Oncologie

Opérées du cerveau sous anesthésie générale pour implanter une canule ou une fibre optique dans l'hippocampe, 210 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau et leur tissu adipeux. L'intervention dure environ une heure, et le porteur signale des crises d'épilepsie rares ainsi que la possibilité que l'animal décolle son implant en se frottant. Chaque souris subit ensuite deux stress de cinq minutes et un test de mémoire, après un régime riche en gras et en sucre administré dès l'adolescence, avec ou sans restriction horaire. Au titre de la réduction, le porteur indique récupérer pour ses mises au point des souris "produites mais non utilisées", issues de croisements transgéniques n'ayant pas donné le génotype voulu.

Objectifs

La consommation de régime alimentaire obésogène (riche en gras et en sucre) pendant la période d’adolescence est associée à des troubles de mémoire. Ceux-ci peuvent être prévenus si l’alimentation obésogène est restreinte dans le temps (chrononutrition). Nos travaux précédents montrent que le régime obésogène entraine une modification de la régulation des hormones glucocorticoïdes (corticostérone chez la souris) qui est restaurée par la chrononutrition. Or ces hormones sont connues pour être fortement impliquées dans les processus de mémoire. Leur altération pourrait expliquer les troubles de mémoire associés à la consommation d’alimentation obésogène. L’objectif principal de ce projet est de mesurer le rôle des hormones glucocorticoïdes in vivo, en temps réel et au cours du temps dans différents contextes d’alimentation (obésogène vs contrôle, avec ou sans chrononutrition) en une utilisant une approche nouvelle basée sur la fibre optique. Nous pensons qu’avec cette technologie nous pourrons plus finement comprendre le rôle de ces hormones dans les troubles de mémoire et leur prévention par la chrononutrition.

Bénéfices attendus

L’achèvement des expériences proposées devrait fournir des preuves de concept pour de nouvelles approches thérapeutiques potentielles utilisant l’alimentation limitée dans le temps(chrononutrition) pour traiter les troubles de la mémoire (et éventuellement des troubles émotionnels) induits par l’obésité. Le projet fournira également de nouvelles connaissances sur les actions des hormones glucocorticoïdes sur le cerveau, ce qui pourrait aider à traiter les pathologies associées à un excès de ces hormones.

Procédures

Chaque animal (210 au total) subit une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. La chirurgie dure environ 1h et la récupération post-opératoire est d’environ 2 heures. Ensuite, chaque animal subit deux stress modérés de 5 min chacun. Tous les animaux subissent un test de mémoire de 2 fois 10 min. Six animaux recevont deux injections de drogue et 6 animaux recevront une injection de drogue. Les injections durent 3 min chacune.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie du cerveau bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (nuisance modérée). L'implantation de canule ou de fibre optique dans la région du cerveau appelée hippocampe (siège de la mémoire), peut entrainer parfois des crises d'épilepsie (rare et de courte durée). La souris opérée peut parfois décoller la canule implantée ou la fibre optique en la frottant. Cela peut générer un inconfort qui reste modéré car il n’y a pas de plaie ouverte. Certains tests de comportement sont stressants mais ne durent que 5 min. Le régime obésogène utilisé n'entraine pas de diabète pour le temps d'exposition maximale utilisé (12 semaines).

Devenir

les animaux sont mis à mort pour prélèvement d’organes (cerveau, tissu adipeux) en vue d’analyses post mortem

Remplacement

L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques de régime obésogène sur la mémoire et les émotions et les effets de la chrononutrition. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la mémoire et des émotions reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la deuxième. Pour les mises au point nous utilisons des animaux produits mais non utilisés (par exemple souris récupérées de croisements de souris transgéniques n'ayant pas le génotype désiré) afin de réduire les pertes pour la réalisation des expérimentations. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié

Raffinement

A leur arrivée, les animaux ne subissent pas d’expérimentation pendant 2 semaines afin de favoriser leur acclimatation à notre animalerie. Nous les manipulons régulièrement pour qu’ils s’habituent à l’expérimentateur. Lors des chirurgies nous pratiquons une anesthésie générale et une antalgie médicamenteuse. La chirurgie est réalisée dans des conditions d’asepsie et nous pratiquons des soins pré et post-opératoires adaptés. Nous avons mis en place un arbre décisionnel de points d’arrêt précoces où nous intervenons pour réduire le stress et la douleur des animaux si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utilisons uniquement des souris car les expériences de comportement sont validées dans cette espèce et les appareillages sont disponibles. Les traitements nutritionnels sont faciles à conduire et divers aliments/régimes alimentaires sont disponibles commercialement. La plupart des expérimentations en neurosciences sont conduites sur des rongeurs (rat ou souris), nos expériences enrichissent le corpus de données en permetttant des compariasons directes avec ce qui es déjà publié. Nous étudions les souris entre 3 et 15 semaines d'âge. Ces âges couvrent la période d'adolescence (3 à 7 semaines) jusqu'à l'état jeune adulte, stades de développement que nous voulons étudier dans notre projet.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, ce qui permet d'y implanter des cellules leucémiques prélevées sur des patients pour qu'elles développent la maladie. 210 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après la transplantation, chacune reçoit quatre injections de polychimiothérapie et de molécules inhibitrices sur animal éveillé, puis un prélèvement sanguin trente-cinq jours plus tard. Elles sont tuées pour prélever moelles osseuses et rates et y doser les cellules leucémiques restantes, ou plus tôt si les points limites sont atteints.

Objectifs

La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) est un cancer du sang. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans. La LAL représente 30% des cancers de l’enfant. Malgré les améliorations du traitement des LAL, les taux de rechute restent élevés (de l’ordre de 20%). Ainsi, pour traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Dans ce projet, nous transplantons des cellules leucémiques issues de patients dans des souris immunodéficientes. Ces souris développent alors la maladie, permettant ainsi de créer des modèles de xénogreffes. Ces modèles sont utilisés pour étudier, en phase préclinique, l’effet thérapeutique de nouvelles molécules anticancéreuses inhibitrices. Comme cela est fréquemment observé après des traitements de polychimiothérapie chez les enfants, des cellules leucémiques résiduelles peuvent persister dans la moelle osseuse. Ce phénomène est également observé dans nos modèles de souris xénogreffées. Dans ce projet, nous étudierons si de nouvelles molécules inhibitrices peuvent renforcer l’efficacité de la polychimiothérapie et permettre l’élimination de ces cellules résistantes.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémies, nous avons identifié de nouveaux composés qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs efficacités, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne donc la découverte de nouvelles molécules inhibitrices et donc de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des Leucémies Aiguës Lymphoblastiques.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques. Une seule injection est prévue par souris, durée de 5 minutes par injection. Après la transplantation, des injections de polychimiothérapies et des molécules inhibitrices spécifiquement testées dans ce projet se feront sur animaux vigiles. Quatre injections par souris sont prévues, durée par injection de 5 minutes. Trente-cinq jours après la transplantation, un prélèvement de sang sur animaux vigiles est prévu. Un seul prélèvement par souris, durée du prélèvement de 5 minutes. Après euthanasie des animaux sous anesthésie, des prélèvements post mortem de rates, et de moelles osseuses seront réalisées pour effectuer des analyses.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des cancers (leucémies), avec une multiplication proliférative des cellules leucémiques lymphoblastiques dans la moelle osseuse, le sang et la rate des animaux. Les injections et prélèvements sur animaux vigiles engendreront du stress et de la douleur au point de piqure.

