D’étudier les déterminants impliqués dans la mise en place du phénomène de résistance aux antibiotiques • De tester et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrer la résistance aux antibiotiques A long terme nous espérons que ce projet permettra l’amélioration des traitements des infections invasives à méningocoques chez l’homme.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans cette étude sont greffés avec de la peau humaine. Le greffon est implanté sur le dos de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale d’une durée d’environ 30min réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux portent un bandage pour protéger le greffon pendant 7 jours. Une fois les bandages enlevés et au minimum 4 semaines après l’implantation du greffon, les animaux seront utilisés dans 2 types d’expériences : 1. Des expériences où les animaux seront infectés par l’injection intraveineuse de bactéries. Les injections se feront via la veine caudale sur des animaux vigiles placé dans un tube de contention pendant 2min. Les animaux seront infectés pendant 3, 6 ou 16 heures puis seront mis à mort. 2. Des expériences d’imagerie intravitale pour l’étude de l’infection via des observations en microscopie réalisée in vivo, chez l’animal anesthésié. À la suite de l’infection des animaux par l'injection intraveineuse de bactéries, les observations seront réalisées pendant une période maximale de 6h00.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des différentes procédures expérimentales présentes dans ce projet : • L’excision d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. • La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. • Lors des expériences d’infection par le méningocoque, les animaux infectés par l’injection intraveineuse de bactéries développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (plus de 24h post-infection).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni être réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront greffés avec de la peau humaine et infectés par le méningocoque.
Remplacement
Du fait de la spécificité du méningocoque pour les cellules humaines, la majorité des études portant sur cette bactérie utilisent des cultures in vitro de cellules humaines infectées, notamment des cultures de cellules endothéliales ou épithéliales, les deux types cellulaires sur lesquels la bactérie peut se fixer. Il est cependant encore impossible de reproduire in vitro la complexité du système vasculaire et son interaction avec le système immunitaire. Notre modèle murin humanisé par xénogreffe de peau humaine est le seul à ce jour à fournir ce niveau de complexité et représente donc un modèle de choix pour l’étude des infections invasives à méningocoques.
Réduction
Le calcul des effectifs des groupes d’animaux de cette étude s’est fait sur la base du retour d’expérience d’une précédente étude où nous avons pu identifier plusieurs causes potentielles de perte d’animaux lors de nos expériences : 1. Une mort prématurée lors de la chirurgie de greffe de peau : hémorragie, non réveil de l’animal… 2. Une mauvaise évolution du greffon au cours du temps conduisant à l’exclusion de l’animal : lésions de grattage, diminution importante de la taille… 3. Une mauvaise qualité du greffon : présence de peu de vaisseaux humains 4. Une mort prématurée de l’animal lors des infections
Raffinement
Les animaux immunodéficients étant considérés comme ayant un « phénotype dommageable », ceux-ci seront hébergés dans une animalerie au statut SPF (specific pathogen free). Une inspection quotidienne permettra de vérifier qu’il n’y a aucune détérioration de leur état due à une potentielle infection. 30 minutes avant le début de la chirurgie, les animaux sont prémédiqués avec l’injection sous cutanée d’un antalgique et d’un anti-inflammatoire non stéroïdien. La chirurgie (~30 min) est réalisée sur des animaux anesthésiés,. Avant de placer les animaux greffés dans leur cage de réveil, ceux-ci sont réhydratés par une injection sous-cutanée de sérum physiologique. Les animaux sont ensuite placés dans une cage de réveil, propre et placée sous une lampe chauffante. Un gel de réhydratation enrichi en sucres est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie. Si des signes de souffrance persistent 3 jours après la chirurgie (poils hérissés, changements d’expressions faciales, abattement, perte d’activité …), les animaux sont mis à mort. Les animaux sont observés quotidiennement les 5 premiers jours suivant la chirurgie pendant le port de leur bandage afin de détecter des signes éventuels de souffrance et vérifier l’intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l’animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie. Si l’animal a détérioré son bandage et lésé le greffon de peau humaine, l’animal est mis à mort. Une fois le bandage enlevé, l’évolution des greffons est suivie hebdomadairement pendant 4 semaines. Les animaux sont placés après infection dans des cages contenant des gels de réhydratation enrichi en sucres et dont la moitié du sol de la cage est chauffé à l’aide de chaufferettes pour aider au maintien de la température corporelle des animaux infectés. Lors des expériences d’exploration par microscopie optique confocale, les animaux reçoivent un traitement préopératoire analgésique 30 min avant le début de l’anesthésie et la chirurgie permettant d’exposer le greffon pour l’observation des vaisseaux humains. Les animaux ayant subi une xénogreffe de peau humaine sont hébergés au nombre de 3 par cage dans des cages contenant du coton et un igloo. Des points limites sont établis pour chacune des procédures expérimentales et associés à des interventions pour réduire leur impact sur le bien-être animal.
Choix des espèces
Cette étude utilise des souris car le système vasculaire et immunitaire de la souris est proche du système vasculaire et immunitaire humain. De plus les modèles immunodéficients disponibles chez cette espèce en font le modèle le choix pour la xénogreffe de peau humaine. Les greffes de peau humaine sont réalisées chez des souris adultes immunodéficientes âgées de 6 à 12 semaines, période pendant laquelle la prise du greffon est maximisée selon nos observations. Les expérimentions sont ensuite réalisées 4 semaines minimum après la chirurgie, période nécessaire à une bonne prise du greffon.
