Oncologie

1566 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe des cellules cancéreuses par voie sanguine ou sous-cutanée sous anesthésie, puis elles reçoivent divers traitements par injection ou gavage et des prélèvements de sang à la joue, pour évaluer un traitement sur cinq types de cancers. Le porteur indique que le développement tumoral peut entraîner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement et un isolement, et que toutes les souris sont tuées pour analyser leurs organes. Il affirme que seul un modèle vivant entier permet d'étudier l'évolution tumorale et les récidives.

Objectifs

Pour traiter leucémie et tumeurs solides, il est important de trouver de nouvelles façons de soigner les patients tout en minimisant les effets secondaires. Récemment, il a été développé un médicament spécifique des cellules qui prolifèrent rapidement (comme les cellules cancéreuses). Aujourd’hui, ce traitement est testé en essai clinique sur des patients atteints de leucémie, et nous souhaitons élargir l’utilisation de notre traitement à d’autres cancers agressifs, comme celui du poumon, du sein, du pancréas et le mélanome. Dans des expériences préliminaires de laboratoire, ces cellules cancéreuses sont tuées efficacement par le médicament. L’utilisation de la souris nous permet de confirmer l’efficacité du médicament dans un environnement physiologique et vivant avant de tester le produit en clinique, chez l'homme. Dans une seconde partie du projet, comme il est souvent difficile de traiter totalement le cancer avec un seul médicament, nous souhaitons combiner notre traitement avec d’autres agents couramment utilisés en cliniques aujourd’hui. Ces combinaisons de plusieurs thérapies sont de plus en plus utilisées en clinique pour augmenter l’efficacité de traitement, réduire le risque que le cancer se redéveloppe et surtout réduire les effets secondaires. Nous avons déjà testé ces combinaisons en laboratoire et avons obtenus de résultats prometteurs. Avant de pouvoir appliquer notre traitement chez les patients atteints de cancers, seul ou en combinaison, il est nécessaire de valider nos résultats sur des modèles animaux qui récapitulent fidèlement ce que l'on observe chez l’homme. Ce projet nous aidera à mieux comprendre comment le cancer peut développer une résistance, comment notre traitement interagit avec le corps humain et d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

Le processus de développement d’un nouveau traitement, de sa conception initiale jusqu’à son autorisation de mise sur le marché, peut nécessiter en moyenne entre 15 et 20 années. Il est donc impératif d’optimiser au maximum l’utilisation de chaque avancée thérapeutique. Ce projet permettra d’une part d’optimiser le développement de notre traitement en l’appliquant sur différents modèles de cancer agressifs, notamment sur un modèle de cancer de pancréas pour lequel seules la chirurgie et la chimiothérapie conventionnelle existent. D’autre part, ce projet apportera une meilleure compréhension de la résistance thérapeutique, et dans la récidive du cancer. Cette compréhension favorisera la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques, qui permettront de réduire la dose administrée de chaque traitement, et par conséquent réduire le coût, les effets indésirables, et surtout la résistance au traitement. En effet, ces bithérapies permettront d’offrir une alternative thérapeutique aux patients résistants à un agent, et donc cibler une plus large partie de la population. Ainsi, ce projet ouvrira de nouvelles perspectives dans le traitement des leucémies aiguës, de cancers solides, et offrira une alternative aux patients en quête de traitements plus efficaces et mieux tolérés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des greffes de différentes cellules cancéreuses pour développer la maladie, par voie sanguine ou sous cutanée. Avant et pendant chaque greffe, les souris sont endormies. Les responsables du projet suivront l’évolution de la maladie 2 fois par semaine. Pour une des procédures, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins au niveau de la joue pour surveiller l’évolution de la maladie. Ces prélèvements seront effectués sur des animaux endormies une fois par semaine au maximum, soit un total de 3 à 12 prélèvements totaux selon la procédure. Les animaux seront divisés en plusieurs groupes pour leur administrer différents traitements par voie sanguine, sous-cutanée ou par gavage. L’administration de traitements ne nécessite pas le recours à l’anesthesie. Selon les procédures, les différents traitements seront administrés par voie orale, par injection sous-cutanée ou par injection sanguine. Toutes interventions sur la souris (injections de cellules tumorales en sous cutanée, gavages, injection du traitement et prélèvements) effectuées par des membres qualifiés dureront 1 à 5 minutes maximum par souris. Le temps de developpement de la maladie (en sous cutanée ou par voie sanguine) est estimé à deux semaines. Au moins 2 fois par semaine, les responsables du projet observeront les animaux pour détecter tout inconfort ou signe de douleur.

