Oncologie

Les 528 souris de ce projet sont des NSG, dépourvues de défenses immunitaires, ce qui permet d'y greffer des cellules cancéreuses humaines et les expose au moindre germe opportuniste. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, greffées par voie intraveineuse et sous-cutanée, puis soumises à des gavages et des injections intrapéritonéales cinq jours par semaine, avec une imagerie sous anesthésie chaque semaine. Le porteur signale la fatigue et l'amaigrissement qui accompagnent le développement tumoral. Toutes seront tuées, une partie en cours de protocole à chaque étape, pour prélever les tissus.

Objectifs

Le projet concerne l’étude de la mise en dormance des cellules souches cancéreuses (CSC) dans la moelle osseuse. Deux modèles de cancer seront utilisés en comparant les cellules souches leucémiques et les cellules de cancer gastrique. Le projet s'appuie sur nos résultats en amont et ceux de la littérature. Les données de la littérature confirment que les CSC sont capables d’aller dans la moelle des os comme les cellules leucémiques et de s’y cacher. Ces mécanismes semblent similaires à la dormance des cellules souches leucémiques dans la moelle osseuse. Les objectifs des approches mises en place sont de mimer ce qui a été observé chez les patients de manière à étudier comment les CSC au travers de mécanismes de dormance deviennent insensible aux thérapeutiques au sein de la moelle osseuse et comment elles sont capables depuis le site de la moelle osseuse d’initier à nouveau un cancer en comparant dans notre cas aux leucémies greffées en sous-cutanée qui ne colonisent jamais la moelle osseuse.

Bénéfices attendus

Les greffes réalisées associées à des analyses moléculaires vont conduire à l’identification de facteurs et de voies qui permettent aux CSC de s’adapter dans la moelle osseuse. La validation des rôles de ces facteurs et de leurs voies in vivo permettra de prouver leurs implications dans la persistance des cellules cancéreuses mais aussi de définir des voies d’action pour bloquer ces mécanismes.

Procédures

Les animaux vont être greffés par injection en intra-veineux et en sous-cutanée une seule fois (1 min), recevoir des traitements par gavage oral ou injection intra péritonéale : Injection intrapéritonéale pour chaque animal (1 min ; 5/semaine), gavage (30s ; 5/semaine) Imagerie nécessite une anesthésie de 15 min au cours de laquelle l’imagerie est réalisée en 10min. Réalisation hebdomadaire.

Impact sur les animaux

Les souris présenteront de l’inconfort dû aux injections pour la greffe et au développement tumorale qui s’accompagne fréquemment de fatigue et d’amaigrissement. Du stress sera induit par les imageries hebdomadaires et de l’inflammation liée aux gavages quotidiens en semaine conduisant à des nuisances légères. Enfin, nous utilisons des souris NSG immunodéficientes et qui malgré des manipulations en conditions stériles peuvent avoir un risque de contamination par des agents pathogènes opportunistes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. En cours de procédure, à chaque étape les animaux sont euthanasiés et les différents tissus d’intérêts sont prélevés.

Remplacement

Pour répondre à nos objectifs tout en diminuant au maximum le recours à des animaux, nous utilisons la modélisation in vitro et ex vivo de la moelle osseuse. De plus, au fil du temps, le suivi bibliographique nous permet d'avoir des mises à niveau régulières pour savoir si nous devons poursuivre la validation d'une molécule ou en changer. Par contre, pour atteindre nos objectifs, des études précliniques sont indispensables. Les modèles murins et xébrafish sont les seul utilisés à ce jour en hématologie.

Réduction

Combinaison des lots témoins lorsque l'on teste plusieurs molécules sur la même cible. Utilisation d’un test de puissance pour définir le nombre d’animaux/groupe. Tests statistiques utilisés pour l’analyse des résultats. De plus, l’expérimentation ne comportera plus que 12 animaux greffés par lot car l’analyse statistique a montré que cela est suffisant pour obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Des soins adaptés sont réalisés (poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt). Ces critères réunis permettront d’établir un score pour intervenir à bon escient. De la nourriture enrichie est donnée après la greffe. Les animaux utilisés étant immunodéficients, les différentes procédures sont réalisées de manières à prévenir tout dommages par des mesures barrières.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour ce projet de formation des cellules sanguines humaines car elle est possible et bien documentée. Les souris sont utilisées en raison de leurs capacités à accepter des cellules humaines : 1). Une forte immunodépression de par l’absence de cellules immunitaires. 2). La capacité d´extrapoler les résultats à l’homme. 3). L´expérience d´utilisation en recherche.

