Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Amélioration de la greffe d’ilots par thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
65 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent un vecteur viral et des immunosuppresseurs, puis subissent une greffe de cellules pancréatiques dans le foie par voie portale, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires, pour tester une thérapie génique censée rendre le foie tolérant à la greffe. Le porteur indique un risque de saignement à l'injection dans la veine porte et une baisse d'immunité exposant aux infections. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne mime l'organisme receveur, tout en reconnaissant que le passage à l'humain supposerait d'abord un partenariat industriel et des validations chez le primate.
Objectifs
L'objectif du projet est de jeter les bases expérimentales d'une nouvelle approche de la greffe d'îlots de Langerhans en clinique humaine. Celle-ci s'effectue actuellement avec des îlots de donneur ou, dans les essais thérapeutiques en cours, avec des cellules pancréatiques issuées de cellules souches humaines. Dans les 2 cas, une immunosuppression importante est necessaire pour tolérer les cellules greffées. Comme les îlots greffés son transplantés dans le foie du receveur par voie portale, notre approche originale est de rendre le foie receveur tolérant aux cellules issues du donneurou cellules souches le cas échéant. Nous avons conçu une stratégie qui consiste à introduire dans les hépatocytes le gène d'une cytokine anti-inflammatoire (IL 10). Pour effectuer ce transfert, nous utiliserons un vecteur viral adéno-associé (AAV) employé actuelleent dans la grande majorité des thérapies géniques (+ de 200 essais de phase 1 ont utilisé/utilisent ces vecteurs pour véhiculer des gènes thérapeutiques). Le vecteur portant le gène de l'IL10 sera injecté au receveur avant la greffe d'îlots. Les cellules hépatiques capteront le vecteur et exprimeront le gène thérapeutiue dans les 2 semaines qui suivront. L'IL10 produite permettra de réduire, voire d'inhiber la réaction immunologique de rejet du greffon qui sera implanté un mois après l'administration du vecteur.
Bénéfices attendus
Après l’achèvement du projet chez le rat, nous aurons en cas de succès obtenu la preuve de concept d’un procédé permettant de rendre le foie d’un patient diabétique tolérant aux îlots (ou aux cellules souches qu’on lui greffera). Dans la mesure où la thérapie génique par vecteurs AAV étend actuellement ses applications à de nombreuses maladies humaines, la biodistribution et la tolérance de ces vecteurs ont été largement étudiées chez l’homme et ne représenteront aucune barrière inattendue dans notre projet clinique. On peut donc en cas de succès chez le rat anticiper une forte probabilité de transfert aux patients diabétiques de type 1, chez qui les greffes restent actuellement très restreintes du fait des limites et des complications de l’immunosuppression. Pour réaliser ce transfert, il faudra très probablement aborder un partenariat avec une société biotechnologique disposant des moyens financiers suffisants pour conduire des validations spécifiques chez le primate et aller vers l’homme.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirugicale, à savoir la greffe de cellules pancréatiques. De plus, les animaux recevront des administrations de médicaments immunosuppresseurs et d'adénovirus 4 semaine avant la greffe. Enfin, les animaux seront prélevés de sang de façon hebdomadaire (
Impact sur les animaux
La transplantation des ilots de Langerhans se faisant dans le systeme sanguin portal, cela peut engendrer des saignements +/- abondants localement. Ceux-ci seront controler par l'application d'eponge hemostatique au niveau du point d'instillation de la veine porte. Cependant, il est eventuellement possible qu'un leger signement persiste après suture et réveil de l'animal (peu probable). Egalement, du fait des traitements immunosuppresseurs, les animaux traités verront leur immunité diminuée. Ils pourraient être eventuellement plus sensible aux infections. Une vigilance accrue sera prévue.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole.
Remplacement
Le projet a pour objectif général l'amélioration de la transplantation de cellules pancréatiques humaines. Il n'existe à ce jour aucune methode alternative efficace nous permettant de mimer l'organisme receveur. L'emploi d'animaux est essentielle dans un tel projet. Néanmoins, des manipulations in vitro préalables nous permettront de déterminer les meilleures concentrations cellules/virus.
Réduction
en fixant un niveau de confiance de 95%, une puissance statistique supérieure à 80%, il faut au minimum 4 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence statistique significative Le choix est donc orienté sur 5 animaux- receveurs par groupe pour pallier toute défaillance technique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement favorable à leur bien-être. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé et habitué à ce genre de geste. Pour la transplantation faite sous anesthésie, un traitement anti-douleur local sera pratiquée, et pour des douleurs plus globales, un traitement systémique est prévu. Afin de suivre le moindre inconfort, nous avons élaborer un arbre décisionnel afin d'adopter les bons gestes et soins suivant les cas (Comportement, Plaie, perte de poids). Si toutefois, ces soins étaient insuffisants pour améliorer la santé de l'animal concerné, nous procéderons à l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Le choix s'oriente chez le rat pour plusieurs : - Taille compatible avec un chirurgie (transplantation intra-hépatique aisée et moins dommageable que chez la souris) - Capacité d'hébergement adapté
Suivi fonctionnel et biologique de souris Apc pré-cachectiques et cachectiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et l'autre dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation qui provoque un cancer de l'intestin et une fonte musculaire, avec sang dans les selles et prolapsus, subissent des tests fonctionnels et des prélèvements de tissus, pour étudier l'activation de l'axe hormonal du stress lors de la cachexie cancéreuse. Le porteur classe le maintien de cette lignée en gravité sévère à cause de la souffrance liée à l'avancée de la maladie et prévoit une mise à mort dès l'apparition de ces signes. Il affirme qu'un système in vitro ne reproduit pas la complexité de ce processus et que seul le modèle murin le permet, les stratégies thérapeutiques restant à proposer.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peut être observé dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Les travaux antérieurs conduits par notre équipe de recherche chez un modèle murin de cancer de l'intestin, ont mis en évidence une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien) associée à une augmentation de la concentration en glucocorticoïdes dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez ces souris.
Bénéfices attendus
En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope dans un modèle pré-clinique de cachexie associée au cancer.
Procédures
Les animaux subiront : 2 tests fonctionnels non invasifs et indolores d'environ 5 à 10 min chacun en fonction de la participation volontaire de l'animal, soit un prelèvement sous anesthésie gazeuse d'une durée de 5 min, soit 1 procédure invasive sous anesthésie générale et sans réveil d'une durée de 1h30; enfin les prélèvements tissulaires seront réalisés sous anesthésie chimique sans réveil.
Impact sur les animaux
Concernant les souris contrôles, aucune nuisance n'est attendue à l'exception du prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse. Concernant les souris spécifiques (s'agissant d'un génotype dommageable : suivi et entretien de la lignée), certaines nuisances peuvent apparaitre (sang dans les fèces, prolapsus). Compte tenu des risques de souffrance pouvant apparaitre en lien avec l'avancée de la maladie, le maintien et l'entretien de la lignée implose une classification de gravité sévère. Dans les cas où ces symptômes évocateurs d'une souffrance animale seraient atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole et une mise à mort éthique sera effectuée sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de procéder aux différentes analyses et prélèvements de tissus.