Devenir

La mise à mort sera effectuée sur les animaux soit en fin de procédure, soit lorsque des points limites auront été atteints. Les animaux seront tous mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever des tissus (les moelles osseuses et les rates) afin de doser la présence des cellules leucémiques.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les inhibiteurs chimiques que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives ; sur des cellules primaires isolées de patients, ainsi que sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que ces molécules qui vont être étudiées in vivo sont fonctionnelles sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche par : la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 7 souris afin de réaliser des tests ANOVA.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. Comme il s’agit d’animaux immunodéficients, un couvercle filtrant sera placé sur toutes les cages. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Après le prélèvement de sang et les injections, nous donnons des soins adéquats, la queue de la souris en légèrement pincée pendant 30 secondes pour éviter tout saignement. Les souris pour lesquelles nous avons prélevé le sang ou injecté sont placées dans une nouvelle cage et dans une litière propre. Une surveillance des animaux sera également réalisée par les expérimentateurs tout le long de la procédure (au minimum 2 fois par semaine puis tous les jours après 35 jours). Nous avons établi les points limites de nos procédures expérimentales. Les procédures d’euthanasie appropriées seront appliquées des lors où un des points limites est observé.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être lancé en étude clinique, il est nécessaire de mener des études précliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes. Quelques semaines après l’injection, les cellules leucémiques humaines sont présentes dans la moelle osseuse et la rate des souris qui constituent un modèle d’étude reproduisant la physiopathologie de cette maladie. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin. L’hématopoïèse et la leucémogenèse des souris (mus musculus) est celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules leucémiques.

Rasées sous anesthésie puis injectées sous la peau du flanc avec des cellules tumorales, 174 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Les tumeurs sont mesurées trois fois par semaine, les animaux pesés une fois par semaine. Le projet porte sur le rôle de cellules dendritiques dans le mélanome et le cancer du pancréas, deux cancers auxquels le porteur attribue plus de 500 000 morts dans le monde en 2022, et il n'annonce comme résultat que l'identification de cibles thérapeutiques "potentielles". Il indique que les tumeurs peuvent nécroser et provoquer une douleur modérée, et annonce un suivi de points limites "précoces et prédictifs" trois fois par semaine.

Objectifs

Le mélanome cutané et le cancer du pancréas sont deux maladies agressives ayant causé la mort de plus de 500.000 patients dans le monde en 2022. Malgré les progrès récents dans le domaine des immunothérapies du cancer, la majorité des patients ne répond pas durablement à ces traitements, en particulier du fait de la mise en place de mécanismes intracellulaires encore mal compris. Nous avons identifié une famille de molécules susceptibles de soutenir la progression du mélanome et du cancer du pancréas et leur résistance aux immunothérapies. L’objectif de ce projet est de comprendre la fonction d’une population de globules blancs nommés cellules dendritiques, dans l’action de ces molécules.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier de nouveaux mécanismes permettant la progression du mélanome et du cancer du pancréas, et leur échappement au système immunitaire, constituant de fait des cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

- Rasage du flanc des souris sous anesthésie (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc de cellules tumorales, sous anesthésie (1x 2 minute/souris) – Pesées (30 secondes, une fois par semaine) – Mesure des volumes tumoraux (30 secondes, 3 fois par semaine)

Impact sur les animaux

L’évaluation des volumes tumoraux et les pesées nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections de cellules tumorales peuvent entraîner des douleurs courtes sur le flanc. -La progression des tumeurs sur le flanc des souris peut induire une douleur modérée. Dans de très rares cas, les tumeurs peuvent nécroser.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter la fonction des protéines d’intérêt non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons effectué une série d’expériences in vitro et d’analyses in silico pour établir le rôle des trois protéines d’intérêt dans la croissance tumorale et l’échappement immunitaire, et pour dresser des hypothèses de mécanisme. Néanmoins à notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de l’informatique, les interactions entre les cellules tumorales, immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le rasage et les injections sous-cutanées seront faites sous anesthésie gazeuse. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide, de l’eau gélifiée, pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de différents modèles de mélanomes, de souris transgéniques, et de protocoles bien établis dans la littérature, nous permettant de mesurer le rôle nos molécules d’intérêt dans la progression des cancers. Les souris seront âgées de 7 à 15 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure. Les animaux seront distribués à 50/50 entre mâles et femelles, hormis pour un modèle de mélanome porteur d’une protéine reconnue uniquement chez la femelle.