Des séances d'IRM d'une à deux heures sous anesthésie générale, répétées chaque semaine : 408 souris reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la patte arrière, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser la tumeur. 368 d'entre elles passent en plus des échographies hebdomadaires, et chacune reçoit jusqu'à six injections de chimiothérapie ou d'immunothérapie en trois semaines. Le porteur indique que la tumeur peut gêner la marche et que des métastases pulmonaires peuvent provoquer des difficultés respiratoires. L'objet immédiat du projet reste de valider des techniques d'imagerie, l'adaptation plus rapide des traitements chez les patients étant renvoyée au conditionnel.

Objectifs

L’ostéosarcome est un cancer des os rare mais agressif, qui survient principalement chez les enfants et les jeunes adultes. Malgré des traitements lourds (chimiothérapie, chirurgie), les options thérapeutiques n’ont que peu évolué depuis 50 ans. Aujourd’hui, il est crucial de trouver des moyens pour détecter plus tôt si un traitement fonctionne ou non, afin d’éviter des thérapies inefficaces et d’adapter rapidement la prise en charge. Ce projet a pour but d’évaluer si des techniques d’imagerie non invasives (échographie et IRM) peuvent aider à suivre l’évolution des tumeurs d’ostéosarcome en temps réel. Ces examens permettraient d’évaluer des changements dans la microstructure de la tumeur (taille, vascularisation, rigidité) et d’identifier des signes précoces de résistance aux traitements. L’objectif final est d’améliorer la prise en charge des patients en personnalisant les thérapies selon la réponse de leur tumeur. L’étude utilisera des modèles expérimentaux de tumeurs chez la souris, ce qui permet de contrôler et de reproduire les expériences avant d’envisager des essais cliniques chez l’humain. Les mesures d’imagerie seront comparées à des analyses réalisées après l’expérience sur les tissus, afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux traitements. L’objectif de ce projet est donc de suivre l’évolution d’un ostéosarcome chez la souris au cours du temps et d’évaluer la réponse à différents traitements à l’aide de techniques d’imagerie non invasive. L’étude vise à mieux comprendre la dynamique tumorale et à identifier des marqueurs précoces de réponse, tout en limitant le recours à des mises à mort intermédiaires. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont doubles : 1. Pour les patients : Actuellement, il faut attendre plusieurs semaines et réaliser des biopsies ou des chirurgies pour savoir si un traitement contre l’ostéosarcome est efficace. Grâce à ces nouvelles méthodes d’imagerie, les médecins pourraient détecter en quelques jours si une tumeur répond au traitement, et ainsi adapter la thérapie plus rapidement pour chaque patient. 2. Pour la recherche : En comprenant mieux comment la résistance aux traitements se développe, ce projet pourrait aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et à concevoir des stratégies pour contourner cette résistance. À terme, cette approche pourrait réduire la durée des traitements inefficaces, améliorer la qualité de vie des patients, et augmenter leurs chances de guérison.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Implantation tumorale : 408 souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales dans la patte arrière, sous anesthésie générale à l’isoflurane. L’injection dure environ 10 à 20 secondes ; la durée totale d’anesthésie est d’environ 5 à 10 minutes. Cette intervention est réalisée une seule fois par animal. Traitements expérimentaux : Les 408 souris recevront des injections de traitement (chimiothérapie, immunothérapie, anti-angiogénique ou solution saline), administrées par voie intrapéritonéale (IP) ou intraveineuse (IV), au maximum 2 fois par semaine pendant la durée de l’étude (jusqu’à 3 semaines, soit un maximum de 6 injections par animal). Chaque injection dure environ 10 à 30 secondes. Les injections sont réalisées sur animaux vigiles par du personnel qualifié, selon des techniques limitant le stress et l’inconfort. Examens d’imagerie : Parmi ces animaux, 368 souris bénéficieront d’examens d’imagerie pour le suivi tumoral. • Échographie : réalisée sous anesthésie générale, durée 20 à 30 minutes, au maximum une fois par semaine. • IRM : réalisée sous anesthésie générale, durée 60 à 120 minutes selon les séquences acquises, au maximum 1 fois par semaine. Chaque séance d’imagerie comprend l’induction anesthésique, l’examen et le réveil surveillé (ou anesthésie sans réveil lorsque requis par l’analyse séquentielle). Surveillance : Les 408 souris feront l’objet d’un suivi au minimum deux fois par semaine (poids, comportement, état général), renforcé si nécessaire. Chaque observation dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Pour cette étude, des souris développeront une tumeur osseuse au niveau de la patte, afin de reproduire les caractéristiques de l’ostéosarcome humain. Les animaux pourront ressentir : Un inconfort et un stress temporaire lors de l’implantation de la tumeur, réalisé sous anesthésie et des manipulations pour le suivi de la pousse tumorale et les injections de traitements. Les procédures d’imagerie nécessitent des anesthésies répétées et prolongées, pouvant entraîner une fatigue temporaire. L’injection de certains agents de contraste peut provoquer un léger inconfort, mais ces substances sont rapidement éliminées par l’organisme et ne présentent pas de risque durable. Un stress léger lié aux manipulations régulières (pesées, mesures de la tumeur) et aux examens d’imagerie, qui nécessitent une anesthésie gazeuse. Une gêne à la marche si la tumeur grossit, mais des aménagements (nourriture accessible, cages adaptées) seront mis en place pour leur bien-être. Les animaux peuvent également être exposés à un stress environnemental, lié au transport entre les installations et aux manipulations pour les mesures et pesées régulières. Dans certains cas rares, l’apparition de métastases pulmonaires pourrait provoquer des difficultés respiratoires.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort de manière indolore. Cette étape est indispensable pour pouvoir analyser précisément la tumeur. Les tissus prélevés après le décès permettront d’étudier en détail les effets des traitements au niveau biologique. Ces résultats seront comparés aux images obtenues pendant l’étude (échographie et IRM) afin de mieux comprendre l’évolution de la tumeur et l’efficacité des traitements.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, des études ont été réalisées uniquement sur des cellules cultivées en laboratoire, en deux et trois dimensions. Ces expériences ont permis de développer et tester les méthodes d’imagerie et d’identifier les paramètres les plus importants pour analyser les tumeurs. Ces travaux in vitro ont ainsi remplacé de nombreuses expérimentations animales exploratoires, réduisant le nombre d’animaux nécessaires. Cependant, les modèles cellulaires ne reproduisent pas la complexité d’une tumeur dans un organisme vivant : ils ne possèdent pas de vaisseaux sanguins fonctionnels, d’interactions avec le système immunitaire ni l’organisation complète des tissus. Or, ces éléments sont essentiels pour mesurer correctement les paramètres d’imagerie envisagés dans ce projet. Pour que les méthodes d’imagerie soient pertinentes et applicables au suivi thérapeutique chez l’humain, il est donc nécessaire de les valider dans un modèle animal vivant, reproduisant fidèlement la physiologie tumorale. Ainsi, bien qu’aucune alternative complète ne permette de remplacer l’expérimentation animale, cette approche progressive permet de limiter le nombre d’animaux utilisés et d’optimiser leur utilisation. Cette stratégie respecte le principe de remplacement en expérimentant d’abord sur des modèles in vitro avant de passer à l’in vivo.

