Oncologie

844 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à 8 Gy puis greffées avec de la moelle osseuse et des lymphocytes, pour développer une maladie du greffon contre l'hôte et chercher des cibles contre la leucémie. Le porteur décrit une perte de poids, un pelage terne et des atteintes cutanées, les souris atteignant 20 % de perte de poids ou un score clinique de 5 étant mises à mort. Les retombées annoncées pour les patients restent générales, et les souris qui n'atteignent pas les points limites sont tuées deux à trois mois après l'irradiation faute d'évolution attendue.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est l'identification de nouvelles cibles dans le traitement des rechutes de leucémie aigue myéloblastique ainsi que dans la maladie du greffon contre l'hôte (maladie induite par la greffe de cellules souches hématopoïétiques lors de traitement des hémopathie malignes). Tout d'abord dans la mise en place du modèle murin de leucémie aigue myéloblastique. Ensuite dans l'identification de nouvelles cibles avec des outils technologiques innovants. Par la suite, nous tenterons de traiter les animaux avec des traitements visant les nouvelles cibles identifiées.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chez l'homme, une maladie qui requiert aujourd'hui de nouveaux traitements permettant la prise en charge des patients réfractaires aux traitements classiques et de soulager ainsi la souffrance des patients. Dans ce projet, nous allons valider une ou plusieurs molécules thérapeutiques qui auront été identifiés via différents processus autant chez la souris que chez l'homme.

Procédures

Les souris seront irradiées en 2 fois 5 minutes chacune à raison de 0,8 Gy/min pour un total de 8 Gy. Le temps total d'irradiation est de 10 minutes par souris. L'irradiation s'effectue dans une pièce adjacente à l'animalerie. Les animaux sont installés par 11 dans une cage à irradiation avec couvercle filtant. Elles seront ensuite injectées sous anesthésie gazeuse isofluorane avec de la moelle osseuse seule ou de la moelle osseuse avec des lymphocytes T provenant de souris donneuses (+ ou - cellules leucémiques) pour un total de 100µl par souris. Le temps d'injection des cellules en comptant l'anesthésie est d'environ 1 minute par animal. Dans un second temps, les souris seront traitées selon le schéma adapté à la molécule avec des injections de 100µL de solution diluée dans une solution saline administrée par voie intrapéritonéale. Le temps d'injection des traitements est d'environ 30 secondes par animal. Des prélèvements sanguins dans le sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse isofluorane à raison d'une à deux fois par expérience. Le temps de prélèvement est d'environ 1 minute par animal. Le volume maximale prélevé sera de 100µL. Le nombre d'intervention par souris est de minimum 2 à maximum 6.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte caractérisés par une perte de poids associée à un pelage terne, possiblement mais pas systématiquement à des atteintes cutanées voire à une posture voutée de l’animal. Les signes cliniques seront classés suivant un score établi de 1 à 5. L’évaluation clinique des animaux (score) se fait de la façon suivante : un score de 1 correspond à la présence d’un des signes suivants et qui peuvent apparaître sans ordre précis : une perte de poids de 10%, une posture voutée, une atteinte des poils, une desquamation de la peau, une diarrhée. Les scores s’additionnent pour arriver à un maximum de 5. Il est à noter que quand la perte de poids atteint 20% et en absence d’autre signe clinique, les souris seront aussi t. Ce score a été évalué par nos pairs spécialistes de la greffe de moelle osseuse, publié dans une revue internationale. Concernant les souris simplement irradiées qui servent de validation de l'expérience, elles meurent d'aplasie. Elles auront de l'anémie et de la perte de poids. Lorsque le poids de ses souris atteint moins 20% du poids initial, ces souris seront mises à mort.

