Oncologie

7 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que 3 630 d'entre elles seront mises à mort dès le départ parce que leur génotype ne convient pas, les autres subissant un régime gras de douze semaines, des jeûnes, de nombreuses injections et prélèvements sanguins, une chirurgie abdominale et une perfusion intracardiaque. L'objectif déclaré est d'étudier le dialogue entre les macrophages et les nerfs des îlots du pancréas, en conditions normales et de diabète. Il affirme que ce dialogue entre organes ne peut s'étudier que sur des modèles animaux.

Objectifs

Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation de la glycémie. Ces micro-organes ont pour fonction de produire les hormones permettant de réguler la glycémie. Les macrophages jouent une rôle important dans la fonction des ilots. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, leur rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. En particulier, l’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux n’a jamais été étudié. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes d’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces interactions dans la fonction des ilots en condition normal, ainsi que dans trois contextes de stress glycémique: le jeun, l’altération des ilots et le diabète, une maladie caractérisée par une dérégulation de la glycémie. Ce projet se déroulera dans deux établissement utilisateurs.

Bénéfices attendus

Il est aujourd'hui admis que les macrophages jouent un rôle primordial dans la régulation de la glycémie par le gras et le foie. Les macrophages résidant dans les ilots pancréatiques n'ont eux été décrits que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'ils restent encore largement ignorés. L'interaction entre les macrophages et le système nerveux a été montré comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant de part la difficulté d'étudier les macrophages des ilots pancréatiques, cette interaction n'est pas encore décrit dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les interaction macrophage/réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans le stress glycémique.

Procédures

Etablissement utilisateur 1: 1 biopsie de queue, 1 prélèvement de sang à la joue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 jeun (6h ou 16h) , 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésies gazeuses (10min), 1 perfusion intra-cardiaque. Etablissement utilisateur 2: 1 anesthésie gazeuse (2h), 1 chirurgie abdominale (2h).

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. -Chirurgie abdominale : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Prélèvement de sang à la joue : douleur légère. -Biopsie de queue : douleur modérée.

Devenir

Procédure 1 : 3630 souris seront mises à mort car leur génotype ne sera pas utilisable. 2280 souris auront le génpotype requis et seront utlisées dans les procédures 2 à 5. Procédure 2 à 5 : Toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier l'interaction des macrophages avec le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de stress glycémique, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ainsi que des études pilotes avec des petits nombres d’animaux ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.

1 800 poissons sauvages, des truites, blageons et chabots, vont être capturés et utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés vivants. Chaque individu est anesthésié, mesuré, pesé, puis incisé au ventre pour l'implantation manuelle d'un transpondeur, en restant hors de l'eau de trente secondes à une minute. L'objectif déclaré est d'évaluer si une passe à poissons aménagée sur un cours d'eau alpin laisse remonter ces espèces vers leurs zones de reproduction. Le porteur affirme que l'étude comportementale in situ est "indispensable" et sans alternative, et prévoit une mortalité post-opératoire faible ainsi que des pertes de marqueurs.

Objectifs

L’objectif principal est d’évaluer la franchissabilité d’une passe à poissons (rampe à plots) aménagée pour rétablir la migration piscicole dans un cours d’eau alpin. La méthodologie proposée implique l’implantation de transpondeur passifs dans des poissons sauvages. Les espèces cibles sont la truite et deux espèces accompagnatrices (blageon et chabot). Le suivi sera réalisé sur deux années minimum pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales. Si le quota d’animaux marqué n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante. Le projet doit permettre d’évaluer scientifiquement le fonctionnement de cet ouvrage piscicole.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en lumière la « transparence » de l’ouvrage à la migration des truites, et des petites espèces accompagnatrices (blageon et chabot), c’est à dire l’absence de sélectivité et de retard à la migration. Dans le cas de blocage avéré des individus, des aménagements seront envisagés pour restaurer encore davantage la migration piscicole et permettre à ces espèces de rejoindre des habitats piscicoles favorables à l’amont, notamment pour la reproduction.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 1800 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux. Des précautions seront prises à chaque étape pour limiter le stress et la douleur des animaux. La cicatrisation après implantation des PIT tags est généralement très bonne, tant sur des lots conservés en pisciculture qu'en milieu naturel.

Devenir

Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement des dispositifs de montaison/dévalaison doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées, dans le cas présent la truite de rivière, le blageon et le chabot. Il est nécessaire de capturer des animaux sauvages en rivière, de les marquer individuellement et de les relâcher vivants à l’aval de l’ouvrage étudié. Ensuite, les déplacements sont évalués en utilisant des dispositifs de détection fixes. A noter également que peu de données existent quant aux comportements et capacité de montaison du blageon et du chabot. On ne peut donc pas se référer à la littérature ni avoir recours à des avis d’expert pour évaluer une franchissabilité théorique : une expérimentation in situ reste indispensable.

Réduction

Le projet est prévu sur une durée de 3 ans, avec captures et marquages les deux premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). Les effectifs prévus par espèce sont un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des « patterns » comportementaux, et évaluer in fine la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du cours d’eau et à la densité de population en place. Chez la truite, il peut être attendu un taux de montaison de 10 à 30%, taux moyen constaté dans les différentes études réalisées. Pour le blageon et le chabot, il est difficile de préciser un taux de montaison, ces espèces étant encore trop rarement étudiées. Cet effectif théorique attendu doit être nuancé par plusieurs facteurs : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas (ou très peu,

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac de 50L oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. Le bac d'anesthésie sera renouvelé toutes les 20 minutes en moyennes ou plus souvent si le temps d’anesthésie augmente, ceci pour éviter que la température ne varie de plus de 2°C et soit toujours 120 mm à l’aide de tags de 23 mm par exemple). Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés en bon état sanitaire (absence de blessure, de parasites, d’infections visibles) seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un bac oxygéné et refroidi, avant transfert dans un vivier placé dans la rivière.

