Oncologie

Des cellules tumorales sont injectées dans la muqueuse intestinale par voie rectale sous endoscopie, geste répété chaque semaine pour suivre la croissance de la tumeur. 2 752 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever rate, ganglions, intestins et tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des traitements anticancéreux par voie orale, rectale, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse ou par gavage, avec des prélèvements de sang à la veine faciale jusqu'à une fois par semaine. Le porteur affirme que l'effectif est calculé "au plus juste" à partir d'expériences antérieures en greffe sous-cutanée, sans donner un seul chiffre à l'appui de ces 2 752 animaux.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans la continuité de projets déjà existants et ayant donné des résultats très prometteurs. Il consiste à mettre au point des modèles de greffe de cellules tumorales dans la muqueuse intestinale afin de se rapprocher au plus près de ce qui se passe chez l’homme dans le cas de personnes atteintes de cancer digestif. En effet des expériences préliminaires ont été réalisées en greffant des cellules tumorales sous-cutanées afin de développer et de tester de nouvelles approches de thérapies de vaccination anti-cancer. Afin de continuer et d’optimiser ces thérapies, il est intéressant et judicieux d’améliorer les modèles d’études. La localisation des cellules tumorales est un paramètre important à prendre en compte dans nos études. En effet, celle-ci peut modifier la réponse aux thérapies due à un différentiel de biodistribution du médicament selon les organes, le microenvironnement, une réponse immunitaire différente selon les organes. C’est pour cela qu’il est important de développer des modèles murins de greffe de cellules tumorales au niveau de l'instestin. De plus dans le cancer colo-rectal les immunothérapies sont peu efficaces, cette étude a pour objectif de tester un traitement local in-situ afin d’augmenter les efficacités de traitements. La stratégie de vaccination des lésions in-situ permettrait d’empêcher les lésions pré-cancéreuses de se développer.

Bénéfices attendus

Malgré les progrès importants dans la prise en charge des patients atteints de cancer digestifs, un certain nombre ne répondent pas aux différente de traitement ou récidivent. Il est donc essentiel de développer de nouvelles thérapies ou d’optimiser les traitements existants. Pour cela, nous avons besoin de modèles se rapprochant au plus près de la pathologie humaine. L’utilisation du modèle murin de greffe de cellules tumorales issues de cancer digestifs au niveau de l'intestin permettra de créer un environnement au plus proche de celui des cancers digestifs chez l’Homme et pourra ainsi répondre à des interrogations auxquelles nous ne pouvons pas répondre dans les modèles traditionnels de greffe tumorale en sous-cutané.

Procédures

Les animaux subiront une endoscopie sous anesthésie afin d'injecter des cellules tumorales dans la muqueuse intestinale. Ces animaux subiront ensuite d'autres endoscopies sous anesthésie afin de suivre l'évolution de la tumeur (une par semaine). Pour les animaux ayant reçu une lignée cellulaire dont le suivi peut être réalisé par imagerie une fois par semaine, une injection intra-péritonéale de produit de traçage sera réalisée suivi par une anesthésie gazeuse pour le placement dans l’appareil d’imagerie. Les animaux recevront ensuite différents traitements anti-cancer (un traitement par animal). Ceux-ci seront administrés soit par voie orale, rectale sous endoscopie, intra-musculaire, intra-péritonéale, inra-veineuse ou par gavage. Les animaux, au cours de la procédure pourront subir des prélèvement de sang veineux périphérique au niveau de la veine faciale après anesthésie gazeuse à l’isoflurane au maximum une fois par semaine.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales sera réalisée sous anesthésie gazeuse par endoscopie dans la muqueuse intestinale ce qui peut induire un stress de l’animal. Le développement des tumeurs peut être à l’origine de souffrance et de gênes qui seront évaluées par observations fréquentes des animaux (poids, état général) 3 fois par semaine et estimation de la prise tumorale par imagerie de bioluminescence après injection IP de luciférine lors de l’utilisation de lignées cellulaire possédant la luciférase ou par endoscopie.

Devenir

A l'issu de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes (rate, ganglions, intestins, tumeurs...) et ainsi réaliser des analyses immunologiques complémentaires. Ces analyses sur les organes permettront de mieux comprendre les mécanismes de développement tumoral ainsi que les mécanismes d'actions et les conséquences des traitements.