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en oeuvre.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal : surface de section transversale des fibres musculaires qui permet d'apprécier l'ampleur de la perte de masse musculaire Après avoir intégré différents paramètres statistiques, il ressort que 12 animaux/groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 14 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront utilisés qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 12 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R et nous permettra d’évaluer les différences significatives pour l'analyse des données.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères : le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
L'essentiel des études expérimentales consacrées à la cachexie associée au cancer a été réalisé en utilisant des modèles souris de cancer. En travaillant sur le modèle souris nous pourront donc comparer nos données à celles de la littérature scientifique. Par ailleurs notre expertise scientifique et technique sur le modèle souris, nous permettra de réaliser ce projet sans étape de mise au point préalable. Afin d'étudier la régulation de l'axe corticotrope lors de la cachexie associée au cancer, les souris seront analysées à un stade pré-cachectique (absence de perte de masse musculaire) à l’âge de 11 semaines et à un stade cachectique (présence d'une perte de masse musculaire) à l'âge de 15 semaines. Nos travaux antérieurs ont permis de valider ces 2 points d'analyse. Des souris de type sauvage issues des mêmes portées que les souris mutées seront utilisées comme animaux contrôles.
Optimisation du schéma d’administration de molécules permettant de rentrer dans le cerveau chez le babouin
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
3 babouins juvéniles vont être utilisés, maintenus en vie et destinés à d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut être anesthésié jusqu'à dix fois pour recevoir des injections intraveineuses de fragments d'anticorps et subir seize prélèvements sanguins de 8 mL, avec deux périodes d'isolement d'une semaine, afin de mesurer la disponibilité de vecteurs censés faire passer des médicaments dans le cerveau. Le porteur indique un stress de capture, des suites d'anesthésie comme des vomissements et un réveil long, et des hématomes liés aux prélèvements répétés. Il affirme qu'il est "nécessaire" de passer par le primate non-humain avant l'humain, cette étude préparant une future étude d'efficacité dont les retombées contre les maladies neurodégénératives restent lointaines.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives cérébrales (Alzheimer, Parkinson, Sclérose latérale amyotrophique, etc…) sont des troubles neurologiques majeurs pour lesquels aucun traitement efficace n’existe et la plupart des traitements pour ces pathologies ne ciblent pas les mécanismes à l’origine de leur développement. Le cerveau est protégé des pathogènes qui pourraient circuler dans le sang par ce qu’on appelle la barrière hémato-encéphalique (BHE). La BHE est imperméable au passage de la plupart des agents thérapeutiques développés par l’industrie pharmaceutique. Nous développons des Vecteurs (V : petits fragments d’anticorps) qui vont se fixer sur des récepteurs présents à l’intérieur des vaisseaux sanguins du cerveau et qui, comme pour les nutriments, vont les faire passer au travers de la membrane des capillaires cérébraux. En couplant nos vecteurs à des molécules thérapeutiques nous sommes capables de délivrer dans le cerveau des médicaments qui autrement ne pourraient pas y aller. Au cours de différentes études réalisées chez la souris, nous avons démontré l’efficacité de nos vecteurs dans ce domaine. L'objectif de la présente étude est de quantifier la disponibilité de deux de nos vecteurs (étude pharmacocinétique simple) une fois injectés dans le sang chez 3 babouins et ceci de façon préalable à une future étude d’efficacité où nous couplerons à nos vecteurs à un agent thérapeutique (étape nécessaire pour valider l’aspect translationnel vers l’Homme en fin d’étude préclinique). En effet les résultats de cette étude nous permettront de définir les modalités optimales du schéma d'administration pour l'étude d'efficacité (la dose, une injection ou plusieurs, en bolus ou en infusion).
Bénéfices attendus
Les enjeux de la réussite d'un tel projet sont assez conséquents. En effet si nos vecteurs sont en capacité d'emmener dans le cerveau des médicaments qui ne pouvaient l'atteindre jusqu'à présent le potentiel est énorme pour le traitement de très nombreuses pathologies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, Sclérose latérale amyotrophique, etc…). A court terme nous comptons grâce à cette étude en planifier une autre qui aura pour but d'emmener dans le cerveau des médicaments qui auront pour but d’empêcher certaines cellules à fabriquer des facteurs responsables de maladies. Ainsi les limites des applications et des cibles de ces médicaments vont bien au-delà des médicaments classiques car ils vont faire synthétiser ou inhiber la synthèse par ces cellules des facteurs absents ou responsables de l'apparition des pathologies. Les bénéfices à long terme de ce projet sont donc de combattre plus efficacement les maladies neurodégénératives cérébrales. A court terme les résultats de cette étude nous permettront d’établir le schéma d’administration de nos composés pour la future étude d’efficacité où sera couplé ce type de molécule thérapeutique.
Procédures
Au cours de la 1e anesthésie, les 3 babouins recevront une injection intraveineuse (
Impact sur les animaux
Stress lors des captures. Anesthésies et conséquences (détresse respiratoire, réveil long, vomissement, dysorexie). Isolement d'une semaine en groupe. Prélèvements sanguins répétés (hématomes). Douleur au site d'injection intramusculaire.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les sujets seront maintenus en vie car les prélèvements et injections ne sont ni invasifs ni douloureux, ils seront donc replacés dans leurs groupes sociaux respectifs. Ils pourront potentiellement être réutilisés dans d'autres projets en prenant en compte l'effet cumulatif.
Remplacement
Toutes études de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécanistiques et physiologiques des mammifères proches de l’Homme. Après les phases précliniques menées chez le rongeur pour les récepteurs ciblés, il est nécessaire de passer chez le primate non humain pour évaluer le potentiel translationnel chez l’Homme avant le passage en clinique réglementaire. Le babouin olive représente un de ces modèles qui permet d’étudier ce potentiel. Le développement de nos vecteurs ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des séquences des vecteurs qui vont être testées passe chronologiquement par une phase d'analyses des différents vecteurs sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux. Ces dernières sont ensuite testées in vitro sur lignées cellulaires avant le passage sur modèles souris avant d’envisager le passage sur PNH.
Réduction
La conception de ce projet vise non seulement à réduire au maximum l’utilisation des primates non-humain (PNH), mais aussi de limiter les interventions à des manipulation transitoires, peu invasives et non terminales. L’expérience acquise chez la souris mais aussi les investigations préalables menées chez le PNH en terme immunogénicité et d’endotoxines permet de se contenter de ce petit n. Le fait de tester également 2 versions de nos vecteurs chez les mêmes animaux nous permet de ne pas inclure 3 animaux supplémentaires et donc de réduire le nombre de babouins utilisés.