Choix des espèces

Les espèces cibles sont la truite commune (Salmo trutta), le blageon (Telestes souffia) et le chabot (Cottus gobio). La truite est l’espèce caractéristique de la rivière étudiée et à fort enjeu halieutique est la plus susceptible de migrer sur des longues distances notamment en période de pré-reproduction, et donc d'être le plus fortement impactée par les obstacles à la migration. Le blageon et le chabot sont des espèces accompagnatrices de la truite, régulièrement capturées en pêche de sondage au niveau du site d’étude. Ces espèces sont moins bonnes nageuses que la truite et leur étude permet de nuancer l’évaluation de l’efficacité de la rampe à plots. Autrement dit, le franchissement du seuil par ces espèces confirmera le bon fonctionnement du dispositif de franchissement. Pour les truites, seuls les individus d’un an et plus dont la longueur totale excédera 120 mm seront marqués, à l’aide de PIT tags 23 mm. Cette taille minimale assure un ratio « poids du l’émetteur / poids du poisson » inférieur à 2%, ce qui est en adéquation avec les préconisations tirées de la littérature scientifique. Les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière. Pour les blageons et les chabots, les individus seront marqués avec des tags de 13 mm, la taille minimum de marquage étant alors calée à 80 mm. Pour ces espèces, cette taille correspond à des animaux de 2 ans et plus, considérés comme adultes et reproducteurs. Tout comme la truite, les individus plus petits que les tailles minimales indiquées seront relâchés sans être marqués, après une phase de réveil dans un vivier placé dans la rivière.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime riche en graisse pour reproduire une obésité, elles subissent des mises à jeun de quatorze heures, dix-sept contentions pour quatorze prélèvements sanguins en quatre jours, des administrations orales et des injections, avant un prélèvement de sang et d'organes terminal. Le porteur décrit comme seuls effets attendus le stress lié à l'identification, à l'anesthésie, à la contention et aux prélèvements. Il revendique l'identification des cellules intestinales de l'action de l'insuline comme "essentiel" pour concevoir des stratégies thérapeutiques, retombée formulée au futur.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre l'implication de l'intestin dans le déclenchement des désordres métaboliques associés à l'obésité, grâce à l'utilisation de divers modèles de souris soumises à un régime riche en graisse afin de mimer l'obésité nutritionnelle chez l'Homme. L’intestin, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote, assure entre autres, un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Cette altération de la barrière intestinale a été proposée comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité, cet état inflammatoire favorisant la prise de poids et certains désordres métaboliques associés. L’insuline contrôlant la fonction barrière de l'intestin chez la souris, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action intestinale de l’insuline favorise ou accélère la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, hyperglycémie) chez des souris soumises à un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre l'implication de l'intestin dans le déclenchement des désordres métaboliques associés à l'obésité. Nous espérons montrer que le dévéloppement d'un diabète (perte d'action de l'insuline) entraine une détérioration de la fonction barrière de l'intestin qui favorise ou accélère la prise de poids et l'augmentation de la glycémie. Notre projet identifiera les cellules intestinales impliquées dans l'action de l'insuline, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Identification ( 1 contention de 30 secondes pour 1 prélèvement ), Sur animaux vigiles : 1 mise a jeun de 14h, 1 mise à jeun de 4h, 17 contentions de 30 secondes pour 14 prélèvements de sang (en 4 jours), 1 administration orale de 45 secondes de produit et 2 injections de 45 secondes de produit. Sur animaux anesthésiés : un prélèvement sanguin (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Il y a un stress lors de l'identification, de l’anesthésie, de la contention, des prélèvements sanguins et des injections.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but de mimer certaines caractéristiques de pathologies métaboliques et inflammatoires (obésité/diabète). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique in vitro qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée sous régime et les tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés et l’application des points limites établis.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines à chaque début de procédure. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des jeûnes répétés, de nombreuses contentions pour gavages et injections, l'implantation d'une pompe sous la peau et, pour certaines, une infection intestinale provoquant perte de poids, léthargie et saignements rectaux, avant le prélèvement du sang et des organes. L'objectif est de comprendre le rôle d'un facteur du glucose dans la perméabilité de l'intestin liée au diabète. Le porteur affirme que ces dérégulations complexes ne peuvent être résolues par des cultures in vitro, malgré des travaux préalables sur organoïdes.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) un rôle endocrine et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2, les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action d’un facteur qui médie les effets du glucose, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice potentiel de ce projet serait de mieux comprendre la fonction d'un facteur relayant habituellement les effets du glucose dans l'intestin. Il permettrait de notamament de comprendre si son blocage pourrait suffir à renforcer la barrière formée par l'intestin et ainsi empêcher l'augmentation de la perméabilité intestinale en cas d'hyperglycémie, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Identification (1 contention de 30 secondes) Sur animaux vigiles : 20 animaux (2 mises à jeun: une de 5h et une de 14h, 11 contentions de 30 secondes pour 6 administrations orales de produit, 3 prélèvements de sang et 2 injections de produit; 45 secondes par gavage ou injection; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), 20 animaux (1 mises a jeun de 14h, 10 contentions de 45 secondes pour 6 administrations orales de produit, 3 prélèvements de sang et 2 à 6 injections de produit; 45 secondes par gavage ou injection; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), 80 animaux (1 mise a jeun de 14h, 2 mises à jeun de 4h, 10 contentions de 45 secondes pour 8 administrations orales de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit; 45 secondes par gavage ou injection; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), 120 animaux (2 mises a jeun: une de 4h et une de 14h, 8 contentions de 45 secondes pour 6 administrations orales de produit, 1 prélèvement de sang et 1 injection de produit; 45 secondes par gavage ou injection; 1minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal); Sur animaux anesthésiés : 20 animaux (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique (20min par souris) et un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)), 220 animaux (un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)).