Remplacement

Un modèle animal, et plus précisément mammifère doté d’un système immunitaire complexe, est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes dans le cancer. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées préalablement à l’aide de modèles de culture cellulaire in vitro, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Les études de délivrance et de biodistribution nécessitent forcément d’avoir recours à l’expérimentation animale. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu. Préalablement à ces expériences in vivo des études in vitro ont été réalisées afin de définir des conditions optimales de croissance tumorale et de conditions d’administration des traitements.

Réduction

Ces expériences in vivo sont réalisées pour soutenir et compléter des résultats qui ont été obtenus in vitro. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste afin de pouvoir montrer des différences significatives ainsi que la reproductibilité et la répétabilité des résultats obtenus. Ces effectifs sont calculés à partir des résultats que l’on a pu obtenir par le passé sur des expériences utilisant des modèles de greffe sous cutanée ainsi que les données de la littérature sur le sujet.

Raffinement

Après une semaine d’acclimatation, les souris seront habituées au geste de la contention et à la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi (abris, matériaux de nidification, contrôle du cycle lumineux, de l’hygrométrie et de la température). Ils bénéficient d’un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et sont manipulés exclusivement par du personnel formé et habilité. Les animaux seront suivis de façon adaptée à l’intensité de la pathologie afin d’évaluer les nuisances causées ainsi que la sévérité de la pathologie. Les procédures expérimentales potentiellement douloureuses seront encadrées par une anesthésie. L’apparition d’une potentielle douleur en lien avec les procédures expérimentales sera appréciée par une échelle d’évaluation de la douleur. Lorsque cela sera possible, des techniques d’imagerie par bioluminescence seront privilégiées pour le suivi de la maladie à la place des endoscopies. Enfin, des points limites seront mis en place, prenant en compte plusieurs paramètres tels que la perte de poids, l’état du pelage, la capacité de locomotion et la présence d’une douleur qui sera évaluée grâce à une grille de score précise. Ces points limites permettront, lorsqu’ils sont atteints, de mettre à mort immédiatement les animaux.

Choix des espèces

La souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’humain, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques. Les modèles utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. La souris présente également l’avantage d’être disponible avec différentes mutations génétiques permettant d’étudier plus profondément certains mécanismes cellulaires. Des souris âgées de 4 à 12 semaines seront utilisées. Ce stade de développement a été retenu car le système immunitaire est pleinement mature permettant d'obtenir une réponse inflammatoire reproductible après implantation de la tumeur. L'utilisation d'animaux adultes limite également les variations physiologiques observées au cours de la croissance ou liées au vieillissement, susceptibles d'influencer les paramètres étudiés. Par ailleurs, la majorité des données publiées concernant le modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales au niveau de l’intestin a été obtenue chez des souris jeunes adultes, ce qui permet de comparer les résultats générés dans ce projet avec ceux de la littérature scientifique et d'assurer la reproductibilité des expériences.

Chaque souris est irradiée sous anesthésie générale, greffée par voie intraveineuse avec des cellules immunitaires modifiées, puis injectée avec des cellules tumorales sous la peau ou dans la veine de la queue, cette dernière injection sans anesthésie. 1 440 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever rate, moelle osseuse et foie. Le porteur reconnaît que les tumeurs diffuses peuvent provoquer une douleur ou un inconfort modéré dans plusieurs organes, et que les tumeurs solides gêneraient les déplacements si les animaux n'étaient pas tués avant. Il présente pourtant cet enchaînement comme "plusieurs manipulations simples, réalisées dans des conditions assurant le confort et la sécurité des animaux".

Objectifs

Les cellules immunitaires sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Elles ont besoin d’énergie pour remplir efficacement leur rôle, et plusieurs mécanismes à l’intérieur de la cellule régulent cette utilisation d’énergie. Ce projet cherche à comprendre comment ces mécanismes influencent l’activité des cellules immunitaires, leur activation, leur déplacement et leur capacité à combattre les tumeurs, qu’elles soient localisées (tumeur solide) ou diffuses dans l’organisme (métastases).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’énergie disponible dans les cellules immunitaires influe sur leur capacité à agir contre les cellules cancéreuses. Le rôle des cellules immunitaires étant primordial, les résultats pourraient aboutir à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques visant à renforcer la réponse immunitaire anti-tumorale. Le projet permettra également d’évaluer l’intérêt potentiel d’un médicament déjà utilisé pour traiter le diabète dans la prise en charge du cancer. Si son efficacité est démontrée, son utilisation en thérapeutique pourrait être facilitée et plus rapide, car ce médicament est déjà autorisé et utilisé chez l’humain.