Impact sur les animaux

Les transplantations de cellules, les prélèvements de sang, et les administrations de traitement par voie intraveineuse se feront sous anesthésies gazeuses, ce qui peut occasionner un stress de courte durée à l’induction et au réveil. Certains traitements sont administrés par voie orale avec une technique appelée gavage qui peut entrainer une gêne physique en cas d’administration quotidienne. Comme attendu dans ce projet, les greffes de cellules vont aboutir à un développement tumoral, qui, à un certain stade, peut occasionner une gêne pour se déplacer, un amaigrissement, une isolation, une perte d’activité.

Devenir

A l'issue des expérimentations, tous les animaux seront sacrifiés pour réaliser des analyses sur les organes et évaluer la présence éventuelle de cellules cancéreuses résiduelles.

Remplacement

Nous avons déjà effectué plusieurs tests de laboratoire (qui ne nécessitent pas l'utilisation d'animaux) qui ont confirmé l’efficacité antitumorale de notre anticorps seul et en combinaison avec d’autres médicaments. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier en profondeur l’évolution tumorale, les récidives, et la réponse de l’organisme au traitement. De plus, il est important d’évaluer consciencieusement les potentiels effets secondaires de notre traitement et s’assurer de la non-toxicité avant son application chez l’homme. Enfin, nous souhaitons étudier l’effet de notre traitement sur la survie des individus. Pour ces raisons, seul un modèle vivant entier pourra répondre entièrement à notre projet. La souris reste donc aujourd’hui le modèle le plus pertinent pour répondre à nos objectifs scientifiques.

Réduction

Grâce à des études déjà réalisées au sein de notre laboratoire et à des tests statistiques réalisés on sait que pour interpréter les résultats obtenus, il faut utiliser au moins 8 animaux par conditions. Ces calculs sont confirmés aussi par d’autres laboratoires, et sont également présents dans la littérature. En plus, nous utiliserons les mâles et les femelles pour généraliser la réponse au médicament chez les deux sexes.

Raffinement

Toutes les procédures seront soumises au respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés en groupe pour privilégier leurs interactions sociales, dans des cages propres et contrôlées, contenant des jouets. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et 2 fois par semaine par les responsables du projet. Les protocoles ont déjà été optimisés pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les injections et prélèvements dures 5 minutes et sont réalisés par des membres qualifiés, sur les animaux endormis permettant la réduction du stress et douleur. En cas de douleur qui peut se développer à cause de l’évolution du cancer, des anti-douleurs leur seront administrés. Un score de douleur sera établi 2 fois par semaine selon une grille très spécifique. En cas de non-réponse aux antidouleurs, les animaux seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est considérée aujourd’hui comme un modèle pertinent pour étudier et comprendre l’évolution du cancer et la réponse aux traitements observée chez l’homme, notamment du fait de la similarité biologique. Pour ce projet nous utiliserons des souris adultes (>6 semaines) pour refléter l'âge de développement de ces tumeurs chez l'homme.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées de paclitaxel, un anticancéreux, pour leur induire une neuropathie douloureuse, puis des injections d'une molécule candidate, et subissent des tests comportementaux d'allodynie tactile et thermique au froid. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une 'nuisance à part entière' mais 'indispensable' à l'étude, et prévoit de tuer tous les rats pour des prélèvements. Il affirme que ce type d'étude sur la douleur n'est pas encore remplaçable par des modèles in vitro.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite (CIPN) est un effet indésirable classique et dose limitant des anticancéreux neurotoxiques (sels de platine, taxanes, vinca alcaloïdes, bortézomib), qui touche environ 60% des patients, et altère profondément la qualité de vie des patients et dont la prise en charge thérapeutique reste très limitée. Aucun traitement préventif ne peut être recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée sur les douleurs associées. En conséquence, les oncologues sont fréquemment contraints de diminuer voire d’arrêter les anticancéreux neurotoxiques lors de l’apparition des premiers symptômes de CIPN. Des travaux récents ont montré l’intérêt d’une molécule, le CARBA1, pour améliorer l'action anticancéreuse du paclitaxel (taxane) et avec des propriétés antioxydantes laissant penser que le CARBA1 pourrait limiter la neurotoxicité du paclitaxel. Ainsi, l’objectif de ce projet sera d’évaluer l’effet préventif du CARBA1 sur la CIPN associé au paclitaxel sur un modèle animal (rat). Ces effets préventifs seront notamment mesurés par des tests comportementaux (allodynie tactile et thermique).