Réduction

Des études préliminaires sur des cellules en laboratoire ont permis de différer l’utilisation des animaux et de réduire leur nombre au strict nécessaire. Ces travaux ont aidé à définir précisément les paramètres à étudier, de sorte que seules les questions ne pouvant pas être résolues autrement soient testées chez l’animal. Le nombre d’animaux a été fixé pour garantir des résultats fiables tout en restant le minimum nécessaire pour évaluer l’intérêt des techniques d’imagerie utilisées. Le projet utilise un modèle tumoral déjà étudié en culture cellulaire, ce qui permet de cibler les expériences in vivo et d’éviter des ajustements ultérieurs susceptibles d’augmenter le nombre d’animaux. Ce projet est organisé de manière séquentielle ce qui permet d’observer l’évolution des tumeurs à différents moments au sein d’un même groupe, sans multiplier les groupes expérimentaux. Les résultats des premières étapes sont utilisés pour ajuster les étapes suivantes, limitant ainsi la duplication des expériences. Les tissus prélevés seront analysés pour plusieurs paramètres, maximisant l’information obtenue par animal.

Raffinement

La nourriture des animaux sera facilement accessible, notamment déposée au fond des cages si des difficultés de déplacement sont observées. Le protocole d’injection des tumeurs et d’imagerie est réalisé sous anesthésie générale avec analgésie adaptée, en utilisant les techniques les moins invasives possibles afin de réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort. Le suivi des animaux est régulier et cinétique, basé sur des critères précis (poids, mobilité, comportement, respiration, tumeur) permettant de détecter rapidement tout signe de mal-être et d’intervenir avant l’apparition de complications avancées, telles que les métastases pulmonaires. Si nécessaire, le protocole sera arrêté et l’animal mis à mort pour éviter toute souffrance inutile. Les examens d’imagerie se déroulent également sous anesthésie, avec surveillance continue de l’état général et de la respiration. La température corporelle est maintenue à l’aide de dispositifs adaptés pour assurer une récupération optimale (tapis ou lit chauffant). En cas d’anesthésies prolongées, des mesures de soutien, comme la réhydratation et une surveillance renforcée pendant le réveil, seront mises en place.