Procédures

Chaque souris sera soumise à plusieurs manipulations simples, réalisées dans des conditions assurant le confort et la sécurité des animaux. Chaque animal recevra : • Une anesthésie générale suivi d’une irradiation (30 minutes) • Une greffe de cellules immunitaires par injection intraveineuse (durée : 1 min) sous anesthésie volatile (durée : 5 min) • Un prélèvement sanguin sous anesthésie afin d’évaluer la prise de greffe (durée : 5 min) • Une injection de cellules tumorales sous la peau (durée : 30 s), sera effectuée sous anesthésie volatile (durée : 5 min) pour la moitié des animaux ou une injection dans la veine de la queue sans anesthésie (inaccessible avec anesthésie), (durée : 1 min) pour l’autre moitié. • Une injection dans l’abdomen ne nécessitant pas d’anesthésie (30 s) ou en sous-cutanée (30 s) après une anesthésie volatile (durée : 5 min)

Impact sur les animaux

Les procédures peuvent provoquer une douleur légère et temporaire lors des injections. L’irradiation aux rayons X n’induit qu’un faible stress et une faible douleur car les animaux seront anesthésiés profondémment. L'injection des cellules de la moelle osseuse et les prélèvements sanguins ne provoquent pas de douleur ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. Nous n’attendons pas de souffrance suite à la greffe. En effet, la prise de greffe se déroule bien dans >90% des cas, d'autre part, les cellules immunitaires modifiées au cours de ce protocole ne sont pas strictement nécessaires à la survie de l’animal et ne sont pas connues pour induire de pathologie. Le développement des tumeurs, notamment dans le modèle de tumeur diffuse, peut entraîner une douleur ou un inconfort modéré en raison de la présence des tumeurs dans différents organes (rate, moelle osseuse, foie). En revanche, la croissance des tumeurs solides n’affecte pas les mouvements ni ne provoque de gêne locomotrice au cours du protocole, les animaux étant euthanasiés avant l’apparition de ces gênes. Tout animal présentant une réaction anormale ou une souffrance non contrôlable sera immédiatement euthanasié conformément aux critères de fin d’expérience établis.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes post mortem pour des analyses sur les cellules immunitaires modifiées et mises en compétition.

Remplacement

Les cellules du système immunitaire modifiées ont été testées in vitro notamment face à des cellules tumorales. Cependant, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité de la réponse anti-tumorale. De ce fait, la mise en place d’expériences in vivo sur un modèle animal est pertinente. Pour des raisons éthiques et de praticité cela ne peut être effectué directement chez l'homme avant preuve chez l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé au strict minimum nécessaire pour permettre une analyse fiable des résultats. Des calculs statistiques simples montrent qu’il faut au moins cinq animaux par groupe pour pouvoir détecter des différences réelles et solides entre les conditions testées, sans augmenter inutilement le nombre d’animaux. De plus, des expériences préliminaires déjà réalisées nous confortent dans ce choix et confirment que cet effectif est suffisant pour obtenir des données solides. La procédure a été conçue pour obtenir le plus de données possibles à partir d’un seul individu, en réalisant plusieurs analyses sur les mêmes animaux. Enfin, la co- injection dans un même animal permet une comparaison directe de nos conditions expérimentales et limite la variabilité, réduisant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires à la réalisation du projet. Cette organisation permet de réduire la répétition d’expériences indépendantes et donc de limiter l’utilisation d’animaux tout en garantissant la qualité scientifique du projet.

Raffinement

L’équipe possède une expertise solide se traduisant par la mise en place de plusieurs mesures visant à garantir au maximum le bien-être des animaux : • Utilisation d’une armoire chauffante pour assurer une bonne récupération de l’animal suite à l’irradiation • Contrôler précisément le nombre de cellules injectées, afin d’éviter une croissance tumorale trop rapide ou imprévisible. Données déterminées suite à l’expertise de l’équipe (8 ans d’utilisation du modèle tumorale) • Assurer une surveillance régulière, tous les deux jours, en observant notamment la motricité, le comportement, la posture et la réponse aux stimulations • Définir des points limites stricts (perte de motricité, perte de réponse aux stimulations) et précoces : si l’un de ces seuils est approché, la fréquence de surveillance est augmentée pour intervenir au bon moment et éviter toute souffrance inutile. • En cas d’apparition de signes d’irritation ou d’inflammation des lavages au sérum physiologique sera effectué deux fois par jour pendant 48h. Si cela ne s’améliore pas un vétérinaire sera alors contacté.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront âgées de 8-9 semaines le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