Impact sur les animaux

Aucun des modèles murins ne présente de phénotype dommageable à l’état basal. Il y a un stress lors de l’anesthésie, de la contention, des injections et des gavages. Concernant les modèles d’infection par un pathogène intestinal, l’apparition de signes généraux de souffrances (tels que poils ébouriffés ou hérissés, perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement, diarrhées et saignements rectaux) est envisageable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser les conséquences intestinales de la perte d’action du glucose à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas au glucose. Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but de mimer certaines caractéristiques de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser les conséquences intestinales de la perte d’action du glucose à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas au glucose.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. De plus, l’application des points limites établis pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

20 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une tumeur colorectale humaine greffée sous la peau, elles reçoivent un peptide radiomarqué au fluor-18 puis passent en imagerie sous anesthésie, avant une ponction cardiaque terminale. L'objectif est d'évaluer la distribution de ce traceur pour le diagnostic du cancer du côlon. Le porteur affirme que les résultats in vitro sont insuffisants et qu'un modèle animal porteur de tumeur est "indispensable".

Objectifs

On estime, en 2018, à plus de 43 000 le nombre de nouveaux cas de cancer colorectal en France. Il s'agit du troisième cancer le plus fréquent et du deuxième cancer en termes de mortalité, avec plus de 17 000 décès par an en 2018. Le cancer du côlon est guérissable dans plus de 90% des cas lorsqu'il est diagnostiqué tôt. Ainsi, le diagnostic précoce de ces cancers est un enjeu majeur afin d'établir un traitement le plus tôt possible et par conséquent avoir un impact direct sur la survie du patient. Même s'il existe des tests biologiques de plus en plus performants, l'imagerie médicale, si elle est optimisée, reste un outil performant et quasi non invasif pour la détection précoce de ces cancers. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés au récepteur de la neurotensine qui est exprimé au niveau du cancer du côlon (lignée HT 29). Aujourd’hui, il n’existe pas de médicament radiopharmaceutique ciblant le récepteur de la neurotensine utilisé en routine. Dans ce projet préclinique, 1 peptide radiomarqué au fluor-18 sera étudié sur 20 souris porteuses de tumeurs du colon (lignée HT-29).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une avancée en recherche préclinique sur la thématique des radiothéranostiques (diagnostiques et thérapeutiques). Si cet analogue de la neurotensine donne de bons résultats in vivo en imagerie PET, nous pourrons envisager une étude thérapeutique plus poussée (TRT : Targeted Radiotherapy) en utilisant ce même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique tel que le Lutétium-177.

Procédures

Les différentes interventions sur les 20 souris Balb/c nude sont les suivantes : - 1 xénogreffe sous-cutanée de cellules tumorales (cancer colorectal) sur le flanc droit (5 min) - 2 Injections intraveineuses au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse pour les 20 souris (5 min) - 2 imageries de 20 min sous anesthésie gazeuse - 1 ponction cardiaque terminale sous anesthésie gazeuse 3% (5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau du flanc droit pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies pour les imageries ([18F]FDG et du radiopeptide étudié) peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 20 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue de la neurotensine radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur à la neurotensine est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique par le peptide radiomarqué.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. Pour l'étude de l'analogue de la neurotensine radiomarqué avec un radioisotope dédié au diagnostic PET, il est nécessaire de visualiser la biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs à ce neuropeptide. Pour cette étude, un modèle murin présentant une xénogreffe sous-cutanée d'une lignée de cancer humain du colon sera utilisé. La présence du récepteur à la neurotensine sur cette lignée a été validée in vitro. La saturation de tous les récepteurs cibles par la neurotensine froide injectée en large excès (groupe dit de "blocking") permet une non fixation du peptide radioactif. Pour cette étude de validation de la biodistribution du radiopeptide, un t-test sera réalisé avec un nombre minimum de 10 souris xénogreffées par condition. Ce nombre permet de prendre en compte une pousse tumorale hétérogène. Ainsi, 10 souris seront injectées avec le radiopeptide seul et un groupe dit "blocking" incluant 10 souris injectées avec le radiopeptide + un large excès de neurotensine "froide".

Raffinement

Les souris étant immunodéprimées, celles-ci sont logées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes à l’intérieur des salles de stabulation de l’animalerie de recherche agréée où l’ambiance est parfaitement contrôlée (hygrométrie, température, ventilation, bruit). De plus les cages sont équipées d’enrichissement pour limiter le stress. Les souris immunodéprimées sont hébergées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes (SOPF). Une limitation du nombre de souris par cage est également requise. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur. Si un des points limites est atteint l'animal sera sorti de l'étude et la décision sera prise par le vétérinaire soit de soigner l'animal soit de l'euthanasier par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la xénogreffe sous-cutanée de tumeur humaine. Des souris femelles seront utilisées pour cette étude car moins agressives que les mâles (moins de risques de blessures au niveau de la tumeur). Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les études seront initiées à 10 semaines de développement. L’induction des tumeurs se fera à 10 semaines. A ce stade de développement, la souris est une jeune adulte. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes. Lorsque les tumeurs atteindront un volume minimum de 150 mm3, l'étude de biodistribution pourra être initiée.