Choix des espèces

Le modèle d'ostéosarcome établi chez des souris immunocompétentes est décrit depuis plus de 10 ans, et ses caractéristiques (implantation, évolution, réponse à la chimiothérapie) sont bien connues. Les ostéosarcomes sont particulièrement résistants aux traitements conventionnels. Il est donc important de pouvoir valider de manière précoce si une thérapie est efficace ou non afin d’en changer si besoin. Le modèle d’ostéosarcome murin utilisé est obtenu par greffe de cellules murines chez des souris immunocompétentes. L’évolution de ce modèle et sa réponse à des thérapies conventionnelles sont bien connues. De plus, nous avons une bonne maîtrise de ce modèle et une première validation ex vivo des mesures de paramètres ultrasonores liés à la microstructure. Les souris utilisées auront 5 semaines. C’est l’âge minimal pour effectuer les greffes. Les traitements commencent 10 jours après la greffe et se poursuivent pendant 3 semaines à raison de 2 traitements par semaine ce qui amène les animaux à un âge de 12 semaines maximum

Les mâles reproducteurs de cet élevage portent une mutation qui déclenche des polypes intestinaux, et sont tués dès les premières traces de sang dans leurs fèces. 2 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans chirurgie ni prélèvement. Leur descendance alimente d'autres projets, autorisés séparément, consacrés à la fonte musculaire liée au cancer. Le porteur qualifie ce modèle murin d'"indispensable" à son activité et affirme que seul un animal peut reproduire la complexité du phénomène.

Objectifs

Notre projet a pour objet de maintenir par élevage interne une lignée de souris permettant l'étude de la cachexie associée au cancer. Des souris mâles porteur de la mutation recherchée à l'état hétérozygote seront hébergées dans notre animalerie pour assurer la production de lots expérimentaux (mâles et femelles, sauvages et hétérozygotes). Les lots expérimentaux seront obtenus par croisement avec des souris femelles saines puis utilisés dans d'autres projet soumis à autorisation par ailleurs.

Bénéfices attendus

Le déconditionnement musculaire, qui désigne une perte de masse et de force musculaire, peut être observée dans différentes situations physiologiques et surtout pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de la qualité de vie des patients et à l'évolution péjorative de l'état de santé des patients.

Procédures

Aucun prélèvement ni chirurgie n'est prévu sur ces animaux.

Impact sur les animaux

Nous possédons désormais un recul d'une dizaine d'année sur cette lignée. L'expression du phénotype ne présente que peu de variation interindividuelle au sein de cette lignée. L'apparition de sang dans le fèces est un indicateur du développement des premiers polypes intestinaux et se situe très en amont des manifestations modérées puis sévère du phénotype. Dans un démarche visant à limiter la souffrance animale, les males reproducteurs seront mis à mort dès les prémices de sang dans les fèces..

Devenir

Mise à mort éthique avant atteinte des points limites

Remplacement

Le déconditionnement musculaire associé au cancer met en jeu un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal peut reproduire la complexité du phénomène..

Réduction

Nous réaliserons des accouplements d'un mâle avec 2 à 3 femelles saines de façon régulière. Nous plannifions d'avoir 20 reproducteurs maximum dans une année afin de couvrir les besoins des projets soumis par ailleurs.

Raffinement

Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés dans un local à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront au minimum de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Un contrôle des fécès sera réalisé à partir de la 10ème semaine de vie afin de déceler l'apparition de sang. Les males seront au maximum maintenu en présence des femelles afin de ne pas être isolés. En cas d'isolement exceptionnel et momentanné d'un male reproducteur, un tunnel-maison lui sera ajouté dans sa cage.

Choix des espèces

Un des objectifs principal de notre activité de recherche est la compréhension des mécanismes de la cachexie associée au cancer et le développement de stratégies thérapeutiques permettant de prévenir ou de limiter le syndrome cachectique. Disposer d'un modèle murin de cachexie associée au cancer est donc indispensable à notre activité. Les animaux seront utilisés de l'âge de 8 à 17 semaines maximum pour la reproduction.

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le foie, les muscles ou le pancréas. Elles subissent une à quatre prises de sang sur animal vigile, jusqu'à huit injections, pour certaines une chirurgie de moins de trente minutes, et une privation de nourriture ou d'eau de douze à quarante-huit heures. Le projet vise à valider chez la souris un biomarqueur sanguin déjà observé chez des patients atteints de lésions aiguës du foie, du muscle ou du pancréas. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ces interactions dans un "organisme entier" et conclut que l'expérimentation animale reste "indispensable".