Remises à l'eau moins d'une heure après l'opération, 35 anguilles argentées capturées dans le milieu naturel vont subir des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un émetteur est implanté dans leur abdomen sous anesthésie, au cours d'une chirurgie de dix minutes au plus, pour mesurer combien d'entre elles atteignent l'estuaire malgré la dizaine d'ouvrages hydroélectriques installés sur leur route. Le porteur annonce une inflammation ou une gêne locale pouvant durer quelques semaines après l'implantation, ainsi qu'une altération temporaire du comportement. L'effectif de 35 individus est calé sur un objectif de trente poissons détectés à l'arrivée, l'espèce ayant été retenue parce que sa survie est déjà entamée par le franchissement des turbines.

Objectifs

L'objectif du projet est d'évaluer le succès de migration des anguilles en dévalaison depuis l'amont d'un bassin-versant jusqu'à son estuaire. Plus d'une dizaine d'ouvrages hydroélectriques sont construits sur cette voie de migration et peuvent induire un retard ou un échec de migration (mortalité lors du franchissement par les turbines par exemple). Cette étude vise à estimer un premier ordre de grandeur du taux d'échappement des anguilles présentent à l'amont du bassin.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont une amélioration de la connaissance sur cette espèce et du degré de continuité écologique de la portion étudiée. Les principaux résultats attendus concernent la vitesse générale de dévalaison et le taux d'échappement (succès de migration) des anguilles.

Procédures

Les poissons seront soumis à une procédure chirurgicale (d'un maximum de 10 minutes) au cours de laquelle des émetteurs seront posés dans l'abdomen des individus.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables possibles sur les animaux sont : le stress lié à la capture et à la manipulation, les effets de l’anesthésiant utilisé pour l'opération, les effets post-opératoires (inflammation liée à l’implantation de l'émetteur ou gêne locale pouvant aller jusqu’à quelques semaines), l'altération temporaire du comportement (lié au stress, à l’implantation, à l’anesthésie pouvant aller jusqu’à quelques heures).

Devenir

Les animaux sont replacés dans leur milieu naturel à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’objectif du projet étant d’évaluer le succès de migration des poissons issus du milieu naturel à l'échelle d'un bassin-versant, le remplacement n’est pas envisageable.

Réduction

Le taux de détection à l'estuaire n'est par nature pas connu avant l'expérimentation puisqu'il est l'objectif même de celle-ci. Néanmoins, lors d'études similaires sur l'anguille menées par notre bureau, nous avons constaté des taux de détection des individus marqués situés entre 80 et 96%. Dans ce cadre exploratoire, afin de tenter de disposer d'une trentaine d'individus détectés à l'estuaire, nous proposons de marquer un effectif de 35 anguilles.

Raffinement

Les opérations d'implantation sont réalisées sous anesthésie et ont la durée la plus courte possible, entre 1 à 3 minutes pour l’implantation d’un émetteur. Une recirculation d’eau avec une légère sédation est installée pour le poisson. Le poids de l'émetteur (3.5g) ne dépasse pas 2% du poids de l'individu (en moyenne 800g). Les émetteurs sont tous encapsulés dans des matériaux biocompatibles. Concernant le marquage, les solutions d'anesthésiant sont changées tous les 20 individus. Les poissons sont manipulés à l'aide d'épuisette en maille en silicone pour éviter l'abrasion provoquée par les mailles classiques en nylon. Les points de suture sont réalisés avec du fil monofilament résorbable. Le fil monofilament endommage moins les tissus et empêche une infiltration d’eau par capillarité. Le matériel est désinfecté avant chaque session de marquage. Les lames de scalpel sont stériles. Les opérateurs portent des gants stériles. Les poissons sont anesthésiés un par un. Un pansement antiseptique est appliqué sur la cicatrice du poisson, ayant un effet dans les heures suivant le marquage. Lors des stabulations pré et post marquage, les poissons sont placés dans des volumes d'eau adaptés de 40L. Une pompe à air à grande capacité permet de maintenir un taux d'oxygène adapté et une limitation à l'exposition à la lumière (couvercle opaque) est prévue. La température est également contrôlée pour éviter le stress thermique. Afin de limiter le stress, les poissons sont relâchés le plus rapidement possible (

Choix des espèces

L’espèce a été choisie, car c’est une espèce migratrice dont la survie est impactée par le franchissement des usines hydroélectriques. Les anguilles utilisées seront les anguilles dites argentées, présentant les signes morphologiques suivants: coloration argentée du ventre et des flancs, fort contraste ventro-dorsale, taille des yeux importante, développement accru des nageoires pectorales, ligne latérale marquée.