Raffinement
Les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). En infirmerie, le programme est renforcé par 2 à 4 enrichissements supplémentaires par jour (manipulatoire, alimentaire, visuel, auditif...) Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. La capture est toujours réalisée en privilégiant une méthode sans contention (ni chimique, ni physique). Elle consiste d’abord à isoler l’animal lors de son passage dans le tunnel de son hébergement. Une fois isolé dans le tunnel, l’animal est transféré dans une boite de transport accolée au tunnel puis transféré dans une zone d’isolement temporaire avec une cage à fond amovible. Les administrations et prélèvements seront réalisés sous anesthésie : les animaux seront sédatés par injection intramusculaire seule ou suivie d'un relais gazeux. Pendant toute l’anesthésie les individus seront surveillés et monitorés et des mesures de réchauffement sont mises en place (matelas air chaud pulsé et couverture de survie). Pour compenser les 4 prélèvements sanguins au cours de la 1e anesthésie, un bolus de perfusion sera administré à la fin du 4e prélèvement. Les animaux seront réveillés par arrêt des gaz anesthésiants mais également injection intramusculaire d’antidote ce qui permet un réveil plus rapide. Pour limiter l’apparition des hématomes, une alternance entre côté droit et gauche sera respectée entre chaque prélèvement. A la fin de chaque prélèvement un point de compression sera appliqué à la main pendant 1 à 3 minutes afin de limiter le risque d’hématome. Les individus seront hébergés pendant toute la durée du projet entre eux en groupes sociaux. Ils seront seulement séparés de leurs groupes de façon transitoire au moment des prélèvements (soit pendant 1 semaine) et toujours avec un congénère. Les animaux seront réintroduits dans leurs groupes sociaux dès le réveil de l'anesthésie du dernier prélèvement, après validation de l’état de santé par un vétérinaire, suivant la procédure validée par la Structure chargée du Bien Être Animal (SBEA).
Choix des espèces
Après les phases précliniques menées chez le rongeur wild type et humanisé pour les récepteurs ciblés, il est nécessaire de passer chez le primate non humain pour évaluer le potentiel translationnel chez l’Homme avant le passage en clinique réglementaire. Nous avons choisi des stades de développement précoces (juvéniles) car à ce stade le développement des récepteurs à la transferrine sur la BHE est déjà stable. De plus à ce stade les animaux ne dépassent pas 8kg et il nous est donc possible de produire la quantité de vecteurs nécessaire pour cette étude en interne, ce qui n'aurait pu être le cas pour des individus plus âgés. Par conséquent les animaux seront sélectionnés entre 8 mois et 4 ans afin de garantir un poids inférieur à 8kg.
Mécanismes des récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, dont 752 en gravité sévère. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau, implantation d'électrodes de deux à six heures et injection de virus, puis des enregistrements neuronaux pendant l'éveil et le sommeil et des tests comportementaux aversifs, pour étudier des récepteurs du glutamate liés à la mémoire de la peur et à l'anxiété. Le porteur qualifie ces procédures comportementales de "modérément aversives et brèves" sans détailler les tests, et signale des douleurs postchirurgicales, des risques anesthésiques et un isolement. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne préserve un réseau neuronal intact, les retombées contre les troubles anxieux étant renvoyées au long terme.
Objectifs
Le projet se déroulera dans deux EU différents. La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté à ce projet par rapport au projet principal déjà autorisé. Le projet vise à l’étude des récepteurs ionotropiques du glutamate, qui font partie d’une grande famille de récepteurs aux neurotransmetteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le cerveau des vertébrés. Ces récepteurs du glutamate jouent un rôle central dans la communication entre neurones et dans les processus cognitifs tels que l’apprentissage et la mémoire. Les récepteurs du glutamate étant impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’une sous-population de récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement, dans un cadre physiologique et pathologique. Il s’agira notamment de comprendre l’importance de ces récepteurs dans la formation et la stabilisation des souvenirs associant un contexte à une émotion donnée et leur implication dans les comportements liés à l'anxiété. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à la réactivation et la coordination de plusieurs structures cérébrales pendant l'exécution et la consolidation des souvenirs aversifs dépendante du sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements in vivo chez des souris libres de leurs mouvements et endormies. L'identification des processus de formation de souvenirs émotionnels est essentielle pour comprendre comment ces processus sont affectés dans la maladie. Ce projet devrait permettre des avancées scientifiques sur les mécanismes et la diversité des récepteurs du glutamate, sur la régulation des signalisations neuronales et des fonctions cérébrales et comportementales associées. Notre travail ouvrira de nombreuses perspectives tant avec des implications importantes sur notre compréhension de la neurotransmission et le développement de nouveaux agents protecteurs contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Ainsi des retombées sont attendues tant dans le domaine fondamental qu’appliqué (développement de nouvelles stratégies thérapeutiques).
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ces troubles touchent environ 15 à 20 pourcent de la population à un moment ou un autre de leur vie. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Les animaux provenant de notre établissement seront impliqués dans 2 transports (aller et retour). Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr) avec ou sans comportement (1h maxi / jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) comportement 2) injection de virus + comportement 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones + comportement. Seule l'injection de virus sera réalisée dans notre EU(2). L'ensemble des autres procédures est réalisé dans l'EU1. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui, selon les besoins, pourra permettre des prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes (hors enregistrement de l’activité neuronale et comportement) est réalisés sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement nécessaire à la préservation des électrodes (stress modéré) ; comportement (stress modéré) ; 2 transports entre les établissements utilisateurs (source de stress) ; identification génétique des animaux réalisés par prélèvement de quelques millimètres à l’extrémité de la queue (douleur légère et stress de courte durée).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure, au sein de l'établissement d'origine des animaux, afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Ce projet est réalisé sur deux établissements et a déjà été autorisé pour l'établissement n°1. Aucun animal supplémentaire n'a été ajouté.
Remplacement
Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 2104 animaux: dont 1920 impliquées sur ce site.
Raffinement
Après leur réception, les animaux sont habitués aux expérimentateurs par une manipulation bienveillante pendant 5jrs (5min) de manière à réduire le stress lors des procédures. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes ou individuellement et disposeront d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur, les animaux seront exclus du protocole. Les procédures comportementales sont modérément aversives et brèves et n'induisent pas d'angoisse sur le long-terme.
Choix des espèces
Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage la qualifient comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Nous utiliserons des souris non génétiquement modifiées et des souris génétiquement modifiées dans le cadre de ce projet. Ces souris se développent normalement et ont un comportement général sans anomalies évidentes. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Prélèvement de tissus pour caractérisation d’animaux génétiquement altérés dans les domaines cardiovasculaire et oncologique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
3000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit un prélèvement du bout de la queue de moins d'un millimètre, sans anesthésie avant l'âge de quinze jours, pour un génotypage servant à trier les lignées d'élevage destinées à des projets cardiovasculaires et oncologiques. Le porteur indique que les animaux jugés non utiles seront mis à mort après le résultat, environ 300 étant maintenus en vie pour la reproduction ou d'autres expériences. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible pour ce prélèvement et décrit une méthode transitoire, en attendant la validation d'un génotypage sur poils présenté comme moins douloureux.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la cause la plus fréquente de décès en Europe et dans le monde. Elles sont associées au vieillissement, à l’obésité, au diabète, et à l’inflammation chronique qui accélèrent ainsi le vieillissement cardiovasculaire et contribuent à la mortalité et à la morbidité chez les patients âgés. Nous utilisons pour les projets concernés des souris pour lesquelles certins recepteurs sont absents. Dans l'objectif de comprendre la survenue du psoriasis paradoxal sous traitement avec des médicaments qui diminuent le facteur de nécrose tumorale. Nous utilisons pour ces études des souris génétiquement modifées pour lesquelles il est necessaire de réaliser la caractérisation et donc procéder à des prélévements de tissus pour analyse génétique.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique permet d'optimiser la gestion de l'élevage et de produire les animaux d'intérêt.
Procédures
Pour chaque individu, 1 prélèvement de bout de queue inférieur à 1 mm sans anesthésie . Extrêmement rarement, pour vérifier des résultats, un prélèvement de bout d'oreille (
Impact sur les animaux
Les risques de saignement prolongé, de cicatrisation lente ou de rejet par la mére sont extrêmement rares.