Une partie des souris utilisées sont des NSG, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, ce que le porteur nomme un "phénotype dommageable". 2 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale pour prélèvement d'organes. Les interventions déclarées se résument à une ou deux injections, quatre prélèvements sanguins sur animal éveillé et un prélèvement sous anesthésie, réparties entre deux établissements. Le porteur admet que l'une des procédures "peut induire des douleurs non prévues" parce que la toxicité des molécules testées n'est pas connue, sans en dire davantage sur le contenu de ces études d'oncologie et de maladies auto-immunes.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de développer de nouvelles molécules innovantes pouvant être utilisées pour le traitement de maladies auto-immunes ou dans le cadre du cancer. L’objectif principal sera donc de réaliser, chez la souris, une analyse toxicologique de ces molécules mais également étudier leurs effets sur le développement de différents types de cancer chez la souris. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, ; les deux premières procédures, dans le premier établissement utilisateur et les trois dernières dans le deuxième établissement utilisateur.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer si les molécules innovantes nouvellement identifiées permettent notamment d’inhiber ou de ralentir le développement de différents types de tumeurs chez la souris. L’ensemble des résultats obtenus sera crucial pour envisager l’utilisation de ces molécules en clinique chez l’homme.

Procédures

1 ou 2 injections (

Impact sur les animaux

Les procédures correspondantes au projet peuvent induire du stress et une angoisse liés à la manipulation/ contention des animaux. Les prises de sang effectuées ainsi que les injections de traitements peuvent induire un inconfort, une angoisse et une douleur légère de courte durée chez celles-ci. Une des procédures peut induire des douleurs non prévues, inhérentes au fait que la toxicité des nouvelles molécules n'est pas connue. Les manipulations des souris lors des prises de sang effectuées peuvent induire un inconfort, une angoisse et une douleur de courte durée chez celles-ci. L'utilisation d'un phénotype dommageable, les souris NSG.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale, des prélèvements d'organes sont réalisés sur ces animaux et des analyses ex-vivo sont effectuées sur ces derniers.

Remplacement

L'évaluation préclinique est une étape importante dans le développement d'un médicament avant son utilisation en clinique. Avant l’expérimentation sur animal, les molécules sont testées au préalable sur différents modèles bio-informatiques (modélisation des structures des molécules et d'affinités pour les cibles thérapeutiques choisies) in vitro (lignées de cellules tumorales et cellules non tumorales) afin d’évaluer leur activité. L'utilisation du modèle souris permet l’étude de différentes pathologies in vivo. Afin de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire d’avoir recours à des organismes modèles de l’Homme. L’utilisation de modèles de souris permet d’étudier la physiologie de ces pathologies au sein d’un organisme vivant dans tout son ensemble.

Réduction

Le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence significative de réponse biologique entre les différents groupes. Dans les procédures expérimentales définies (études précliniques de pharmacocinétiques, de toxicité et d'efficacité), les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans un milieu enrichi et amélioré. Des analgésiques peuvent être administrés aux souris. L’utilisation d’une grille unique de score est mise en place ainsi que l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. La grille de score est décrite dans chacune des procédures L’aspect général des animaux ainsi que le suivi pondéral seront transcrits dans la grille de score. Le bien-être des animaux est analysé et est pris en compte tout au long des protocoles expérimentaux. Des points limites pour lesquels les animaux seront mise à mort ont été défini. Il n'y a pas d'échanges d'animaux entre les deux établissements utilisateurs, pas de transports d'animaux entre ces deux sites.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal qui permet d’élargir nos connaissances sur le développement, la physiopathologie de différentes pathologies mais aussi tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Son utilisation permet de connaitre la physiologie in vivo des différentes pathologies chez des modèles de souris. ​Le choix de l'espèce se porte sur le fait que cette espèce est un modèle de mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique.​ Jeunes adultes entre 5 à 8 semaines pouvant finir leur croissance. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités dans la mesure où la présence de graisse peut entrainer une modification de la biodisponibilité de la molécule.

Deux à trois semaines à 4-6 °C, vingt-quatre heures sur vingt-quatre, en cage individuelle, avec une prise de température rectale quotidienne : 610 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Pour 94 d'entre eux, le froid arrive après huit semaines passées à 28 °C, transition que le porteur décrit comme "un stress plus important", avec sortie du protocole si la température corporelle reste durablement sous 33,5 °C. L'objectif déclaré est de comprendre comment le tissu adipeux brun produit de la chaleur, piste explorée contre l'obésité. Le rat a été préféré à la souris parce que sa taille fournit davantage de tissu adipeux brun par animal, ce qui permet d'en utiliser moins pour une même expérience.