2 232 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Le protocole enchaîne des tests métaboliques avec injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins à la queue, une injection de glycérol ou de cardiotoxine dans le quadriceps sous anesthésie pour léser le muscle, un régime enrichi en lipides destiné à rendre les animaux obèses, des mesures de force et d'endurance en isolement, et un transport entre deux établissements. Le porteur reconnaît que l'inconfort lié à l'obésité induite "pourrait durer plusieurs semaines". Il fonde l'effectif sur les habitudes expérimentales de l'équipe et sur des expériences préliminaires, un calcul de puissance étant jugé difficile à mettre en œuvre, et les souris sont tuées par groupes d'âge, à 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 2 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux établissements utilisateurs (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever poumons, foie, rate, cerveau et ganglion médiastinal. Les souris reçoivent une puce d'identification, une infection intranasale par Mycobacterium bovis sous anesthésie, puis une prise de sang par semaine et deux pesées hebdomadaires. Parmi les bénéfices attendus, le porteur place la mise au point d'une vidéosurveillance des animaux infectés en isolateur, présentée comme un moyen de détecter plus tôt les comportements annonçant les points limites. Il indique partir de vingt-quatre souris pour en conserver six au dernier jour du protocole, un quart des animaux contrôlant l'infection en formant des granulomes, les dix-huit ou dix-neuf autres se dégradant jusqu'aux points limites et étant tués entre le vingt et unième et le trente-cinquième jour.

Objectifs

La tuberculose bovine est une pathologie majeure en santé animale. L'espèce mycobactérienne adaptée aux animaux, Mycobacterium bovis (Mb), est le principal agent pathogène responsable de la tuberculose bovine en Europe et au Royaume-Uni. C'est un pathogène zoonotique multi-hôtes capable d'infecter les ruminants (bovins, caprins, ovins), la faune sauvage et l'homme. Les programmes de surveillance et d’éradication, basés sur des campagnes de tests et l'abattage systématiques des bovins réactifs, n'ont pas permis d'éradiquer la tuberculose bovine (bTB). La bTB représente donc un risque direct pour les économies agricoles, la santé animale et humaine et la biodiversité dans les pays touchés. Il existe une hétérogénéité dans la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par Mb, ce qui influence directement le risque de transmission par les bovins infectés et la faune sauvage. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections à Mb est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Le projet a pour objectif de comprendre comment Mb interagit avec le système immunitaire de l’hôte et comment cette bactérie module la progression et la transmission de la maladie. Pour cela, nous souhaitons identifier les gènes de Mb essentiel pour sa persistance et sa dissémination. Pour cela nous souhaitons i) Comparer la virulence de mutants de Mb (ii) Suivre la réponse immunitaire et le développement du granulome en réponse aux différents mutants.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous mettrons au point pour la première fois la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur pour raffiner nos points limites (détection plus précoce de comportements). La validation du matériel, son installation, et de la méthode d’analyse permettra de proposer ce suivi pour nos prochains projets. Les résultats permettront de caractériser le rôle de 3 gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination de Mb. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés par les différentes souches.

Procédures

Pose de la puce d’identification et télémétrique : 1 fois et 1min/animal. Anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale + infection par voie intranasale : 1 fois et 15 min/animal. Prise de sang : 1 fois par semaine et 3 min/animal/prélèvement. Pesée : bi hebdomadaire et 1min/pesée/animal. Les prises de sang peuvent engendrer un hématome et la contention peut engendrer du stress pour l’animal.