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier une nouvelle stratégie thérapeutique de prévention de la CIPN associée au paclitaxel. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des CIPN est très limitée (aucun traitement préventif et seule la duloxétine modérément recommandée sur les douleurs). L’objectif ultime sera de proposer un nouvel agent capable de prévenir la CIPN qui devra faire l’objet d’une preuve de concept dans le cadre d’une étude clinique impliquant la personne humaine.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections de paclitaxel ou de son véhicule associées à des injections de CARBA1 ou de son véhicule. Le nombre d’injections pour le paclitaxel sera de 4 (J0, J2, J4, et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) et de 6 pour le CARBA1 (J-2, J-1, J0, J2, J4, et J7) par voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à 3 semaines après la fin des injections : 1. Mesure de l'allodynie tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal (stabulation dans des portoirs (box) individuel pour 24 rats); 2. Mesure de l'allodynie thermique au froid : durée du test pour un animal 5 minutes (max).

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées de paclitaxel pourront être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux, mais ce phénomène est très limité voire absent avec les doses de paclitaxel utilisées (nb. Nous ne l’avons jamais observé avec ce modèle animal, mais cet effet est retrouvé plus fréquemment avec les autres anticancéreux neurotoxiques). Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations de paclitaxel, et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux, car l’altération de l’état général des animaux est un biais important à la pertinence des analyses conduites.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des 2 expérimentations afin d’effectuer des prélèvements.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie des CIPN, qui n'est-elle même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur (troubles nociceptifs neuropathiques), l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales sont injectées ou greffées par chirurgie dans la glande mammaire, puis une partie des animaux est irradiée sous anesthésie, le porteur reconnaissant des risques de nécrose, d'ulcération tumorale et d'érythèmes cutanés. Les tumeurs et organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit le microenvironnement tumoral et présente une protéine comme cible thérapeutique potentielle.

Objectifs

Le cancer, dont les cancers du sein et des voies aérodigestives supérieures, reste un problème majeur de santé publique. La radiothérapie est actuellement appliquée dans plus de 70% des traitements contre le cancer et fait partie de l’arsenal antitumoral incontournable. Cependant, la radiothérapie possède comme effets secondaires l’augmentation de l’immunosuppression du microenvironnement tumoral, en ciblant notamment un composant de ce microenvironnement, ce qui a pour conséquence de diminuer les chances de rémission complète chez les patients. Ce composant, une protéine de la matrice extracellulaire produite non seulement par les cellules cancéreuses mais également et majoritairement par des cellules fibroblastiques appelées FRC, joue un rôle primordial dans la genèse d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur favorisant la progression et la malignité des tumeurs. Il est suggéré que ce composant lorsqu’il est produit par les cellules FRC contrecarre la mort des cellules cancéreuses induite par la radiothérapie et empêche une rémission tumorale complète. La présente étude s’attachera à analyser dans des modèles d’expérimentation in vivo l’impact de cette protéine, présente dans le microenvironnement tumoral, sur le traitement par radiothérapie de tumeurs mammaires et des voies aérodigestives supérieures et à définir l’effet de la protéine produite par les cellules cancéreuses par rapport à celui de la protéine produite par les cellules FRC sur le développement d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur. Il est attendu qu’en diminuant l’expression de cette protéine, et donc son effet immunosuppresseur, on améliore l’efficacité de la radiothérapie et ainsi qu’on puisse atteindre une rémission complète de la tumeur.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de cette étude est d'évaluer et caractériser, grâce à des modèles d'expérimentation in vivo, l’impact d'une protéine cible fortement produite dans les tissus tumoraux, et du traitement par radiothérapie sur le développement des cancers mammaires et des carcinomes de la tête et du cou. Le but in fine étant de déterminer si cette protéine pourrait être une cible thérapeutique potentielle en santé humaine. En effet, nous prévoyons qu’une réduction ou absence de cette protéine dans les tissus tumoraux entraînera une diminution de l’aspect immunosuppressif du tissu tumoral et de ce fait améliore la rémission des tumeurs induite par le traitement de radiothérapie.