1432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen, dont un agent pro-inflammatoire qui peut faire perdre 10 à 15 % du poids, subissent un régime obésogène et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline par incisions répétées de la queue, avant un prélèvement de sang terminal. L'objectif est de comprendre comment les hormones thyroïdiennes limitent l'inflammation cérébrale via la microglie et freinent l'obésité. Le porteur renvoie le bénéfice, une "nouvelle possibilité de lutte contre l'obésité", au conditionnel et conclut qu'aucun modèle in vitro ne remplace la souris pour ces échanges entre organes.

Objectifs

L’obésité est un problème de santé publique mondiale. Trouver des mécanismes capables de limiter la prise de poids en réponse à des régimes trop gras est nécessaire. Les hormones thyroïdiennes ont cette propriété mais ne peuvent pas être utilisées en tant que telles car elles provoquent aussi des effets indésirables. Il est donc nécessaire de comprendre comment elles peuvent avoir cette action. L’inflammation est un facteur qui favorise l’apparition de l’obésité. L’hypothalamus est la région du cerveau impliquée dans les régulations métaboliques. Les cellules immunitaires responsables de l’inflammation dans le cerveau s’appellent cellules microgliales. In vitro les hormones thyroïdiennes ont un effet anti-inflammatoire dans ces cellules. L’objectif de ce projet est d’abord de verifier qu’in vivo aussi les hormones thyroïdiennes sont capables de limiter l’inflammation provoquée par un agent bactérien ou un régime trop gras, via leur action dans la microglie. Puis nous évaluerons l’importance de ces hormones dans la microglie pour l’apparition de l’obésité en réponse à un régime obésogène.

Bénéfices attendus

L’obésité est un problème de santé publique mondiale. Trouver des mécanismes capables de limiter la prise de poids en réponse à des régimes trop gras est nécessaire. Les hormones thyroïdiennes ont cette propriété mais ne peuvent pas être utilisées en tant que telles car elles provoquent aussi des effets indésirables. Il est donc nécessaire de comprendre comment elles peuvent avoir cette action. Cette étude permettra de déterminer si cibler le pouvoir anti-inflammatoire des hormones thyroïdiennes dans l’hypothalamus constitue une nouvelle possibilité de lutte contre l’obésité

Procédures

L’ensemble des animaux évoqués sont vigiles sauf indication contraire Dans la première expérience certains animaux seront nourris pendant 15 jours avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne. Après les 10 premiers jours, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1fois/jr, 15 secondes, 5 jours). Toutes les souris sont ensuite injectées dans l’abdomen (1 fois, 15s) et analysée après 0, 1 ou 5 jours. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s) Dans la deuxième expérience certains animaux seront nourris pendant 15 jours avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne. Après les 10 premiers jours, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1fois/jr, 15 secondes, 5 jours). Puis L’alimentation normale sera remplacé par un régime obésogène pour 3 ou 7 jours) pour certains des animaux. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s) Dans une troisième expérience, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1 fois/jr, 15s, 5 jr). Pour certains, le régime alimentaire normal sera remplacé par un régime obésogène (2 mois). Toutes les souris seront soumises à un test pour mesurer leur capacité à utiliser du glucose administré en gavage (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère incision à la queue (1 incision, 5s par prélèvement). Après une semaine toutes les souris seront soumises à un autre test sanguin pour mesurer leur capacité à utiliser le glucose en réponse à une injection d’insuline dans la cavité abdominale (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée comme après gavage au glucose. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s)

Impact sur les animaux

Ne travaillant que sur les mâles et les animaux mutants et contrôles issus d’une même portée devant être répartis dans les différents groupes expérimentaux (nourriture), certains peuvent être isolés pendant l’ensemble de la procédure. Une douleur temporaire peut apparaitre suite aux injections quotidiennes d’hormones ou de tamoxifène 5 jours d’affilées. Il y a aussi un risque d’inflammation de la cavité péritonéale suite à ces injections répétées. Les prélèvements à la queue dans les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer une douleur plus légère. Après l’injection de LPS (procédure 1), la perte de poids peut être importante (entre 10 et 15% du poids pré-injection) le premier jour pour remonter en suite. Pour la procédure 3, sous le régime obésogène les animaux peuvent prendre beaucoup de poids. Cette forte prise de poids peut s’accompagner de difficulter à se déplacer. Lors des tests de tolérance à l’insuline, les souris peuvent se retrouver en hypoglycémie

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour prélèvements des tissus à analyser par histologie ou biologie moléculaire ou pour récupérer des cellules

