Oncologie

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des cycles de jeûne de 24 heures alternés avec 24 heures d'alimentation pendant quatre semaines, des piqûres répétées de la queue pour mesurer la glycémie et un prélèvement de sang terminal, avant la mise à mort pour prélever le foie et d'autres organes. Le porteur étudie le rôle d'une protéine du foie chez des souris modifiées pour ne plus la produire, les bénéfices annoncés se limitant à comparer ces effets avec ceux d'un jeûne unique. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire ce processus par des méthodes sans animaux et conclut que le recours à la souris est "approprié".

Objectifs

Chez les animaux, des épisodes de jeûne sont fréquemment observés en cas de blessure ou de manque de nourriture ou encore lors de l'hibernation, dans le but d'économiser l'énergie et de s'adapter aux différents environnements. Les mammifères sont ainsi capables de tolérer de longues périodes de jeûne grâce à une réponse adaptative de l'organisme. Le foie joue un rôle majeur dans cette adaptation aux situations de jeûne car il permet la production de carburants, nécessaires au fonctionnement du cerveau et du coeur notamment. Cette production de carburants par le foie est primordiale et controlée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARα. De nombreuses études examinent les effets sur la santé de différentes stratégies nutrtionnelles qui impliquent des périodes de jeûne. Ces stratégies qui alternent des périodes de jeûne et des périodes d'alimentation ont montré des effets bénéfiques sur plusieurs pathologies, notamment chez la souris. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer le rôle de PPARa dans la réponse au jeûne lorsqu'il est alterné avec des périodes d'alimentation à volonté. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles qui n'ont pas la protéine PPARa dans le foie et leur contrôle, que nous soumettrons à des alternances de jeûne de 24h et d'alimentaion à volonté de 24h sur une période de 4 semaines. Les effets seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes dont le foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir si PPARa spécifiquement dans le foie joue un rôle dans les réponses induites par des jeûnes répétées. Nous pourrons également comparer les effets avec le rôle connu de PPARa lors d'un jeûne unique.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime standard à volonté ou soumis à des cycles jeûne de 24h/alimentation à volonté pendant 4 semaines. Les animaux seront pesés toutes les semaines. Chaque pesée prend environ 20 secondes par animal. La glycémie sera mesurée chaque semaine par prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Le jeûne unique et le jeûne répété peuvent induire une perte de poids, une baisse de la glycémie et de la température corporelle. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et un épanchement au niveau de la joue.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car le jeûne est un processus physiologique qui fait intervenir différents tissus agissant en synergie, notamment le foie et le tissu adipeux, et plusieurs hormones qui agissent à distance. Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car elle permet d'étudier le rôle d'une protéine spécifique.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie) Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure, renourri et replacé en conditions d’hébergement standard après examination par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

1 596 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des greffes de cœur, de peau ou d'îlots pancréatiques sous anesthésie, l'implantation d'une pompe diffusant des traitements et jusqu'à neuf prélèvements sanguins, certaines recevant une induction chimique de diabète. Le porteur indique que les chirurgies entraînent gêne et douleur au réveil malgré les analgésiques et des difficultés de mouvement à la cicatrisation. Il étudie le rôle des cellules Natural Killer dans le rejet de greffe et affirme que ce phénomène ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

La transplantation d’organe consiste à remplacer un organe non fonctionnel par un organe provenant d’un donneur de la même espèce mais génétiquement différent. Un des principaux risques après une transplantation est le rejet de l’organe greffé. Celui-ci résulte de la capacité du système immunitaire du receveur à discriminer comme étranger le tissu transplanté. Actuellement, on considère que les lésions de rejet sont principalement le fait des lymphocytes T et des anticorps dirigés contre le greffon (réponse du système adaptatif). Récemment des preuves expérimentales ont montré que le rejet pouvait aussi être induit par l’activation d’une autre population cellulaire : les cellules Natural Killer (NK). Ce type de rejet étant nouveau, les mécanismes exacts ainsi que l’impact des différents immunosuppresseurs utilisés habituellement en transplantation pour prévenir le rejet est inconnu sur ce type de rejet.Les cibles cellulaires et moléculaires du greffon reconnues par le système immunitaire varient selon le type de rejet : cellules des vaisseaux sanguins du greffon ou cellules plus en profondeur du tissu transplanté par exemple. Les objectifs de ce projet qui sera mené chez la souris sont : i) d’acquérir des données nouvelles pour mieux comprendre le rôle des différents effecteurs immunitaires et l’interaction avec leurs cibles cellulaires et ou moléculaires, ii) tester des molécules pour pouvoir retarder le développement des lésions de rejet et prolonger la durée de vie des greffons. Il s’agit d’un objectif prioritaire en transplantation compte tenu de la pénurie d’organe. Ceci pourrait ainsi permettre d’améliorer l’accès à la greffe pour les patients qui le nécessitent. Différents types de greffe (dites vascularisés ou non vascularisés) seront nécessaires pour mettre en évidence les mécanismes impliqués (en termes de cibles cellulaires), ainsi des souches de souris transgéniques différentes afin de mimer les différences moléculaires entre donneurs et receveurs. Ce projet sera découpé en 6 procédures : en effet, chaque type de modèle de greffe (cardiaque, cutané ou pancréatique) sera étudié en vu des objectifs 1 et 2 suivants : 1) La caractérisation des mécanismes moléculaire et cellulaires impliqués dans les rejets de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots et 2) la validation de molécules pour évaluer leurs capacités à réduire le risque de rejet de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots sur une durée de 8 Semaines maximum. 1596 souris maximum