Procédures

Un groupe d’animaux subira une injection unique en sous-cutanée et sous anesthésie générale pendant 10 minutes maximum, de cellules au niveau de la nuque. Un second groupe subira une greffe par chirurgie sous anesthésie générale pendant 15 minutes maximum, de cellules au niveau de la glande mammaire. Une partie de ces animaux subiront également une irradiation soit à faible dose soit à forte dose (5 minutes maximum) sous anesthésie générale d’une durée maximum de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables que nous pourrions observer sur nos modèles murins de tumeurs mammaires et de tumeurs des voies aérodigestives supérieures (VADS) sont : inflammation, nécrose ou ulcération tumorale, problème d’alimentation ou de déplacement dû au développement de tumeur, infection ou mauvaise cicatrisation post-chirurgie, perte de poids, variation de la fréquence respiratoire. L’irradiation peut induire des érythèmes cutanés et des nécroses suite à l’évolution de la croissance tumorale post-traitement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des différentes procédures pour effectuer un prélèvement et une analyse des tumeurs et de différents organes.

Remplacement

Le modèle animal est nécessaire car il n'existe pas de modèle in vitro pour reproduire l’ensemble des mécanismes impliqués dans la tumeur, comme l'environnement tumoral, la réaction du système immunitaire, les mécanismes physiologiques impliqués et l'impact sur la survie de l'animal, entre autres exemples. Un des objectifs de notre étude est de développer et valider un modèle 3D in vitro et le modèle animal est indispensable à l’obtention d’échantillons tumoraux issus d’animaux irradiés et non irradiés qui serviront de base à la caractérisation et à la validation de modèles tumoraux 3D in vitro en cours de développement dans le laboratoire..

Réduction

Un outil de calcul de la taille des échantillons biologiques a été utilisé afin de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire, mais néanmoins suffisant, pour pouvoir atteindre les objectifs et réaliser une analyse statistique pertinente.