Impact sur les animaux

Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourraient être observés. Nous savons par expérience que les souris sont sensibles aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec la souche M.bovis de référence. Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, cerveau, ganglion médiastinal) et fluides biologiques (sang, urine et fèces). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, des lésions, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test statisitique. Pour obtenir un groupe de 6 souris au dernier jour du protocole, nous savons qu’il nous faut partir d’un groupe de 24 animaux. En effet, tous les animaux ne réagissent pas pareil à l’infection, certains la contrôlent en formant des granulomes pulmonaires matures (25% des animaux), et les autres doivent être sacrifiés au fur et à mesure du protocole car ils atteignent les points limites (entre J21 et J35 classiquement). Chez ces animaux sensibles, des lésions désorganisées sont observables dans le poumon. En résumé, nos protocoles comprennent 24 souris, nous analysons les réponses immunitaires de deux groupes : les animaux résistants (5-6 souris) et sensibles (18-19 souris). Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes et la vidéosurveillance sera mise en place pour mieux suivre les souris. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. les animaux seront habitués en amont à la cellule d’expérimentation, une semaine avant le début de l’expérimentation Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruités ou rondelle de banane séchée ou popcorn sera réalisée.

Choix des espèces

Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. De plus le modèle murin permet une manipulation en animalerie A3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce. Le modèle murin nous offre la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour les voies de signalisation ou cytokines impliquées dans les réactions immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines (sexe indifférent). Pour ce projet, il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.

1 500 souris, toutes tuées à l'issue, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous la peau, puis de vingt à trente administrations du composé testé, jusqu'à soixante en cas de deux prises quotidiennes, avec une contention tous les deux jours pour mesurer la tumeur qui pousse sous sa peau. Les inhibiteurs testés visent le mélanome et les cancers du côlon et du pancréas, en combinaison avec les immunothérapies existantes. Le porteur écrit que ces expériences sont "cruciales pour l'avancée du projet et les levées de fond nécessaires" dans le cadre d'une collaboration avec une start-up, et qualifie la souris d'"indispensable" pour répondre à la question posée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de traitements utilisant des inhibiteurs de la protéine NFkB Inducing Kinase (NIK) et leurs dérivés sur les cancers solides tels que le mélanome et les cancers du côlon et du pancréas en monothérapie ou en combinaison avec les immunothérapies actuelles sur des modèles de cancers chez la souris. Ceci permettra de proposer des solutions à des patients en échec thérapeutique. En effet si les Immunothérapies ont été une avancée majeure pour le traitement de certains types de cancers une proportion de patients ne répond pas à ces traitements et des combinaisons avec des molécules permettant de restaurer cette réponse aux immunothérapies seraient une avancée majeure.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la mise en évidence de l'efficacité in vivo de nos inhibiteurs de NFkB Inducing Kinase (NIK) contre la croissance tumorale ainsi que de l'intérêt de leur utilisation pour potentialiser l'effet des immunothérapies dans des modèles ayant des taux de réponse variables en fonction des modèles cellulaires utilisés. Dans le cadre de notre collaboration avec une start-up, ces expériences sont cruciales pour l’avancée du projet et les levées de fond nécessaires au passage vers les études pré-cliniques puis cliniques.

Procédures

Les animaux subiront : - 1 injection de cellules tumorales (5 secondes) - 1 injection/ jour avec nos molécules ou 1 à 2 traitement oral/ jour avec nos molécules (5 secondes) pendant la durée du traitement. - 1 contention pour mesurer la taille des tumeurs tous les deux jours. Ceci sur une durée de traitement de 2 à 3 semaines, 3 à 4 semaines pour les modèles de cancer du pancréas. Les souris recevront de 20 à 30 injections/administrations selon le modèle et de 40 à 60 en cas d'administrations 2 fois par jour.

Impact sur les animaux

Lors des injections des cellules tumorales en sous-cutané, il peut y avoir un risque d’irritation et de gonflement aux zones d’injection. Les souris vont ensuite subir une croissance tumorale sous-cutanée. Pour les traitements en injection intrapéritonéale, il peut y avoir un risque d’irritation, gonflement, infection aux zones d’injection et absence de toilettage. Pour les traitements par voie orale, les risques sont des fausses routes et de légers saignements.

Devenir

A la fin de chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort. Nous prélèverons la tumeur et les organes (foie, rate, poumons) afin de réaliser les études qui nous apporterons le plus de renseignements possibles sur le fonctionnement de nos nouvelles molécules thérapeutiques.