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes impliquant le système plaquettaire dans ce type de rejet ainsi que la validation de certaines molécules candidates nous permettraient de proposer de nouveaux traitements pour améliorer la survie du greffon aux patients transplantés

Procédures

Souris donneuses de greffon cardiaque : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 1h Souris receveuses de greffon cardiaque : greffe cardiaque sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – opération au niveau du cou (total opération 2h) Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon de pancreas : Injection dans le ventre pour une induction chimique de diabète (maximum 30 secondes) Greffe des cellules de pancréas sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – au niveau du rein - Incision au niveau du flanc latéral. (total opération 2h). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe – Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon cutané : Greffe d’un morceau de peau sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) au niveau du flanc (total opération 30-40 min). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe Expérience de maximum 49 jours

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales et les prélèvements de sang (sinus, submandibulaire ou queue) sont susceptibles d’entrainer un stress (contention) et une légère douleur. La greffe de cœur, d’ilots ou de peau sont des procédures bien documentées, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. Chacun des 3 types de chirurgie entrainera une gêne lors du réveil et douleur malgré les analgésiques) et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux.

Devenir

Les souris seront mises à mort en fin de procédure avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Le rejet d’organe ne peut pas être reproduit in vitro

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs à 10 animaux par groupe. Nous tenons compte du taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques soit 12 initial, et la mise en place du diabète, taux de réussite 70% soit 14 initial pour obtenir 10 souris par groupe au final. Les groupes comporteront donc entre 10 et 14 individus au maximum afin d’avoir au moins 10 animaux analysables par groupe compte tenu des taux de réussite de chaque chirurgie. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 1596 souris (mus musculus).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement aspect general). Différents traitements seront administrés pour réduire la douleur (analgésie) et les souris seront sous anésthésie générale pour les chirurgies Analgésie local pour les prélèvements sanguins. Pesée hebdomadaire, et fréquence augmentée à 2 fois par semaine si perte de poids > 10%. Suivi post op à 4-6h post opération, J1 et J2 Aucune chirurgie le jeudi et vendredi pour un suivi à J1 et J2. Mesure de la glycémie pour mesurer la prise de greffe Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement (ils ne seront isolés que s’ils présentent une lésion au niveau de la suture de la peau post chirurgie) -anésthésie locale avant l’incision sur la zone à opérer (pompe et greffon) et sur la zone avant suture -antiobiotique durant les 24h post chirurgie La perte du greffon, ilots, peau ou cœur, ne peut entrainer la mort de l’animal en soi. L’utilisation de la pompe permettra de traiter les souris quotidiennement sans avoir recours à des injections IP quotidienne. Les souris sont placées en armoire chauffante après la chirurgie durant 4-6hpuis remise dans leur cage sur portoir Les gestes techniques chirurgicaux sont réalisés par un chirurgien (chirurgie humaine) formée à la chirurgie sur rongeur et ces gestes précis en particulier. Les chirurgies sont réalisées sous hote avec des loupes binoculaires avec du materiel steril En cas d'infection, un traitement antibiotique sera administré. Des points limites précis et prédictifs ont été définis de manière à éviter toute souffrance inutile des animaux.

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire allogénique, c’est-à-dire entre souris de fond génétique différent. Notre projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiés précédemment développés et disponibles présentant des défauts immunitaires plus ou moins importants. De tels modèles n'existent que dans l'espèce souris. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature.

1 365 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation puis de une à neuf injections, avec induction de tumeurs, pour étudier le rôle de sous-types de cellules dendritiques dans l'immunothérapie du cancer. Le porteur indique que la croissance tumorale et les traitements peuvent entraîner une perte d'appétit et de poids et que l'irradiation peut causer amaigrissement et diarrhée. Il qualifie d'"indispensable" le recours à la souris et renvoie les retombées thérapeutiques pour les patients à un horizon futur.

Objectifs

La mort cellulaire immunogène est un processus de mort cellulaire qui déclenche une réponse immunitaire. Lorsqu'une cellule meurt de manière immunogène, elle libère des signaux moléculaires qui attirent les cellules du système immunitaire, comme les cellules dendritiques qui jouent un rôle central. Actuellement, différents sous-groupes de cellules dendritiques ont été identifiées mais, à ce jour, leur rôle n’est pas encore clair. Les objectifs de ce projet sont : 1) Découvrir et comprendre quels sous-types de cellules dendritiques sont les plus importants pour garantir un meilleur effet avec la thérapie immunogène anticancéreuse. 2) Etudier comment les chimiothérapies immunogènes et l’immunothérapie affectent les bons sous-types de cellules dendritiques et montrent un meilleur traitement contre le cancer que les autres. Cette recherche pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour améliorer l'efficacité des approches thérapeutiques immunogènes contre le cancer par amorçage du potentiel des cellules dendritiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Les recherches dans ce projet peuvent avoir un impact significatif sur le développement de traitements plus personnalisés et efficaces contre le cancer en exploitant le potentiel des sous-populations spécifiques de DC dans la thérapie immunogène. Voici quelques-uns des avantages attendus de ce projet : 1) En étudiant comment la déplétion sélective de certaines sous-populations de DC affecte la réponse immunitaire, nous pourrions parvenir à une compréhension plus approfondie du rôle spécifique de ces cellules dans la thérapie immunogénique du cancer. Cela permettrait de mieux cibler les interventions thérapeutiques pour maximiser leur efficacité ; 2) En comprenant comment les différentes sous-populations de DC interagissent avec la chimiothérapie et l'immunothérapie, nous pourrions optimiser la combinaison de ces approches pour une meilleure réponse immunitaire et une plus grande efficacité dans le traitement du cancer ; 3) Ces recherches pourraient révéler des sous-populations spécifiques de DC qui sont essentielles pour une réponse immunitaire efficace. Cela ouvrirait la voie à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux recevront une irradiation (durée 14 minutes) suivie d'une injection (durée 2 minutes) sous anesthésie locale. Suivant les lots, les souris pourront avoir entre 1 et 9 injections (durée 2 minutes) sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations (préhension, injections) peuvent induire du stress chez l'animal. La croissance tumorale et les traitements (la chimiothérapie et l'immunothérapie) peuvent entraîner une perte d'appétit et une perte de poids. L’irradiation peut induire des atteintes modérées de la santé avec amaigrissement et diarrhée transitoires.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélever des organes et faire des analyses de biologie moléculaire et cellulaire.