Raffinement

Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés et maintenus en groupes sociaux dans des cages agrémentées avec de la litière, de maisonnette et rouleaux de coton (nidification), de frisures de papier kraft et tunnel (cachette) et de bâtons à ronger pour diminuer leur stress et favoriser leur activité. Les protocoles expérimentaux seront réalisés par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement une semaine avant de démarrer les procédures expérimentales. L’implantation des cellules tumorales et l’irradiation seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien des souris sur un tapis chauffant et avec du gel ophtalmique sur leurs yeux pour les protéger. Une analgésie pré- et post-opératoire ainsi qu’une analgésie locale seront effectuées lors des greffes par chirurgie. Pour les trajets entre le site d’hébergement et le site d’irradiation (effectués en voiture, < 5 min), les souris seront mises dans des boites de transport dédiées avec un filtre sanitaire, de la nourriture et de l’eau gélifiée, de la litière, de la frisure de papier kraft et des rouleaux de coton. Des chaufferettes seront ajoutées sous les boites pour éviter tout risque d’hypothermie des souris. Des points limites ont également été établis pour éviter toute souffrance animale. Les souris seront pesées et leur état général évalué tous les jours durant les trois premiers jours post-greffe (ou jusqu’à cicatrisation complète) et post-irradiation puis au minimum 3 fois par semaine. Les données issues de ce suivi individuel seront enregistrées dans une grille d’évaluation de la souffrance/points limites permettant la surveillance des animaux. Tout signe anormal (points limites : perte de poids excessive, comportement ou apparence/état de l’animal anormal, respiration anormale, etc.) sera signalé aux responsables. De plus, si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition de douleurs, une injection d’un analgésique sera effectuée. La surveillance et les soins des animaux avant l’intervention seront assurés par une équipe qualifiée de zootechniciens, vétérinaires, techniciens et chercheurs. La structure en charge du bien-être animal accompagnera le projet dans sa mise en œuvre, avec les conseils du vétérinaire désigné.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle murin car celui-ci possède de multiples avantages dont celui d'être un modèle animal déjà validé dans le laboratoire depuis de nombreuses années. De plus, la souris récapitule de manière très similaire à l’homme l'ensemble des mécanismes moléculaires et des paramètres impliqués dans le développement tumoral : microenvironnement, réaction du système immunitaire, dissémination des métastases, mécanismes physiologiques impliqués et/ou associés, impact sur la survie. Les souris seront utilisées adultes à partir de 8 semaines d'âge minimum, ceci afin de mimer la pathologie chez l’homme adulte. L’utilisation de souris plus jeune n’est pas pertinente car les mécanismes physiologiques impliqués seraient potentiellement différents, le jeune individu étant encore en cours de développement.

114 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent un anticorps et une sonde radioactive par voie intraveineuse, suivis de séances d'imagerie sous anesthésie. Le projet teste une radiothérapie interne visant à irradier sélectivement la tumeur. Le porteur fixe des points limites, une perte de poids de plus de 20 % ou une tumeur de plus de 1 500 mm3 déclenchant la mise à mort.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est d’évaluer une approche thérapeutique du cancer colorectal. Cette approche repose sur le principe de la radiothérapie interne, visant à sélectivement irradier les tumeurs afin de les détruire. Une stratégie consiste à injecter au patient un anticorps ciblant la tumeur, et sur lequel a été greffé un atome radioactif dont l’énergie du rayonnement est suffisante pour causer des dommages importants aux cellules cancéreuses. Cependant, cette stratégie peut engendrer une toxicité au niveau d’autres tissus de l’organisme, car les anticorps restent longtemps dans la circulation sanguine. Aussi, l’approche thérapeutique que nous souhaitons évaluer ici consiste à séparer l’injection de l’anticorps (ciblage de la tumeur) de celle de la radioactivité (action thérapeutique). Dans ce contexte, l’anticorps est dans un premier temps administré et va se fixer au niveau de la tumeur (préciblage de la tumeur). Dans un second temps, une sonde radioactive est administrée et va spécifiquement reconnaître l’anticorps fixé sur la tumeur et ainsi, délivrer son énergie à cette dernière (action radiothérapeutique). Cela permet d’irradier sélectivement les tumeurs tout en limitant la toxicité périphérique. Malgré les excellents résultats observés au niveau préclinique, il n’existe à ce jour aucun essai clinique de cette approche en raison d’une ingénierie difficile. Pour remédier à ces verrous scientifiques, nous proposons d’évaluer de nouveaux outils (optimisation des temps entre l’injection de l’anticorps et l’injection de la radioactivité et amélioration de la reconnaissance entre l’anticorps et la sonde radioactive grâce à la synthèse de nouvelles molécules) dans un modèle préclinique de cancer colorectal.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ces travaux nous permettra d’évaluer l’intérêt de l’optimisation d’une approche par radiothérapie interne dans la prise en charge des cancers colorectaux avec pour objectif à plus long terme d’améliorer la prise en charge clinique de cette pathologie, en augmentant l’eefficacité de la radiothérapie. Par ailleurs, cette approche sera extrapolable à d’autres type de cancer.