Devenir

Les animaux dont la perte de poids aura atteint 20% du poids initial ou bien un score clinique de 5 seront mis à mort ainsi que les animaux qui n'auront pas atteint les points limites deux à trois mois après l'irradiation. Pour les procédures 1, 2 et 3, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 2 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus. Pour la procédure 4, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 3 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier l’effet de molécules thérapeutiques sur le développement de la maladie du greffon contre l’hôte in vivo. Dans ce cadre, les expériences in vitro ne pourront pas remplacer l’utilisation des animaux et ne pourront pas répondre à l’hypothèse émise. Toutefois, toutes les expériences pouvant donner des informations sur le mode d'action de la molécule en question sans avoir recours à l'expérimentation in vivo seront réalisées sur des cellules in vitro.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés au maximum, les expériences seront regroupées le plus possible. Ainsi, nous testerons par exemple les traitements en préventif et en curatif dans une seule expérience, ceci nous permettra de réduire le nombre d'animaux contrôles nécessaires pour chaque expérience. Le nombre d'animaux pour chaque procédure a été calculé par une approche statistique à l'aide du document « Estimation du nombre d’animaux nécessaires » de Hugues Jacobs.

Raffinement

Afin d’éviter la souffrance des animaux, les souris ayant atteint un score de 4 ou une perte de poids de 20% seront mises à mort. Cette méthode impose une analyse fine 3 fois par semaine de chaque animal afin d’établir le score clinique associé à un suivi quotidien de l’état général des souris dans le but d’abréger toute souffrance. L'enrichissement et l'hébergement des animaux dépend entièrement des conditions imposées par l'animalerie. Ce qui consiste à déposer 3 enrichissements différents dans les cages comme les Nestlets, un smart home, ainsi que des Bed-r’nest. Le nettoyage des cages a lieu une fois toutes les deux semaines par les zootechniciens, mais les souris étant contrôlées tous les 2 jours par l'expérimentateur, les cages souillées sont changées rapidement.Les drogues antalgiques peuvent agir directement sur le système immunitaire et modifier les résultats, elles ne seront donc pas utilisées dans nos expériences. Toutefois, les animaux seront mis à mort quand leur état ne permet pas d'envisager une amélioration. Lors de l’injection des cellules et du prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbitale, les souris seront anesthésiées sous isofluorane et un anesthésique local type collyre d'oxybuprocaïne sera utilisé.

Choix des espèces

La maladie du greffon contre l'hôte a été étudiée depuis des décennies dans plusieurs milliers d'études publiées. La disponibilité de modèle génétiquement modifié représente un atout non présent dans les autres espèces et qui nous permet de mieux étudier la réponse immune et de se rapprocher au plus de la maladie chez l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte préférentiellement entre 8 et 12 semaines. A cet âge, ils possèdent un système immunitaire bien développé et sont suffisamment matures pour supporter les doses d'irradiations auxquelles ils seront soumis.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un anticancéreux, le bortézomib, pour induire une neuropathie, puis subit des tests hebdomadaires de sensibilité tactile et thermique évaluant l'allodynie, pour en étudier le mécanisme membranaire. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une nuisance modérée "indispensable" à l'étude et signale une possible baisse de poids. Il reconnaît que des animaux plus âgés seraient plus proches de la clinique humaine mais les écarte pour leur "coût" financier et éthique.

Objectifs

L’objectif principal de projet est d’étudier le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique, le bortézomib et de connaître l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme. Parmi les objectifs secondaires, nous souhaiterions (1) mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et (2) tenter de découvrir les facteurs prédisposant à cette pathologie expliquant pourquoi certains malades sont spécifiquement atteints.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.

Procédures

Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max).

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation de l’allodynie tactile et de l’allodynie au froid, tests n’excédant pas 60 minutes et 5 minutes respectivement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg) et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score a été construite afin d’identifier une altération trop importante de l’état de l’animal menant à l’euthanasie de l’animal en cas d’obtention d’un score supérieur à 15 (grille en annexe).

Choix des espèces

Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important (financier et éthique) et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une dizaine d'injections et jusqu'à dix-huit prélèvements de sang, pour tester si la neutralisation d'une protéine circulante limite les effets du syndrome de Cushing. Le porteur décrit des nuisances "très limitées" et un inconfort "léger", tout en indiquant que les glucocorticoïdes peuvent induire obésité, résistance à l'insuline et ostéoporose. Il affirme que l'appétit et le comportement alimentaire ne sont pas modélisables in vitro et conclut au caractère "indispensable" de l'animal vivant.