Remplacement

L'utilisation de la souris dans la recherche sur la chimiothérapie et l'immunothérapie est indispensable car les maladies traitées par perfusion et immunothérapie, particulièrement le cancer, sont des affections complexes impliquant des interactions entre de multiples voies biologiques et des cellules. Les souris sont des modèles animaux qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec les humains, permettant ainsi de comprendre les mécanismes biologiques et les réponses aux traitements dans un système vivant complet. Les DCs sont d'une complexité biologique considérable, et leur fonctionnement et leurs interactions avec d'autres cellules immunitaires sont encore en cours de découverte. Donc l'utilisation de modèles in vivo dans la recherche sur la biologie des cellules dendritiques est indispensable pour obtenir des informations approfondies sur leur fonction, leur rôle dans la réponse immunitaire, leur contribution aux maladies et leur potentiel thérapeutique.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés ; nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail comme expliqué dans chaque procédure. De plus, toutes les expériences reposant sur la reconstitution de la moelle osseuse seront réalisées avec des moelles osseuses cryoconservées au lieu de les extraire de nouveaux animaux donneurs, ce qui réduit de moitié le nombre d'animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront en environnement enrichi et stimulant pour les animaux en expérimentation, avec suffisamment d'espace, de matériel et d'interactions sociales, pour améliorer leur bien-être (sizzlenests, tunnels, maisons). Les protocoles expérimentaux sont rigoureux, optimisés et validés, et minimisent la souffrance animale et les manipulations inutiles, tout en fournissant des résultats scientifiquement valides. Le personnel de recherche est formé en continu afin de réduire le stress et l'inconfort des animaux. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature. Un suivi quotidien est mis en place pour s'assurer de la santé des animaux et mettre en place des mesures correctrices quand c'est nécessaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les interventions seront réalisées sous anesthésie locale ou générale et raffinées (utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...).

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, et pratiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - Les souris âgées à partir de 6 semaines seront utilisées dans cette étude afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

1 191 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation suivie d'une greffe de moelle osseuse, quatre gavages, des prélèvements de sang et l'implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie, pour reproduire une myélofibrose que 100 % des animaux développent. Le porteur indique que la maladie provoque une splénomégalie, une perte d'appétit et un amaigrissement. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut réunir ces paramètres et conclut à la nécessité de la souris pour étudier la maladie dans un "organisme dans sa globalité".

Objectifs

Les néoplasmes myéloprolifératifs sont des cancers du sang caractérisés par la prolifération excessive des cellules myéloïdes tels que les globules rouges, les mégacaryocytes (donnant naissance aux plaquettes) et des granulocytes et peuvent aboutir au développement de leucémies, dont la plus grave est caractérisée par les mutations dans des gènes régulant la production de plaquettes. Elle conduit à une amplification anormale de plaquettes dans la moelle osseuse qui vont s’activer et libérer différents cytokines et facteurs de croissance. Ces derniers vont agir sur les cellules stromales de la moelle osseuse ce qui conduira à la production de collagène en excès et à une dégénerescence par fibrose. Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace dans cette maladie, à l'exception de la greffe de moelle osseuse. Chez les patients atteints de cette maladie, les meiilleurs traitements sont inefficaces.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace de la myélofibrose. Ici nous proposons un nouveau modèle préclinique au développement de la MF rapide et homogène (100% d'animaux développent la maladie contre 60% avec les modèles précédemment décrits) qui nous permettra non seulement de décrypter les mécanismes physiopathologies de la maladie mais aussi de tester des drogues identifiées pendant une pédiode courte et sur un nombre d'animaux diminué car ce nouveau modèle est très reproductible. Les bénéfices potentiels sont le développement de traitements pour cette pathologie grave.

Procédures

Gavages 4 fois, durée 1 minute. Irradiations: 1 fois (13 minutes) et greffes (durée 5 minutes), sous anesthésie générale. Prélèvements de sang (nombre 3), durée 2 minutes sous anesthésie générale. Injections des médicaments (1 ou 2 injections) durée 1 minute, anesthésie locale. Implantation de pompes osmotiques, durée 8 minutes, une fois, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le gavage induit une contrainte légère. Les irradiations suivies de greffe induisent une contrainte modérée pour les animaux: fatigue transitoire, possibilité de diarrhée transitoire. Les injections et les prélèvements de sang induisent une contrainte légère et transitoire du fait de la préhension des animaux. L'implantation de pompes osmotiques est une peite chirurgie légère qui est très bien tolérée. Le modèle proposé conduit au développement de la myélofibrose accompagnée de la diminution de cellules hématopoïétiques au niveau de la moelle osseuse et leur augmentation au niveau de la rate (splénomégalie). Les animaux peuvent présenter des signes cliniques du fait de la perturbation de la formule sanguine, avec perte d'appétit et amaigrissement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les organes hématopïétiques.

