Oncologie

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer du sein leur sont greffées sous la peau, puis elles reçoivent des traitements par voie orale, sous-cutanée ou par gavage pendant plusieurs semaines, la tumeur étant prélevée à la mise à mort. L'objectif est de comprendre la résistance à l'hormonothérapie du cancer du sein via une protéine. Le porteur affirme que les travaux in vitro ne reproduisent pas l'activité de cette protéine dans la tumeur et qu'un modèle de greffe chez la souris est requis.

Objectifs

Les patientes atteintes de cancer du sein qui présentent une tumeur exprimant un récepteur aux estrogènes sont traitées par hormonothérapie. En clinique les traitements de ces patientes par hormonothérapie diminuent le taux de rechute et améliorent la survie des patientes. Néanmoins l’efficacité de ces thérapies est limitée par la résistance à ces traitements, car jusqu’à 40% récidivent. C’est pourquoi de nouvelles molécules sont en cours de développement. Le problème majeur est qu’il n’existe pas de marqueur prédictif de réponse à ces traitements. Récemment, il a été identifié une protéine, dont la présence dans le noyau cellulaire participe à l'activité anti-tumorale des traitements. L’objectif du projet est de comprendre le rôle de cette protéine dans la réponse des patientes aux différentes hormonothérapies et de restaurer la sensibilité aux hormonothérapies dans des modèles résistants, en régulant la bonne localisation de cette protéine. Pour ceci, un modèle murin développé à partir de greffe de cellules cancéreuses humaines permettra de reproduire la réponse anti-tumorale observée chez les patientes sensibles ou résistantes aux traitements hormonaux, et d'étudier le rôle de cette protéine.

Bénéfices attendus

L'utilisation de ce modèle murin de xénogreffes qui mime la tumeur des patientes hormono-sensibles permettra de mieux comprendre la résistance au traitement par des hormones et donc d'identifier des biomarqueurs de la sensibilité des patientes à l’hormonothérapie, d’adapter les traitements des patientes ayant un cancer du sein hormonosensible et donc d'entrevoir de nouvelles thérapies.

Procédures

Des cellules humaines de cancer du sein sont injectées sous la peau des souris. Pour effectuer ce geste, la souris est endormie durée 4 min, une seule injection de 0.1 ml, durée 20 sec. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine au maximum, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. Les composés sont administrés par voie orale dans l’eau de boisson (à partir de l’entrée des souris en protocole jusqu’à la mise à mort),ou par injection sous cutanée (1x/semaine, 10 sec, pendant 4 semaines maximum), ou par gavage (1x/sem à 5 x/sem selon le composé, 45 sec, pendant 4 semaines maximum).

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané entrainera le développement de tumeur, en réponse à la stimulation par l'estrogène dans l’eau de boisson. Un surdosage d'estrogène pourrait induire un gonflement abdominal (jamais observé dans les conditions utilisées). Tumeur : nécrose ou un gêne à la locomotion (très rare). Injections répétées peuvent entrainer une irritation. Multi-contentions peuvent engendrées un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car la tumeur sera prélevée pour des analyses immunohistochimiques, biochimiques et moléculaires.

Remplacement

Nos travaux menés in vitro dans des cellules de cancer du sein suggèrent l'activité bénéfique d'une protéine dans la réponse aux antiestrogènes ches les patientes atteintes d'un cancer du sein hormonosensible. Ces travaux in vitro ne permettant pas de reproduire l'activité de la protéine telle qu'elle est observée dans les tumeurs chez la patientes. Des études in vivo seront faites grâce à un modèle de greffe de cellules humaines de cancer du sein, chez la souris. Ce modèle murin mime ainsi la tumeur mammaire humaine et est nécessaire à l'observation des caractères de la tumeur chez les patientes.

Réduction

La formation de tumeur chez les souris est d'environs 80% dans ce modèle murin de cellules de cancer du sein. Nous étudierons l'inhibition de la croissance entre les souris traitées et les souris non traitées. Pour mesurer une différence significative des traitements, sur la croissance des tumeurs, entre les groupes de souris traitées et celles ne recevant pas le traitement, il faut greffer 10 souris par groupe.

Raffinement

Les analyses de croissance des tumeurs seront non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant. De l'aliment humidifié en fond de cage sera disposé si un animal présente une gêne de la mobilité due à la croissance tumorale ou une irritation lors de gavage (très rare). Les traitements seront planifiés, en fonction de leur fréquence, de façon à ce qu'un animal recoive un seul traitement par gavage par jour. La greffe des cellules sera faite sous anesthésie. Une anesthésie locale par application de crème sera réalisée lors de l'indentification des animaux

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est couramment utilisée en oncologie car l’inoculation de cellules tumorales humaines n’induit pas le rejet de la greffe dans cette espèce. Les études concernent le cancer du sein, c'est pourquoi l'expérimentation sera réalisée avec des souris femelles de 8 semaines, car à cet âge, l’ensemble des fonctions est mature.

150 chevreuils sauvages vont être utilisés, puis relâchés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés au filet et anesthésiés, les brocards subissent une collecte de sperme par électro-stimulation, un prélèvement de sang à la jugulaire et des prélèvements de fèces et de poils, une fois par an. Le porteur reconnaît des risques de blessures, de stress de capture et de myopathie de capture pouvant être mortelle. Il justifie l'étude de la sénescence de reproduction par la nécessité d'une population sauvage suivie de longue date, qu'aucune population captive ne pourrait remplacer.