Devenir
Dés résultat de génotypage, les animaux non utiles seront mis à mort. Les animaux utiles pour les projets ou l'élevage seront maintenus en vie et seront en utilisation continue pour des expériences qui seront décrites dans des DAP spécifiques
Remplacement
Pas de remplacement possible sur le projet de prélévement de tissus. L’approche de remplacement est prise en charge dans chaque projet autorisé.
Réduction
La reproduction n’est utilisée que pour produire le nombre d’animaux prévue dans les projets considérés. Les caractéristiques de reproduction propres à chaque lignée (nombre de petits par portée, nombre de modifications génétiques,…) sont pris en compte pour planifier la fréquence et le type de croisements. Les lignées qui ne seraient plus utilisés (fin de projet) ne seront pas maintenues respirantes, et seront congelés. Cette méthode de prélèvements de tissus sera utilisée jusqu’à validation des méthodes de caractérisation génétique à partir de prélèvement de poils moins douloureux.
Raffinement
Les prélèvements sont réalisés par des personnels expérimentés, selon une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée, limitant stress, douleur et saignement. L'anesthésie est prévue sur les animaux de plus de 15 jours. Une surveillance et un suivi de la cicatrisation est réalisé dans les jours suivant le prélèvement.
Choix des espèces
Les lignées en élevage sont définies par les besoins des projets autorisés. Les prélèvements sont réalisés avant ossification de la queue pour limiter douleur et stress.
Rôle du récepteur au LDL cholestérol dans les effets hypocholestérolémiants du bypass gastrique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit un génotypage par biopsie de la queue, une chirurgie de bypass gastrique ou une simple laparotomie sous anesthésie, des prélèvements sanguins hebdomadaires puis une mesure létale de l'absorption du cholestérol, pour étudier le rôle d'un récepteur intestinal dans les effets de la chirurgie bariatrique. Le porteur indique une mortalité postopératoire de 0 à 30 %, des douleurs sur cinq jours, un risque de désunion de la cicatrice et une dénutrition. Il affirme que ce système biologique intégré ne peut pas être "substitué" par des approches in vitro et ne retient que les expériences jugées "indispensables".
Objectifs
L’obésité, problème majeur de santé publique concernant actuellement plus d’un adulte sur 20 dans le monde, est associée de manière significative à de nombreuses complications métaboliques. La chirurgie bariatrique est le traitement de référence de l’obésité. L’objectif de ce projet est d’étudier la fonction intestinale d’un récepteur présent à la surface des cellules intestinales sur les effets hypocholestérolémiants de ces chirurgies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus d’un tel projet s’inscrivent dans la réflexion, d’actualité, autour des chirurgies métaboliques et de leur indication chez des patients obèses présentant des comorbidités variées. Les retombées attendues d’un tel projet seront une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques du bypass gastrique. Ces données pourront permettre, à l’avenir, de mieux adapter le type de chirurgie au profil métabolique des patients, voire de développer des molécules pouvant cibler ces mécanismes pour le traitement des dyslipidémies.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie caudale à l'âge de 5-6 jour pour déterminer par PCR leur génotype. Les animaux subiront tous une chirurgie de type By-pass gastrique Roux en Y (RYGB) ou laparotomie seule (Sham) sous anesthésie générale et analgésie appropriée. Du sang sera prélevé à l’extrémité de la queue après anesthésie cutanée locale chez les animaux vigiles avant la chirurgie puis une fois par semaine. A J21 après la chirurgie, une mesure de la tolérance au glucose sera réalisée par gavage d’une solution glucosée. Du sang sera prélevé à la queue chez les animaux vigiles 0, 15, 30, 60 et 120 min après le gavage. Les animaux seront ensuite euthanasiés par ponction cardiaque (prélèvement de 1mL de sang) après mesure de l’absorption et de l’excrétion du cholestérol sous anesthésie générale et analgésie appropriée.
Impact sur les animaux
La biopsie caudale initiale de génotypage induit une douleur légère de courte durée. En tant que protocole sévère, les effets indésirables attendus sont : - Une mortalité entre 0 et 30% après chirurgie - Des douleurs pendant les 5 premiers jours qui nécessitent une antalgie appropriée - Un risque de désunion cicatricielle post-opératoire qui nécessite une surveillance biquotidienne initiale - Une dénutrition qui nécessite une supplémentation ferrique et vitaminique quotidienne
Devenir
La mesure de l’absorption intestinale et de l’excrétion du cholestérol est une procédure létale.
Remplacement
Les conséquences physiologiques des chirurgies bariatriques impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Il n’existe pas malheureusement à l’heure actuelle de méthodes ex vivo / in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de la chirurgie bariatrique.
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
Des protocole péri-opératoire et post-oératoire ont été mis en place afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal, et palier aux risques d'anémie et de carences nutritionnelles. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Les souris seront nourries avec une nourriture sous forme de gel riche en graisse ( de J1 à J5, puis le régime riche en graisse sous forme solide sera réintroduit à partir de J3. Les souris seront placées en couveuse pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.
Choix des espèces
Les conséquences physiologiques et métaboliques des chirurgies bariatriques impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les différentes voies et les transporteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines et dans les pathologies hépatiques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. A ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale. A 8 semaines, les souris seront mises sous un régime hyperlipidique pour atteindre (après 12 à 16 semaines) un poids supérieur à 40g compatible avec une bonne tolérance aux chirurgies bariatriques
Etude des conditions de réception des poissons au sortir des dispositifs de dévalaison et des ouvrages évacuateurs
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
400 saumons atlantiques au stade smolt vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés dans la rivière. Chaque individu est hameçonné sous anesthésie puis lâché dans un dispositif de dévalaison de centrale hydroélectrique, pour mesurer les dommages subis au passage des barrages. Le porteur indique que l'hameçon provoque une douleur jusqu'à cicatrisation et que le test est arrêté si plus de 20 % des poissons subissent des dommages sévères. Il présente le recours aux poissons comme une étape "nécessaire" pour calibrer des capteurs censés, à terme, remplacer l'usage d'animaux non-humains dans ce type d'étude.
Objectifs
Suite à son autorisation, le projet « Innocuité » ayant pour objectif : (1) de tester différentes conditions de réception des poissons dévalant, soit au débouché des dispositifs de dévalaison au niveau des prises d’eau des centrales hydroélectriques, soit lors de leur franchissement d’un barrage, afin d’améliorer les critères de réception et d’assurer un transfert sans dommage des poissons, (2) et de développer une méthode alternative à l’usage des animaux pour effectuer ces tests à l’avenir, a débuté en 2019. Cependant, des périodes de confinement liées à la pandémie de la COVID19 sont intervenues au printemps 2020 et 2021. Les tests in situ programmés durant ces périodes n’ont ainsi pas pu être réalisés comme prévus et le projet a pris du retard. D’autre part, les capteurs, initialement prévus pour le développement de la méthode alternative, se sont avérés inappropriés et souvent défectueux, et une nouvelle phase de développement des capteurs a été nécessaire. L’autorisation de projet arrive à sa fin en décembre 2023 sans que l’on ait pu le terminer. Nous souhaitons demander un prolongement d’un an, ce qui nous permettra de bien réaliser les tests initialement prévus. L’approche méthodologique, décrite en détail dans la demande initiale d'autorisation du projet et ayant obtenu l’avis favorable du comité éthique, est conservée à l’identique.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est non seulement de définir de critères hydrauliques garantissant le passage des poissons sans dommage par les barrages ou les dispositifs de dévalaison, mais aussi, d’identifier les valeur-seuils des différents paramètres enregistrés par les modules sensoriels, au-delà desquels les dommages sur les poissons apparaissent, afin de pouvoir les utiliser à l’avenir pour vérifier les bonnes conditions de réception, sans avoir recours à des animaux (remplacement).