Objectifs

Certaines lésions aiguës affectant des organes vitaux tels que le foie, les muscles ou le pancréas peuvent déclencher des réponses inflammatoires et métaboliques systémiques sévères. Ces atteintes sont observées dans différents contextes pathologiques humains, notamment lors d’intoxications aiguës, de sepsis ou de maladies auto-immunes et peuvent évoluer vers une défaillance multiviscérale. Ces processus sont fréquemment associés à l’activation de mécanismes de mort cellulaire régulée, tels que l’apoptose, la nécroptose et la ferroptose, qui, lorsqu’ils sont activés de manière excessive ou non contrôlée, peuvent contribuer à l’aggravation des lésions tissulaires. L’objectif général du projet est d’identifier et de caractériser un mécanisme commun de signalisation systémique des lésions tissulaires aiguës reposant sur la libération, dans la circulation sanguine, d’un biomarqueur intracellulaire lors de la mort cellulaire. Le projet vise à valider et à approfondir des observations réalisées chez l’homme, notamment dans des cohortes de patients présentant des pathologies inflammatoires aiguës ou métaboliques, afin d’évaluer la valeur prédictive de ce biomarqueur vis-à-vis de la morbidité et de la mortalité, en complément des marqueurs actuellement utilisés.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes biologiques impliqués lors de lésions aiguës touchant des organes vitaux. En s’appuyant sur plusieurs modèles expérimentaux complémentaires, il permet d’analyser comment des dommages cellulaires sévères peuvent être associés à la libération de signaux circulants reflétant l’intensité des atteintes tissulaires et la réponse globale de l’organisme. Les résultats attendus contribueront à mieux comprendre les liens entre les lésions locales d’un organe, les réponses systémiques observées dans l’organisme et l’évolution vers des formes graves de la maladie. Cette approche intégrée, combinant des observations issues de différents niveaux d’analyse, vise à identifier des indicateurs biologiques globaux permettant de mieux apprécier la sévérité des atteintes et leur évolution dans le temps. À plus long terme, ces travaux pourront apporter des connaissances utiles pour la recherche biomédicale, en particulier pour l’étude de pathologies inflammatoires aiguës ou chroniques pouvant conduire à une altération de plusieurs organes. Les bénéfices attendus concernent principalement l’amélioration des connaissances fondamentales sur les mécanismes en jeu, susceptibles de contribuer indirectement au développement de stratégies de prise en charge ou de prévention de ces pathologies chez l’homme ou l’animal.

Procédures

Toutes les souris feront l'objet de manipulations de routine nécessitant d'être brièvement maintenues. Afin de clarifier le parcours des animaux, les interventions se répartissent ainsi, selon les groupes étudiés : Prélèvements sanguins : chaque animal subira entre 1 et 4 prises de sang, réalisées sur animal vigile. Chaque geste dure quelques secondes. Injections : certains animaux recevront entre 1 et 8 injections, réalisées sur animal vigile ou sous anesthésie selon la nature de l’intervention. Chaque injection dure quelques secondes. Lorsque l’intervention est susceptible d’induire une douleur, un traitement analgésique préventif est administré en amont. Ces traitements analgésiques sont intégrés au nombre total d’injections prévues. Injection sous anesthésie générale : pour un groupe spécifique, une injection nécessaire à l’induction du modèle expérimental sera réalisée sous anesthésie générale de très courte durée. Le geste dure quelques minutes. Un traitement analgésique sera ensuite maintenu pendant la phase d’observation. Chirurgie : certaines souris subiront une unique intervention chirurgicale de moins de 30 minutes. Cet acte sera réalisé sous anesthésie générale profonde, associée à des traitements analgésiques préventifs locaux et généraux. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie liée à l’anesthésie. Contrôle de l’alimentation ou de l’accès à l’eau : avant le début de certaines expériences, certains animaux vigiles seront soumis à une période unique et temporaire de retrait de la nourriture ou de l’eau, d’une durée comprise entre 12 et 48 heures selon la procédure concernée. Cette étape est nécessaire pour standardiser leur état métabolique ou reproduire les conditions physiopathologiques du modèle.