Remplacement

Nous avons tout d’abord caractérisé et testé nos composés in vitro et sélectionné les plus efficaces sur les cellules tumorales et vérifier leur innocuité sur des cellules normales. Il est maintenant nécessaire de passer chez le rongeur afin d’avoir une approche plus physiologique et étudier les combinaisons avec les immunothérapies. Nous pourrons ainsi déterminer lesquels de ces traitements sont les plus efficaces dans les modèles cancéreux utilisés (mélanome, cancer du côlon et pancréas) pour diminuer la croissance tumorale et potentialiser une réponse immunitaire antitumorale. Le passage chez l’animal est crucial avant le développement potentiel de ces molécules chez l’homme, ce qui permettrait une alternative à l’échec thérapeutique des traitements actuels.

Réduction

Des statistiques prédictives ont été réalisées. Nous avons choisi de faire des groupes de 10 souris et de refaire l’expérimentation 3 fois. Si après 2 expériences, les résultats sont significatifs, nous ne reproduirons pas une 3ème fois (réduction du nombre d’animaux). Les données de volume tumoral seront analysées statistiquement (comparaison de la croissance tumorale suivant les différents traitements).

Raffinement

Nous réaliserons aussi un suivi attentif des animaux par observation, et une pesée des souris deux fois par semaine, qui permettra l’arrêt de l’expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance. Les souris seront réparties aléatoirement dans les différents groupe de traitement afin de ne pas biaiser l'analyse. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie.

Choix des espèces

La souris représente le modèle préclinique le plus pertinent pour ce projet, car elle possède un système immunitaire complet, fonctionnel et étroitement comparable à celui de l’homme. L’étude des interactions entre tumeur, immunité et modulation pharmacologique — notamment via les inhibiteurs de NFkB Inducing Kinase (NIK) — nécessite impérativement un organisme immunocompétent. Les mécanismes de surveillance immunitaire et la réponse aux immunothérapies sont conservés chez la souris, permettant de modéliser fidèlement les phénomènes étudiés. Aucun autre modèle animal ou in vitro ne permettrait de reproduire de manière aussi fiable la complexité de ces interactions, rendant la souris indispensable pour répondre à la question scientifique. Les souris seront utilisées à l’âge de 5 semaines. Elles seront commandées à 4 semaines et acclimatées pendant 1 semaine. La croissance tumorale est optimale pour les souris à cet âge-là et ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà effectuées au laboratoire ainsi qu’avec les données de la littérature.

Génétiquement modifiées pour exprimer un gène humain, les souris de ce projet sont élevées et transportées dans des cages séparées pour ne pas être mêlées à d'autres lignées. 400 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous la peau, puis une chimiothérapie ou des anticorps par voie intrapéritonéale, la croissance de la tumeur étant suivie jusqu'à cinq semaines, avec mise à mort le jour même si le score de douleur atteint 8 ou si la tumeur s'ulcère. Toutes sont tuées par inhalation de CO2, pour une ponction cardiaque post mortem et le prélèvement des ganglions, de la rate et de la tumeur.

Objectifs

De nombreux mécanismes suppresseurs déjouant la surveillance du système immunitaire ont été mis en évidence lors du développement des tumeurs. Parmi ceux-ci, les points de contrôles immunitaires notamment ceux exprimés par les cellules myéloïdes représentent donc des cibles thérapeutiques intéressantes pour restaurer une réponse immunitaire efficace et éradiquer les tumeurs. La compréhension de ces points de contrôles immunitaires représente ainsi un enjeu crucial en sante pour les patients atteints de cancer et permettent de développer l'immunothérapie pour bloquer ces points de controle qui a révolutionné les traitements des patients cette dernière décennie. Aussi, il est important de déterminer le rôle de ces points de contrôles dans des modèles in vivo de tumeurs chez la souris par le blocage à l'aide d'anticorps thérapeutiques pour établir la preuve de concept de leur potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Le blocage de la molécule chez le rongeur permettrait de mettre en évidence l'importance de la molécule étudiée dans le développement du cancer et ainsi de générer à long terme de nouveaux médicaments pour les patients atteints de cancers.

Procédures

Les animaux (400 au total) seront injectées par des cellules tumorales par voie sous cutanée (en 15 secondes) et seront traités par de la chimiothérapie ou des anticorps thérapeutiques en intrapéritonéal en 5 secondes). Le suivi des souris (croissance de la tumeur) sera suivi sur 5 semaines maximum et certaines souris seront prélevées pour leurs organes 14 jours après l'injection des cellules tumorales.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une souffrance au niveau de la peau injectée par la tumeur en sous cutanée mais il est rarrement observé de dégradation de leur état général (attitude prostrée, poils hérissés, etc..).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, nous prélèverons le sérum du sang (ponction cardiaque après la mort), les ganglions, rate et la tumeur à jour 14 après euthanasie de l'animal par inhalation de CO2. Les animaux seront tous mis à mort à la fin des procédures experimentales car ces animaux ayant reçu des injections de cellules tumorales ne peuvent pas être réutilisés pour d'autres expérimentations.