Procédures
Tous les individus (400) seront attachés, un par un, à une canne à pêche via un hameçon (hameçonnage sous anesthésie générale), relâchés dans le dispositif de dévalaison (lot test) ou dans la rivière à l’aval du dispositif testé (lot témoin), puis récupérés et observés. La durée d’expérimentation ne dépassera pas les 10-15 minutes en tout.
Impact sur les animaux
Stress physique pendant la manipulation (15 minutes cumulées), douleur suite à l’implantation de l’hameçon jusqu’à la cicatrisation.
Devenir
Tous les animaux en bonne santé seront libérés dans le milieu naturel.
Remplacement
La conduite en parallèle de tests « poissons » et « Sensor » doit permettre d’identifier les valeur-seuils des différents paramètres enregistrés par les Sensors au-delà desquels les dommages sur les poissons apparaissent, ceci dans l’optique de remplacer dans les futures études, l’usage des poissons vivants par les Sensors. Certes, cela ne réduit pas directement le nombre de poissons utilisés pour notre projet mais devrait le réduire, voire le supprimer une fois les critères d’innocuité définis.
Réduction
Chaque test in situ « poisson » sera réalisé sur 100 smolts pour avoir un échantillon représentatif. Toutefois, après avoir lâché 50 poissons, si le taux de dommages sévères est >20%, le test sera arrêté et les 50 smolts restants seront relâchés dans la rivière. Le projet prévoit de réaliser les tests sur plusieurs sites. Les résultats seront élaborés au fur et à mesure de l’acquisition des données. Si les données provenant des premiers sites permettent d’obtenir une relation claire entre mesures Sensor et dommages poissons, les autres sites ne seront pas investigués.
Raffinement
Méthodes de raffinement utilisées : - Implantation des hameçons sous anesthésie générale. - Hameçons avec ardillon protégé par une rondelle de caoutchouc insérée sur la hampe de l’hameçon, évitant toute blessure supplémentaire par l’ardillon qui sera coupé avant de décrocher le poisson. - Fil détendu pour ne pas « brider » les poissons, récupération lente pour limiter leur fatigue. - Très bonnes conditions de stabulation (température, oxygène) et régulièrement surveillées, - Bassins couverts pour réduire la luminosité et tranquilliser les smolts (conditions identiques à la pisciculture). - Faible densité dans les bassins (156 l/kg de smolts, soit une concentration 10 fois inférieure aux préconisations pour la stabulation dans les ascenseurs à poissons). - Manipulation rapide, remis en liberté des poissons après tests.
Choix des espèces
L’utilisation de Sensor doit nous permettre à terme de ne plus utiliser d’animaux pour ce type d’étude. Toutefois pour en arriver là, il est nécessaire de « calibrer » les enregistrements des capteurs en les reliant aux dommages subis par les poissons qui peuvent être de différente nature (écaillure, plaie externe ou interne, endommagement/rupture de la colonne vertébrale…). L’espèce choisie, le saumon atlantique, est une des espèces cibles pour la conception des dispositifs de dévalaison. La morphologie et la physiologie des smolts de saumon atlantique en période de dévalaison, en particulier leur forte sensibilité à l’écaillure à ce stade physiologique, et dont l’intégrité est très importante pour leur survie future en mer, sont des prérequis pour notre étude. La perte d’écailles est l’un des premiers dommages subis par les smolts au passage des obstacles si le dispositif n’est pas approprié. Les juvéniles de saumon atlantique en phase migratoire vers la mer (stade smolt) seront utilisés. La morphologie et la physiologie des smolts de saumon atlantique en période de dévalaison, en particulier leur forte sensibilité à l’écaillure à ce stade physiologique, et dont l’intégrité est très importante pour leur survie future en mer, sont des prérequis pour notre étude.
Entretien d’une lignée de souris portant une invalidation du gène de la SELENOT dans les neurones POMC
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardées pour la reproduction ou tuées. Ce projet entretient une lignée invalidée pour le gène SELENOT dans certains neurones, le seul geste décrit étant une biopsie de la queue sous anesthésie pour génotypage. Les animaux de génotype inadéquat et les couples qui ne produisent plus de portées sont mis à mort. Le porteur justifie l'élevage par l'étude du rôle de cette protéine dans l'obésité, possible selon lui seulement sur un organisme intégré.
Objectifs
La SELENOT est impliquée dans le contrôle du stress cellulaire suggérant que cette protéine pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique et qu’un défaut de son activité pourrait contribuer au développement de l’obésité et ses comorbidités. Lors d'un régime riche en graisses (high fat diet, HFD) chronique, les neurones hypothalamiques développent un stress qui induit une résistance à la leptine et à l'insuline, et conduit à un gain de poids. Les données récentes ont permis d’établir que le développement des circuits hypothalamiques contrôlant l'homéostasie énergétique sont altérés par le stress qui est associé à l'obésité, entraînant une diminution de la production et de la sécrétion de l'hormone centrale de l'homéostasie énergétique. Ces observations suggèrent que les neurones hypothalamiques pourraient être avantageusement ciblés pour le traitement des dysfonctionnements des neurohormones causés par le stress associé à l'obésité.
Bénéfices attendus
L'obésité et le diabète de type 2 connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans de sorte que la pandémie de "diabesity" actuellement observée au niveau mondial constitue un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que l’hypothalamus de sujets obèses est soumis à un stress oxydatif et inflammatoire permanent, suggérant que des facteurs de contrôle de ce stress pourraient être impliqués dans l’homéostasie énergétique et constituer des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l’obésité associée au diabète de type 2. La SELENOT que nous avons mise en évidence pour ses fonctions protectrices des cellules sécrétrices présente plusieurs avantages qui peuvent en faire une cible thérapeutique très intéressante pour combattre l'obésité et le diabète de type 2 qui lui est associé. En effet, la SELENOT réduit le stress cellulaire en général. Elle peut agir aussi bien au niveau du cerveau que dans d'autres organes impliqués dans le contrôle du métabolisme énergétique. Les études intégrées que nous projetons de réaliser avec les souris requièrent des analyses in vivo qui pourront déboucher sur des applications chez des patients atteints d'obésité et de diabète de type 2.
Procédures
Les animaux destinés à la reproduction subiront une biopsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm destiné au génotypage des animaux) sous anesthésie : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie.
Impact sur les animaux
Une biopsie caudale est nécessaire pour génotyper les animaux; cette biopsie peut entrainer des douleurs chez l’animal. Ces douleurs seront évaluées et réduites/atténuées par l’utilisation d’analgésiques.
Devenir
L'ensemble des animaux générés dans ce projet sera destiné à la reproduction et à l'entretien d'une lignée de souris. Les animaux de génotype adéquat seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissance à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ou ne produisant plus de portées seront mis à mort selon les procédures précédemment décrites. Les animaux de génotype inadéquat donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.