Procédures

Les animaux subiront deux types d'intervention: - inoculation de cellules tumorales par voie sous-cutanée, sous anesthésie générale. Chaque souris ne subira cette intervention qu'une fois. La croissance tumorale sera alors suivie, avec une mesure du volume tumoral 2 fois par semaines pendant 3 semaines, toujours sous anesthésie générale afin de réduire l'angoisse de la manipulation. - injection intraveineuse sur animal vigile placé dans un système de contention: au maximum, une souris subira cette intervention 2 fois, 1 fois pour l'injection de l'anticorps, 1 seconde pour l'injection de la sonde radioactive. Ces 2 injections seront espacées d'au moins 24 heures. Ces injections seront réalisées par du personnel compétent et ne dureront que quelques minutes. Suite à l'injection de molécules radioactives, les animaux seront placés sous anesthésie générale pour l'évaluation de la distribution de ces molécules par imagerie. L'acquisition des images sous anesthésie durera au maximum 45 minutes et sera répétée au maximum 3 fois, à 24 heures d'intervalle, pour l'évaluation de la pharmacocinétique des anticorps.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles sont le stress dû aux manipulations et la douleur engendrée par les procédures, principalement les injections (réduites à quelques dizaines de secondes car réalisées par un expérimentateur expert). Aucune nuisance liée à l’imagerie in vivo ou aux anesthésies n’est attendue. Pour les animaux porteurs de tumeur, les nuisances peuvent être relatives à une gêne fonctionnelle liée à la présence de la tumeur ou encore une nécrose précoce de la tumeur. Dans tous les cas, un suivi régulier des animaux permettra de réagir rapidement en cas d’apparition d’une souffrance pour l’animal. L’arbre décisionnel viendra orienter les actions à mener jusqu’à l’atteinte de points limites. Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (hébergement en groupe, portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne).

Devenir

Tous les animaux seront porteurs de tumeurs sous-cutanées et ne pourront être réutilisés. Aussi, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure

Remplacement

Plusieurs sondes radioactives seront évaluées au cours de ce projet. Ces sondes ont été testées dans un premier temps in vitro afin de sélectionner les plus adaptées. La culture cellulaire ne permet pas de mimer la distribution et le métabolisme des molécules étudiées. A ce stade, le passage sur un modèle préclinique est donc inévitable pour juger de façon optimale l’effet des molécules étudiées.

Réduction

Les molécules évaluées ont dans un premier temps été caractérisées et sélectionnées par des méthodes in vitro afin de réduire le nombre de groupe d’animaux requis pour le projet. Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en étant certain d’obtenir le matériel tumoral suffisant pour réaliser des études de caractérisation du modèle et atteindre une validité statistique. Sur ce plan, nous utiliserons des groupes de 6 souris.

Raffinement

Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (hébergement en groupe, portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). Lors des procédures expérimentales (inoculation des cellules et imagerie), les souris seront placées sous anesthésie générale gazeuse afin d’éliminer toute douleur potentielle et de réduire l’angoisse générée par la manipulation. De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliqués si besoin. Une surveillance régulière des animaux consistera à observer et évaluer la présence de certains critères signes d’une dégradation de l’état général : prostration, œil clos, diarrhées, nécrose, infection au niveau de la tumeur…. Le poids sera régulièrement suivi ainsi que le volume tumoral. Une perte de poids supérieure à 20 % du poids maximal ainsi qu’un volume tumoral supérieur à 1500 mm3 sont deux signes cliniques imposant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale en imagerie préclinique comme en cancérologie. En ce qui concerne le modèle tumoral, les études préliminaires réalisées ont pu mettre en évidence une croissance plus homogène chez les souris balb/c nude, décrite dans la littérature pour ce modèle. Les animaux utilisés seront des souris adultes de 5 semaines, pesant environ 20 g ayant atteint leur maturité sexuelle afin d'éviter l'influence des variations hormonales liée à la puberté. Le développement des xénogreffes que nous comptons utiliser est relativement rapide (environ 3 semaines), ce qui implique que les animaux seront inclus dans les procédures d’imagerie à l’âge de 7-8 semaines (20-25g).