Objectifs

La progression de l'obésité dans le monde est une préoccupation cruciale de la recherche médicale. L’une des stratégies envisagées pour lutter contre ce fléau consisterait à stimuler la thermogenèse, en particulier par le tissu adipeux brun et beige, qui ont la capacité de produire une grande quantité de chaleur à partir de la graisse qu’ils brûlent. La caractérisation des mécanismes de thermogenèse constitue donc une piste de recherche prometteuse pour la prévention et le traitement des maladies métaboliques. Le projet présenté ici permettra d'identifier précisément le rôle du système Créatine-Kinase / Phosphocréatine, dans le processus de production de chaleur par les tissus adipeux brun / beige et de déterminer si ce système pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans la lutte contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Le système Créatine-Kinase / Phosphocréatine (système CK / PCr) est connu depuis des années pour jouer un rôle majeur dans le transfert d’énergie (réserve et navette énergétique) au sein des cellules musculaires et nerveuses. Des travaux récents montrent une nouvelle fonction de ce système dans la thermorégulation par le tissu adipeux, et également dans la prévention des maladies métaboliques, Cependant, les mécanismes impliqués restent à être élucidés. Notre projet vise à caractériser pour la première fois le rôle du système CK / PCr dans la bioénergétique des tissus adipeux et de déterminer par quel(s) mécanisme(s) et à quelle ampleur, le système CK / PCr participe à la production de chaleur par les tissus adipeux brun/beige. Cette étude pourrait apporter une connaissance primordiale concernant la bioénergétique des tissus adipeux et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention et le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

Les 3 groupes d’animaux seront exposés aux différentes températures (respectivement à 4-6°C, 22-23°C ou 28°), 24h/24, 7J/7 durant 14 ou 21 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire), en armoire ventilée et en cage individuelle. La prise de température corporelle (sonde rectale) sera prise quotidiennement durant toute la période de stabulation (phase d’habituation de 5 jours avant le début de l’exposition aux différentes températures et pendant toute la durée de l’exposition jusqu’au jour de l’euthanasie de l’animal, soit durant 19 ou 26 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire). La prise de la température corporelle aura lieu 1 fois par jour pour tous les groupes, à l’exception des 5 premiers jours concernant les animaux du groupe exposé au froid (4-6°C), pour lesquels la température corporelle sera prise 2 fois par jour (début de matinée vers 9h et milieu d’après-midi vers 15h). Cette prise de température, qui nécessite une légère contention, ne dure pas plus d’une minute.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de pouvoir suivre précisément leur prise alimentaire. L'isolement constituera donc un inconfort pour l'ensemble des animaux. La seconde source d'inconfort sera liée à l'exposition au froid (4-6°C), 24h/24, durant 2-3 semaines. Elle concerne 204 animaux. Les études utilisant de tels protocoles d'exposition au froid, ne décrivent ni de chute drastique de la température corporelle, ni d'inconfort majeur. Après quelques jours d'acclimatation, durant lesquels les animaux peuvent frissonner et présenter une légère baisse de leur température corporelle, les animaux retrouvent une activité normale. L'inconfort lié à l'exposition au froid est d'autant moindre que, la température de thermoneutralité des rats étant autour de 28°C, lorsque ces derniers sont hébergés à 22°C, ils présentent déjà une certaine adaptation (présence marquée de tissu adipeux brun interscapulaire). Début de modification [Le protocole pour le lot supplémentaire (exposition des animaux à la neutralité thermique (28°C) pendant 8 semaines avant leur exposition au froid (4-6°C) constituera un stress plus important que le passage de 22°C au froid (94 animaux sont concernés), mais au vu des premiers résultats obtenus avec le protocole initial d'exposition au froid, cela semble nécessaire pour favoriser le brunissement du tissu adipeux blanc inguinal (en plus de l'induction du TAB interscapulaire). Les études utilisant ce type de protocole ne décrivent aucune nuisance majeure sur l’animal. On a pu également observer durant notre protocole initial d’exposition au froid, qu'aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et qu'aucune mesure corrective n'a été nécessaire.] Fin de modification.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui auraient éventuellement été exclus de la procédure seront également euthanasiés dès la sortie du protocole. Des tissus pourront éventuellement être prélevés après euthanasie et congelés en vue d’une utilisation ultérieure en TP pour des dosages biochimiques.