Remplacement

Le développement de la myélofibrose survient dans un environnement qui nécessite la présence de différentes cellules, les cellules hématopoïétiques porteuses de la mutation causale de la maladie, différents types de cellules de l'environnement qui seront activées après la libération de cytokines par les cellules hématopoïétiques et le confinement de la moelle osseuse. Il est impossible de réunir ces paramètres in vitro. De plus, la maladie ne touche pas uniquement la moelle osseuse, on observe la splénomégalie et la fibrose au niveau de la rate. Seuls les traitements de souris mimant les symptômes hématologiques des patients atteints de NMP permettront d’analyser leur efficacité dans l’organisme dans sa globalité, incluant la réponse immunitaire contre les cellules mutées.

Réduction

Le nombre d'animaux par lot a été minimisé et s'est basé sur la littérature et l’expérience du laboratoire sur ce modèle de maladie. Le nombre indiqué ne sera atteint que si tous les médicaments présentent un effet sur la myélofibrose. Si un médicament n'a pas d'effet, le test sera arrêté précocément.

Raffinement

Toutes les interventions (greffes, prélèvement de sang) seront faites sous anesthésie générale. Une surveillance clinique quotidienne sera effectuée pour s'assurer de leur santé physique et comportementale. Une alimentation adaptée sera ajoutée dans les cages en cas de diminution de la prise alimentaire et les points limites précoces seront strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi en tout temps (abri en carton, papier, coton, ...).

Choix des espèces

L'utilsiation de souris nous permets dans un temps très court l'obtention d'un nombre d'animaux à expérimenter. Nos modèles miment parfaitement les pathologies humaines (Thrombocytémie Essentielle et Polyglobulie De Vaquez) qui mènent à la myélofibrose. Ce sont donc de bons modèles, statistiquement solides et probant pour les études proposées. Ces souris modèlisent au plus près les conditions pathologiques humaines. Le modèle conduit à un développement rapide de la myélofibrose et ceci de façon très homogène ce qui permet de réduire le nombre d'animaux et le temps de traitement.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le parasite de la leishmaniose viscérale par injection intrapéritonéale, puis reçoivent une injection quotidienne pendant dix jours de molécules candidates. Le porteur indique que la voie d'administration peut provoquer des réactions au point d'injection et prévoit de tuer toutes les souris pour prélever leur foie et leur rate. Il affirme qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne reproduit la leishmaniose dans sa complexité, ce qui rend selon lui l'expérimentation animale 'incontournable'.

Objectifs

Leishmania infantum est un de agents majeurs des leishmanioses viscérales (avec L. major). Les leishmanioses viscérales (LV), également appelées kala-azar, sont mortelles dans plus de 95% des cas en absence de traitement. Elles se caractérisent par des poussées irrégulières de fièvre, une perte de poids, une hépatosplénomégalie et une anémie. La plupart des cas sont observés au Brésil, en Afrique de l’Est et en Inde. On estime que 50 000 à 90 000 nouveaux cas de LV surviennent chaque année dans le monde et que seuls 25% à 45% de ces cas sont notifiés à l’OMS. Les LV demeurent l’une des principales maladies parasitaires à haut potentiel d’épidémie et de mortalité. En 2018, plus de 95 % des nouveaux cas signalés à l’OMS provenaient de 10 pays : Brésil, Chine, Éthiopie, Inde, Iraq, Kenya, Népal, Somalie, Soudan et Soudan du Sud. La leishmaniose viscérale est endémique dans la Région Européenne (au sens de l’OMS), en 2018, plus de 200 cas y ont été signalés (pour l’essentiel sur le pourtour méditerranéen). Ce nombre augmente, en parallèle aux pressions migratoires et au réchauffement climatique et par ailleurs une forte prévalence est retrouvée chez les canidés domestiques dans le pourtour méditerranéen. Le traitement de la leishmaniose dépend de plusieurs facteurs, parmi lesquels la forme de la maladie, les affections concomitantes et l’espèce parasitaire. La leishmaniose est une maladie qui peut être traitée et guérie, mais qui requiert un système immunitaire compétent car les médicaments n’éliminent pas entièrement le parasite de l’organisme, ce qui induit un risque de rechute en cas d’immunosuppression. Par ailleurs, les traitements de choix ont une forte toxicité. Des résistances aux traitements courants se développent progressivement dans les zones d’endémie. Les besoins pour de nouvelles molécules actives sont donc pleinement justifiés. Avant toute tentative de maturation de telles molécules vers un nouveau médicament à usage humain ou vétérinaire, il est indispensable, au-delà des essais in vitro, d’avoir des données de bases sur leur activité in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet envisagés à long terme sont de : - Permettre le développement d’un médicament vétérinaire capable de traiter les animaux de compagnie (leishmaniose canine en particulier), servant de réservoir parasitaire et présentant donc un risque zoonotique de transmission humaine opportuniste, particulièrement dans les départements français de l’arc méditerranéen. - Permettre le développement d’un médicament à usage humain permettant d’améliorer le traitement de maladies parasitaires rares et négligées. - Permettre de mettre à jour une molécule tête de série pour le développement de dérivés d’hémisynthèse (molécules naturelles modifiées par synthèse chimique afin d'améliorer leurs propriétés pharmacodynamiques et/ou pharmacocinétiques) encore plus actifs, à l’instar de la benzyl pénicilline, tête de série de toutes les pénicillines et céphalosporines utilisées comme antibiotiques humains et animaux depuis des décennies.