Remplacement
Les études métaboliques y compris le contrôle de la prise de nourriture et de la glycémie ne sont possibles que dans un système intégré et nécessitent donc l’utilisation d’animaux modèles afin d’avoir une approche physiologique de l’implication de la SELENOT dans le contrôle de l'homéostasie énergétique.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à réduire le nombre d'animaux générés en choisissant un génotype précis. Le nombre d'animaux de génotype non adéquat, générés dans la descendance des croisements est ainsi divisé par deux.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux qui sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes qui n’existent pas chez d’autres modèles mammifères. La reproduction des animaux est faite à partir de 8 semaines de vie pour étudier la physiologie adulte.
Impact des dérivés indoliques produits par le microbiote intestinal sur le développement cérébral en période néonatale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux dépourvus de microbiote sont colonisés par des bactéries, séparés de leur mère à répétition et soumis à 28 tests neurologiques et 8 tests comportementaux entre 6 et 45 jours de vie, les mères étant gavées une fois. Le projet étudie l'effet de dérivés du tryptophane produits par le microbiote sur le développement du cerveau. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro assez complexe n'existe pour cet objectif.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau. Or les facteurs qui influencent ce développement sont encore mal connus. Parmi les facteurs candidats figurent les molécules produites par le microbiote intestinal. En effet, la période néonatale est aussi celle de la colonisation microbienne intestinale, caractérisée par une évolution progressive des populations bactériennes résidentes et de leurs capacités métaboliques. A cet égard, le profil des molécules produites par le microbiote intestinal et présentes dans le cerveau de jeunes souris évolue entre la naissance et le sevrage. Cette évolution concerne notamment le profil des métabolites microbiens du tryptophane, un acide aminé essentiel, à structure indolique, . Ces données rejoignent des observations chez l’être humain montrant que, chez des nouveau-nés à terme, le microbiote de ceux nés par césarienne a un potentiel métabolique altéré. En effet, chez les nouveau-nés par césarienne, il n'y a pas de transmission du microbiote vaginal et fécal de la mère, comme c'est le cas lors d'un accouchement par voie basse. En raison de la fréquence accrue de troubles cognitifs chez les personnes nées par césarienne et des effets neuronaux des substances dérivées du tryptophane produites par le microbiote chez les rongeurs, nous supposons qu'une perturbation de la colonisation microbienne intestinale pourrait influencer le développement cérébral. Pour tester cette hypothèse, nous allons simuler, chez des souris initialement dépourvues de microbiote intestinal, une altération de la production de ces substances en les colonisant avec des bactéries produisant ou non les dérivés en question. Ces souris seront soumises de l’âge de 6 jours à l’âge de 45 jours (jeunes adultes) à des tests comportementaux. Leur cerveau sera analysé pour différents paramètres caractérisant l’état du neurodéveloppement.
Bénéfices attendus
En examinant comment les substances issues du tryptophane produit par les microbes intestinaux peuvent agir comme messagers entre le microbiote intestinal et le système nerveux central pendant la période néonatale, nous aiderons à comprendre comment ces mécanismes et ces voies de communication fonctionnent à un moment crucial qui influence la vie d'un individu.
Procédures
Les femelles reproductrices (animaux vigiles, n=96) seront gavées 1 fois à l’aide d’une sonde de gavage souple (durée 1 à 2 minutes). Elles subiront 1 prélèvement de fèces émis spontanément, d’une durée de quelques minutes. Les souriceaux (animaux vigiles, n=128) subiront à J42 1 prélèvement de fèces émis spontanément, d’une durée de quelques minutes. Les souriceaux (animaux vigiles, n=128) dans la périodes entre J6 et J44 subiront en tout 28 tests neurologiques de développement en 4 sessions de 5 à 15 mn, et 8 tests comportementaux en 8 sessions de 6 à 15 mn.
Impact sur les animaux
Pour effectuer les évaluations neurologiques, les portées seront séparées temporairement de leur mère ce qui va générer du stress. Lors des prélèvements fécaux les souris seront isolées quelques minutes dans des pots individuels. Le gavage des mères sera effectué par des personnes entraînées, qui les pratiquent en routine, mais un accident pourrait se produire pouvant entrainer une douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d'échantillons biologiques.
Remplacement
Ce projet vise à déterminer l’effet de l’inoculation de 2 souches bactériennes produisant ou non les dérivés métaboliques d’intérêts sur le développement du cerveau de jeunes souris. Ces bactéries sont capables de générer des métabolites pouvant agir sur les structures cérébrales par voie nerveuse ou circulatoire. L’utilisation d’animaux est donc obligatoire, car il n’y a aucun modèle in vitro ou in silico suffisamment complexe qui existe et puisse être utilisé dans cet objectif.
Réduction
Le nombre d’animaux a été fixé au strict nécessaire. Le facteur limitant est l’étude biochimique des cerveaux. En effet, l’étude comporte la détermination de plusieurs marqueurs cérébraux qui ne peuvent pas être mesurés simultanément sur les mêmes cerveaux. Nous avons évalué à 8 souris femelles et 8 souris mâles par type de marqueurs. Pour les tests neurologiques et comportementaux, et les analyses dans les autres échantillons biologiques, le nombre sera de 16 souris femelles et 16 souris mâles.
Raffinement
Chaque cage comporte un tunnel en plastique transparent, des bâtons à ronger et du matériel de nidification en guise d'enrichissement. Les souriceaux seront conservés avec leur mère pendant la durée de la lactation. Lors des évaluations neurologiques et comportementales avant le sevrage, les souriceaux seront isolés par portée entière dans une cage contenant de la litière de la cage d’origine, et du papier absorbant déchiqueté par la mère. La durée de chaque évaluation sera courte et les souriceaux seront immédiatement replacés dans la portée. Pour éviter le rejet de la portée, le nid n'est pas déplacé pendant le change, la litière est enlevée et replacée autour du nid sans le déranger. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés une fois par semaine et les points limites préalablement définis sont contrôlés.
Choix des espèces
Seuls les rongeurs permettent la mise au point de modèles d’animaux à microbiote intestinal particulier en isolateur adaptés à notre étude. La souris a été préférée au rat car, en isolateur, où l'espace est restreint, cette espèce permet de tester simultanément un nombre d’animaux plus important, et d’utiliser des dispositifs expérimentaux de plus petite taille, donc plus nombreux et plus variés. Par ailleurs, puisque la majorité des études publiées au cours des dernières années sur les relations entre le microbiote intestinal et le système nerveux central de l’hôte ont été réalisées chez la souris, les études menées avec cette espèce permettent une meilleure comparaison des résultats avec ceux de la littérature. Les souris sont utilisées de la naissance à la fin de l’adolescence, car nous voulons déterminer l’impact de produits bactériens sur le développement cérébral.
Remodelage du microenvironnement tumoral par des vésicules extracellulaires libérées par les cellules cancéreuses sur le collagène de type1
- Recherche fondamentale
- Oncologie
345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris immunodéficientes reçoivent des greffes de cellules cancéreuses dans la queue, la glande mammaire ou le foie, suivies de séances d'imagerie répétées sous anesthésie pendant que se forment des micrométastases. Le projet cherche à comprendre comment des vésicules libérées par des cellules agressives augmentent le pouvoir métastatique de cellules moins invasives. Le porteur affirme que la complexité de la tumeur intégrée impose le recours au modèle animal après les tests in vitro.