88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un régime riche en graisses et en sucres pendant douze semaines, avec des gavages de sucre et d'huile, des prélèvements de sang répétés et une prise de poids réduisant leur mobilité, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le projet cherche à montrer un effet protecteur de lipides végétaux contre l'obésité. Le porteur présente le résultat comme une "preuve de concept" pour de futures études chez l'humain.

Objectifs

La transition nutritionnelle vers des systèmes alimentaires sains et plus durables est en faveur de la végétalisation des régimes alimentaires. Il est devenu important de mieux comprendre le rôle et les mécanismes d’action des nutriments d’origine végétale d’un point de vue de la santé métabolique. Si les protéines végétales ont suscité un vif intérêt ces dernières années, certains lipides spécifiques des végétaux verts restent encore méconnus et peu exploités. Leur absorption et métabolisme in vivo sont jusqu’ici peu décrits. Des travaux préliminaires suggèrent néanmoins des effets anti-inflammatoires, des effets de réduction des lipides sanguins circulants, ainsi qu’une potentielle utilisation par les bactéries intestinales. Les lipides végétaux naturellement présents dans différents aliments végétaux pourraient donc constituer de potentiels prébiotiques (susbtrats pour les bactéries intestinales) avec des bénéfices importants pour la santé, et avoir ainsi un rôle à jouer dans le cadre de stratégies nutritionnelles préventives dans la lutte contre l’obésité. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mettre en évidence les potentiels effets protecteurs des lipides végétaux sur la mise en place de l’obésité chez la souris. Pour cela, nous étudierons leurs effets sur : le métabolisme des lipides et des glucides, la santé intestinale (absorption, fonction barrière, bactéries) et l’inflammation.

Bénéfices attendus

Cette étude animale devrait permettre de montrer pour la première fois que la consommation de certains lipides végétaux peut éviter une altération du métabolisme, un déséquilibre des bactéries intestinales et une augmentation de l’inflammation. Les résultats de cette approche pourront alors constituer une preuve de concept pour de futures études cliniques d’intervention nutritionnelle chez l’Homme, notamment chez des personnes souffrant d’obésité.

Procédures

- Alimentation riche en graisses et en sucres pour 3 groupes de 12 souris pendant 12 semaines ; alimentation d’entretien pour 1 groupe contrôle de 8 souris pendant 12 semaines. - Mesure de la composition corporelle sur toutes les souris vigiles, contention dans un tube, moins de 2 minutes par souris, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Collecte de crottes de toutes les souris vigiles, 30 minutes dans une cage individuelle, deux fois par souris à 12 semaines d’écart. - Mise à jeun (6h ou 12h) des animaux avant les gavages de toutes les souris, deux fois à 1 semaine d’écart. - Un gavage avec du sucre pour tester le métabolisme des glucides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage de sucre/souris sur les 12 semaines d’étude). - Un gavage avec de l’huile pour tester le métabolisme des lipides sur toutes les souris vigiles : la contention et le gavage durent moins de 1 min par souris (1 gavage d’huile/souris sur les 12 semaines d’étude). - Les deux gavages seront espacés d’une semaine. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec du sucre (15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) sur toutes les souris vigiles lors de la 10ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun quelques secondes par souris. - Prélèvements de sang à la queue avant (T0) et suite au gavage avec de l’huile (1, 2 et 4heures) sur toutes les souris vigiles lors de la 11ème semaine d’étude. Ces prélèvements durent chacun environ 30 secondes par souris. - Une injection dans l’abdomen des anesthésiques (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : quelques secondes. - Un prélèvement de sang sous anesthésie profonde sur toutes les souris (1 seule fois durant les 12 semaines d’étude) ; durée : 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une prise de poids est attendue chez les souris suivant une alimentation riche en graisses et en sucres. Cette prise de poids pourra entraîner une diminution de la mobilité des animaux concernés. Un isolement court (30 min) sera nécessaire pour la récupération des fécès et pourra induire un léger stress aux animaux. La mise à jeun (12h ou 6h avant gavage d’huile ou sucre) peut également induire un stress chez les animaux. Lors des deux gavages, léger stress dû à la contention de l’animal et gêne/irritation potentielle de l’œsophage liée au passage de la sonde. Les prélèvements sanguins réalisés après les gavages pourront induire un stress chez les animaux. Pour la mesure de composition corporelle, les souris sont introduites dans un tube cylindrique (espace réduit) pendant moins de 2 minutes, ce qui peut induire un léger stress aux animaux. L’injection dans l’abdomen des anesthésiants (avant le prélèvement terminal) peut induire une douleur transitoire.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier les effets des lipides végétaux sur le métabolisme de différents organes et l’inter-communication entre tous ces organes. Il est à l’heure actuelle impossible de reproduire dans des modèles de culture cellulaire les mécanismes métaboliques et inflammatoires en lien avec la modification des bactéries intestinales, et l’implication de toutes les voies de régulation au centre de la communication entre les différents organes. Par conséquent, le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à notre question scientifique. De plus, une étude clinique chez l’Homme ne peut pas être envisagée directement à ce stade car les comités d’évaluation des études cliniques demandent des résultats préliminiares précliniques (à l’échelle d’un organisme entier) pour démarrer une étude chez l’Homme.