Objectifs

Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim. Cette protéine agit comme un stimulateur de production de graisse (lipogenèse) et un stimulateur de l'appétit. L’augmentation de cette protéine accroît la prise alimentaire, réduit la glycémie, et encourage la lipogenèse à tous les niveaux. La neutralisation de cette protéine apparaît donc comme un candidat d'intérêt dans la lutte contre l’obésité. Or, l'exposition chronique à des niveaux excessifs de glucocorticoïdes entraine un syndrome de Cushing qui est caractérisé par le développement de l'obésité, une résistance à l'insuline, une perturbation des taux de graisses dans le sang, une faiblesse musculaire, une fragilité des os et des accidents vasculaires. L’objectif de ce projet est donc d’étudier et de déterminer si la neutralisation de cette protéine circulante peut empêcher/réduire les effets secondaires indésirables du Syndrome de Cushing.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique afin de limiter ou d’éradiquer le syndrome de Cushing (effets indésirables associés à une exposition importante aux glucocorticoïdes).

Procédures

Pour certains animaux 12 injections sous anesthésie locale par souris (durée quelques secondes) et 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute) - Pour d'autres animaux: 10 injections par souris (durée quelques secondes) et 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute) - Pour d'autres animaux, 11 injections par souris (durée quelques secondes), 18 prélèvements de sang (durée quelques secondes à 1 minute). Pour tous, 1 prélèvement de sang unique sous mandibulaire (100µL, 1 minute), à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

Les injections sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. Les prélèvements de sang, très limités en volume, ne provoqueront qu'un inconfort léger, local et transitoire. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les glucocorticoïdes peuvent induire l'obésité, la résistance à l'insuline, la dyslipidémie, la myopathie et l'ostéoporose.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible de modéliser, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Le nombre nécessaire d'animaux a été déterminé grâce à une analyse statistique préalable. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de détecter toute modification.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. -La souris est un animal très utilisé en laboratoire, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jour de leur naissance, elles reçoivent une injection dans le cerveau, puis subissent à 21 jours un traumatisme crânien provoqué par un impact sous anesthésie, suivi de séries de tests comportementaux et d'IRM, avant d'être tuées par perfusion d'un fixateur. Le porteur présente ce modèle comme reproduisant un traumatisme crânien pédiatrique et renvoie les retombées thérapeutiques à un potentiel futur. Il affirme qu'"aucun modèle in vitro ou informatique" ne permet cette étude et que le projet "ne peut pas se passer de l'expérimentation animale".

Objectifs

Le projet que nous avons développé vise à étudier les changements qui se mettent en place au sein du cerveau à la suite d'un traumatisme crânien léger et qui contribuent aux atteintes comportementales à long terme. Ce projet unique va explorer le potentiel thérapeutique d’une protéine d’intérêt, la cavéoline, en étudiant son rôle protecteur dans le cerveau. Notre équipe utilisera un modèle léger de traumatisme crânien chez la souris, nous permettant d'étudier sur le long cours, à l'aide de tests comportementaux et d'outils d'imagerie innovants, les processus induits sur le système nerveux central avec une définition encore inaccessible chez l'homme. Ces processus chroniques seront étudiés par l’utilisation de souris ayant reçu une injection permettant l’augmentation de notre protéine d’intérêt. Suite à l’induction du traumatisme crânien, ces animaux seront soumis à une évaluation comportementale permettant d’évaluer leurs capacités locomotrices, leur niveau d’anxiété et leur mémoire et nous réaliserons également un suivi au cours du développement par imagerie IRM. Notre étude sur le rôle de cette protéine d’intérêt pourrait nous permettre d’établir la pertinence de cette protéine dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques innovantes.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine CAV1 (CAVéoline-1) représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.