Objectifs
Les métastases sont responsables de 90% des causes de décès lié au cancer selon l’OMS, et représente un problème majeur de santé publique. En effet, le mécanisme de formation des métastases est très complexe et il n’existe actuellement aucun traitement. La compréhension du mécanisme de formation des métastases constitue donc un enjeu majeur pour identifier de nouvelles cibles et axes thérapeutiques. L’objectif de ce projet vise à comprendre l’impact de vésicules extracellulaires produites par des cellules agressives métastatiques sur la capacité à former des métastases de cellules moins invasives (qui potentialiseraient le pouvoir métastatique des cellules moins invasives). Ce projet implique l’injection de cellules cancéreuses chez la souris afin de pouvoir suivre la formation de micrométastases en réponse à la stimulation aux vésicules extracellulaires ou non. Nous avons montré un effet significatif de ces vésicules extracellulaires sur l’augmentation des capacités invasives in vitro. La présence de ces vésicules dans un modèle in vitro 3D a également été confirmée. Les expériences in vivo nous permettrons de tenir compte de l’environnement complexe de la tumeur intégrée dans un organisme entier. Seules les expériences in vivo nous permettront de valider notre hypothèse.
Bénéfices attendus
A la fin du projet, ces résultats nous permettront de valider que ces vésicules sont impliquées dans la formation de métastases. A des fins thérapeutiques, ces vésicules pourront par la suite être ciblées par des traitements visant à réduire la formation de métastases aujourd’hui largement responsable de la gravité des cancers et des rechutes. Grâce à cette étude, nous pourrons apporter des bénéfices sur la meilleure compréhension des cellules à former des métastases mais aussi une nouvelle cible thérapeutique pour espérer mieux soigner les patients à terme.
Procédures
Greffe par voie caudale sur animaux vigiles (une fois par procédure, moins de 5 minutes). Greffe dans la glande mammaire sur animaux anesthésiés (une fois par procédure- durée : 5min/animal). Greffe dans le foie sur animaux anesthésiés (une fois par procédure- durée : 10min/animal). Imagerie par bioluminescence ( 1 à 2 fois par semaine ou tous les 15 jours en fonction de la procédure et en fonction du développement tumoral obtenu soit au plus 20 fois -durée de la séance d'imagerie : environ 20 minutes sur animaux anesthésiés)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un stress dû à la contention/préhension des animaux. 2/ des douleurs durant et après les injections orthotopiques 3/ Un inconfort au niveau des sutures dans les heures suivant les injections orthotopiques. 4/ Un stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boîte à induction lors des imageries) et de réveil. 5/ le développement de micro- métastases.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser l'analyse post-mortem des différents organes qui présenteront des micrométastases.
Remplacement
Tous les tests cellulaires in vitro réalisés en amont de cette étude montrent le rôle important de ces vésicules dans la tumorigénicité des cellules de cancer du sein et notamment dans le potentiel métastatique. Cependant, les tumeurs sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal.
Réduction
Une expérience pilote nous permettra de déterminer le nombre nécessaire et suffisant à la greffe tumorale. Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. La croissance tumorale sera suivie de manière longitudinale tout au long de l'expérience notamment grâce l’expression de la luciférase dans nos cellules, système très sensible qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires par lot pour détecter 50% de différence inter lots avec 50% d’écart type intra lot est de 10, les expériences seront réalisées en duplicat et des tests statistiques seront effectués.
Raffinement
Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, mesure hebdomadaire du poids des souris et du volume tumoral, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt). Les cellules greffées exprimeront la luciférase ce qui permettra de détecter l’apparition de cellules tumorales très précocement permettant ainsi d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge plus rapide.
Choix des espèces
Nous avons choisi de réaliser nos expériences sur des souris immunodéficientes qui permettent la greffe de cellules humaines Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´inoculation de cellules.
Νanoémulsions combinant fénofibrate et oxydes de fer pour le traitement du glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
462 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie et une infusion intracrânienne du traitement, avec perte de poids, de motricité et de sensibilité attendues à mesure que la tumeur se développe. Le projet teste des nanoémulsions de fénofibrate associées à des oxydes de fer contre le glioblastome. Le porteur affirme qu'un modèle in vivo complet est "indispensable" pour intégrer le microenvironnement de la tumeur.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale maligne et agressive dont la médiane de survie est faible. La résistance aux traitements est due notamment au microenvironnement tumoral constitué de trois composantes : l’hypoxie, la barrière hémato-encéphalique ainsi que la composante inflammatoire. Ce projet a pour but de développer une nouvelle stratégie thérapeutique du glioblastome basée sur la formulation de nanoémulsions de fénofibrate (NEF) associées à des nanoparticules d’oxydes de fer (SPIONs). En effet, nous avons développé une formulation de fénofibrate dans des nanoémulsions permettant d’améliorer sa solubilisation et le rendre ainsi compatible avec une utilisation sur des modèles cellulaires et animaux. Afin de cibler la composante inflammatoire, le fer contenu dans les SPIONs est utilisé pour stimuler la réponse inflammatoire. Ces SPIONs pourraient également améliorer la stabilité des NEF.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’étudier le potentiel thérapeutique des nanoémulsions de fénofibrate associées à des SPIONs. Il vise à démontrer l’intérêt d’outils innovants pour le traitement du glioblastome. Cette stratégie est également basée sur l’utilisation d’un principe actif, développé initialement pour une pathologie différente, associée à un autre agent de thérapie et de diagnostic (les SPIONs) ciblant la composante inflammatoire du glioblastome, autre facteur limitant de l’efficacité des traitements. De façon totalement originale, il s’agit de valoriser un nouvel outil nanotechnologique pour lequel les avantages en terme d’incorporation de principe actif et d’augmentation de leur solubilisation a déjà été établi. L’approche de thérapie combinée ciblant plusieurs composantes du glioblastome est d’emblée intégrée à ce projet pour optimiser les chances de réussite du traitement. De plus, le choix de plusieurs modèles expérimentaux a pour objectif de favoriser la translation des résultats.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale et infusion intracrânienne du traitement) : 30 minutes maximum par animal, réalisée au maximum deux fois sur chaque animal, les 462 animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de GBM. Pour remédier à la perte de poids, les souris disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire (DietGel Recovery). Le poids de chaque animal sera mesuré avant, pendant et après les procédures d’implantation tumorale et d’injection du traitement. Si une perte de poids supérieure à 15% est observée, la procédure sera arrêtée. Les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal, un autre point de vigilance est ainsi défini pendant l’acquisition IRM par une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations / min. S’il est atteint, le pourcentage d’isoflurane sera légèrement diminué et si la fréquence n’augmente pas à nouveau, la procédure sera arrêtée. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale et l’injection du traitement peut induire des douleurs. Pour limiter ces douleurs, les souris reçoivent une injection de buprénorphine (sous-cutanée ; 0,05 mg/kg) 15min avant la chirurgie. L’induction de l’anesthésie des souris est ensuite réalisée avec 5% d’isoflurane (apporté dans un mélange gazeux contenant 70% N2O/30 % O2) pour l’induction puis les animaux sont maintenus anesthésiés à 2,5% d’isoflurane pendant la chirurgie. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer les cerveaux pour analyses post-mortem.