Remplacement

Nous avons déjà étudié et pu établir l’effet anti-inflammatoire de l’hormone thyroïdienne in vitro. Le but ici est de comprendre l’impact de cet effet anti-inflammatoire dans un contexte physiologique d’inflammation et son impact sur les conséquences métaboliques de cette inflammation L’hypothalamus est une région du cerveau qui présente une grande diversité cellulaire. Les différents types cellulaires interagissent entre eux pour élaborer les réponses physiologiques adaptées. Les outils génétiques nous permettent aujourd’hui d’inhiber sélectivement la signalisation thyroïdienne dans un type cellulaire donné chez la souris, ici la microglie. Aucun modèle in vitro ne peut se substituer au modèle animal, pour ce type d'études physiologiques qui impliquent la communication entre différents organes, en réponse à différentes conditions physiologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum pour permettre l’obtention de résultats significatifs. 6 animaux (mâles) par condition expérimentale en fin d’expériences sont nécessaires et suffisants. En effet les effets de l’hypothyroïdie sont variables d’un animal à l’autre. Pour certaines expériences, on augmente le nombre d’animaux à 8 par groupe car dans ces expériences des animaux devront peut-être être retirés avant la fin suite à l’atteinte de points limites. Cette étude est aussi séquentielle : l’ensemble des expériences proposées ne seront pas forcément menées à bien. En particulier, nous n’étudierons l’importance des hormones thyroïdiennes dans la microglie pour l’apparition de l’obésité en réponse à un régime riche en gras que si les premières études montrent que les hormones thyroïdiennes régulent l’inflammation dans l’hypothalamus.

Raffinement

Autant que possible, les animaux sont maintenus en groupes sociaux à deux ou trois animaux par cage pour limiter le stress. Si les animaux viennent à être séparés suite à des blessures, ou pour permettre la ventilation des animaux dans les différents groupes, on leur procurera un enrichissement dans leur cage. Nous veillerons au bien être et la bonne santé des animaux tout au long des expériences, en leur effectuant des visites trois fois par semaine, en vérifiant leur poids, et observant que leur comportement soit normal. Des lotions antiseptiques seront appliquées en cas de blessure Lorsque des injections quotidiennes doivent être faites dans l’abdomen nous changeons chaque jour le site d’injection pour minimiser les risques d’inflammation. Lorsqu’une perturbation importante des animaux est attendue, comme la perte de poids après injection de l’agent pro-inflammatoire, la fréquence de la surveillance des animaux est augmentée à deux fois par jours jour. La nourriture obésogène a tendance à rancir, elle est donc renouvelée deux fois par semaine. L’insuline peut faire chuter le taux de glucose sanguin. Lors des tests de tolérance à l’insuline, on veille à ce que ce taux ne descende pas en dessous d’un seuil critique. Si ce seuil est atteint l’animal est immédiatement injecté avec du glucose Des analgésiques et anesthésiques sont utilisés pour limiter la douleur lors des prélèvements sanguins et des derniers traitements avant la mise à mort des souris.

Choix des espèces

Les rôles des hormones thyroïdiennes chez la souris sont très similaires à ceux chez l’homme. Chez ces deux espèces les hormones thyroïdiennes stimulent la dépense énergétique et contrôlent la température. La souris est un modèle de choix pour les manipulations génétiques et les expériences de physiologie. Ce modèle est aussi le plus utilisé de nos jours pour ce genre d’études ce qui nous permet d’une part de comparer directement nos résultats à ceux obtenus par d’autres équipes de recherche et d’autre part de disposer du matériel nécessaire pour réaliser les expériences. Nous utilisons des souris adultes car nous ne voulons pas d’interférence entre les processus de croissance et métaboliques.

6 vaches laitières vont être utilisées, puis conservées pour le troupeau et réutilisables, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à deux vagues de chaleur artificielles atteignant 35°C en chambre climatique, avec six prélèvements de sang à la queue et des prélèvements de lait, pour étudier la stabilité thermique du lait. Le porteur indique que le stress thermique entraîne un inconfort, une hausse de la respiration, de la sudation et du besoin de boire, et une baisse possible de la production laitière. Il affirme qu'il est impossible de se passer des vaches puisque l'étude porte sur le lait qu'elles produisent, projet destiné aux éleveurs et à l'interprofession laitière.

Objectifs

Les laits de consommation subissent des traitements thermiques de type UHT pour permettre leur conservation dans le temps ou des ultrafiltrations pour concentrer certains éléments d’intérêt. Certains laits, pour des raisons mal déterminées, ne supportent pas ces traitements et floculent, soit immédiatement, soit lors de leur conservation en briques. Une meilleure compréhension des causes de la variabilité des instabilités du lait entre systèmes d'élevage des vaches laitières pourrait aider à cibler des leviers par lesquels les problèmes d’instabilité des laits pourraient être limités au niveau des élevages. La France subit ou risque de subir de plus en plus de vagues de chaleur extrême associées au changement climatique. Les effets de ces stress thermiques sur l’instabilité des laits ont été peu documentés. Un effet via les perturbations acido-basiques induites au niveau de l’organisme des animaux pourrait être à l'origine d'une instabilité des laits. Pour des températures entre 5 et 28°C, la vache laitière n'a pas de difficulté de régulation de sa température corporelle, du moins si l'humidité relative est modérée. Par contre, avec des températures supérieures à 25°C, on constate des chutes rapides et importantes d’ingestion et de production laitière. L’objectif de l'expérimentation sera de caractériser finement les effets de deux vagues de de chaleur successives, telles qu’on peut les anticiper en France, sur la stabilité thermique des laits (aptitude à supporter les traitements UHT), en lien avec des paramètres sanguins.

Bénéfices attendus

Nous allons mieux connaître les mécanismes physiologiques déterminant la stabilité thermique des laits afin de résoudre les problèmes qui se posent sur le terrain. Nous pourrons valoriser ce travail auprès des éleveurs et de l'interprofession laitière. Nous participerons à l'identification de biomarqueurs de stabilité thermique dans le lait afin d'aider les éleveurs à mieux gérer ce problème car la stabilité thermique est un paramètre difficile à mesurer en routine à ce jour, bien que les conséquences de sa chute soient importantes dans les unités de transformation laitière.