Procédures

1. injection unique dans le cerveau le jour de naissance sous anesthésie générale courte (moins de 15 minutes) adaptée à ce stade de développement. Réalisé une seule fois. 2. trauma crânien léger juvénile (TC): 21 jours après leur naissance, les animaux subiront une anesthésie générale courte (5 minutes) pendant laquelle il recevront un impact léger au niveau du crâne. Animaux contrôles soumis uniquement à l’anesthésie générale. Réalisé une seule fois. 3. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes, 2 tests de coordination motrice d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux de 5 minutes et 2 tests d’apprentissage spatial qui nécessitent des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale s’étalera sur 2 semaines, avec 11 jours où l’animal sera testé sur une durée de 5 min par jour. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers, un jour après le dernier test comportemental. 5. Fixation du tissu cérébral. Anesthésie générale profonde et adaptée. Perfusion d’un fixateur pendant 5 minutes jusqu’à l’arrêt du cœur. Prélèvement des tissus.

Impact sur les animaux

Notre modèle repose sur une injection dans le cerveau à la naissance sous anesthésie très courte. Ce geste peut entraîner une réduction de la température du corps ou un retard de croissance. De plus, nous utiliserons un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Les conséquences possibles incluent des altérations d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de mobilité, d’anxiété ou de douleur. Chaque série comportementale peut entraîner du stress et de la fatigue. L’anesthésie réalisée lors de l’imagerie par IRM peut aussi entraîner une dépression respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure, soit 348 animaux. Ceci est nécessaire pour les analyses en immunohistochimie et par imagerie IRM qui complèteront et seront essentielles à cette étude.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données scientifiques permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Le projet concerne 348 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes lors des tests comportementaux / IRM.

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. La procédure chirurgicale d’injection stéréotaxique chez le nouveau-né sera réalisée avec des protocoles d’anesthésie et d'analgésie permettant de supprimer toute douleur durant et après la procédure. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Le bien-être des animaux sera assuré par des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. Dans ce projet, les souris seront injectées en intracérébral le jour de la naissance afin de permettre une transfection robuste 3 semaines plus tard. Les traumatismes crâniens seront donc réalisés sur des souris juvéniles à 21 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à moyen terme.

405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de formulation d'ARNm puis des injections d'un substrat luminescent et des séances d'imagerie, avant d'être tuées pour mesurer l'expression de l'ARNm dans leurs organes. Le porteur revendique l'optimisation de vaccins à ARNm et la réduction de leurs coûts, et signale la douleur liée aux piqûres intramusculaires. Il affirme que les modèles cellulaires ne sont "pas prédictifs" et qu'"aucune méthode de remplacement fiable" n'est disponible.

Objectifs

Le projet a pour objectif l'augmentation de l'efficacité de la vaccination anticancer par ARNm. Les ARNm ne rentrent pas seuls dans les cellules et ont besoin d’être vectorisés pour résister aux nucléases extracellulaires. Les nanoparticules lipidiques (LNP) permettent de délivrer l’ARNm dans les cellules dendritiques pour exprimer l’antigène et induire une réponse immune. Dans le cas de la régénération osseuse, ce sont des cellules ostéoprogénitrices qui sont transfectées. Nous voulons comparer différentes formulations et différentes structures d’ARNm. Il n'existe pas de système permettant de modéliser l'interaction croisée des formulations d’ARNm de différentes structures avec l’organisme. Dans ce projet, nous cherchons à optimiser à la fois l'internalisation cellulaire des ARNm en sélectionnant différentes formules de LNP et leur traduction en protéines en sélectionnant différentes structures d'ARNm. Dans les deux cas l'objectif est de maximiser l'expression de l'ARNm thérapeutique, ce qui est quantifié dans cette demande en mesurant l'intensité du signal bioluminescent. Ces optimisations serviront aux deux applications thérapeutiques de l'équipe, la vaccination par ARN et la régénération tissulaire par ARN. Nous avons synthétisé une bibliothèque de lipides permettant de faire des LNP. Les tests sur modèles cellulaires nous ont permis de retenir 8 types de lipides pour évaluation in vivo. Cette évaluation in vivo est nécessaire car les modèles cellulaires ne sont pas prédictifs de l'activité des LNP dans un organisme. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner pour chaque formulation la structure d’ARNm entraînant la plus forte expression in vivo après injection intramusculaire ou intraveineuse. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins chez l’homme.