Remplacement

Au vu de sa complexité, le phénomène de brunissement induit naturellement en réponse à l'exposition au froid, ne peut pas être entièrement reproduit in vitro. En effet, les tissus adipeux sont constitués de cellules de différents types qui interagissent entre elles et il est difficile de reproduire cette hétérogénéité et ce dialogue in vitro. De plus, l’étude des modifications adaptatives des tissus adipeux en réponse au froid nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme, qui préserve la communication nerveuse et hormonale, entre les différents types de tissus adipeux d’une part, et entre ces tissus et les organes impliqués dans le métabolisme, comme le foie et le pancréas, d’autre part. L'exposition au froid de l'animal, constitue donc une approche indispensable à l'étude du phénomène de brunissement et aucun modèle alternatif ne peut remplacer le modèle animal. Cependant, en parallèle de ces travaux à l'échelle de l'animal, l'utilisation de modèles cellulaires issus de tissus adipeux humains permettra de voir si certains mécanismes observés sur les adipocytes de rat acclimatés au froid sont retrouvés/ transposables chez l'Homme.

Réduction

Le choix du modèle animal, le rat plutôt que la souris, permet de limiter le nombre d'animaux à utiliser. En effet, les tissus adipeux brun et beige sont des tissus peu abondants et certains des protocoles de l’étude nécessiteraient, chez la souris, de grouper les TAB provenant de 3 à 4 animaux pour une seule expérimentation. Chez le rat, 2 animaux seulement devraient suffire pour obtenir la même quantité d’informations. Par ailleurs, le choix d'une exposition prolongée au froid (2-3 semaines) afin d'obtenir une adaptation maximale de l’animal, permettra d’atteindre les objectifs de l’étude tout en limitant le nombre d’animaux nécessaire. Grâce à l'utilisation d'appareillage de précision, une précision maximale des mesures pourra être obtenue avec très peu de matériel biologique. Pour finir, le niveau de dispersion des données attendues a été pris en compte, afin de calculer le nombre d'animaux au plus juste sans risquer pour autant de compromettre l'interprétation statistique des résultats. De plus, si les données issues de la série préliminaire pour la condition choisie sont exploitables, elles pourront être intégrées à l'étude principale, ce qui réduira le nombre total d'animaux de 8 individus.

Raffinement

Un suivi attentif des animaux, par un personnel formé, sera opéré chaque jour durant la période de stabulation avant et pendant l'exposition aux températures étudiées, afin d'évaluer l'inconfort subi (isolement, température ambiante) et leurs éventuelles conséquences sur le bien-être animal. Début de modification [Des critères comportementaux visant à évaluer l'état général de l'animal et la mesure de variables physiologiques concrètes (masse corporelle, température rectale) de façon journalière et la prise de nourriture (2 fois par semaine) ont été mis en place et seront également appliqués y compris dans ce nouveau protocole. Les animaux mis en cage individuelle, pourront se voir et se sentir dans les armoires ventilées. Afin de réduire le stress, l'habituation aux conditions de stabulation en armoire ventilée et en cage individuelle se fera en 2 temps. Durant notre protocole initial d’exposition au froid, aucun animal ne s’est retrouvé en difficulté et aucune mesure corrective n'a été nécessaire. Dans ce nouveau protocole, où la transition au froid sera plus marquée, la surveillance rapprochée (2 fois par jour) des animaux sera maintenue. Les points limites déjà définis permettront de mener des actions visant à réduire l'inconfort, pouvant aller jusqu'à la sortie du protocole si les signes de souffrance dépassent certaines limites fixées ou si la température corporelle chute durablement en dessous de 33,5°C.] Fin de modification. En plus des expériences prévues dans le projet ANR (sur les tissus adipeux), il est prévu de prélever d'autres organes (foie, coeur, cerveau, muscle, vaisseaux sanguins) afin de recueillir un maximum de données sur les effets du froid et sur l'impact de la température de stabulation (22-23°C versus 28°C neutralité thermique).