Impact sur les animaux

Des périodes de contrôle alimentaire sont prévues et peuvent induire une sensation de faim, une baisse transitoire d’activité et une gêne liée au jeûne. Un contrôle alimentaire plus prolongé peut majorer la sensation de faim, entraîner une perte de poids transitoire et une altération temporaire de l’état général. Un contrôle hydrique est également prévu et peut induire une sensation de soif et une gêne transitoire. La contention, les manipulations répétées, les administrations et les prélèvements réalisés sur animaux vigiles peuvent induire un stress aigu transitoire, une réaction d’évitement et une détresse ponctuelle. Le placement en dispositif de contention pour certaines administrations, ainsi que la répétition de gestes techniques au cours de certaines procédures, peuvent majorer ce stress transitoire. Certaines étapes impliquent une anesthésie et une intervention chirurgicale, susceptibles d’induire un stress physiologique, une baisse transitoire de la thermorégulation et, plus rarement, une détresse cardio-respiratoire pendant l’anesthésie ou au réveil. Certaines administrations nécessitent un réchauffement transitoire, pouvant constituer un stress thermique. Les prélèvements sanguins peuvent induire une douleur légère et transitoire, ainsi qu’un risque d’hématome ou de saignement local. Les administrations par injection peuvent induire une douleur brève au point d’injection et une irritation locale ; lorsqu’elles sont répétées, elles peuvent augmenter le risque de réaction inflammatoire locale et de complication interne. Les administrations intramusculaires peuvent induire une douleur locale et une gêne locomotrice transitoire. L’intervention chirurgicale peut induire une douleur post-opératoire, un risque d’inflammation locale, un risque d’infection et une altération transitoire de la mobilité. L’induction expérimentale de lésions aiguës peut entraîner une maladie avec inconfort, douleur modérée, baisse d’activité, troubles transitoires de l’alimentation et de l’hydratation.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Notre laboratoire met en œuvre, en amont des expérimentations animales, des approches de remplacement visant à limiter le recours aux animaux lorsque cela sera possible. Les phases exploratoires et de mise au point reposent notamment sur des modèles in vitro (essais sur des cultures de cellules) et sur des approches in silico, utilisés pour tester des hypothèses, optimiser des conditions expérimentales et sélectionner les paramètres à mesurer. Toutefois, les objectifs de ce projet nécessitent des investigations in vivo. Les modèles retenus reposent sur l’induction de lésions d’organes ainsi que sur l’évaluation de leurs conséquences métaboliques. Ces phénomènes impliquent des interactions intégrées entre plusieurs organes et systèmes (notamment immunitaire, métabolique et nerveux). À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de façon suffisamment fidèle l’ensemble de ces interactions et leur dynamique dans un organisme entier, ni d’évaluer de manière intégrée les effets des procédures sur l’état général, la réponse inflammatoire et les paramètres biologiques mesurés aux temps précoces définis. En conséquence, l’expérimentation animale reste indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un nombre total maximal de 240 souris. La stratégie de réduction repose sur l’optimisation du plan expérimental afin de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en maintenant la validité scientifique des résultats. Afin de réduire le recours à des animaux témoins distincts, chaque animal sera utilisé, lorsque le protocole le permet, comme son propre contrôle, grâce à la réalisation de prélèvements ou de mesures avant et après l’administration expérimentale. Cette approche permet des comparaisons pour un même individu et contribue à limiter le nombre total de souris nécessaires au projet. Par ailleurs, les expérimentations seront regroupées et planifiées de manière à mutualiser les lots lorsque cela est possible. Plusieurs tissus seront prélevés chez un même animal et utilisés pour différentes analyses afin de maximiser les informations obtenues. De plus, les échantillons seront partagés avec des collaborateurs dans un cadre défini afin d’éviter la réalisation d'expériences redondantes et de limiter la production de nouveaux lots d’animaux. La taille des effectifs a été établie de manière stricte grâce à un calcul de puissance : cette méthode permet de déterminer l’effectif minimal nécessaire pour observer un effet. En conséquence, chaque groupe expérimental comprendra 15 souris, ce qui permet de prendre en compte la variabilité naturelle entre les individus tout en limitant le nombre d’animaux. Enfin, sur ces effectifs réduits, il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques rigoureux pour garantir une interprétation fiable et solide des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et de prise en charge des animaux respecteront strictement la réglementation en vigueur ainsi que les pratiques validées au sein de l’établissement utilisateur. Les animaux seront hébergés en cages collectives, avec un accès permanent à une alimentation standard et à l’eau ad libitum, sauf lorsque des périodes de privation ou de restriction seront explicitement prévues par certaines procédures expérimentales. L’environnement sera enrichi par la mise à disposition de matériaux de nidification et d’abris, afin de favoriser l’expression de comportements naturels et de limiter le stress. Une surveillance clinique régulière, adaptée à chaque procédure, sera assurée tout au long du projet. Elle permettra l’identification précoce de tout signe de mal-être ou d’altération de l’état général, tels qu’une diminution de l’activité, une posture anormale, une piloérection ou des modifications du comportement. Des points limites spécifiques à chaque modèle expérimental sont définis afin de limiter la douleur, la souffrance ou la détresse des animaux. L’apparition d’une altération marquée de l’état général ou de signes cliniques sévères conduira à une évaluation immédiate et, le cas échéant, à l’arrêt anticipé de la procédure pour l’animal concerné. Les sites d’injection et, lorsque cela est applicable, les zones chirurgicales feront l’objet d’une observation régulière afin de détecter précocement toute réaction locale ou complication. Un suivi attentif sera également assuré après les administrations ou les interventions chirurgicales, en particulier durant les phases critiques définies pour chaque procédure. Des mesures adaptées de prise en charge seront mises en œuvre afin de limiter l’inconfort lié aux actes expérimentaux, incluant le recours à des protocoles d’anesthésie et d’analgésie appropriés ainsi que des mesures de maintien de la température corporelle lorsque cela est nécessaire. En cas de diminution de la prise alimentaire, un apport nutritionnel complémentaire sous forme de gel alimentaire pourra être mis à disposition afin de garantir un apport énergétique suffisant. L’ensemble des actes expérimentaux sera réalisé par du personnel formé et habilité à l’expérimentation animale, conformément aux exigences réglementaires, afin d’assurer des manipulations maîtrisées, reproductibles et respectueuses du bien-être animal.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris, incluant des souris commerciales non transgéniques et des souris génétiquement modifiées pour cibler des gènes spécifiques liés aux maladies étudiées. Ces souris sont fertiles, possèdent un système immunitaire normal et ne présentent aucun problème de santé lié à leur génétique dans des conditions d’élevage classiques. Le choix de la souris se justifie par la pertinence de cette espèce pour étudier les inflammations aiguës, les lésions des organes et les mécanismes de mort des cellules. La souris permet d’explorer globalement les interactions entre les systèmes immunitaire, métabolique et sanguin, qui sont au cœur de ce projet. Ces réactions complexes à l'échelle de l'organisme entier ne peuvent pas être reproduites de façon adéquate par des méthodes alternatives (comme des cultures de cellules). De plus, la souris constitue un modèle de référence pour lequel il existe une grande expertise en élevage, en soins vétérinaires, et de nombreux outils d’analyse fiables. La disponibilité de souris génétiquement modifiées et la grande similitude des mécanismes biologiques étudiés avec ceux observés chez l’humain rendent cette espèce particulièrement adaptée à nos objectifs. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 8 semaines. À ce stade, les souris ont terminé leur développement et présentent un système immunitaire et un métabolisme adultes, ce qui est indispensable pour garantir la fiabilité scientifique des résultats de cette étude.