Etude de l’inactivation d’un gène pour un modèle de neurocristopathie
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
896 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour un modèle génétique de malformations de la face et de l'intestin. Le porteur indique que les souriceaux les plus atteints meurent après la naissance de malformations qui les empêchent de se nourrir, et qu'une analgésie n'est pas possible pour ces animaux trop fragiles pour survivre au sevrage. La survie d'une partie est suivie pendant trois semaines au maximum avant mise à mort, tandis que des femelles et des mâles reproducteurs sont gardés et réutilisés pour d'autres portées. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour ces maladies rares et qu'il est "nécessaire" de faire naître des animaux.
Objectifs
Il existe dans la cellule des processus de régulation de la production d'energie. Nous avons montré que l'inactivation de l'une de ces voies dans les cellules à l'origine de la formation des os de la face et du système nerveux de l'intestin aboutissait à la naissance de souriceaux présentants de graves malformations de la face et de motricité digestive. Dans notre modèle génétiquement modifié dans lequel une voie de production d'ernergie est inactivée,nous inactivons un second gène. Il est décrit dans le littérature scientifique que cela avait des effets bénéfiques dans d'autres pathologies de la même famille.
Bénéfices attendus
Les malformations associées aux defauts de développement que nous étudions sont à l'origine de maladies congénitales chez l'enfant qui se traduisent comme dans notre modèle par des malformations de la face et du système nerveux de l'intestin. Ce groupe de maladies s'appelle des neurocristopathies. Parmi les plus connues il y a le syndrome de Hirschsprung et celui de Waardenburg. D'autres malformations sont aussi concernées comme celles qui surviennent suite à la consommation d'alcool pendant la grossesse ou la prise de médicaments dit tératogènes, c'est à dire qui peuvent induire des malformations du foetus lorsqu'ils sont pris en période de grossesse. Ce sont des maladies orphelines, pour lesquelles presque aucun traitement n'est disponible à ce jour. Les bénéfices attendus sont notamment une amélioration de nos connaissances sur le rôle des processus cellulaires de production d'ernergie et du métabolisme en général dans l'apparation de ces syndromes.
Procédures
Bien que le phénotype attendu soit sévère nous utilisons 42 % des animaux produit à la naissance ou avant. Pour ces animaux il n'y aura aucune souffrance. Pour 7% nous étudierons leur survie après inactivation d'un gène, pour une période de 3 semaines maximum. Les animaux seront observés et monitorés selon les points limites décrits dans le projet. Enfin 59% sont des animaux d'élevage pour lesquel il n'y aura aucune souffrance. Pour suivre les animaux reproducteur nous effectuerons avant leur 15jours un tatouage aux phalanges en conformité avec les recommandations de la CNEEA et sous la supervision de notre SBEA. En outre pour le génotypage de nos animaux, nous effectuerons 1 biopsie de moins d'un millimètre de large à l'oreille.
Impact sur les animaux
Les animaux les plus sévèrement atteint meurent après la naissance à cause de multiples malformations qui les empêches de se nourrir et de digérer normalement. La gravité de ces malformations est variable d'un individu à l'autre et les points limites nous permettrons de minimiser la souffrance de ces animaux. Une analgésie n'est pas possible pour ces animaux fragiles qui ne survivront pas jusqu'au sevrage. La biopsie pour le génotypage des individus pourra produire douleur légère de courte durée au moment du prélèvement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure car leur maladie est sévère et incurable. L'euthanasie sera suivi de prélèvement post mortem pour des études de biologie moléculaire et d'histologie.
Remplacement
Nous travaillons sur des syndromes liés à des défauts de développement embryonnaire. Ces pathologies génétiques rares au tableau clinique complexe n'ont pas de modèle in vitro. En parallèle d'études des mécanismes moléculaires in vitro sur une lignée de cellule de crêtes neurales, il est nécessaire d'étudier le devenir de ces cellules in vivo, dans leur microenvironnement. Pour étudier l'impact réel des modifications génétiques sur l'évolution de ces pathologies, nous devons faire naitre des animaux.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux à faire naitre, nous obtimisons nos croisements pour maximiser les chances d'obtenir. Pour la réalisation d'une coube de survie, la dispersion le long de l'axe temporel nécéssite que nous utilisions 10 individus pour nos statistiques. hormis cette expérimentation, toutes nos analyses sont réalisés sur des tissus post-mortem. La pénétrance du phénotype étant variable d'un individu à l'autres 10 individus permet de nous assurer que nos conclusions sont robustes.
Raffinement
Les femelles seront regroupées et réutilisées après l'expérimentation pour générer d'autres portées. Les points limites prédictifs et précoces sont en place pour éviter toute souffrance aux animaux. (mise à mort si perte de poids, euthanasie des animaux avant l'apparition des tumeurs chez nos animaux reproducteurs. Les mâles reproducteurs devront être isolés après les accouplements car il n'est plus possible de les mettre entre mâles et les laisser avec des femelles engendrerrait trop de portées inutiles. Les cages font déjà l'objet d'un enrichissement important dans toutes les cages. Les cages ouvertes dans notre animalerie permet des échanges olfactifs et visuels. Les mâles pouvant reservir pour de nombreux accouplement nous les gardons pour les réutiliser.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré dont de developpement de l'embryon est très proche de celui de l'Homme, En outre, nous avons déjà beaucoup de donnée dans nos modèles animaux. Nous travaillons à la compréhension du famille de maladie du developpement induisant des malformations graves chez les enfants. Nous travaillons donc à un stade embryonnaire E15,5 et avec des animaux nouveaux-nés. Nous travaillons aussi avec quelques animaux en période de lactation pour évaluer l'évolution de la pathologie les jours suivants la naissance après des traitements correcteurs.