Remplacement

Le meilleur modèle pour regarder l'effet d'une molécule sur la croissance tumorale et la survie est in vivo et en utilisant des animaux génétiquement modifiés; il existe une alternative de modèles tumoraux en 2 dimensions, ou organoïdes. Cependant, à ce stade avec des organoïdes, il ne serait pas possible d'analyser le rôle de cette molécule dans ce contexte tumoral car pour l'instant les études sur les organoides de tumeurs permettent uniquement de regarder des molécules exprimées par les lymphocytes T et non des molécules exprimées par des cellules myéloides comme c'est le cas ici. Par ailleurs, la réponse immune anti-tumorale est complexe et fait intervenir de multiples acteurs cellulaires qu'il est difficile à reproduire à l'heure actuelle dans les modèles in vitro lorsque l'on souhaite étudier la réponse immune anti-tumorale dans sa globalité.

Réduction

Pour les expériences in vivo, le calcul de la taille de l'échantillon a été effectué à l'aide du logiciel en ligne « Experimental Design Assistant » (https://eda.nc3rs.org.uk/eda/login/auth) en fonction de l'ampleur estimée de l'effet et de l'écart-type (variabilité basée sur les données antérieures obtenues) pour les différents tests non paramétriques, avec un seuil de signification p < 0,05 et une puissance fixée à 0,90. La taille de l'échantillon avec EDA indique un total de 10 souris par groupe (controle et injecté par anticorps) par procédure respectivement, dans au moins 2 expériences distinctes. Les données seront analysées à l'aide de GraphPad Prism. La mise en évidence de différences éventuelles entre ces groupes sera effectuée à l’aide de tests statistiques non paramétriques, sur des séries non appariées, puisque ni la normalité des distributions parentes, ni l’analyse de l’égalité des variances ne peuvent être réalisées dans de tels protocoles sans sacrifier un nombre important d’animaux. Les analyses statistiques porteront majoritairement sur des comparaisons de moyenne à l’aide du test U de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'animalerie selon les normes qui leur sont propres afin de ne pas ajouter un stress supplémentaire au protocole utilisé. Les animaux sont suivis tous les 3 jours pour la croissance tumorale dans les modèle sous cutanés d'adénocarcinome du colon et de fibrosarcome afin de suivre la croissance tumorale et détecter le plus précocement une douleur et d’y mettre un terme, soit par traitement antalgique, soit par sacrifice de l’animal si la souffrance ne peut pas être contrôlée. L’observation d’une perte de poids et/ou d’une attitude indiquant un état non naturel (attitude prostrée, poils hérissés, etc..) et de souffrance conduira à l’euthanasie de l’animal selon le système de score indiqué en tableau en annexe et si le score est supérieur ou égal à 8, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié le jour même par inhalation de CO2. Par ailleurs, l'animal sera systématiquement euthanasié si une ulcération de la tumeur est observée.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle de CLEC-1, nous devons utiliser des souris hCLEC-1 (Knock In KI) pour tester son rôle dans des modèles expérimentaux de développement tumoral. Ces souris ont été génétiquement modifiées pour exprimer le gène humain clec1a. Ces souris sont donc spécifiquement confinées dans des cages bien répertoriées lors de l'élevage et du transport et ne sont pas mélangées à d'autres types de souris. La preuve de concept in vivo de l'effet de l'anticorps est essentielle et ces souris qui ont cette modification génétique avec le CLEC-1 humanisé permettent de réaliser ce type d'expérience in vivo pour mimer ce qui se passe en clinique. Les souris receveuses de tumeurs seront utilisées entre 8 et 12 semaines d'âge (souris adultes) car il faut un système immunitaire adulte. Les souris seront également prélevées pour leurs organes lymphoïdes secondaires ou leur moelle osseuse à 8-12 semaines (âge adulte). Pour les chimères, les souris seront utilisées entre 10-12 semaines après reconstitution pour que le repeuplement hématopoïétique soit optimal.