Procédures

Les vaches seront exposées à deux périodes de vagues de chaleur modérées reproduites artificiellement en chambres climatiques. Chaque période durera une semaine. Chaque jour, la température s'élèvera graduellement à partir de 7 h du matin pour atteindre 35 °C à 12 h. Elle restera à 35°C jusqu'à 19 h, puis descendra rapidement à 19°C, température qui sera atteinte vers 20 h et qui restera constante toute la nuit. Les vaches laitières auront une prise de sang à la queue toutes les semaines pendant 6 semaines, soit 6 prises de sang. La prise de sang est peu douloureuse et dure peu de temps (quelques secondes). Toutefois, la peau peut être légèrement sensible lorsque l'aiguille la traverse. Le volume de sang prélevé est très faible par rapport au volume sanguin total d’une vache. Le prélèvement de lait consiste à prélever 2 L de lait dans le bidon qui a recueilli la totalité du lait issu de la traite des vaches. La traite va durer un dizaine de minutes.

Impact sur les animaux

L'élévation de la température dans les traitements TC de fortes températures ambiantes va induire une adaptation physiologique des vaches à la chaleur. L'ampleur de la hausse de température va être controlée pour mimer deux vagues de chaleur modérées, proches du seuil défini par Météo France pour la température (https://meteofrance.com/changement-climatique/observer/changement-climatique-et-vagues-de-chaleur) et courtes (7 jours). Le stress thermique va par définition entrainer un inconfort et une adaptation physiologique consistant en une hausse de la fréquence respiratoire, de la sudation et un besoin accru d’abreuvement. Il peut aussi entrainer une baisse de la production laitière et une baisse d’ingestion, au moins sur les heures les plus chaudes de la journée. La prise de sang est peu douloureuse et dure peu de temps (quelques secondes). Toutefois, la peau peut être légèrement sensible lorsque l'aiguille la traverse. Le volume de sang prélevé est très faible par rapport au volume sanguin total d’une vache.

Devenir

Les animaux n’ayant subi aucune intervention invasive, ni traitement susceptible d’avoir des effets importants sur leur santé et/ou survie seront conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable des installations expérimentales. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci soit effectivement possible.

Remplacement

L'expérimentation concerne directement la qualité du lait. Il est donc impossible de se passer des vaches laitières qui produisent ce lait.

Réduction

Le schéma expérimental sera un schéma en double inversion. Les 6 vaches laitières seront réparties dans 2 salles climatisées et elles recevront chacune deux fois les régimes de température décrits. Ce nombre de 6 vaches impliquées est un bon compromis entre la nécessité de maximiser la puissance statistique et nos capacités expérimentales en termes de remplissage de salles climatisées. Les expériences passées avec ce type de schéma montrent qu'un groupe de 6 vaches produira des réponses adaptatives à la hausse des températures envisagées dans ce projet suffisantes pour être mises en évidence à travers une comparaison des périodes entre elles sur les paramètres cibles suivants : production laitière, température corporelle, fréquence respiratoire. Les données seront analysées par analyse de variance.

Raffinement

L'expérimentation est basée sur le lait. Les seuls actes invasifs sont des prises de sang (6 au cours des 6 semaines d'expérimentation). Leur nombre est vraiment faible. Ces prises de sang seront réalisées à la queue, partie de l'animal peu douloureuse. Les vaches seront bloquées au cornadis comme au moment de l'alimentation, donc sans subir aucun stress lié à ce blocage qui est habituel. Les vaches seront maintenues dans un environnement d’élevage habituel aux conditions de température près. Ces conditions sont adaptées à leurs besoins comportementaux et sanitaires, et elles ne seront jamais en isolement social. Les prélèvements et la surveillance des animaux se feront par des personnes compétentes et habilitées. Les points limites pour arrêter l’expérimentation pour certaines vaches qui ne s’adapteraient pas aux hausses de température seront une baisse durable d'ingestion (25% par rapport à la période de référence), un rythme respiratoire supérieur à 120 respirations/min (mesuré par observation) ou une température rectale matinale des vaches avant le démarrage de la phase de montée en température des salles hors de la gamme physiologique (> 39°C).

Choix des espèces

Vache laitière de race Prim’ Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches laitières seront des vaches adultes en milieu de lactation (vêlages compris entre fin août et fin septembre). Au cours de l’expérimentation, ces vaches seront à différents stades de gestation.