Objectifs

La sénescence de reproduction - le déclin des performances de reproduction avec l'âge - est un processus biologique très répandu dans le vivant, associé à de profondes implications biologiques, démographiques et sociétales. Pourtant, très peu d’études se sont intéressées à la sénescence de reproduction des mâles en milieu naturel. L’objectif de notre projet est donc d’identifier les facteurs biologiques (ex : effort de reproduction en début de vie, santé des individus) et écologiques (ex : qualité des ressources, exposition à des polluants) qui modulent les performances de reproduction au cours de la vie des mâles, en milieu naturel. Pour mener à bien ce projet, il est par essence indispensable de travailler sur une population animale sauvage pour laquelle les individus sont suivis de la naissance à la mort. En outre, il est nécessaire que les trajectoires individuelles des mâles qui seront échantillonnés soient déjà disponibles (données sur la croissance ou la santé des individus). Nous analyserons les causes évolutives de la sénescence de reproduction des chevreuils mâles (brocards) dans une population française de chevreuil. Nous organiserons des captures estivales afin de collecter de nouvelles données sur les traits pré-copulatoires (ex : morphologie des bois) et post-copulatoires (ex : qualité des spermatozoïdes) pendant la période du rut. Nous testerons ensuite des prédictions issues des théories évolutives du vieillissement, en examinant si une forte allocation à la croissance et à la reproduction en début de vie est associée à une sénescence de reproduction plus précoce ou plus marquée. De plus, nous explorerons si ces associations sont modulées par les conditions environnementales et par une dégradation de santé des individus (évaluée par divers marqueurs de la sénescence, tel que l'âge épigénétique). Basé sur une combinaison unique de données comportementales, physiologiques, génétiques et de traits d’histoire de vie, ce projet permettra d’obtenir une compréhension fine des causes et conséquences évolutives de la senescence de reproduction. Ces travaux menés chez un mammifère longévif en milieu naturel ouvriront de nouvelles perspectives de recherche aussi bien pour la biologie évolutive que pour la biogérontologie. Les individus qui composent la population d'étude sont suivis individuellement depuis plus de 40 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’identifier des marqueurs phénotypiques (ex : taille des caractères sexuels secondaires) et moléculaires (ex : âge épigénétique) de la sénescence de reproduction des mammifères mâles. A terme, ce projet permettra d’identifier les mâles souffrant d’une fertilité réduite par des mesures bien moins invasives que l’électro-stimulation (ex : par simple mesure phénotypique ou dosage sanguin). Ainsi, l’identification plus aisée des mâles les plus fertiles permettra d’affiner les protocoles de gestion des populations. La majeure partie de nos connaissances actuelles sur le vieillissement est basée sur des expériences menées sur des modèles animaux à courte durée de vie dans des environnements contrôlés (par exemple des rongeurs de laboratoire), ce qui rend difficile l'extrapolation des résultats à des espèces à longue durée de vie comme l'humain. Dans ce contexte, notre projet est porteur pour la recherche biomédicale car le chevreuil présente un cycle de vie lent (c'est-à-dire une faible fécondité annuelle et un taux de survie élevé à l'âge adulte) plus proche de celui de l'homme que de nombreux organismes de laboratoire. En outre, il se concentre une population naturelle, et pour laquelle les individus sont suivis de la naissance à la mort et les échantillons biologiques couvrant toute la vie des individus déjà disponibles. De plus, il fournira des informations essentielles sur le rôle joué par les conditions environnementales sur le déclin des capacités reproductrices masculines. En effet, les perturbations écologiques actuelles sont susceptibles d'avoir des conséquences néfastes sur la fertilité des mâles, et pourraient être déjà impliquées dans la détérioration inquiétante de la santé reproductive des hommes comme actuellement documentée dans la plupart des populations humaines du monde entier. À plus long terme, ce projet pourra également fournir des connaissances fondamentales sur l'étiologie des maladies reproductives masculines. Jusqu'à présent, les études sur le vieillissement reproductif masculin dans les sciences vétérinaires et biomédicales n'ont pas intégré de considérations éco-évolutives. Pourtant des approches similaires, réalisées dans des populations sauvages de mammifères longévifs ont déjà conduit à des percées dans notre compréhension de la santé reproductive des femmes.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : pose de boucles auriculaires à la première capture (si non marqué - durée 1 min), pose d'une puce d’identification injectable à la première capture (si non marqué - durée 1 min), une anesthésie, une collecte de sperme par an (durée 20 min maximum), 1 prélèvement de sang dans la jugulaire (14 ml mL maximum) (durée 1 min), un prélèvement de fèces au niveau rectal (durée 2 min), 1 prélèvement de ~100mg de poils au niveau du miroir (durée 1 min), 1 prélèvement de touffes de poils au niveau des glandes interdigitales et métatarsales (durée 2 min).

Impact sur les animaux

Les deux effets indésirables principaux sont i) les risques de blessures superficielles et de traumatologie (fractures extrêmement rares mais possibles lorsque l’animal se prend dans le filet) et ii) le stress causé par la capture (phase de course qui précède la capture au filet puis démaillage et mise en sabot). Contrairement aux captures hivernales, le stress lié à la contention sera atténué puisque les animaux seront anesthésiés. La conséquence la plus fréquemment observée de ce stress de capture est une réduction de l’activité locomotrice journalière dans les jours suivant la capture, dont la durée a été évaluée à 14 jours chez le cerf de Virginie. Plus rarement peut survenir une hyperthermie liée au stress et à la contention, ou une myopathie de capture, s’exprimant essentiellement soit sous la forme d’un choc post-capture (dans les 6 heures suivant la capture, avec risque mortel) soit sous la forme d’un syndrome d’ataxie-myoglobinurie (dans les heures ou jours suivant la capture). Les prélèvements d’échantillons seront réalisés sur des animaux anesthésiés et analgésiés. Ainsi, le stress associé aux protocoles d’échantillonnage sera limité (collecte de fèces, prise de sang, pose de boucles auriculaires et d'une puce d'identification injectable, éléctro-stimulation), et l’inconfort et les douleurs associées (potentiellement détectées par des vocalisations) au protocole seront modérées, de courte durée et ne persisteront pas au-delà de la manipulation. L’inconfort qui pourrait émaner de ces protocoles sera réduit au minimum par l’administration d’un analgésique à action centrale. Aucun des prélèvements n’est à même de provoquer une douleur qui persisterait une fois l’animal réveillé et relâché.

Devenir

Les animaux seront remis en liberté.

Remplacement

Ce projet de recherche sur le chevreuil repose sur le suivi individuel de brocards. Il vise en particulier à explorer les trajectoires d’allocation dans la reproduction des brocards au cours de la vie et de comprendre comment celles-ci sont modulées par les conditions environnementales (ex : niveau de pollution, conditions climatiques) à la naissance ou au cours de la vie adulte et influent la survie des individus à long termes. Ce projet est dans la lignée des suivis à long-termes en écologie basés sur le suivi le plus long et le plus complet possible des individus au cours de leur vie en milieu naturel. Il n’existe donc, par essence, aucune méthode substitutive à notre protocole de recherche. Les approches in vitro ou in silico, ne permettent pas d’étudier simultanément les réponses des individus aux variations de conditions environnementales de manière intégrée (prises en comptes du spectre complet de traits reproducteurs, morphologie des bois, sécrétions odorantes, quantités et qualité des spermatozoïdes) au niveau individuel ainsi que les conséquences à long terme sur la valeur sélective des individus. En outre, une compréhension fine du rôle de l’environnement sur la sénescence nécessite, par essence, de se focaliser sur des populations sauvages. Nous avons en effet démontré que les conditions de captivités modifient les patrons de sénescence. Les populations de mammifères captives ou de laboratoire ne constituent donc pas une alternative pertinente à l’utilisation de populations sauvages lorsqu’il s’agit d’étudier le rôle de l’environnement sur le processus de sénescence. Notre protocole est calibré pour que toutes les quantités de tissus prélevées soient en adéquation avec des objectifs prédéfinis précis. Toutefois, si certains échantillons s’avéraient non utilisés (en particulier les échantillons de sperme pour lesquels nous ne pouvons pas contrôler de manière précise la quantité que nous allons collecter) ou si une amélioration des protocoles de biologie moléculaire permettait de réduire la quantité de tissus à utiliser pour la quantification d’un paramètre donné, les échantillons supplémentaires et restants seraient mis à disposition de notre réseau de collaboration (et participerait ainsi à du remplacement pour des projets futurs).

Réduction

Notre objectif est de réaliser le protocole sur un total de 30 brocards (d’âges connus ou non), lesquels seront recapturés annuellement le temps de la durée du projet. Ce nombre de 30 individus est le nombre minimal pour pouvoir utiliser les outils statistiques appropriés à l’étude de la sénescence en milieu naturel (ex : modèle linéaire mixte généralisé avec un effet aléatoire de l’individu sur l’intercept du modèle. Dans cette étude nous ciblerons, lors des mini-traques, des mâles déjà marqués lors de captures hivernales précédentes (pour lesquelles le comité d’éthique a déjà rendu un avis favorable) et pour lesquels une partie des trajectoires individuelles est déjà connue. Ce ciblage permet de limiter la capture de nouveaux individus tout en se concentrant sur ceux ayant le plus de valeurs scientifiques. Si un animal venait à être capturé une seconde fois au cours du même été, aucun prélèvement ne serait pris et l’animal serait immédiatement relâché sur son site de capture. Toutes les femelles et les individus de moins de 1 an (faons de l’année) seront également immédiatement relâchés. Le nombre et la quantité des échantillons prélevés seront minimisés lors des captures estivales. La quantité de sang prélevée passera notamment de max 1 ml/kg (volume max= 20ml) à 14 ml (individus >20kg) afin de quantifier uniquement les paramètres physiologiques qui seront mis en lien avec les traits reproducteurs (ex : morphologie des bois, sécrétions odorantes, quantités et qualité des spermatozoïdes) et la santé des brocards. Les fèces collectés en amont de l’électro-stimulation avant de vider le rectum seront conservés pour des analyses d’éco-physiologie. La réduction des prélèvements est également anticipée par le stockage des échantillons non utilisés et leur mise à disposition pour notre réseau de collaborations. Les données collectées sur les 6-8 individus capturés au cours des trois jours de tutorat seront utilisées dans les analyses (avec ajout d’un facteur ‘phase pilote’ dans l’analyse) et contribueront donc à réduire le nombre d’individus capturés (ces brocards feront parties des 30 individus prévus dans le projet).

Raffinement

Le respect du bien-être animal est une préoccupation majeure du programme chevreuil. Afin de minimiser l’inconfort et la douleur des individus, plusieurs dispositions ont été prises. - Les protocoles ont déjà été travaillés en amont pour limiter les nuisances pour les animaux. Par exemples, l’ajout d’un analgésique (butorphanol 0.2 mg/kg) a déjà été rajoutée au protocole d’anesthésie afin de limiter de façon substantielle les possibles douleurs associées à l’électro-stimulation. - Les protocoles d’anesthésie et d’électro-stimulation seront optimisés en fonction des réponses du chevreuil aux protocoles initialement définis (ex : diminution de la tension maximale si trop de vocalisation, voir ci-après). D’autres alternatives qui pourraient le cas échéant être envisagées ont également été listées, comme par exemple la collecte de sperme par pharmaco-induction si l’électro-stimulation s’avérait trop inconfortable pour les animaux. - Des points limites spécifiques à la réalisation du protocole, l’anesthésie et l’électro-stimulation ont déjà été établis (voir section ci-après). - L’équipe technique sera tutorée (6 personnes tutorés: 3 pour l’anesthésie et 3 pour l’électro-stimulation) par des vétérinaires experts de l’anesthésie et de l’électro-stimulation. Pour les années suivantes, les experts reviendront le premier jour des captures pour revalider les compétences de l’équipe technique et éventuellement raffiner les protocoles en fonction des progrès et avancées réalisées dans le domaine. - Les manipulations seront effectuées dans un local réservé à cet effet par du personnel qualifié afin de minimiser le stress pour les animaux capturés. Les brocards auront les yeux couverts d’un tissu le temps que les prélèvements soient réalisés. Une fois manipulés, les brocards seront remis dans un sabot (caisse de contention adaptée à la morphologie du chevreuil et permettant un déplacement rapide des animaux) de façon à être immédiatement relâchés au plus près de leur territoire (sur la parcelle où ils ont été capturés).

Choix des espèces

Le chevreuil est pertinent pour l’étude de la sénescence reproductive masculine puisqu’il s’agit d’une espèce longévive et que les brocards allouent de façon complexe à la reproduction (ex : territorialité, pousse des bois, émission de molécules odorantes). La population ciblée revêt en de nombreux avantages pour ce projet. Dans cette population, clôturée et très faiblement chassée, les individus sont suivis individuellement de la naissance à la mort depuis bientôt 50 ans. Les animaux d'âge connu sont suivis de près tout au long de leur vie grâce à des captures hivernales et des observations sur le terrain. De nombreuses données (ex : démographiques, phénotypiques, génétiques) sont donc déjà disponibles pour plus de 50% des individus de la population, notamment ceux qui seront ciblés en priorité pour ce projet de recherche. De plus le recours à des populations captive ou de laboratoire ne permettrait pas de répondre aux objectifs de notre projet. Le projet repose sur l’étude de la reproduction des mâles. Les études antérieures sur les brocards ont révélé que les mâles étaient sexuellement matures à 9-10 mois ou un peu plus tard (14 mois environs, c’est à dire le second été suivant leur naissance). Nous inclurons donc dans notre étude, uniquement des mâles ayant au moins 14 mois. Au cas où un mâle plus jeune (c’est à dire un faon de l’année) se ferait piéger dans les filets au moment des captures, il serait relâché aussitôt.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses humaines du sein ou du pancréas sous la peau, les tumeurs étant ensuite fragmentées et regreffées sur d'autres souris, puis des injections répétées d'une molécule à base de fer dans la queue. Le porteur indique que la croissance tumorale et les injections répétées peuvent provoquer douleur et lésions. Il conclut que ces études précliniques restent nécessaires au dépôt de brevet et à la poursuite d'essais cliniques.

Objectifs

Malgré les progrès dans leur diagnostic et traitement, les cancers du pancréas et certains cancers du sein ont encore un pronostic défavorable. Ainsi il est primordial de trouver de nouveaux traitements. Ce projet a pour but d’étudier le pouvoir anti-cancéreux d’un nouveau produit à base de fer (à une dose déjà montrée comme non toxique pour les souris) sur des souris ayant reçus une greffe au niveau du flanc, sous la peau, de cellules cancéreuses humaines (pancréas ou sein).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet à court termes sont de prouver que la molécule a un effet anticancéreux dans un modèle animal (souris). A long terme, cela permettrait de réaliser d’autres essais pré-cliniques voir cliniques et in fine améliorer le traitement des patients atteints du cancer du pancréas et du cancer du sein.

Procédures

Les animaux recevront une injection unique de cellules cancéreuses (mammaires pour une partie et pancréatique pour une autre partie) au niveau du flanc sous la peau. Une fois les tumeurs développées, elles seront fragmentées pour être greffées sur de nouvelles souris et ce à deux reprises. Cela permet d’obtenir un modèle tumoral fiable. La durée de cet acte est approximative car cela dépendra du temps que mettent les cellules à former une tumeur à chaque étape. 14 souris seront nécessaires pour cette étape (7 par modèle de cancer : sein et pancréas). Ensuite, aura lieu les greffes des fragments obtenus lors de la dernière transplantation, aux 66 souris nécessaires pour l’injection du composé. Une fois les tumeurs obtenues, les souris seront réparties en groupes pour les injections. Pour chaque modèle (cancer du sein et cancer du pancréas), il y aura 3 groupes de 11 souris , 1 groupe contrôle et deux groupes recevant 2 modalités d’injections de la molécule différentes. Pour chaque groupe, 4 souris seront mises à mort en cours d’expérimentation (étude de l’effet précoce de la molécule sur la tumeur) et les 7 autres en fin d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Durant les actes expérimentaux, les souris seront soumises à différents injections. Elles seront également soumises à une chirurgie légère. A la suite de ces actes, les souris pourront ressentir une soif ou/et une faim moins importante que d’habitude. Les injections répétées de la molécule au niveau de la queue peuvent entrainer une douleur et une atteinte des tissus au niveau du site d’injection, afin d’éviter cela, nous injecterons à différents endroits de celle-ci. Le développement des tumeurs peut entrainer une douleur et une gêne, au fur et à mesure de la croissance de la tumeur. Les animaux seront donc susceptibles de gratter la zone de greffe ou d’injection. Après tout acte chirurgicaux ou injections, les animaux seront isolés le temps qu’ils récupèrent toutes leurs facultés mais seront rapidement remis en cage collective afin d’éviter un stress lié à l’isolement de l’individu.

Devenir

Pour la première partie de l’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort en cours de procédures pour récupérer au fur et à mesure les tumeurs et les fragmenter / regreffer. Pour la deuxième partie de l’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et étudier l'effet des différentes injections à un temps précoce ou à l'issu de l'expérimentation (temps tardif)

Remplacement

Aucune méthode alternative de remplacement ne permet de satisfaire l’objectif de Remplacement à notre connaissance. Ces études précliniques chez l’animal restent nécessaires au dépôt de brevet concernant son effet anticancéreux sur les animaux et à la poursuite d’études cliniques pour exploiter pleinement les capacités antitumorales de la molécule AIM3 dans le traitement de cancer du pancréas et du cancer du sein triple négatif

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre de souris, nous avons décidé d’éviter un quatrième groupe contrôle (ne recevant qu’une injection de la solution dans lequel est repris le composé). Nous utiliserons donc un seul groupe contrôle pour les comparaisons aux deux groupes traités.

Raffinement

Les expériences seront réalisées afin de minimiser le stress et l’apparition de douleurs chez les animaux. Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés afin de limiter le stress engendré par la contention. La présence d’enrichissement dans les cages (frisure de papier kraft, de bûchettes et/ou tunnel) est un critère de raffinement. Des critères d'arrêt anticipés de l'expérimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifiés. Dès qu’un des points limites est atteint la souris en question sera écartée du protocole et mise à mort par dislocation cervicale à la suite d’une anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Le modèle de souris « nude » du fait de sa déficience en système immunitaire est le modèle animal le plus approprié pour des études en cancérologie expérimentale car il permet d’injecter chez l’animal des cellules cancéreuses d’origine humaine sans risque de rejet. La taille de la tumeur de la souris est suffisante pour l’analyse de la distribution de la molécule d’intérêt. 8 semaines : adulte, poids d’au moins 20 g. La veille bibliographique réalisée sur les études in vivo établies à partir de modèle de cancer du pancréas et de cancer du sein démontrent l’utilisation de souris femelles « nude » sans système immunitaire âgées de 8 semaines.

295 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une instillation nasale d'adénovirus qui déclenche des tumeurs pulmonaires, puis des injections intrapéritonéales répétées de thérapie ciblée, de chimiothérapie et d'immunothérapie pendant vingt semaines, avec des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que les tumeurs, invisibles de l'extérieur, peuvent provoquer une insuffisance respiratoire et une cachexie, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Les retombées annoncées pour les patients atteints de ce cancer du poumon restent au conditionnel, et il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'évaluer l'anticorps.

Objectifs

Le carcinome squameux du poumon (LUSC) est un sous-type courant de cancer du poumon. Il est la deuxième cause de décès liée au cancer du poumon, causant environ 400 000 décès par an dans le monde. La grande majorité des patients atteints de LUSC sont de gros fumeurs actuels ou anciens indiquant une forte association de la pathologie au tabagisme. Contrairement à d'autres sous-types de tumeurs du poumon, il n'existe pas encore de thérapies ciblées approuvées pour le LUSC, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet vise en prérequis à étudier le développement tumoral dans un modèle murin de LUSC. L'objectif principal de notre projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec une chimiothérapie ou une immunothérapie sur le développement des tumeurs dans ce modèle murin. Nous analyserons pour cela l’incidence et la progression tumorale. La pertinence de notre thérapie ciblée sera également évaluée par ablation génétique de son gène. De manière secondaire, nous étudierons la biologie de notre cible thérapeutique dans ce même modèle à l’aide de systèmes rapporteurs d’expression.

Bénéfices attendus

Des options thérapeutiques limitées sont disponibles pour le LUSC à un stade avancé. Malgré une compréhension plus approfondie des altérations génétiques qui caractérisent les LUSC et des années de travaux d'essai ciblant ces altérations, les thérapies personnalisées restent peu satisfaisantes. Seule l'immunothérapie a marqué la première amélioration substantielle de la survie globale des patients atteints de LUSC depuis plus d'une décennie, mais moins d’un tiers des patients montrent un bénéfice au traitement. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement de notre cible thérapeutique (et de son activité en association avec des chimiothérapie et des immunothérapies. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Prélèvement tissulaire sur animaux vigiles, de 2 mm au niveau de la queue pour génotypage à 4 semaines postpartum. 1X 5 sec. Marquage à l’oreille à 4 semaines postpartum. 1x 5 sec. Pour l'injection de virus: Anesthésie par injection. 1X 20 sec. Durée de l'anesthésie 5 min. Pour l'imagerie intra-vitale: Anesthésie gazeuze. 1X20 sec toutes les 4 sem de 4 à 40 sem post-infection. Durée de l'anesthésie 10 min. Instillation nasale de virus 1X 5 min. Injections intraperitonéales sur animaux vigiles : Thérapie ciblée injections 2X/sem pendant 20 sem, 20 sec. Immunothérapie 2X/sem pendant 5 sem, 20 sec. Chimiothérapie 1x/sem pendant 20 sem, 20 sec.

Impact sur les animaux

Les animaux sont anesthésiés pour procéder à l’instillation nasale des adenovirus. La manipulation des souris et les diverses injections intrapéritonéales peuvent générer du stress à l’animal. L’instillation nasale des virus peut provoquer de légères lésions au niveau des narines ainsi qu’induire de la toux. Les tumeurs induites par l'adénovirus se développent au niveau pulmonaire. Elles ne sont par conséquent pas visibles de l’extérieur et peuvent occasionner une insuffisance respiratoire. Les contentions lors des pesées et des traitements peuvent générer du stress. Les méthodes d’imagerie imposent des manipulations, du transport et de l’anesthésie par inhalation qui sont autant de stress pour l’animal. Dans les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids). Les animaux peuvent présenter des blanchissements et refroidissement des extrémités. Ces signes peuvent être en lien avec l’affaiblissement provoqué par l’atteinte pulmonaire caractéristique de ce modèle de souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés pour analyse à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’étude de la biologie de notre cible thérapeutique a été réalisée sur des lignées cellulaires au préalable. Des analyses d’expression ont été effectuées sur les données publiques. L’ensemble des résultats obtenus nous a conduit à la nécessité de recontextualiser les cellules tumorales dans leur environnement. La complexité des réponses thérapeutiques de certains traitements anticancéreux rend difficile leur étude sur des lignées cellulaires. Les modèles murins représentent en ce sens un modèle adapté qui intègre la dynamique des nombreux type cellulaires impliqués dans la mise en place de ces réponses. De plus, le modèle génétique utilisé récapitule parfaitement toutes les étapes de développement de ce type de cancer pulmonaire. Son utilisation est donc nécessaire pour évaluer l’effet d’une thérapie sur l’incidence et la progression de la maladie. La présence de tous les différents types cellulaires est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité dde notre traitement. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de l'efficacité de notre anticorps dans le contrôle de l’immunité et les cellules cancéreuse.

Réduction

Les travaux actuellement publiés sur ce modèle de tumorigénèse n’indiquent pas la variabilité d’apparition des tumeurs chez les individus et ne permet donc pas une évaluation du nombre d’individus par une approche de calcul statistique. Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience sur la réponse aux traitements utilisés dans d’autres modèles et pour disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Les effectifs seront évalués au regard de la variabilité observée dans les premières expériences de mise en place du modèle. La stratégie de production des animaux et d’entretien la lignée génétiquement modifiée permet de réduire le nombre d’individus avec un génotype non désiré. 40 souriss seront utilisées pour réaliser un suivi longitudinal afin d’identifier l’hétérogénéité et la rapidité du développement tumoral de ce modèle de 20 à 40 semaines. Les temps de mise à mort pour le reste des proédures pourront être redéfinis au regard de ces résultats. L’autopsie des animaux sera réalisée afin de quantifier les lésions pulmonaires et détecter d’éventuelles invasions métastatiques (celles-ci n’ayant pas été décrites aux temps réalisés dans ce modèle). Certaines expérimentations seront faites 2 fois pour permettre différents types de prélèvements tissulaires. Les effectifs tiennent compte de la variabilité des effets de l’immunothérapie et de la chimiothérapie observée dans d’autres protocoles identiques. Dans un but de réduction, la répétition de ces expériences ne sera pas réalisée en cas d’absence d’effet mesuré. Les effectifs évalués prennent en compte la mise au point des protocoles de traitement des échantillons biologiques récupérés.

Raffinement

Dans ce modèle de souris, des petites lésions pulmonaires apparaissent à partir de la semaine 30 post induction avec le virus. 100% des animaux présentent des lésions entre 40 et 50 semaines. Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Le poids des animaux sera évalué 2 fois par semaine selon les phases du développement tumoral. Pour l’ensemble des expériences, les signes de souffrance seront surveillés 2 fois par semaine puis 3 fois par semaine à partir d’un âge de 30 semaines. Des signes d’insuffisance respiratoire, d'amaigrissement et de prostration sont également possibles en lien avec la pathologie induite ou après l’administration de chimiothérapie. Des mesures d'enrichissement du milieu à partir de 20 semaines permettant un réchauffement des individus seront mis en place afin de limiter l’apparition d’hypothermies. De la nourriture semi-liquide sera mise dans la cage en cas de perte de poids

Choix des espèces

Le modèle de souris génétiquement modifiées utilisé est capable de générer des tumeurs pulmonaires représentatives uniquement du sous-type désiré, dans 100 % des souris et qui récapitulent les aspects génétiques, moléculaires et microenvironnementaux de la maladie humaine. L'administration nasale de virus permet la spécificité d’organe. La souris immunocompétente est le modèle le plus approprié pour faire des suivis pharmacologique dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux, de la chimiothérapie ou de l'immunothérapie. Par ailleurs la posologie des drogues utilisées est bien standardisée (voie, doses, volumes, etc...) contrairement à d'autres modèles tels que le poisson zèbre. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris jeunes adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément au modèle établi. Le développement tumoral pulmonaire commence à partir de 20 semaines suivant l'administration nasale de virus.

140 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La seule intervention sur l'animal vivant décrite est un frottis vaginal quotidien pendant deux semaines, les rattes étant ensuite tuées pour prélever l'hypophyse et étudier la régulation de la fertilité femelle. Le porteur affirme que ce geste, bien réalisé, "n'induit pas de nuisance au-delà de l'acte de contention". Il indique retenir la ratte pour la régularité de ses cycles et la richesse de la littérature, aucun modèle in vitro ne recomposant selon lui ce cycle biologique complexe.

Objectifs

Chez le mammifères dont l’espèce humaine, la fonction de reproduction est contrôlée par l'axe gonadotrope, constitué par l'hypothalamus, l'hypophyse et des gonades. Dans l'hypophyse, les cellules gonadotropes jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la fonction de reproduction. En effet, ces cellules intègrent différents signaux venus de l'organisme et secrètent en réponse deux hormones, la LH (hormone luteinisante) et la FSH (hormone folliculo stimulante) qui régulent les fonctions gonadiques et donc la fertilité. L'un des régulateurs majeurs de la fonction des cellules gonadotropes est le neuropeptide hypothalamique GnRH, mais il est maintenant bien décrit que les cellules gonadotropes sont sensibles à de très nombreux signaux comme les hormones sexuelles secrétées par les gonades, faisant de ces cellules de véritables plateformes d'intégration de signaux. De plus, le cocktail de stimulation que reçoit les cellules gonadotropes varie fortement au cours de la vie des mammifères, entraînant des modifications de secrétions des hormones gonadotropes. Cela permet la mise en place des étapes clefs de la vie reproductive comme la puberté ou le déroulement des cycles sexuelles chez les femelles. Cette stimulation complexe, associée à la complexité structurelle de l'hypophyse, composée de 6 types cellulaires endocrines chez les rongeurs, a cependant longtemps représenté un frein à l'étude des mécanismes moléculaires de l’intégration par les cellules gonadotropes. Etudier ces phénomenes complexes et dynamiques dans des modèles de cellules en culture est cependant difficile : Les modèles de cellule en culture, par nature réductionniste, peinent en effet à cette complexité physiologique, et les résultats obtenus à partir de ceux-ci traduisent donc mal les processus se déroulant dans l'animal vivant. L’avènement récent des techniques en cellules uniques représente une opportunité extra-ordinaire pour étudier les mécanismes régulant la fonction gonadotrope dans toutes leurs complexités physiologiques, dans l’animal vivant. Ces nouvelles techniques de pointe permettent, en effet, de dissequer les méchanismes moléculaires au sein même des tissus, dans toute leur complexité biologique. Ce projet permettera donc de comprendre comment les cellules gonadotropes régulent la fertilité alors que celle-ci décline dans l’espèce humaine et chez de nombreux animaux d’élevage.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait, à cours terme, permettre de mieux comprendre comment les cellules gonadotropes intègrent une signalisation complexe et changeante afin de réaliser sa fonction de régulation hormonale de la fertilité femelle. Ce projet permettra de découvrir de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la régulation de la fonction gonadotrope et donc dans la régulation de la fertilité chez les mammifères. A plus long terme, les résultats de ce projet pourraient permettre d’identifier de nouvelles causes génétiques des infertilités humaines, un sujet de préoccupation émergent dans nos sociétés modernes.

Procédures

Le projet n'inclu qu'un seul type d'intervention sur l'animal vigil: La réalisation de frottis vaginaux quotidien pendant deux semaines. Chaque frottis est réalisé en moins d'une minute (environ 10 à 30 secondes)

Impact sur les animaux

Ce projet ne fait intervenir qu’une étape, hors mise à mort, pouvant induire un éventuel inconfort : la réalisation des frottis vaginaux. Ceux-ci seront cependant réalisés par un personnel compétent qui veillera à réduire l’inconfort des animaux. Ce geste, quand il est réalisé dans les règles de l’art, n’induit pas de nuisance au-delà de l’acte de contention.

Devenir

La finalité de l'expérience est de prélever l'hypophyse. Ceci ne peut être fait sur animal vivant. L'ensemble des animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prelevement de l'hypophyse.

Remplacement

Les modèles cellulaires in vitro ne peuvent se substituer aux modèles animaux dans ce projet car nous nous interessons à des phénomenes physiologiques qui se déroulent aux cours d'un cycle biologique complexe, impossible à recapituler fidelement in vitro. Le modèle rat est particulierement approprié car c'est le modele animal dans lequel les connaissances en physiologie de l'axe gonadotrope sont les plus pointues d'un part, et d'autre part, les rattes présentent des cycles oestriens extrêmement répétables et réguliers, en comparaison d'autres especes comme la souris. Ceci permet de selectionner des animaux de façon fiable et donc de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Réduction

Comme indiqué si dessous, la robustesse des événements physiologiques programmant la fertilité femelle chez la ratte permet de limiter le nombre d'animaux necessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, les echantillons seront analysés par des methodes de pointe en cellule unique permettant l'acquisition d'une grand nombre de donnée sur le même echantillon. Cela permettra donc de réduire le nombre d'échantillon necessaire. Un projet pilote montre que trois hypophyses prélévées au même moment du cycle donnent une representation statistiquement fiable des evenements moléculaires qui se déroulent à ce moment précis. Des expériences de confirmation des résultats ainsi acquis seront cependant necessaire et necessiteront des animaux supplementaires. Notre recul expérimental nous permet de penser que, pour les verification de l'expression des genes et des proteines, 3 hypophyses par groupe de ratte seront suffisantes. Pour les expériences necessitants des cultures primaires de cellules hypophysaires, notre experience montre que les résultats sont fiables à partir de 10 rattes par culture primaire.

Raffinement

Le projet ne fait pas intervenir de pratique invasive générant des dommages sur animaux vivants. Les frottis vaginaux necessitant toutefois une contention, les animaux seront accoutumés quotidienement à la contention et par simulation d’un frottis pendant une semaine avant le début des vrais frottis. Conditions d'environement: Les rattes seront hébergées dans les conditions suivantes: deux femelles par cage, cage enrichie de materiel de nidification et de rongeage, nourriture et eau ad libitum, cycle jour nuit 12H-12H. Points limites: L'aspect global des animaux sera évalué quotidiennement (pelage propre, présence de blessure...). En cas de signe de déterioration de l'état de santé (perte de poinds, pélage sale, prostration), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Comme déja indiqué, le rat est une espèce de choix pour l'étude des processus de régulation neuro-hormonale de la fertilité femelle chez les mammifères de part : 1) la régularité des cycles sexuels et 2) par l'existence d'une bibliographie étendue sur le sujet. Nous utiliserons des rattes femelles adultes de 8 semaines puisque nous nous intéressons à la régulation du cycle estrien qui se met en place après la puberté (7-8 semaines chez le rat Wistar)

320 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pompe est implantée chirurgicalement sous anesthésie pour administrer en continu des molécules candidates, avec des prélèvements de sang à la jugulaire sous anesthésie, dans le cadre du développement de médicaments. Le porteur présente cette pompe comme un "raffinement" évitant les injections répétées, tout en reconnaissant des douleurs post-opératoires pendant 48 heures et un risque d'infection au site d'incision. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reflète l'absorption et le métabolisme d'une molécule dans un organisme vivant.

Objectifs

La recherche et le développement de nouveaux médicaments impliquent la réalisation de tests visant à caractériser les molécules candidates et leur comportement après administration chez l'animal que ce soit dans des études de pharmacocinétique ou d'efficacité. La réalisation de ces tests nécessite parfois d'effectuer des administrations répétées de la molécule à étudier. Les pompes osmotiques sont des pompes miniatures pouvant être implantées chez la souris, le rat ou d'autres animaux de laboratoire lors de protocoles de recherche expérimentale. Ces mini-pompes permettent d’administrer des médicaments, des hormones et d'autres substances à l’étude à des débits continus et contrôlés sur une période allant d'un jour à six semaines, sans recours à des branchements externes, ni à des manipulations fréquentes. Leur fonctionnement automatisé libère le personnel de laboratoire des astreintes liées aux injections répétées durant la nuit ou pendant le week-end et permet de raffiner les techniques d'administration des molécules. Ce projet a donc pour objectif de raffiner ces administrations grâce à la pose d'une pompe Alzet®, cette dernière permettra l'administration en continue de la molécule chez les animaux en évitant par la suite des contentions et des injections répétées, ce qui n'affectera pas leur bien-être.

Bénéfices attendus

L'ajout d'un dispositif à administration lente en continu permettra de raffiner les modèles animaux en réduisant les manipulations / contentions chez l'animal, ainsi que les éventuelles administrations répétées de molécules. L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Procédures

Pour la pose de la pompe Alzet® les animaux seront anesthésiés puis subiront une procédure chirugicale (durée d'intervention 10 minutes pour les procédures 1 & 3 et 20 minutes pour la procédure 2). Les animaux seront anesthésiés pour effectuer les prélèvements de sang plusieurs fois au cours des procédures, l'animal sera alors endormi puis prélevé à la veine jugulaire (durée d'intervention 5 minutes).

Impact sur les animaux

L'installation de la pompe chez l'animal peut entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place (Vétédine) et l'animal placé sous surveillance renforcée.

Devenir

Tous les animaux des procédures seront mis à mort car ils auront subi une administration de molécules et ne pourront donc pas être inclus dans un nouveau protocole expérimental. De plus, pour la plupart des tissus seront prélevés afin d'analyses complémentaires.

Remplacement

La recherche et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques impliquent la réalisation de tests chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d'intégrer et de refléter les caractéristiques d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination d'une molécule donnée au sein d'un organisme vivant. Il existe cependant des modèles cellulaires permettant d'évaluer la cytotoxicité, l'absorption et le métabolisme de molécules in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules, mais doivent ensuite être confirmés chez l’animal. - Des premières données concernant la pharmacocinétique, le métabolisme et la tolérance des molécules in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire dans chaque lot a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience.

Raffinement

La pose d'une pompe va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'il implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la pompe sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré, per et post opératoire. Le milieu sera enrichi dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le poteniel de souffrance et /ou de détresse chez les animaux, des points limites précis et spécifiques ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en oeuvre tout au long du projet.

Choix des espèces

Les multiples homologies de séquences entre le rat, la souris et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Il est ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, ces espèces présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.

232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras de douze semaines, elles subissent une constriction chirurgicale de l'aorte pour provoquer un stress cardiaque, puis des échocardiographies et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, afin d'étudier le rôle de l'enzyme PIKfyve. Le porteur indique que cette chirurgie a déjà entraîné 10 % de mortalité post-opératoire. Il affirme qu'aucune méthode alternative validée ne permet de se passer du modèle animal en physiopathologie cardiaque.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est un problème majeur de santé publique, dont la prévalence augmente fortement, principalement à cause de l’obésité et du diabète de type 2. Nos études précédentes ont montré que l’enzyme PIKfyve est un acteur majeur dans la progression de l’insuffisance cardiaque chronique. Cependant, son rôle exact reste à élucider, notamment dans le contexte de l’insuffisance cardiaque liée à l’obésité. L'objectif de ce projet est de comprendre le rôle de PIKfyve dans la progression de l'insuffisance cardiaque liée au diabète en utilisant un modèle de souris dont le gène PIKfyve est non-fonctionnel.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre le rôle de PIKfyve dans la progression de l'insuffisance cardiaque en lien avec l'obésité et le diabète de type 2, problématique majeure de santé publique, et permettra d'améliorer nos connaissances sur la progression de cette pathologie multifactorielle et complexe.

Procédures

Les animaux seront soumis à 6 interventions différentes: 1/ un régime riche en graisse afin d'induire un phénotype obèse et diabétique de type 2 (n=96, pendant 12 semaines); 2/ une procédure chirurgicale visant à réaliser une constriction de l'aorte afin d'induire un stress cardiaque (n=96, durée de l’intervention : 1h); 3/ une échocardiographie transoesophagienne afin de mesurer la fonction cardiaque des animaux (n=192, durée de l’intervention 15min); 4/ une mesure de la composition corporelle (n=192, durée de la procédure : 2min); 5/ un test de tolérance au glucose afin de mesurer le métabolisme glucidique (n=192, durée de l’intervention : 3h); 6/ un test de tolérance à l'insuline afin d'étudier la sensibilité des animaux à l'insuline (n=192, durée de l’intervention : 3h).

Impact sur les animaux

Le régime riche en gras induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime riche en gras auront un suivi plus précis avec des remplissages des biberons d'eau et changes de litières plus fréquents si nécessaire. La procédure chirurgicale de constriction transverse de l'aorte (TAC, ou aortic banding) peut entrainer une mortalité post-opératoire (précédemment observée à 10% de l'effectif). Afin de limiter la douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgésique lors du protocole chirurgical. La lignée invalidée pour PIKfyve dans le cœur est une lignée déjà établie et qui a fait l'objet d’une étude rétrospective démontrant aucun effet néfaste chez la souris. L’échocardiographie transoesophagienne est réalisée sous anesthésie gazeuse et n’entraîne pas de nuisances pour l’animal. La mesure de la composition corporelle est réalisée sur animal vigile et acclimaté. Pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, les prélèvements sanguins sont réalisés au niveau de la veine caudale afin de limiter la douleur occasionnée à l'animal, à 2 semaines d'intervalle afin de garantir un repos suffisants aux animaux. Les volumes prélevés conformes aux BPL. Une surveillance sera assurée par un zootechnicien afin de s'assurer de l'absence de saignements après réintroduction des animaux dans les salles d'hébergement.

Devenir

Tout les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les prélèvements d'organes nécessaires.

Remplacement

Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle pas de méthode alternative validée permettant de s’affranchir du modèle animal pour les études de physiopathologie cardiaque.

Réduction

Le critère principal de jugement de la fonction cardiaque sera la mesure de la fraction d'éjection (EF) et de raccourcissement (FS) du ventricule gauche. Des données de la littérature nous permettent de prévoir que nos groupes expérimentaux doivent comporter 12 individus afin d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales : anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal, traitement analgésique après réveil et 24h après l'opération. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l’animal, selon une grille de score établie. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, perte de poids, absence de toilettage. Le franchissement de ces points limites précoces conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux obèses et diabétiques dont un gène a été rendu non-fonctionnel. A ce jour, seul le modèle de souris (Mus musculus) permet de réaliser ces études. Les animaux utilisés seront âgés de 2 mois, correspondant au stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature car ils sont les plus réceptifs à la procédure chirurgicale et au régime riche en gras.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées d'hydrogels chargés d'anticorps puis des séances d'imagerie en fluorescence sous anesthésie, trois fois par semaine pendant 21 jours, pour comparer ce relargage continu aux injections classiques. Le porteur reconnaît que ces injections peuvent provoquer une inflammation locale, accentuée par les frottements sur le gel. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit la complexité d'un environnement sous-cutané et conclut que la souris est "nécessaire", l'intérêt annoncé étant une administration moins coûteuse.

Objectifs

L’objectif du projet est de démontrer une équivalence ou une amélioration à l'administration d’anticorps thérapeutique en utilisant une formulation à base d’hydrogels comme une alternative aux méthodes d’injections sous-cutanées actuellement utilisée en routine clinique.

Bénéfices attendus

A la fin de ces expériences, nous espérons pouvoir déterminer une méthode de relargage continue d’anticorps améliorée par rapport aux injections cumulées, offrant une nouvelle alternative moins couteuse.

Procédures

Injections sous cutanée des composées sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris, 1 fois seulement. Imagerie en fluorescence sur des souris anesthésiées, durée 1mn/souris. 3x/semaine pendant 21 jours.

Impact sur les animaux

L'injection sous cutanée des composées pourrait engendrer une inflammation locale. De plus les frottements et pressions sur les hydrogels pourraient accentuer potentiellement cette inflammation. Les effets indésirables potentiels de l'anesthésie sont une irritation des voies respiratoires et une légère tendance au spasme laryngé dû à l’âcreté du produit employé, une baisse de la pression artérielle et une augmentation de la fréquence cardiaque. Ces effets potentiels ont été pris en compte dans l'établissement des points limites.

Devenir

Les animaux ayant subi ces interventions ne pourront pas servir pour d'autres expérimentations et seront mis à mort.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Les études in silico et in vitro ne permettant pas de reproduire les conditions permettant de récapituler la complexité d'un environnement sous-cutané. Le modèle animal est donc nécessaire pour récapituler le relargage sous-cutané des anticorps piégés dans des hydrogels.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente en tenant compte de la puissance du test statistique qui sera utilisé. De plus l'emploie d'un système d'imagerie en fluorescence du petit animal permettant un suivi dans le temps pour chaque animal, réduit le nombre d'animal requis et renforce la fiabilité des résultats.

Raffinement

Le protocole expérimental prend en compte l’impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Les souris sont maintenues en groupe de 5 par cage pour maintenir une interaction sociale entre individus. L’environnement d’élevage est enrichi à l’aide de nids et de carrés de cellulose pour garnir ces nids. Si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition de douleurs (réduction de la réactivité, difficulté de locomotion, fourrure non entretenue, tendance à l'isolement) un traitement par un analgésique sera effectué. Des points limites ont été établis pour anticiper toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les réplications de mouvement, frottements, pressions sur le gel qu’un humain pourrait avoir ne sont réplicables que sur un organisme vivant. La souris est l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude. De plus la souris est le modèle adéquat pour les raisons suivantes : - nombreux protocoles bien établis pour cette espèce - possibilité de comparaison de nos résultats avec ceux d’autres groupes utilisant des hydrogels de formulations différentes Des souris adultes seront utilisées car le système d'hydrogel s'adresse à ce type de populations.