Procédures

Tous les animaux infestés recevront l'inoculum de parasites par voie intrapéritonéale (100 microL) en 1 seule injection sur environ 1 min d'intervention. Tous les animaux traités le seront par injection intrapéritonéale (100 microL) à raison d'1 injection par jour durant environ 1 min et ce, pendant 10 jours. Les animaux témoins, c'est-à-dire non infestés et non traités, ne subiront aucune intervention.

Impact sur les animaux

La voie d'administration, intrapéritonéale, est susceptible d'engendrer des réactions au niveau du point d'injection (dépôts de fibrine).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever leur foie et leur rate postmortem.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude est envisagé après de nombreuses études réalisées in vitro sur ces 2 molécules (tests sur lignée d'amastigotes axéniques de Leishmania infantum, modèle in vitro de leishmanies intramacrophagiques, tests sur macrophages, et lignées cellulaires cancéreuses (HepG2) et non cancéreuses (cellules VERO). Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la leishmaniose dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour l’analyse statistique appropriée. Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Par ailleurs, uniquement 2 molécules (1 molécule naturelle et 1 molécule de synthèse) actives in vitro, sélectionnées à partir de 2 projets de recherche différents, seront testées afin de mutualiser les groupes de souris contrôle (1 groupe non traité non infesté, 1 groupe infesté non traité et 2 groupes infestés et traités par 2 doses de traitement de réference, soit au total une réduction de 20 souris comparativement à 2 essais in vivo indépendants). De plus, le fait de tester le traitement de référence sur ce modèle lors de la phase préliminaire, permettra, en cas d'inefficacité dudit traitement, d'avorter l'essai in vivo des molécules à tester.

Raffinement

Les méthodes d’analyses choisies permettent l’étude simultanée d’un grand nombre de paramètres (paramètres cliniques (scores de poids, et de comportement) et charge parasitaire mesurée par 2 techniques). Ceci conduit à réduire la variabilité expérimentale et le nombre de techniques à réaliser, donc le nombre d’animaux à utiliser. Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit. Le bien-être animal sera donc une priorité mise en oeuvre par le suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de zootechnie qui évaluera l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, comportement, prostration, perte de poids, piloérection, présence de blessures). L'enrichissement et le développement de l'aspect social du groupe seront ménagés. L'expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé de l'animal selon les points limites et les critères d'arrêt définis dans les procédures afin de limiter la douleur, la souffrance ou l'angoisse de l'animal. Par ailleurs, le modèle proposé (évaluation de l’activité des molécules 18 jours après l’inoculation), permet de ne pas entrainer l’apparition de symptômes (hépato-splénomégalie, anorexie, asthénie) douloureux pour les animaux. En effet, en l'absence de traitement, les symptômes apparaissent 30 à 45 jours après inoculation, la leishmaniose étant une parasitose chronique. Lors du sacrifice, les organes ou parties d’organes non requis pour l’expérience en cours, ainsi que le matériel traité non consommé, seront conservés pour d’autres utilisations éventuelles, constituant une bio-banque accessible au collectif, prévenant l’utilisation d’autres animaux. Par exemple, les prélèvements sanguins effectués pourront servir à l'évaluation pharmacocinétique des molécules testées.

Choix des espèces

Dans le cadre de la confirmation, in vivo, de l’efficacité de molécules actives sur les leishmanies, l’utilisation de souris, qui ne sont pas l’hôte usuel de ces parasites, est consensuelle dans la collectivité scientifique. Les souris utilisées seront des souris balb/c femelles en raison de leur moindre agressivité, diminuant ainsi le stress des animaux. Les souris sont utilisées entre 6 et 10 semaines d’âge (ou environ 20-25 g pour une souris). C’est le meilleur compromis pour la qualité de l’inoculation et la présence d’un système immunitaire mature.

1566 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des cellules cancéreuses par voie sanguine ou sous-cutanée sous anesthésie, puis elles reçoivent divers traitements par injection ou gavage et des prélèvements de sang à la joue, pour évaluer un traitement sur cinq types de cancers. Le porteur indique que le développement tumoral peut entraîner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement et un isolement, et que toutes les souris sont tuées pour analyser leurs organes. Il affirme que seul un modèle vivant entier permet d'étudier l'évolution tumorale et les récidives.