Procédures

Les souris vont recevoir 1 seule injection de formulation ARNm soit en intramusculaire dans chacun des muscles des cuisses (1 injection par cuisse), soit en intraveineuse dans la queue (1 injection unique sur souris).L'injection des formulation se fait sous anesthésie gazeuse. Aucune formulation ne sera injectée dans le lot témoin. Au temps 6h, 24h, 48h et 96h au maximum après l’injection de la formulation (LNP-ARNm), les souris recevront par voie intrapéritonéale le substrat de la luciférase (4 fois au maximum durant l'étude), puis elles seront imagées en imagerie de bioluminescence.( 4 séances de 1 minute au maximum). Les souris seront anesthésiées sous isoflurane (2%) durant le rasage ( 1 fois 5 minutes) et les injections des formulations (1 fois 3 minutes maximum) mais seront vigiles durant l'injection intrapéritonéale du substrat de la luciférase.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à une douleur suite au rasage et à l’injection des formulations mis à part la douleur induite lors de la piqure liée à l'aiguille et à l’injection de la solution en intra musculaire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort puis des prélèvements seront réalisés pour quantifier l'ARNm dans les organes où le signal a été détecté.

Remplacement

L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.

Réduction

L’effectif des souris mis en œuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive, le suivi longitudinal permettra de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests statistiques ANOVA.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement dès leur arrivée. Ils seront hébergés dans une animalerie confinée dans des cages de type 2 à cinq souris par cage avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum, un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Les cages contiendront un enrichissement qui sera soit un tube en carton, soit un cylindre opaque soit une petite maison transparente pour souris. Les méthodes utilisées seront mises en œuvre par du personnel formé. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive (imagerie de bioluminescence) chez la souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et de régénération tissulaire. Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage de formulations et de structures ARNm. Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.

120 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses humaines puis des injections de lymphocytes modifiés, la croissance des tumeurs étant suivie par imagerie jusqu'à leur mise à mort. Le porteur indique que les tumeurs peuvent atteindre une grande taille, provoquer une détresse respiratoire ou une paralysie des membres arrière avant l'application du point limite. Il affirme que les études précliniques sur animaux sont "incontournables" et qu'il est "nécessaire" de vérifier l'efficacité in vivo.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers agressifs. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre des antigènes de la tumeur (ou Adoptive Cell Transfer). Malgré son efficacité dans le traitement de cancers hématologiques, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Nous avons développé des cellules qui présentent une activité anti-tumorale supérieure aux cellules CAR classiques dans nos modèles in vitro. Nous hypothétisons que ces cellules CAR seront plus efficaces dans les tumeurs hématologiques mais aussi contre les tumeurs solides. Ce projet vise donc à étudier : L’efficacité anticancéreuse des nouveaux lymphocytes humains T activés in vitro et exprimant des récepteur CAR (Chimeric Antigen Receptor) dans un modèle de xénogreffe humaine de lymphome et deux modèles de cancer solide du poumon) et du pancréas. Nous étudierons l’effet de l’injection des lymphocytes T humains (issus des donneurs sains) et exprimant un récepteur chimérique (CAR) dans des souris immunodéprimées supportant une xénogreffe des cellules humaines de cancer du pancréas, lymphome ou de cancer du poumon et qui expriment le gène de la luciférase. Nous suivrons la croissance tumorale par imagerie luminescente.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du pancréas et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue. Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions. Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse et placées sur un tapis chauffant pour maintenir leur température corporelle et surveillées au réveil.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peuvent occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisance pourront apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 300 mm2 pour les tumeurs sous cutanées), il y a apparition de détresse respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une paralysie des membres arrière est observée (pour la tumeur Raji). Si ces signes sont observés souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle ainsi que son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons utiliser un modèle murin afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les deux jours pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur (ex : analgésiques locaux type Lidocaïne au point d’injection à la queue ; et/ou antalgiques type AINS). De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.