Réduction

A notre connaissance, aucune étude sur la souris n’a encore été réalisée pour évaluer les effets de lipides spécifiques des végétaux verts dans un contexte d’obésité induit par une alimentation riche en graisses et en sucres. Nous ne disposons donc pas de données de la littérature pour réaliser un calcul d’effectif. S’agissant d’une étude pilote et exploratoire, une dizaine de souris par groupe semble nécessaire et suffisante (8 souris pour le groupe contrôle et 12 souris pour chacun des groupes avec alimentation riche en graisses et en sucres). De plus, l’étude sera lancée tout d’abord sur des souris mâles, et si les résultats sont significatifs chez les mâles alors la même étude sera réalisée sur des souris femelles (n=44) pour extrapoler ou non les résultats aux deux sexes

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en place pour veiller au bien-être des animaux et réduire au minimum toutes les nuisances potentielles : 1/ Ajout des lipides végétaux à l’alimentation des animaux pour éviter manipulation et contention quotidiennes des souris (contrairement à une supplémentation par gavage quotidien). 2/ Avoir le même expérimentateur (maximum 2) tout au long de l’étude et habituer les animaux à sa/leur présence (odeurs, voix, etc) pour diminuer leur stress face aux humains. 3/ Avoir du personnel expérimenté et formé aux gestes techniques des différentes procédures (tests métaboliques, mise à mort), et à l’observation de comportements « normaux » des animaux. 4/ Surveillance étroite des animaux 2 fois par semaine (apparence physique, comportement, poids, prise alimentaire), 5/concernant les gavages : - l’administration par voie orale est une méthode moins invasive que l’injection par voie intraveineuse ; - pour limiter la potentielle irritation de l’œsophage des animaux lors des gavages une sonde de gavage coudée au bout arrondi sera utilisée par un personnel expérimenté - les volumes de gavage seront réduits au minimum pour éviter tout incomfort aux animaux. - une surveillance étroite du comportement des animaux sera réalisée suite aux gavages, - les gavages seront espacés d’une semaine afin de réduire le stress des animaux, 6/ Les contentions prévues lors des pesées, gavages ou lors de la mesure de la composition corporelle seront toujours effectuées de manière brève par un expérimentateur formé, 7/ En fin d’étude, les animaux seront anesthésiés pour éviter toute douleur au moment du dernier prélèvement sanguin, 8/ Mise en place de points limites précoces permettant, si l’un est atteint, d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

En raison de la grande similitude de régulation du métabolisme entre la souris et l’Homme, la souris est un modèle de choix pour étudier et caractériser les effets santé des lipides végétaux en situation d’obésité. Les souris débuteront l'étude à 8 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Le passage à une alimentation riche en graisses et en sucres à cet âge est très bien toléré par les animaux, et les perturbations du métabolisme attendues les semaines suivantes sont bien décrites et maîtrisées.