8 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sensibilisées à un allergène puis soumises à un déclenchement provoquant une réaction allergique pouvant devenir systémique, elles reçoivent des composés dont la voie et la fréquence d'administration sont fixées "selon le choix du sponsor", avec prélèvements de sang et de fèces. Le projet, mené pour des partenaires commerciaux, vise à évaluer des candidats médicaments contre le choc anaphylactique. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne peut se substituer à la souris pour reproduire les mécanismes de l'allergie alimentaire.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement curatif de l'allergie alimentaire, seuls les symptômes sont pris en charge. Cette pathologie peut affecter la qualité́ de vie des patients mais également avoir des conséquences graves dans le cas de choc anaphylactique ou œdème de Quincke. Le choc anaphylactique est un réaction immunitaire allergique grave en réponse à l’exposition à un allergène. Cet allergène peut venir des aliments, de certains médicaments, d’une piqûre d’insecte, du contact avec du latex, voire d’un effort physique intense après ingestion d’un aliment légèrement allergène. Si le risque de décès par suite du choc anaphylactique existe, il demeure rare, de l’ordre de 0,3 %. Cette réaction peut atteindre le système cardiaque, respiratoire, cutané, gastro-intestinal, entrainant notamment des difficultés respiratoires, des réactions cutanées, des nausées/diarrhées, une baisse de la tension artérielle et possiblement la mort. La recherche menée ici a pour objectif de tester de futurs candidats médicaments ou substituts alimentaires qui pourront permettre de mieux prendre en charge cette pathologie et de la traiter de façon durable. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles expérimentaux permettant une meilleure compréhension et analyse des mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement de ces maladies inflammatoires ainsi que l'efficacité́ de nouvelles molécules thérapeutiques visant à̀ améliorer la santé des patients. Pour cela nous proposons plusieurs modèles de sensibilisation présentant comme allergène : l'ovalbumine, la bétalactoglobuline bovine (BLG), des extraits contenant de l’arachide, du gluten, du blé, du sésame, des fruits à coques, du sésame, des coquillages, des crustacés, des poissons (liste non exhaustive). La molécule à tester sera administrée par différentes voies recréant les diverses possibilités d’administration médicamenteuses chez l’Homme et selon la voie d'administration conseillée pour ce composé.

Bénéfices attendus

Les modèles animaux d'allergie alimentaire utilisés dans cette étude sont pertinents pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le processus inflammatoire de l'allergie alimentaire afin de répondre à un besoin important de santé, celui des conséquences graves dans le cas de choc anaphylactique ou œdème de Quincke pouvant porter atteinte à la vie des patients souffrants d'allergies alimentaires.

Procédures

Dans le but de réaliser une réaction allergique plus importante un jeûne de 4 heures pourra être réalisé avant chaque sensibilisation et/ou lors du challenge final. La molécule à tester pourra être administrée dans l’eau de boisson, dans l’alimentation, par gavage, inhalation, injection intra péritonéale, intravasculaire, sous-cutanée, intradermique ou intramusculaire selon le choix du sponsor. La fréquence de l'administration est variable en fonction de la demande de nos partenaires. Les animaux seront pesés quotidiennement. Au cours de l'étude, le sang sera prélevé en respectant un volume maximum de 7,5% du volume sanguin circulant pour une période de récupération de 7 jours. Les fécès pourront également être prélevés maximum 1 fois par semaine au cours de l’étude. D'autres prélèvements seront possibles en fonction des demandes du sponsor. Des relevés de température rectale ainsi qu'un scoring clinique pourront être effectués quotidiennement pour surveiller l’inconfort des animaux. Les animaux sont ensuite anesthésiés sans réveil et le sang total est prélevé au niveau de l'aorte abdominale ainsi que d'autres organes.

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable est le développement d'une réaction inflammatoire à un niveau local et possiblement systémique en fin d'étude, lors du challenge.

Devenir

Tous les animaux du protocole sont euthanasiés à la fin et des prélèvements sont réalisés pour l'analyse.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude des allergies alimentaires. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R nous cherchons à̀ : - réduire le nombre des animaux utilisés en utilisant un nombre très proche du nombre minimal de 6 animaux nécessaire à une étude statistique. Basé sur la bibliographie et notre précédente expérience du modèle le nombre de 10 animaux permet de répondre à la fois à l’hétérogénéité et la variabilité individuelle tout en respectant la puissance statistique et la nécessité de réduire les animaux.

Raffinement

Dans le respect de la règle des 3R nous cherchons à̀ : - raffiner en apportant du soin et une observance accrue aux animaux en souffrance ou en angoisse suite à l'induction des maladies. Ces pathologies étant basées sur l'inflammation, un traitement pharmacologique visant à̀ réduire la souffrance de l'animal ne pourra être envisagé sans compromettre les résultats de l'étude. L'état de santé des animaux sera évalué́ quotidiennement selon des critères d'apparence physique et comportementaux selon le tableau détaillé́ dans le paragraphe. Les souris sont hébergées selon les conditions de la règlementation 2010/63/UE en unités individuelles ventilées de type III ou IV avec enrichissement de l’environnement (composants de nidification et igloo). L'enrichissement pourra être augmenté si nécessaire.

Choix des espèces

Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'allergie alimentaire sont complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces évènements par une approche substitutive de culture cellulaire. La souris est largement décrite dans la littérature pour être une espèce de choix dans ce modèle. Les allergies alimentaires pouvant survenir à tout moment de la vie d'un individu, les souris seront préférentiellement utilisées à l'âge adulte (8-12 semaines) au début des investigations, car elles présentent un système immunitaire mature. Cependant selon la population ciblée, l’âge pourra être laissé à l’appréciation du sponsor, les animaux pourront être plus jeune ou plus âgés. L'âge minimal étant de 3 semaines et l'âge maximal sera déterminé par l'âge de la population ciblé et peut être de 3 ans.

7 656 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections intrapéritonéales d'anticorps répétées et des prélèvements sanguins dont un prélèvement terminal, pour étudier l'immunosurveillance anti-tumorale. Le porteur décrit une tumeur pouvant se nécroser en son centre et des points limites censés arrêter les atteintes avant un stade avancé. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées à terme, tandis que le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à la souris pour l'étude in vivo de ces mécanismes.