Objectifs

Pour traiter leucémie et tumeurs solides, il est important de trouver de nouvelles façons de soigner les patients tout en minimisant les effets secondaires. Récemment, il a été développé un médicament spécifique des cellules qui prolifèrent rapidement (comme les cellules cancéreuses). Aujourd’hui, ce traitement est testé en essai clinique sur des patients atteints de leucémie, et nous souhaitons élargir l’utilisation de notre traitement à d’autres cancers agressifs, comme celui du poumon, du sein, du pancréas et le mélanome. Dans des expériences préliminaires de laboratoire, ces cellules cancéreuses sont tuées efficacement par le médicament. L’utilisation de la souris nous permet de confirmer l’efficacité du médicament dans un environnement physiologique et vivant avant de tester le produit en clinique, chez l'homme. Dans une seconde partie du projet, comme il est souvent difficile de traiter totalement le cancer avec un seul médicament, nous souhaitons combiner notre traitement avec d’autres agents couramment utilisés en cliniques aujourd’hui. Ces combinaisons de plusieurs thérapies sont de plus en plus utilisées en clinique pour augmenter l’efficacité de traitement, réduire le risque que le cancer se redéveloppe et surtout réduire les effets secondaires. Nous avons déjà testé ces combinaisons en laboratoire et avons obtenus de résultats prometteurs. Avant de pouvoir appliquer notre traitement chez les patients atteints de cancers, seul ou en combinaison, il est nécessaire de valider nos résultats sur des modèles animaux qui récapitulent fidèlement ce que l'on observe chez l’homme. Ce projet nous aidera à mieux comprendre comment le cancer peut développer une résistance, comment notre traitement interagit avec le corps humain et d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

Le processus de développement d’un nouveau traitement, de sa conception initiale jusqu’à son autorisation de mise sur le marché, peut nécessiter en moyenne entre 15 et 20 années. Il est donc impératif d’optimiser au maximum l’utilisation de chaque avancée thérapeutique. Ce projet permettra d’une part d’optimiser le développement de notre traitement en l’appliquant sur différents modèles de cancer agressifs, notamment sur un modèle de cancer de pancréas pour lequel seules la chirurgie et la chimiothérapie conventionnelle existent. D’autre part, ce projet apportera une meilleure compréhension de la résistance thérapeutique, et dans la récidive du cancer. Cette compréhension favorisera la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques, qui permettront de réduire la dose administrée de chaque traitement, et par conséquent réduire le coût, les effets indésirables, et surtout la résistance au traitement. En effet, ces bithérapies permettront d’offrir une alternative thérapeutique aux patients résistants à un agent, et donc cibler une plus large partie de la population. Ainsi, ce projet ouvrira de nouvelles perspectives dans le traitement des leucémies aiguës, de cancers solides, et offrira une alternative aux patients en quête de traitements plus efficaces et mieux tolérés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des greffes de différentes cellules cancéreuses pour développer la maladie, par voie sanguine ou sous cutanée. Avant et pendant chaque greffe, les souris sont endormies. Les responsables du projet suivront l’évolution de la maladie 2 fois par semaine. Pour une des procédures, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins au niveau de la joue pour surveiller l’évolution de la maladie. Ces prélèvements seront effectués sur des animaux endormies une fois par semaine au maximum, soit un total de 3 à 12 prélèvements totaux selon la procédure. Les animaux seront divisés en plusieurs groupes pour leur administrer différents traitements par voie sanguine, sous-cutanée ou par gavage. L’administration de traitements ne nécessite pas le recours à l’anesthesie. Selon les procédures, les différents traitements seront administrés par voie orale, par injection sous-cutanée ou par injection sanguine. Toutes interventions sur la souris (injections de cellules tumorales en sous cutanée, gavages, injection du traitement et prélèvements) effectuées par des membres qualifiés dureront 1 à 5 minutes maximum par souris. Le temps de developpement de la maladie (en sous cutanée ou par voie sanguine) est estimé à deux semaines. Au moins 2 fois par semaine, les responsables du projet observeront les animaux pour détecter tout inconfort ou signe de douleur.

Impact sur les animaux

Les transplantations de cellules, les prélèvements de sang, et les administrations de traitement par voie intraveineuse se feront sous anesthésies gazeuses, ce qui peut occasionner un stress de courte durée à l’induction et au réveil. Certains traitements sont administrés par voie orale avec une technique appelée gavage qui peut entrainer une gêne physique en cas d’administration quotidienne. Comme attendu dans ce projet, les greffes de cellules vont aboutir à un développement tumoral, qui, à un certain stade, peut occasionner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement, une isolation, une perte d’activité.

Devenir

A l'issue des expérimentations, tous les animaux seront sacrifiés pour réaliser des analyses sur les organes et évaluer la présence éventuelle de cellules cancéreuses résiduelles.

Remplacement

Nous avons déjà effectué plusieurs tests de laboratoire (qui ne nécessitent pas l'utilisation d'animaux) qui ont confirmé l’efficacité antitumorale de notre anticorps seul et en combinaison avec d’autres médicaments. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier en profondeur l’évolution tumorale, les récidives, et la réponse de l’organisme au traitement. De plus, il est important d’évaluer consciencieusement les potentiels effets secondaires de notre traitement et s’assurer de la non-toxicité avant son application chez l’homme. Enfin, nous souhaitons étudier l’effet de notre traitement sur la survie des individus. Pour ces raisons, seul un modèle vivant entier pourra répondre entièrement à notre projet. La souris reste donc aujourd’hui le modèle le plus pertinent pour répondre à nos objectifs scientifiques.

Réduction

Grâce à des études déjà réalisées au sein de notre laboratoire et à des tests statistiques réalisés on sait que pour interpréter les résultats obtenus, il faut utiliser au moins 8 animaux par conditions. Ces calculs sont confirmés aussi par d’autres laboratoires, et sont également présents dans la littérature. En plus, nous utiliserons les mâles et les femelles pour généraliser la réponse au médicament chez les deux sexes.