Jusqu'à trente gavages et cinq privations d'eau de quinze heures trente en cinq jours : 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent une prise de sang et jusqu'à trois injections sur animal vigile, un isolement quotidien d'environ une heure pour mesurer la prise de boisson, et deux passages en pot de plastique jusqu'à ce que l'animal défèque. Le projet cherche à savoir si les souris qui absorbent mal le fructose en boivent moins par aversion, et si leur microbiote en est la cause. Toutes seront tuées pour prélever le cæcum et son contenu.

Objectifs

Le fructose est un sucre très présent dans notre alimentation et mal absorbé lorsqu’il est consommé en excès, on parle de malabsorption du fructose. Cette malabsorption, très fréquente chez les enfants et les jeunes adultes, cause des symptômes gastrointestinaux (production excessive de gaz, diarrhées, douleurs abdominales) et peut induire une sensation de satiété. Nous étudions ce phénomène à l’aide de modèles de souris qui présentent les mêmes difficultés d’absorption du fructose que les humains. Nous avons constaté que le fructose, consommé lors d’un repas ou sur le long terme : augmente une hormone digestive pouvant jouer un rôle dans les douleurs intestinales et la prise alimentaire, modifie la composition du microbiote intestinal, et change le comportement alimentaire des animaux : ils mangent moins pendant les deux premiers jours d’exposition au fructose, puis reviennent à la normale à partir du sixième jour. Nous voulons comprendre si dans ce contexte de mauvaise absorption du fructose, ces changements de comportement alimentaire traduisent un phénomène d’aversion (réaction négative ou ressentiment fort qui pousse à éviter ou à rejeter quelque chose) puis d’habituation suite à la consommation ponctuelle ou répétée à ce sucre et identifier les médiateurs biologiques impliqués. Nous souhaitons savoir si ces modifications de la prise alimentaire sont liés aux changements du microbiote et si ce dernier en est la cause directe. Pour cela, nous comparerons des souris normales à des souris qui absorbent mal le fructose, traitées ou non par des antibiotiques déplétant le microbiote. Elles recevront un régime sans fructose, puis seront soumises à un test visant à évaluer leur préférence ou leur refus de la solution de fructose par rapport à une solution neutre telle que l’eau, un test d’aversion lors d’une exposition ponctuelle, dite « aigüe » (5 min) ou répétée, dite « chronique » (10 jours) à ce sucre. Ce test a pour but de comparer le volume de fructose ingéré sous forme liquide dans la boisson à celui de l’eau afin d’évaluer la préférence de boisson des animaux et ainsi leur potentiel refus (aversion), vis-à-vis de ce sucre. Nous analyserons aussi le microbiote et marqueurs biologiques potentiellement liés à ces modifications du comportement alimentaire. L’objectif est de mieux caractériser la malabsorption du fructose et les mécanismes associés en clarifiant le lien entre le fructose, le microbiote, la douleur viscérale et la prise alimentaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier les mécanismes impliqués dans les changements de comportement alimentaire observés chez les souris qui n’absorbent pas bien le fructose, suite à une exposition répétée ou ponctuelle à ce sucre. En effet, cela permettra de mieux comprendre la mise en place de ce phénomène et de déterminer s’il existe un lien entre ces changements de comportements alimentaires, la douleur intestinale, et les changements du microbiote. En effet, l’identification des médiateurs biologiques impliqués dans l’établissement de ces symptômes de malabsorption du fructose, pourraient permettre de développer à terme, de meilleures stratégies alimentaires ou thérapeutiques et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes atteintes. De plus, on retrouve des symptômes similaires dans le syndrome de l’intestin irritable (SII), qui est le désordre intestinal le plus fréquent, avec 14,4 à 22 % des patients atteints qui n’absorbent pas bien le fructose. Ainsi, compte tenu de la forte prévalence du SII dans le monde, et d’un pourcentage non négligeable de malabsorption du fructose parmi les patients atteints de SII, il semble crucial d’en décrypter les mécanismes sous-jacents.