Objectifs

Dans le domaine complexe de la biologie humaine, la lutte contre le cancer est un combat permanent qui exige un arsenal d'approches innovantes. Parmi celles-ci, le concept d'immunosurveillance est apparu comme un gardien essentiel dans la lutte contre les tumeurs malignes. L'immunosurveillance fait référence à la capacité innée du système immunitaire à reconnaître et à éliminer les cellules anormales, y compris celles qui ont un potentiel cancéreux. Ce mécanisme de défense naturel constitue une ligne de défense cruciale, détectant et éradiquant les cellules indésirables avant qu'elles ne se transforment en tumeurs à part entière. On ne saurait trop insister sur l'importance de l'immunosurveillance dans la lutte contre le cancer. Contrairement aux traitements traditionnels du cancer qui ciblent souvent la tumeur elle-même, l'immunosurveillance s'attache à donner aux défenses de l'organisme les moyens d'identifier et d'éliminer les menaces cancéreuses. Toutefois, ce processus n'est pas sans faille, car les cellules cancéreuses peuvent échapper à la détection immunitaire grâce à diverses stratégies. Il est donc urgent d'améliorer et d'affiner les mécanismes d'immunosurveillance afin de garantir une défense plus efficace contre le cancer. L'amélioration de l'immunosurveillance implique une approche multidimensionnelle. En outre, il est essentiel de démêler l'interaction complexe entre le système immunitaire et les microenvironnements cancéreux. En comprenant comment les tumeurs manipulent leur environnement pour échapper à la détection, nous pourrons développer des stratégies pour contrer ces tactiques et renforcer l'immunosurveillance. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer comment les cellules tumorales échappent à leur éradication par le système immunitaire et de déterminer si le ciblage de ces voies représente une option thérapeutique prometteuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de proposer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrants de cancers.

Procédures

Les souris seront rasées sur un des flanc (environ 30 secondes, réalisé sur souris vigile avec du matériel spécifique) et recevront une injection unique en sous-cutanée de cellules cancéreuses. Chaque injection prendra environ 5 minutes par souris et sera réalisée sur des souris vigiles. Une partie des souris recevra une injection intrapéritonéale d'anticorps tous les 2 jours pendant 2 semaines ou deux fois par semaine pendant 2 semaines. Chaque injection prendra environ 30 secondes et sera réalisée sur des souris vigiles. Pour ¼ des animaux, un prélèvement sanguin sera réalisé en cours de procédure et toutes subiront un prélèvement sanguin terminal. Ces prélèvements prendront environ 1 minute par souris. Un dernier groupe de souris recevra 4 injections intrapéritonéales sur 4 jours (une par jour). Chaque injection prendra environ 30 secondes par souris et sera réalisée sur des souris vigiles.

Impact sur les animaux

Lors d'injections intrapéritonéales répétées, il peut y avoir une inflammation au point d'injection. En ce qui concerne l'aspect et la taille de la tumeur, la tumeur peut présenter un trou en son centre. Avant l’arrivée aux points limites, les animaux pourraient subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection d’immunothérapies. Nous avons une grande expertise de ces modèles. Nous savons que la croissance tumorale n’entrainerait des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, absence de toilettage, une prostration et/ou une agitation), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…) qu’à un stade avancé de du développement de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes et tumeurs et ainsi réaliser les études in vitro nécessaires à savoir analyser la composition cellulaire (cytométrie, immuno-histochimie) et biochimique de la tumeur.

Remplacement

Comme notre projet repose sur l’influence de l’expression de gène tumoraux sur le dialogue entre système immunitaire et les cellules cancéreuses, il n’existe pas à ce jour d’autre alternative que l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes moléculaires et des interactions complexes impliqués.

Réduction

Bien qu’il n’existe à ce jour pas de méthode de remplacement pour réaliser ces études, notre expérience des modèles utilisés nous permet de définir le nombre de souris minimum à utiliser afin d’être statistiquement significatif, grâce à l'utilisation de méthodes statistiques adaptées. De plus nous avons conçu le projet de façon à ce que les procédures soient réalisées les unes après les autres. En cas de résultats non concluant de la procédure initiale, les procédures suivantes ne sont pas réalisées, ce qui réduira le nombre d’animaux prévus dans ce projet. Enfin aucun effet hormonal n’a été décrit à notre connaissance dans ce modèle. Cela nous permettra de limiter notre étude exclusivement aux femelles, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé pour ce projet.

Raffinement

Une grande importance sera accordée au bien-être des souris. En termes de raffinement, les souris sont hébergées en groupe avec de l'eau stérilisée par filtration, des aliments à volonté et un enrichissement systématique du milieu par diamond twist et igloo rouge. Leur suivi permet de détecter tout signe de souffrance, de détresse et ainsi la prise immédiate des mesures adéquates grâce à l’application de points limites adaptés à la pathologie du lymphome B. La notion d’enrichissement du milieu des rongeurs utilisés est familière aux demandeurs. Tous les participants à ce projet sont dûment qualifiés et ont validé les compétences requises pour les manipulations proposées. D’autre part, afin de minimiser l’inconfort des procédures concernées nous alternerons les sites d’injections en intra-péritonéal, utiliserons des aiguilles très fines adaptées aux injections répétées afin de minimiser/s’affranchir de problème lié à l’injection et nous utiliserons également une tondeuse spéciale rongeurs.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. Les modèles utilisés sont les modèles les mieux adaptés pour étudier la réponse antitumorale. Nos souris seront âgées de 6 à 20 semaines car c’est durant cette période que le développement tumoral est optimal.