Raffinement

Toutes les procédures seront soumises au respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés en groupe pour privilégier leurs interactions sociales, dans des cages propres et contrôlées, contenant des jouets. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et 2 fois par semaine par les responsables du projet. Les protocoles ont déjà été optimisés pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les injections et prélèvements dures 5 minutes et sont réalisés par des membres qualifiés, sur les animaux endormis permettant la réduction du stress et douleur. En cas de douleur qui peut se développer à cause de l’évolution du cancer, des anti-douleurs leur seront administrés. Un score de douleur sera établi 2 fois par semaine selon une grille très spécifique. En cas de non-réponse aux antidouleurs, les animaux seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est considérée aujourd’hui comme un modèle pertinent pour étudier et comprendre l’évolution du cancer et la réponse aux traitements observée chez l’homme, notamment du fait de la similarité biologique. Pour ce projet nous utiliserons des souris adultes (>6 semaines) pour refléter l'âge de développement de ces tumeurs chez l'homme.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées de paclitaxel, un anticancéreux, pour leur induire une neuropathie douloureuse, puis des injections d'une molécule candidate, et subissent des tests comportementaux d'allodynie tactile et thermique au froid. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une 'nuisance à part entière' mais 'indispensable' à l'étude, et prévoit de tuer tous les rats pour des prélèvements. Il affirme que ce type d'étude sur la douleur n'est pas encore remplaçable par des modèles in vitro.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite (CIPN) est un effet indésirable classique et dose limitant des anticancéreux neurotoxiques (sels de platine, taxanes, vinca alcaloïdes, bortézomib), qui touche environ 60% des patients, et altère profondément la qualité de vie des patients et dont la prise en charge thérapeutique reste très limitée. Aucun traitement préventif ne peut être recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée sur les douleurs associées. En conséquence, les oncologues sont fréquemment contraints de diminuer voire d’arrêter les anticancéreux neurotoxiques lors de l’apparition des premiers symptômes de CIPN. Des travaux récents ont montré l’intérêt d’une molécule, le CARBA1, pour améliorer l'action anticancéreuse du paclitaxel (taxane) et avec des propriétés antioxydantes laissant penser que le CARBA1 pourrait limiter la neurotoxicité du paclitaxel. Ainsi, l’objectif de ce projet sera d’évaluer l’effet préventif du CARBA1 sur la CIPN associé au paclitaxel sur un modèle animal (rat). Ces effets préventifs seront notamment mesurés par des tests comportementaux (allodynie tactile et thermique).

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier une nouvelle stratégie thérapeutique de prévention de la CIPN associée au paclitaxel. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des CIPN est très limitée (aucun traitement préventif et seule la duloxétine modérément recommandée sur les douleurs). L’objectif ultime sera de proposer un nouvel agent capable de prévenir la CIPN qui devra faire l’objet d’une preuve de concept dans le cadre d’une étude clinique impliquant la personne humaine.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections de paclitaxel ou de son véhicule associées à des injections de CARBA1 ou de son véhicule. Le nombre d’injections pour le paclitaxel sera de 4 (J0, J2, J4, et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) et de 6 pour le CARBA1 (J-2, J-1, J0, J2, J4, et J7) par voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à 3 semaines après la fin des injections : 1. Mesure de l'allodynie tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal (stabulation dans des portoirs (box) individuel pour 24 rats); 2. Mesure de l'allodynie thermique au froid : durée du test pour un animal 5 minutes (max).

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées de paclitaxel pourront être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux, mais ce phénomène est très limité voire absent avec les doses de paclitaxel utilisées (nb. Nous ne l’avons jamais observé avec ce modèle animal, mais cet effet est retrouvé plus fréquemment avec les autres anticancéreux neurotoxiques). Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations de paclitaxel, et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux, car l’altération de l’état général des animaux est un biais important à la pertinence des analyses conduites.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des 2 expérimentations afin d’effectuer des prélèvements.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie des CIPN, qui n'est-elle même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur (troubles nociceptifs neuropathiques), l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales sont injectées ou greffées par chirurgie dans la glande mammaire, puis une partie des animaux est irradiée sous anesthésie, le porteur reconnaissant des risques de nécrose, d'ulcération tumorale et d'érythèmes cutanés. Les tumeurs et organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le microenvironnement tumoral et présente une protéine comme cible thérapeutique potentielle.

Objectifs

Le cancer, dont les cancers du sein et des voies aérodigestives supérieures, reste un problème majeur de santé publique. La radiothérapie est actuellement appliquée dans plus de 70% des traitements contre le cancer et fait partie de l’arsenal antitumoral incontournable. Cependant, la radiothérapie possède comme effets secondaires l’augmentation de l’immunosuppression du microenvironnement tumoral, en ciblant notamment un composant de ce microenvironnement, ce qui a pour conséquence de diminuer les chances de rémission complète chez les patients. Ce composant, une protéine de la matrice extracellulaire produite non seulement par les cellules cancéreuses mais également et majoritairement par des cellules fibroblastiques appelées FRC, joue un rôle primordial dans la genèse d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur favorisant la progression et la malignité des tumeurs. Il est suggéré que ce composant lorsqu’il est produit par les cellules FRC contrecarre la mort des cellules cancéreuses induite par la radiothérapie et empêche une rémission tumorale complète. La présente étude s’attachera à analyser dans des modèles d’expérimentation in vivo l’impact de cette protéine, présente dans le microenvironnement tumoral, sur le traitement par radiothérapie de tumeurs mammaires et des voies aérodigestives supérieures et à définir l’effet de la protéine produite par les cellules cancéreuses par rapport à celui de la protéine produite par les cellules FRC sur le développement d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur. Il est attendu qu’en diminuant l’expression de cette protéine, et donc son effet immunosuppresseur, on améliore l’efficacité de la radiothérapie et ainsi qu’on puisse atteindre une rémission complète de la tumeur.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de cette étude est d'évaluer et caractériser, grâce à des modèles d'expérimentation in vivo, l’impact d'une protéine cible fortement produite dans les tissus tumoraux, et du traitement par radiothérapie sur le développement des cancers mammaires et des carcinomes de la tête et du cou. Le but in fine étant de déterminer si cette protéine pourrait être une cible thérapeutique potentielle en santé humaine. En effet, nous prévoyons qu’une réduction ou absence de cette protéine dans les tissus tumoraux entraînera une diminution de l’aspect immunosuppressif du tissu tumoral et de ce fait améliore la rémission des tumeurs induite par le traitement de radiothérapie.