Choix des espèces

La plupart des études sur les mécanismes de thermorégulation ont été menées sur les modèles rat ou souris. Plus récemment, le cycle futile de la créatine a été décrit chez la souris. Le choix de focaliser l'étude sur le modèle rat a été motivé principalement par le fait que la taille de l'animal étant supérieure, la quantité de tissu adipeux brun est considérablement plus importante et que par conséquent le nombre d'animaux nécessaire pour une même expérience pourra être réduit par rapport au modèle souris. Par ailleurs, le rat est considéré comme étant un modèle plus proche de l'humain, ce modèle est couramment utilisé et de nombreuses données existent. Les animaux mâles et femelles seront utilisés à l'âge jeune adulte, environ 8-10 semaines. Début de modification [afin de limiter le développement du TAB avant l'exposition au froid, les animaux seront placés à la neutralité thermique dès l'âge de 4 semainesleur réception Chez l'adulte tous les mécanismes de thermorégulation sont établis et l'influence hormonale est stabilisée.

376 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une injection de cellules tumorales de cancer colorectal, jusqu'à trente injections de traitement à raison de deux par semaine, et jusqu'à quinze séances d'imagerie sous anesthésie générale. Le porteur annonce cachexie, obstruction intestinale, risque de péritonite lié aux injections répétées et sensibilité accrue aux infections, liée au phénotype dommageable de ces souris. Les molécules testées ont déjà donné des résultats qu'il qualifie de "très prometteurs" en culture cellulaire, et il affirme que reproduire l'environnement tumoral impose désormais un "organisme entier".

Objectifs

Nous avons identifié, via des analyses in vitro (données non publiés), des molécules prometteuses pour le traitement des cancers colorectaux. L’objectif ce projet est de valider in vivo cette hypothèse et d’évaluer l’efficacité de ces molécules comme nouvelle stratégie thérapeutique du cancer colorectal.

Bénéfices attendus

Le cancer du côlon est la quatrième cause maligne diagnostiquée et la cinquième cause de décès par cancer dans le monde. En France, il touche chaque année plus de 47 500 personnes et cause près de 17 000 décès. Il présente un des pronostics les plus sombres en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie pour le traitement du cancer du côlon.

Procédures

Une partie des souris sera soumise à une seule injection de cellules tumorales sous anesthésie générale (moins de 5 minutes/animal). Une partie des animaux vigiles sera soumis à une seule injection de cellules tumorales (moins de 5 minutes/animal). Une partie des animaux vigiles seront soumis à des injections de traitements antitumoraux (pour un total maximum de 30, 2 fois par semaine, moins d’une minute par animal). Une partie des souris sera soumise à des examens non invasifs d’évaluation tumorale sous anesthésie générale (dix minutes par animal, une fois par semaine, 15 fois maximum). A la fin des expériences, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéficientes ont un phénotype dommageable et présentent une sensibilité accrue aux infections. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. La croissance tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie, obstruction intestinale) et peut induire une gêne chez l’animal. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections peuvent s’infecter. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules pour la thérapie du cancer du colon. Ces molécules ont été identifiées et ont données des résultats très prometteurs in vitro. Cette étude peut exclusivement être conduite in vivo, car il est essentiel d’utiliser un model reproduisant au mieux l’environnement tumoral. Cela se traduit par la nécessité d’utiliser un organisme entier dans lequel les cellules et les cytokines peuvent circuler, permettant ainsi une représentation plus fidèle des interactions biologiques complexes à l’intérieur du corps.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 376 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes homogènes de souris pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous utiliserons des tests statistiques pour évaluer et comparer les effets dans les divers groupes de traitements. Une veille bibliographique attentive et constante sera effectuée pour s’assurer que les expériences planifiées n’ont pas été déjà rapportées dans la littérature scientifique.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, maisonnettes, …). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général des animaux sera suivi. Le poids sera mesuré 1 fois par semaine. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Des points limites surveillés seront mis en place lors des procédures de croissance tumorale. L’anesthésie générale des animaux sera effectuée (avec tapis chauffants). Si les souris apparaissent affaiblies (prostration) pendant la procédure, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques. La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Notre établissement utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.