Procédures

Les animaux seront soumis à un et/ou deux tests comportementaux ayant pour objectif d’évaluer leur réaction (refus ou préférence) vis-à-vis du fructose via la mesure de sa consommation dans la boisson. Au cours de ce protocole qui durera au total 5 jours, les souris seront soumises à 5 périodes de restriction d’eau de 15h30, à un hébergement individuel (de courte durée (1h05/jour) nécessaire pour mesurer la prise hydrique, à un prélèvement sanguin (moins de 20 secondes) à l’état vigile, à maximum 3 injections (moins de 20 secondes/ injection) à l’état vigile, à maximum 30 gavages (moins de 20 secondes / gavage) à l’état vigile ainsi qu’à de la contention (quelques secondes) à l’état vigile. Les animaux seront soumis à deux prélèvements de fèces au total, au cours desquels les animaux seront placés dans un pot transparent, le temps (maximum 10 minutes) qu’ils évacuent deux fèces.

Impact sur les animaux

Les animaux seront susceptibles d’être seront susceptibles d’être soumis : A un stress et une potentielle déshydratation, lors des périodes de test de préférences et de mesure de la prise hydrique, nécessitant une période de restriction d’accès à l’eau. • A un stress lors de l’hébergement individuel de courte durée, nécessaire pour mesurer la prise hydrique au cours des tests d’aversion, lors de la récolte de fèces impliquant le placement de la souris dans un pot en plastique afin qu’elle émette des selles et lors du prélèvement de sang, nécessitant une contention de moins de 20 secondes. Au cours de ce prélèvement et des injections prévues, les animaux ressentiront une légère douleur due à la piqûre, de l’ordre de quelques secondes.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever certains tissus (caecum et contenu de caecum).

Remplacement

À ce jour, aucun modèle ou technique in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire les interactions complexes entre le fructose, le microbiote et l’axe intestin-cerveau. Le recours à des animaux est donc indispensable pour intégrer et analyser de manière globale les données génétiques, physiologiques, du microbiote et de l’alimentation ainsi que les informations biologiques obtenues à partir des dosages hormonaux dans le sang et des analyses des tissus intestinaux et cérébraux.

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental et par génotype afin d’obtenir des résultats fiables et significatifs. Ce nombre a été déterminé en prenant en compte la variabilité des mesures de prise hydrique et des dosages ainsi que la variabilité connue des réponses du microbiote et de son adaptation au fructose. Pour analyser les résultats, nous utiliserons des méthodes statistiques adaptées, en fonction du type de données recueillies, pour garantir des conclusions solides et précises. Dans cette perspective de réduction, nous prévoyons de n’inclure qu’un seul groupe contrôle, valable pour l’ensemble des groupes tests.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place : • Un enrichissement du milieu de vie : Les souris disposeront de papier sopalin pour construire leur nid, d’un bâton à ronger, d’un abri en propylène rouge, ainsi que de deux hamacs pour réduire les risques de bagarres. • Les animaux seront en groupe ; • Une habituation à la contention : Les animaux seront habitués à la contention et à l’expérimentateur afin de minimiser leur stress pendant les manipulations expérimentales ; • Cages des souris placées côtes à côtes sur le même portoir dans des cages transparentes lors de l’hébergement individuel nécessaire au test de préférence et de mesure de la prise hydrique d’aversion ; • Une surveillance et une pesée seront réalisées quotidiennement pendant la période du test d’aversion, pour contrôler l’état des animaux et s’assurer de leur bien-être tout au long du test et pouvoir intervenir ; • Des points limites seront définis et appliqués.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé dans les recherches sur les maladies gastro-intestinales, en raison de sa pertinence scientifique. Nous disposons de données préliminaires sur ces modèles génétiques originaux, qui sont disponibles uniquement chez la souris et indispensables pour notre étude. De plus, la souris possède les mêmes transporteurs et enzymes impliqués dans le métabolisme du fructose que l’humain ce qui renforce sa pertinence pour cette étude. Enfin, la malabsorption du fructose observée chez l’homme l’est également chez la souris et fait intervenir chez l’un comme chez l’autre, une altération dans la voie du métabolisme du fructose. Les groupes de souris seront testées pour l’aversion au fructose à 7 semaines d’âge, ce qui correspond chez l’humain à environ la tranche d’âge « 18-25 ans », groupe démographique étant le plus grand consommateur de fructose dans la population humaine.