Procédures

Un groupe d’animaux subira une injection unique en sous-cutanée et sous anesthésie générale pendant 10 minutes maximum, de cellules au niveau de la nuque. Un second groupe subira une greffe par chirurgie sous anesthésie générale pendant 15 minutes maximum, de cellules au niveau de la glande mammaire. Une partie de ces animaux subiront également une irradiation soit à faible dose soit à forte dose (5 minutes maximum) sous anesthésie générale d’une durée maximum de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables que nous pourrions observer sur nos modèles murins de tumeurs mammaires et de tumeurs des voies aérodigestives supérieures (VADS) sont : inflammation, nécrose ou ulcération tumorale, problème d’alimentation ou de déplacement dû au développement de tumeur, infection ou mauvaise cicatrisation post-chirurgie, perte de poids, variation de la fréquence respiratoire. L’irradiation peut induire des érythèmes cutanés et des nécroses suite à l’évolution de la croissance tumorale post-traitement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des différentes procédures pour effectuer un prélèvement et une analyse des tumeurs et de différents organes.

Remplacement

Le modèle animal est nécessaire car il n'existe pas de modèle in vitro pour reproduire l’ensemble des mécanismes impliqués dans la tumeur, comme l'environnement tumoral, la réaction du système immunitaire, les mécanismes physiologiques impliqués et l'impact sur la survie de l'animal, entre autres exemples. Un des objectifs de notre étude est de développer et valider un modèle 3D in vitro et le modèle animal est indispensable à l’obtention d’échantillons tumoraux issus d’animaux irradiés et non irradiés qui serviront de base à la caractérisation et à la validation de modèles tumoraux 3D in vitro en cours de développement dans le laboratoire..

Réduction

Un outil de calcul de la taille des échantillons biologiques a été utilisé afin de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire, mais néanmoins suffisant, pour pouvoir atteindre les objectifs et réaliser une analyse statistique pertinente.

Raffinement

Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés et maintenus en groupes sociaux dans des cages agrémentées avec de la litière, de maisonnette et rouleaux de coton (nidification), de frisures de papier kraft et tunnel (cachette) et de bâtons à ronger pour diminuer leur stress et favoriser leur activité. Les protocoles expérimentaux seront réalisés par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement une semaine avant de démarrer les procédures expérimentales. L’implantation des cellules tumorales et l’irradiation seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien des souris sur un tapis chauffant et avec du gel ophtalmique sur leurs yeux pour les protéger. Une analgésie pré- et post-opératoire ainsi qu’une analgésie locale seront effectuées lors des greffes par chirurgie. Pour les trajets entre le site d’hébergement et le site d’irradiation (effectués en voiture, < 5 min), les souris seront mises dans des boites de transport dédiées avec un filtre sanitaire, de la nourriture et de l’eau gélifiée, de la litière, de la frisure de papier kraft et des rouleaux de coton. Des chaufferettes seront ajoutées sous les boites pour éviter tout risque d’hypothermie des souris. Des points limites ont également été établis pour éviter toute souffrance animale. Les souris seront pesées et leur état général évalué tous les jours durant les trois premiers jours post-greffe (ou jusqu’à cicatrisation complète) et post-irradiation puis au minimum 3 fois par semaine. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans une grille d’évaluation de la souffrance/points limites permettant la surveillance des animaux. Tout signe anormal (points limites : perte de poids excessive, comportement ou apparence/état de l’animal anormal, respiration anormale, etc.) sera signalé aux responsables. De plus, si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition de douleurs, une injection d’un analgésique sera effectuée. La surveillance et les soins des animaux avant l’intervention seront assurés par une équipe qualifiée de zootechniciens, vétérinaires, techniciens et chercheurs. La structure en charge du bien-être animal accompagnera le projet dans sa mise en œuvre, avec les conseils du vétérinaire désigné.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle murin car celui-ci possède de multiples avantages dont celui d'être un modèle animal déjà validé dans le laboratoire depuis de nombreuses années. De plus, la souris récapitule de manière très similaire à l’homme l'ensemble des mécanismes moléculaires et des paramètres impliqués dans le développement tumoral : microenvironnement, réaction du système immunitaire, dissémination des métastases, mécanismes physiologiques impliqués et/ou associés, impact sur la survie. Les souris seront utilisées adultes à partir de 8 semaines d'âge minimum, ceci afin de mimer la pathologie chez l’homme adulte. L’utilisation de souris plus jeune n’est pas pertinente car les mécanismes physiologiques impliqués seraient potentiellement différents, le jeune individu étant encore en cours de développement.