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées de GBM afin de déterminer des doses efficaces pour les trois lignées de GBM utilisées ainsi que la maitrise de la formulation des nanoémulsions mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous avons réalisé des simulations statistiques à l’aide des données précédemment acquises au sein de l’équipe pour les groupes A, B et C. Ces simulations ont été réalisées à l’aide de l’outil BiostaTGV disponible sur le site internet https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#. Ces simulations ont permis de mettre en évidence pour le Groupe A (modèle GL261) un nombre minimum de 10 animaux par sous-groupe. De même, pour les Groupes B (modèle U-251-MG) et C (modèle U-87-MG) un nombre minimum de 30 animaux et 20 animaux respectivement par sous-groupe de traitement est nécessaire. Ce nombre d’animaux est cependant un nombre maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (5 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et bénéficieront également d’enrichissement (roue d’activité, cartons). L'hébergement des animaux immunodéprimés se fera en cage ventilée individuelle permettrant le maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes. Les animaux seront surveillés dès leur arrivée jusqu’à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique, respiration) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée 3 fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que de complément alimentaire afin de limiter la perte de poids due aux procédures expérimentales. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents.
Choix des espèces
Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur les cellules tumorales tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral qui peuvent modifier l’effet thérapeutique du traitement. Nous utiliserons donc des souris immunocompétentes C57Bl/6 car ces souris présentent la composante inflammatoire et notamment macrophagique, cible de notre traitement. Le modèle de tumeur cérébrale utilisé repose sur l’implantation de cellules de gliome GL261, cellules issues de souris C57Bl/6 qui permet alors d’éviter toute inflammation aberrante due au rejet de « greffe » par la souris souche utilisée. Nous utiliserons également des souris immunodéficientes Nude, sans lymphocytes T, mais présentant des lymphocytes B, des cellules tueuses naturelles (NK) et des cellules myéloïdes (macrophages). Ce modèle nous permettra d’étudier l’effet du traitement sur un modèle de tumeur cérébrale reposant sur l’implantation de cellules de glioblastome d’origine humaine ; permettant une plus grande représentativité de la réalité clinique. Cette étude va également inclure un nombre égal de souris mâles et femelles pour l’ensemble des procédures, en lien avec les recommandations actuelles. En effet, le GBM est un cancer touchant aussi bien les hommes que les femmes. Le sexe sera pris en compte comme variable lors des différentes analyses. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs.
Impact de l’administration de la flunarizine sur le développement de la SLA liée à FUS dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la flunarizine par gavage quotidien pendant 14 jours, subissent des tests moteurs et un test d'anxiété, un électromyogramme sous anesthésie et une biopsie de l'oreille pour génotypage. Le projet cherche à savoir si cette molécule déjà commercialisée pourrait ralentir une forme de sclérose latérale amyotrophique liée au gène FUS, maladie sans traitement. Le porteur pose ce repositionnement comme une hypothèse et affirme que seul un modèle souris reproduit la complexité comportementale et nerveuse recherchée.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la forme principale de maladie du motoneurone adulte (neurones localisés dans la moelle épinière et impliqués dans la transmission du signal moteur). La maladie du motoneurone principale chez l’enfant est l’amyotrophie spinale. Il existe des points communs au niveau génétique et fonctionnel entre ces deux maladies. Ces deux maladies entrainent une mort inévitable des patients et aucun traitement n’est actuellement disponible pour la SLA liée à la mutation du gène FUS. Des travaux récents ici d'une collaboration ont identifié une nouvelle molécule, la flunarizine, comme une molécule ayant un effet protecteur dans le contexte de l’amyotrophie spinale. La SLA et l’amyotrophie spinale partageant un certain nombre de points communs, y compris dans les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie, il est raisonnable de faire l’hypothèse que la flunarizine puisse aussi exercer une action protectrice dans la SLA-FUS. C’est ce que nous voulons tester dans ce projet. La flunarizine possède une autorisation de mise sur le marché et est utilisée essentiellement pour des traitements de courte durée mais peut entrainer à forte dose des effets néfastes. Nos objectifs sont donc : (i) de déterminer la dose de flunarizine ayant un effet bénéfique (expression de gènes cibles) mais sans effet secondaire chez des souris sauvages (ii) de caractériser l’effet de la flunarizine sur les défauts moteurs établis dans un modèle murin de SLA-FUS.
Bénéfices attendus
La SLA FUS est une maladie fatale, sans traitement à l’heure actuelle. La flunarizine est une molécule disposant d’une autorisation de mise sur le marché qui a fait ses preuves dans un modèle murin modélisant une maladie ayant des similitudes avec la SLA. Notre projet pourrait amener les arguments expérimentaux pour repositionner la flunarizine pour le traitement de la SLA-FUS.
Procédures
Les animaux recevront un traitement (administration par gavage sur animal vigil afin de limiter les risques de fausse route) durant 14 jours, à raison de 1 fois par jour. La durée du gavage est d’environ 20 secondes. Nous réaliserons un suivi mensuel des capacités motrices (force musculaire). Ce test se passe en 3 session de 3 minutes maximum chacune, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes. Les animaux seront toujours remis en groupe. Nous réaliserons un test d’anxiété 2 fois au cours de la vie de l’animal (avant le début du traitement et un mois après). Ce test se déroule sur une session unique de 5 minutes. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris anesthésiées afin d’éviter toute souffrance. Nous réaliserons un prélèvement d’un petit bout d’oreille (1mm de diamètre) lorsque les souris auront entre 7 et 10 jours ce qui entrainera une douleur légère et de courte durée.
Impact sur les animaux
Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement, raison pour laquelle nous avons développé une grille spécifique de scorage afin de suivre chacune des souris dès le début du traitement. La molécule utilisée peut entrainer des problèmes musculaires lorsqu’elle est administrée à forte dose. Nous avons développé une seconde grille d’évaluation afin de nous assurer que les doses choisies ne sont pas néfastes. Nous pourrions également observer un stress causé par la passation du test moteur et du test d’anxiété. Un temps de repos sera systématiquement appliqué pour le test moteur qui nécessitent plusieurs passages successifs. Si nous remarquons que les souris sont fatiguées, nous espacerons les différentes sessions. La procédure d’électro myo gramme qui permet d’observer la présence ou non d'atteinte des muscles sera réalisée sous anesthésie, les souris ne ressentiront donc aucune douleur. Le prélèvement d’un morceau d’oreille pour définir le génotype de nos souris entrainera une douleur légère et brève.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements et analyses.
Remplacement
Ce projet a pour but de déterminer s’il est possible d’utiliser la flunarizine pour contre carrer, ou du moins ralentir, le développement des troubles moteurs observés dans la SLA. Pour étudier cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale (avec l’apparition possible des troubles de l’anxiété et des troubles moteurs) mais aussi une complexité structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme. La souris nous offre la possibilité de travailler avec ces deux niveaux de complexité.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé le suivi longitudinal. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pour 1. vérifier que la flunarizine soit utilisable dans nos conditions d’expérimentations, 2. déterminer la dose de flunarizine que nous utiliserons ensuite et 3. diminuer le nombre de souris impliquées dans l’étude longitudinale (nous n’étudierons plus qu’une dose de flunarizine au lieu de trois si nous ne faisions pas cette première étude).
Raffinement
L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.
Choix des espèces
Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (4 mois) car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles.