Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
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Effet de la température sur le développement et la croissance de la seiche commune
- Recherche fondamentale
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- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
486 seiches communes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevées à trois températures pendant huit semaines, elles sont capturées à l'épuisette puis anesthésiées par le froid avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau, des lobes optiques et des yeux, pour étudier l'effet de la température sur le développement de leur système nerveux et leur camouflage. Le porteur souligne que la seiche possède un système nerveux et des comportements élaborés, analogues à ceux des vertébrés. Il indique qu'aucune partie ne peut être prélevée sans dommage irréversible, ce qui "implique" la mise à mort.
Objectifs
Les facteurs externes comme la température ont des effets sur le développement du système nerveux chez certains organismes animaux. Ce projet a pour objectif de tester l’effet de la température sur le développement d’un Céphalopode, mollusque au système nerveux et comportements élaborés. Notre espèce est la seiche commune européenne. Il s’agit plus précisément de déterminer si la température modifie 1) les régulations « génétiques » en lien avec le développement du système nerveux et des yeux 2) les comportements, en particulier de camouflage. Le camouflage est en effet directement contrôlé par le système nerveux et il a été montré que le camouflage peut être modifié par la température. Dans un contexte de réchauffement climatique, y compris sur les zones côtières, ce projet permettra de mieux comprendre comment le développement du système nerveux central (cerveau et lobes optiques de la seiche) et les comportements associés peuvent être modifiés par la température afin d’inférer des hypothèses évolutives et fonctionnelles sur l’influence du facteur température au cours du développement, chez l’embryon et chez le juvénile après éclosion.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’identifier si la température est un facteur important voire essentiel au développement et à la croissance du système neuro/photosensoriel permettant la mise en place des capacités cognitives chez la seiche dont le système nerveux est analogue à celui des vertébrés. L’approche par l’expression des gènes et l’étude comportementale parallèle permet de tester les régulations moléculaires mises en place en lien avec les réactions observables de l’organisme. Les résultats attendus sont de déterminer quel est l’effet de la température sur cet organisme et si son comportement et son cycle biologique pourraient être affectés. Il a été montré récemment que la température pouvait modifier le comportement de camouflage à l’éclosion, mais pas celui d’exploration du milieu. Nous cherchons à évaluer en première approche si ces modifications de camouflage perdurent jusqu’à 4 semaines ou si elles se lissent et si ces modifications dependent du “substrat”. La mise en place des deux conditions (HV et HNV) permettra d’évaluer si la visibilité des activités environnantes modifie le comportement, la neurogenèse et donc l’expression des gènes (stimulation, habituation). Par ailleurs, les résultats permettront d’optimiser les conditions d’élevage de cette espèce pour laquelle les standards de culture sont inexistants.
Procédures
Les animaux sont exposés à trois conditions de températures sur une durée de 8 semaines : sur la période ceux dans des aquariums avec fonds artificiels différents sont soumis à 1 pêche à l’épuisette , ceux destines aux études moléculaires sont soumis à 3 pêches à l’épuisette (à une semaine d'intervalle) d'une durée de 10 à 20 secondes. Ils sont immédiatement transférés dans un récipient, anesthésiés, puis mis à mort.
Impact sur les animaux
Un à trois (en fonction des aquariums) prélèvements manuels à l’épuisette d’une durée de 10 à 20 secondes sont prévus par aquarium sur toute la durée de l’expérimentation, ce qui peut occasionner du stress. Un siphonnage quotidien des aquariums peut également occasionner du stress sur une durée de 2 à 3 min. La température haute (24°C) en exposition prolongée (moins de 2 mois) peut occasionner un inconfort. Cette nuisance est supposée légère.
Devenir
Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique la mise à mort des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréversibles (pas de survie après prélèvement des yeux, du cerveau entre autres).
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à déterminer, par une approche physiologique globale, l’effet de la température sur le développement et la croissance des organes du système nerveux (cerveau, lobe optique, yeux) d’un organisme entier, en lien avec le comportement. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle
Réduction
La mise en place de collecteurs (support de ponte artificiel) relevés tous les jours dans le milieu naturel permet de récolter le nombre d’œufs nécessaire pour réaliser cette expérimentation en s’affranchissant de la conservation d’un stock de géniteurs en laboratoire. Il n’y a donc pas de maintenance de géniteurs sauvages. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Le nombre de 5 échantillons est le minimum adéquat pour garantir une puissance statistique suffisante pour examiner les variations d’expression. Nos expériences précédentes ont montré que les qualités d’ARN extrait étaient inégales. Le nombre d’animaux prend donc en compte la quantité d’ARN parfois insuffisante pour tester l’ensemble des gènes cibles, et les variabilités intra expérimentales (correspondant à la variabilité biologique) afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique, soit 10 animaux. Pour les estimations par approche génique de la neurogenèse, la variabilité interindividuelle peut être importante, 5 animaux sont également nécessaires. Chaque étape de prélèvement nécessite donc au total 15 individus. N’attendant pas de différence dans le nombre de neurones du cerveau, les animaux pour la phase d’études comportementales seront fixés uniquement pour les études d’expression de gènes réduisant ainsi le nombre d’animaux de 15 à 10. Cependant, afin de pallier d’éventuelles anomalies individuelles, les études de comportement intégreront 12 animaux par traitement.
Raffinement
Les juvéniles éclosent dans leur aquarium d’origine (où ont été déposés les œufs aux températures cibles) ; ils ne sont donc pas déplacés. A l’éclosion, ils auront un enrichissement environnemental varié à disposition dans les aquariums sous la forme de cachettes diverses (pièces de PVC (coude/té) de différents diamètres (16 à 25mm)) leur permettant de se cacher comme en milieu naturel. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée (petites crevettes et mysis sp.) deux fois par jour (matin et après-midi). Les rations sont réévaluées quotidiennement pour adapter la quantité d’aliment distribué à la biomasse de l’aquarium et au métabolisme des animaux (température). La température haute maximale appliquée reste inférieure à la température maximale observée en plein soleil dans les « mares » à marée basse. Les constantes physico-chimiques (température, salinité, pH, oxygène) sont contrôlées quotidiennement sur toute la durée du développement. La concentration en déchets azotés (nitrate, nitrite, ammonium/ammoniac) est mesurée chaque semaine afin de suivre la qualité d’eau d’élevage. Afin de limiter le stress et la souffrance supposée des juvéniles, ils sont transférés délicatement et rapidement dans un récipient contenant de l’eau de mer du système d’élevage jusqu’à une salle adjacente où la mise à mort sera réalisée. Le récipient est mis sur glace ce qui permet un refroidissement progressif, et une anesthésie des animaux par le froid. Ils sont observés jusqu’à constatation d’une léthargie (relâchement pupillaire, le relâchement des bras et du manteau) puis une fois la mort confirmée (arrêt respiratoire); les juvéniles sont alors placés dans le fixateur
Choix des espèces
Les céphalopodes sont les seuls mollusques possédant des capacités cognitives et des comportements élaborés. La seiche européenne pond des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, son développement est court (
Etude des conséquences à long terme de l’isolement social dès la période adolescente chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
554 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère, 494 tuées à l'issue et 60 gardées pour réutilisation. Isolées en cage individuelle du sevrage à l'âge adulte, elles subissent une batterie de tests comportementaux, un test de nage, des chocs électriques de faible intensité et un stress de contention, pour étudier les conséquences de l'isolement social sur l'anxiété et la mémoire. Le porteur indique que les souris isolées devraient développer les troubles comportementaux qui font l'objet de l'étude et renonce à tout enrichissement pour ne pas biaiser les résultats. Sur le remplacement, il affirme que ces comportements ne peuvent s'étudier que chez l'animal vivant.
Objectifs
Il est aujourd'hui largement documenté que l'isolement social durant la période adolescente constitue un facteur de risque au développement de troubles anxieux et mnésiques, et de déficit des interactions sociales à l'âge adulte. Ainsi, des études portant sur des enfants élevés dans des institutions où de la négligence et une absence d'interactions et de stimulations sociales ont été rapportées ont montré que la privation est corrélée à des altérations du fonctionnement neuronal et à d'importants troubles comportementaux. Néanmoins la compréhension des mécanismes impliqués reste très parcellaire en raison de la nature observatoire et corrélationelle des études épidémiologiques disponibles à ce jour. Sur la base de ces observations, notre projet a pour objectif de mettre en place un modèle murin d'isolement social durant l'adolescence, d'en analyser les conséquences comportementales à long terme, et de relier les potentiels dysfonctionnements comportementaux à une altération du développement de l'hippocampe, une structure clé pour la gestion des états émotionnels, des capacités cognitives et pour la mise en place des interactions sociales. Deux groupes expérimentaux seront crées: un groupe "Social" dans lequel les souris seront élevées en groupe social stable; un groupe "Isolement" dans lequel les souris seront hebergées individuellement à partir du sevrage (P21) et ce jusqu'à la fin de l'expérience à l'âge adulte. Les animaux seront soumis à l'âge adulte à une batterie de tests visant à caractériser leur niveau d'anxiété générale ainsi que leur capacité d'interaction avec leurs congénères et leur capacités mnésiques. L'impact des différents traitement sur le développement de l'hipppocampe sera également analysé.
Bénéfices attendus
Ces expériences fourniront des informations uniques sur les facteurs à l'origine de l'émergence des troubles anxieux et sociaux ainsi que sur les processus neuronaux impliqués. Elles permettront à moyen terme d'identifier des marqueurs biologiques précoces prédictifs d'une vulnérabilité comportementale ultérieure. La transposition à l'humain, à plus long terme, permettra la prise en charge des individus à risque.
Procédures
Procédure 1: hébergement en cage individuelle durant la gestation . Procédure 2: hébergement en cage individuelle du sevrage à la mise à mort à l'âge adulte; tests comportementaux (4 tests de 30 min max par jour). Procédure 3: hébergement en cage individuelle du sevrage à la mise à mort à l'âge adulte; tests comportementaux de 30 min max par jour. Procédure 4: hébergement en cage individuelle du sevrage à la mise à mort à l'âge adulte; tests comportementaux de 10 min max par jour. Procédure 5: hébergement en cage individuelle du sevrage à la mise à mort à l'âge adulte; test comportemental de 30 min; stress de contention de 30 min; prélèvements de sang (3 prélèvement à 30 min et 90 min d'intervalles pour un volume de 50µl par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes seront isolées afin de dater précisément la mise bas. Les animaux des groupes "isolé" seront hébergés en cages individuelles avec peu de contacts sensoriels avec leurs congénères. Nous nous attendons à ce qu'ils développent des troubles comportementaux qui font l'objet même de l'étude. Toutes les souris (hormis les mères) recevront 3 injections intrapéritonéales à 24h d'intervalle. Ces injections et le composé injecté sont sans effets nuisibles pour l'animal. Un groupe de souris sera soumis a des tests comportementaux basés sur leur propension naturelle à explorer de nouveaux environnements / congénères. Ces tests sont non invasifs et sans nuisances pour l'animal. Un second groupe sera soumis à deux tests légèrement aversifs. Dans le premier, les souris doivent nager pour trouver un refuge. Les sessions durent moins d'1 minute et sont sans impact sur le metabolisme ou le comportement ultérieur des animaux. Dans le second, les animaux recoivent des chocs électriques de faible intensité et durée (1seconde) qui engendrent une légère douleur et un inconfort immédiat mais est sans impact sur leur comportement ultérieur. Enfin, un dernier groupe de souris sera soumis à un stress aigü de 30 min (stress de contention) . Nous nous attendons à une activation de l'axe hormonal du stress qui fait l'objet de l'étude.
Devenir
Les femelles utilisées pour la reproduction (procedure 1) et les 60 souris démonstratrices utilisées en procédure 2 et 3 seront gardées en vue d'une réutilisation dans le même établissement utilisateur. Toutes les autres souris seront mises à mort pour collecte des cerveaux en vue des analyses ultérieures.
Remplacement
L’objectif du projet est de caractériser et de valider un protocole de stress précoce dans un modèle murin et d’étudier les conséquences de ce stress sur le développement de troubles anxieux, mnésiques, et d'interaction sociale à l’âge adulte. Par essence, l'expression de tels comportements ne peut s'envisager que chez l'animal in vivo et il n'est pas possible a l'heure actuelle d'envisager le remplacement de ce modèle par des approches in vitro ou in silico.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Pour les études comportementales, un effectif de 12 animaux par groupe est nécessaire. Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, et les tests comportementaux envisagés étant non invasifs, nous effectuerons tous les tests sur les mêmes animaux. Pour le test de paradigme social à trois chambres, nous utiliserons comme souris étrangères les animaux reproducteurs ayant Cre-. Ces animaux Cre- sont issus des mêmes accouplements que ceux mis en place pour générer les animaux Cre+. Enfin mâles et femelles seront utilisés.
Raffinement
Afin de ne pas interférer avec les conséquences de l'isolement social, aucune mesure de surenrichissement ne sera mise en place par ce qu'elle pourrait biasier les résultats. Néanmoins, des points limites stricts et spécifiques seront mis en place et un soin particulier sera accordé à l'observation des animaux au travers de la surveillance quotidienne effectuée par le personnel zootechnique mais aussi par l'évaluation de critères de bien être: pesée des souris a chaque changement de cage (une fois tous les 15 jours), observation de l'état du poil,
Choix des espèces
La neurogenèse dans le GD de l'hippocampe, qui est notre candidat mécanistique pour expliquer les effets de l'isolement social, a été étudiée principalement chez le rongeur. De plus, le modèle utilisé dans ce projet est la souris car 1) ce projet fait suite à des premières études réalisées chez la souris; 2) il s'insère dans un projet plus général faisant appel à des lignées transgéniques développées chez la souris (lignées GR-flox, Ascl1-flox...). Enfin le modèle d’étude employé doit permettre de reproduire un système biologique fonctionnel et complexe, dont les mécanismes ontogénétiques sont comparables à ceux qui régissent le développement des mêmes fonctions chez l’humain. Dans ce cadre, le modèle rongeur constitue un outil incontournable. Nous avons opté pour l'utilisation de souris dans un souci d'homogénéité de l'ensemble de nos expériences, ce qui permet une réduction du nombre d'animaux utilisés. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage (21 jours de vie) et jusqu'à l'âge adulte puisque notre modèle a pour objectif d'étudier l'impact à long terme de l'isolement social durant les périodes juvéniles et adolescentes.
Etude et visualisation de la réponse immunitaire au cours de la croissance tumorale et durant l’immunothérapie dans un modèle de tumeur solide.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 248 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau ou dans le côlon, certaines une chirurgie d'imagerie sous anesthésie sans réveil, pour analyser la réponse immunitaire et le mode d'action d'immunothérapies anticancéreuses. Le porteur indique attendre peu d'effets de la tumeur sous-cutanée et fixe la mise à mort au dépassement d'un volume tumoral limite. Les bénéfices avancés pour les patients sont renvoyés au moyen et long terme, tandis que les souris reçoivent d'emblée des cellules tumorales et ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de s’appuyer sur l’imagerie d’animaux entiers afin (1) d’analyser l’organisation de la réponse immunitaire anti-tumorale et (2) d’identifier le mode d'action des traitements cancéreux ainsi que de leurs répercussions sur l’organisme. Pour cela nous tenterons d'identifier le rôle de chacune des populations cellulaires retrouvées au sein d'une tumeur (ex. les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes T). Nous tenterons d'évaluer leur contribution directe ou indirecte sur l’efficacité de l’immunothérapie. Enfin, nous souhaitons mettre en lumière les limitations de ces thérapies afin d’apporter de nouvelles hypothèses de travail pour l’amélioration des traitements. En résumé, ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’utilisation des immunothérapies dans les cancers primaires de la peau et du colon pour ainsi contribuer, au moyen/long terme, à l’amélioration de la prise en charge des patients en clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra d’apporter des connaissances essentielles sur le mode d’action d’immunothérapies actuellement utilisées en clinique ou en cours de développement pour le traitement des cancers solides (ex : cancer du sein, de la peau, du colon, lymphome de la peau etc) et pour lesquelles une majorité des patients rechutent ou ne répondent pas. Comprendre les raisons pour lesquelles ces immunothérapies guérissent seulement une petite fraction des patients est alors primordial afin d’en générer des nouvelles de plus grande efficacité ou d’identifier les patients à même de répondre positivement au traitement. A court terme, ce projet offrira des pistes de travail pour générer des immunothérapies capables de contourner les limitations que nous aurons identifiées et donc avec une meilleure efficacité. Ainsi, nos travaux offriront au long terme de nouvelles thérapies pour traiter la majorité des patients atteint de cancer solide et améliorer leur espérance de vie.
Procédures
La greffe de la tumeur consistera à une injection de quelques secondes au début de l’expérience. Les animaux seront ensuite manipulés quotidiennement pour mesurer la pousse de la tumeur. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30minutes pour effectuer de l’imagerie et seront ensuite maintenus endormis pendant 2 à 3h mais cette procédure sera sans reveil.
Impact sur les animaux
Notre projet propose d’étudier les immunothérapies anti-tumorales et nécessite donc la greffe de tumeur aux souris en sous-cutanée au niveau du flanc et aussi au niveau du colon. Le bien-être de chacune des souris sera contrôlé fréquemment. Notre connaissance précédente suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables causés par la pousse tumorale sous-cutanée. La localisation (le flanc) de la tumeur ne semble pas impacter leur mobilité, elles ne perdent pas de poids, leur pelage reste soyeux et leur comportement demeure inchangé. L’injection des thérapies que nous proposons d’étudier dans ce projet pourra ne pas causer d’effets indésirables ou avoir un effet à court terme (24-72h) par exemple sur la température corporelle de l’animal liée à l’élimination des cellules tumorales. Des mesures pour soulager l’inconfort des animaux seront mises en place et sont décrites plus loin dans ce protocole.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales.
Remplacement
De nombreuses expériences seront validées au préalable in vitro à l’aide des lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces expériences pourront être effectuées dans des cultures cellulaires 2D ou des organoïdes (Structures 3D mimant les certains aspects des tumeurs solides in vivo) et nous permettront de déterminer des doses ou la cinétique sur laquelle nous souhaiterions étudier le mode d’action de la thérapie in vivo. Différentes doses seront utilisées in vitro afin de déterminer la dose optimale de la thérapie. Ces travaux nous permettront de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons par la suite pour identifier le mode d’action de la thérapie in vivo. Une telle approche permettra de réduire de façon significative le nombre d’animaux dont nous aurons besoin pour notre recherche. Néanmoins, les tests in vitro ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieues in vivo. C’est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action de certaines thérapies.
Réduction
L'utilisation de l'imagerie sur l'animal vivant permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car l'observation en temps réel permet d'acquérir plusieurs données à partir d’un un même animal, en observant les cellules immunitaires avant traitement, puis dans les heures qui suivent l'administration des traitements. Dès que possible, les expériences de cytométrie et de dosage protéiques (ou d’imagerie multiplex) seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation. D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. Selon les procédures, les paramètres évalués seront variables, cela entraine des nombres de groupes variables que nous avons optimisés et réduits au maximum pour obtenir des résultats significatifs tout en prenant en compte la variabilité de la croissance tumorale. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de cancer et auront reçu un traitement anti-tumoral.
Raffinement
Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (poil ébouriffé, prostration, taille de la tumeur) sont établis pour raffiner les procédures et soulager les animaux à l’aide d’analgésique ou de les mettre à mort si la souffrance persiste. Pour la pousse de tumeur sous-cutanée, la tumeur sera mesurée 3 fois par semaine afin de contrôler la pousse tumorale et de mettre à mort l’animal si le volume de la tumeur atteint 1500mm2. Ce volume est calculé selon la formule longueur x largeur x hauteur. La hauteur est difficile à mesurer et une approximation en est faite. On considère la hauteur comme étant la longueur divisée par deux. La formule finale est donc : Longueur x largeur x (largeur/2). Cette limite est idéale pour limiter l’impact de la tumeur sur le bien-être de l’animal qui n’aura aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Après l’administration de l’immunothérapie, la température corporelle de l’animal sera mesurée afin de s’assurer d’une bonne tolérance au traitement. Concernant l’intervention chirurgicale pour la greffe de tumeur au niveau du colon, l’animal sera administré en amont de l’opération avec une dose d’antalgique afin de minimiser la douleur et sera anesthésié sur plaque thermo contrôlée pour limiter la perte de chaleur corporelle. La cage sera supplémentée avec du dietget et la litière pourra être remplacée par une litière en cellulose en post-chirurgie.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain. Les souris sont l’espèce la plus appropriée pour nous éclairer sur les mécanismes d’action des immunothérapies pour le traitement des cancers chez l’humain. Par ailleurs, l’imagerie intravitale en temps réel peut être réalisée relativement facilement sur des souris. Tous les animaux utilisés dans ce projet de recherche seront adultes (>5 semaines). Notre étude s’effectue sur un système immunitaire adulte afin de se rapprocher au mieux de la clinique et des patients porteurs de ces cancers.
Analyse des dysfonctionnements périnataux des réseaux moteurs chez la souris SOD1-KCC2-T906A/T1007A, un modèle de la maladie SLA exprimant une activité KCC2 génétiquement augmentée
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
4 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues du croisement de deux lignées génétiquement modifiées, elles sont pesées puis soumises à des tests d'agrippement et de rotarod, le porteur prévoyant de les laisser atteindre les points limites pour évaluer un éventuel gain de survie dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique. Il indique que l'atteinte de ces points limites peut occasionner des effets indésirables et une difficulté à se nourrir en fin de vie. Sur le remplacement, il décrit des modèles in vitro qu'il juge seulement "complémentaires" de l'approche in vivo.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie caractérisée par une dégénérescence des neurones commandant les muscles. La SLA survient pendant la vie adulte et conduit à une paralysie fatale. Aucun traitement n'est disponible pour cette maladie. La plupart des études se sont focalisées sur les périodes symptomatiques ou pré-symptomatiques et non sur les mécanismes initiaux conduisant fort probablement à la survenue de la SLA. La présente DAP est basée sur nos récents travaux montrant que la transmission synaptique inhibitrice est réduite aux stades périnataux au niveau des neurones moteur de la moelle épinière de souris modèle de la maladie SLA. Notre projet est donc basé sur l’hypothèse que les premières dérégulations liées à la SLA débutent dès le développement du système nerveux central et sont accompagnées de mécanismes de compensation. L'effondrement tardif de ces mécanismes de compensation conduirait à l'apparition des symptômes de la SLA. Nos travaux montrent un déficit dans la transmission synaptique inhibitrice à des stades précoces de développement. Nous proposons donc d’augmenter la transmission synaptique inhibitrice chez la souris en utilisant une approche génétique et nous émettons l’hypothèse que cette augmentation aura des répercussions positives sur le développement de la maladie chez la souris adulte.
Bénéfices attendus
Le présent projet a pour but de mettre en évidence un défaut d'inhibition chez une souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA). Cette démonstration pourra être bénéfique aux patients SLA qui pourraient être traités par des molécules agissant sur l'inhibition synaptique.
Procédures
Aucune procédure chirurgicale n'est prévue dans le présent projet. Les souris seront pesées de manière hebdomadaire, soumises au test d'agrippement (grip-test) et au test du rotarod (locomotion sur un cylindre mobile). La survie des souris sera également évaluée. Enfin, certaines souris seront euthanasiées afin de collecter les tissus nerveux (moelle épinière).
Impact sur les animaux
Notre projet prévoit de laisser les souris atteindre les points limites afin d'évaluer l'éventuelle amélioration de leur durée de vie après croisement avec des souris ayant un niveau d'inhibition accru. L'atteinte des points limites, bien que ces derniers soient controlés, peut occasionner des effets indésirables sur les animaux. Certaines souris seront enthanasiées en vue de prélever des tissus nerveux pour étude immunohistochimique à posteriori. Là encore, bien que réduits au maximum par des injections de produits anesthésiants, des effets indésirables sur les animaux sont à considérer.
Devenir
Les souris modèle de sclérose latérale amyotrophique ayant atteint les points limites et les animaux contrôles du même âge seront euthanasiés afin de prélever des tissus nerveux et réaliser à postériori des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les souris utilisées dans notre projet sont des souris transgéniques modèles murins de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) et des souris génétiquement modifiées afin d'augmenter le niveau d'inhibition au sein du système nerveux. Les deux souris seront croisées pour obtenir des animaux doublement génétiquement modifiés. Des animaux contrôles de la même lignée (et même portée) seront utilisés. Les modèles murins de la maladie SLA sont les animaux les plus utilisés pour tenter de comprendre les mécanismes de développement de cette maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs. Des modèles in vitro ont été développés pour l'étude du dysfonctionnement des motoneurones issus de patients SLA mais ces modèles restent complémentaires aux approches in vivo. Il est donc logique que le modèle murin de la SLA soit utilisé dans le cadre de la présente DAP.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, notre projet basé sur des méthodes variées permet d'utiliser au maximum tous les embryons et animaux néonataux disponibles issus d'une portée. Concernant les expériences réalisées chez l'adulte, un nombre minimum d'animaux est programmé en accord avec les tests statistiques qui seront réalisés à posteriori.
Raffinement
Les souris sont élevées avec un enrichissement. Des points limites sont établis afin de réduire au maximum la souffrance des animaux liée à leur difficulté à se nourrir en fin de vie.
Choix des espèces
La souris modèle de la maladie sclérose latérale amyotrophique (SLA) que nous utilisons reproduit les symptômes de la maladie de manière fiable et reproductive. L'autre souris présente un taux d’inhibition accru. Ces deux souris seront croisées afin d'obtenir des souris SLA ayant un niveau plus élevé d'inhibition (souris présentant une double modification génétique). Ces souris et leur contrôles non génétiquement modifiés seront testées chez des mâles puis femelles, au niveau comportemental à l'âge de 8 semaines jusqu'à l'âge de 20 semaines environ (= âge moyen de fin de vie de nos souris modèles de SLA).
Evaluation de la qualité de sources protéiques alimentaires chez le rat
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre proposée à l'adoption. Ils sont placés en cage individuelle pendant 48 heures pour recueillir urines et fèces, subissent des prélèvements sanguins à la queue et une injection d'un traceur avant la mise à mort, pour mesurer la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à la demande de la FAO. Le porteur indique que l'isolement en cage peut provoquer un stress car les rats vivent habituellement en groupe. Sur le remplacement, il affirme que les données in vitro ne sont pas comparables et que le recours à l'animal reste "nécessaire" pour obtenir des données fiables.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser la qualité nutritionnelle de différentes sources de protéines à destination de l’alimentation humaine. Il répond notamment à une demande de l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) de produire une base de données sur la digestibilité et la qualité de l’ensemble des sources protéiques. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.
Bénéfices attendus
De très nombreuses études montrent que le niveau de consommation des protéines animales des pays les plus riches ne pourra pas se généraliser à l’échelle planétaire en l’état actuel des ressources. Dans ce contexte, le maintien de la part des protéines dans l’alimentation nécessite de développer de nouveaux régimes et pratiques alimentaires qui viseront à augmenter la part relative des produits végétaux et inclure de nouvelles sources de protéines plus durables. L’évaluation de la qualité des protéines durables issues de ressources alternatives est une étape essentielle lors du développement d’ingrédients protéiques à haute valeur ajoutée. Ce projet permettra d’obtenir ces données. La caractérisation de la qualité de ces nouvelles sources de protéines permettra également de promouvoir certaines sources de protéines ou de recommander l’association de différentes sources de protéines pour répondre aux besoins de populations spécifiques.
Procédures
Afin de collecter leurs urines et fèces, les rats sont placés durant une durée limitée (48h) dans des cages individuelles spécifiquement conçues pour ces recueils. Lors de la procédure 3, Des prélèvements sanguins de 0,5mL de sang sont collectés à la veine de la queue des rats vigiles. Trois prélèvements sont réalisés par animal (avant, 1h après et 3h après l’ingestion du repas contenant la protéine à tester). Du matériel spécifique est utilisé pour limiter le temps et le stress engendrés par ce geste ; la durée ne dépasse pas 5 minutes par prise. Un anesthésique local est également appliqué sur la queue avant la prise de sang afin de minimiser la douleur. Des pesées quotidiennes sont réalisées pour lesquelles les rats sont emmaillotés dans une lingette afin de les habituer à être emmailloté. Ce même emmaillotage est également réalisé lors de la prise de sang pour contenir le rat. 30 minutes avant la mise à mort des animaux, l’injection d’un marqueur permettant d’évaluer la formation des protéines dans différents organes et tissus est réalisée sous anesthésie gazeuse en moins de 3 minutes.
Impact sur les animaux
La qualité nutritionnelle des protéines est évaluée en déterminant la consommation alimentaire individuelle des rats et en collectant les urines et fèces ponctuellement. Ceci permet de calculer plusieurs indices de qualité connus pour être transposables à l’homme. Il est donc nécessaire de les héberger en cage individuelles. Le placement en cage individuelle peut induire un stress lié à l’isolement car les rats sont des animaux vivant habituellement en groupe. Les prélèvements sanguins sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré.
Devenir
Selon les critères de qualité des protéines évalués, la mise à mort des animaux n’est pas nécessaire. Ainsi, les animaux pourront soit être placés pour l’adoption, soit être mis à mort à la fin de l’étude en fonction des critères de qualité à mesurer.
Remplacement
Un protocole de digestion des protéines in vitro a été harmonisé via un réseau international ces dernières années. Cependant les données obtenues in vitro ne sont pas complétement comparables avec les données obtenues chez l’animal. Le recours à des modèles animaux est donc aujourd’hui encore nécessaire pour obtenir des données fiables de digestibilité des acides aminés et donc des données sur la qualité des sources protéiques. Aussi, il n’y a pas de modèle n’utilisant pas d’animaux actuellement sur les effets des sources de protéines sur les concentrations d’acides aminés dans le sang ainsi que sur la formation de protéines dans les différents organes.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux par groupe a été calculé à 8 rats/groupe à partir de données comparables déjà publiées afin de garantir qu’avec ce nombre d’animaux les résultats soient interprétables. Afin de limiter le nombre d’animaux, les rats pourront être ré-utilisés pour évaluer un ou plusieurs critères de qualité des protéines. Les résultats pour chaque groupe sont comparés entre à l’aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles sont enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque. Les animaux sont regroupés (entre animaux de même sexe et de même lot), deux fois par semaine durant 2 heures dans des espaces spécialement conçus, appelés parcs. Les parcs sont des espaces de 1 m² environ, avec des tunnels suspendus, des zones où se cacher et des zones à escalader. Ces périodes de regroupement permettent aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Lors des prises de sang, un anesthésique local est appliqué sur la queue. L’animal est également habitué à l’emmaillotage dans un tissu lors des pesées quotidiennes afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Lors des injections du traceur permettant la mesure de la formation des protéines, les rats sont anesthésiés. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
LLe régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. Ainsi, l'Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) recommande l’utilisation de l’être humain, ou des modèles animaux que sont le porc et le rat pour l’évaluation de la qualité des protéines. Le critère de qualité des protéines se basant sur la capacité de la protéine à soutenir la croissance se mesure chez de très jeunes rats mâles et femelles, après le sevrage (3 semaines, ~50 g) . Le critère de qualité des protéines évaluant l’utilisation et la digestibilité de la protéine en collectant les fèces et les urines se mesure chez de jeunes rats mâles et femelles encore en phase de croissance (8 semaines, ~250 g). Le critère de qualité des protéines évaluant la digestibilité des acides aminés au niveau de l’intestin se mesure chez des rats mâles et femelles encore en phase de croissance (10 semaines, ~300 g).
Etude in vivo de l’impact de gènes de virulence de Mycobacterium bovis sur la physiopathologie de la tuberculose chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système respiratoire
Infectées par voie intranasale sous anesthésie avec des souches mutantes de Mycobacterium bovis, l'agent de la tuberculose bovine, les souris reçoivent aussi une puce télémétrique et subissent une prise de sang chaque semaine. 264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes, afin de préciser le rôle de trois gènes de virulence de la bactérie. Le porteur part de groupes de 24 souris pour en garder 6 au dernier jour, les autres étant mises à mort au fil du protocole quand elles atteignent les points limites, en général entre J21 et J35, avec perte de poids rapide et prostration. Il annonce une mise à mort "dès l'apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite", sans chiffrer ce seuil.
Objectifs
La tuberculose bovine est une pathologie majeure en santé animale. L'espèce mycobactérienne adaptée aux animaux, Mycobacterium bovis (Mb), est le principal agent pathogène responsable de la tuberculose bovine en Europe et au Royaume-Uni. C'est un pathogène zoonotique multi-hôtes capable d'infecter les ruminants (bovins, caprins, ovins), la faune sauvage et l'homme. Les programmes de surveillance et d’éradication, basés sur des campagnes de tests et l'abattage systématiques des bovins réactifs, n'ont pas permis d'éradiquer la tuberculose bovine (bTB). La bTB représente donc un risque direct pour les économies agricoles, la santé animale et humaine et la biodiversité dans les pays touchés. Il existe une hétérogénéité dans la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par Mb, ce qui influence directement le risque de transmission par les bovins infectés et la faune sauvage. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections à Mb est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Le projet a pour objectif de comprendre comment Mb interagit avec le système immunitaire de l’hôte et comment cette bactérie module la progression et la transmission de la maladie. Pour cela, nous souhaitons identifier les gènes de Mb essentiel pour sa persistance et sa dissémination. Pour cela nous souhaitons i) Comparer la virulence de mutants de Mb (ii) Suivre la réponse immunitaire et le développement du granulome en réponse aux différents mutants.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous mettrons au point pour la première fois la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur pour raffiner nos points limites (détection plus précoce de comportements). La validation du matériel, son installation, et de la méthode d’analyse permettra de proposer ce suivi pour nos prochains projets. Les résultats permettront de caractériser le rôle de 3 gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination de Mb. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés par les différentes souches.
Procédures
Pose de la puce d’identification et télémétrique : 1 fois et 1min/animal. Anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale + infection par voie intranasale : 1 fois et 15 min/animal. Prise de sang : 1 fois par semaine et 3 min/animal/prélèvement. Pesée : bi hebdomadaire et 1min/pesée/animal. Les prises de sang peuvent engendrer un hématome et la contention peut engendrer du stress pour l’animal.
Impact sur les animaux
Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourraient être observés. Nous savons par expérience que les souris sont sensibles aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec la souche M.bovis de référence. Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire.
Devenir
L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, cerveau, ganglion médiastinal) et fluides biologiques (sang, urine et fèces). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, des lésions, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.
Remplacement
A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test statisitique. Pour obtenir un groupe de 6 souris au dernier jour du protocole, nous savons qu’il nous faut partir d’un groupe de 24 animaux. En effet, tous les animaux ne réagissent pas pareil à l’infection, certains la contrôlent en formant des granulomes pulmonaires matures (25% des animaux), et les autres doivent être sacrifiés au fur et à mesure du protocole car ils atteignent les points limites (entre J21 et J35 classiquement). Chez ces animaux sensibles, des lésions désorganisées sont observables dans le poumon. En résumé, nos protocoles comprennent 24 souris, nous analysons les réponses immunitaires de deux groupes : les animaux résistants (5-6 souris) et sensibles (18-19 souris). Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).
Raffinement
Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes et la vidéosurveillance sera mise en place pour mieux suivre les souris. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. les animaux seront habitués en amont à la cellule d’expérimentation, une semaine avant le début de l’expérimentation Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruités ou rondelle de banane séchée ou popcorn sera réalisée.
Choix des espèces
Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. De plus le modèle murin permet une manipulation en animalerie A3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce. Le modèle murin nous offre la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour les voies de signalisation ou cytokines impliquées dans les réactions immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines (sexe indifférent). Pour ce projet, il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.
Impact de la neuroinflammation et des encéphalites virales sur le développement précoce du système nerveux
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
10 345 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, une partie gardée vivante comme géniteurs et les autres tués à l'issue. Aux stades larvaires surtout, ils sont infectés par des virus neuroinvasifs ou reçoivent des injections de cytokines et une activation optogénétique, pour étudier l'impact d'une inflammation précoce sur le système nerveux. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte d'équilibre, hémorragies, arythmies et nécrose cérébrale, les larves atteignant un point limite étant alors anesthésiées. Il affirme que ces interactions complexes ne peuvent être "totalement remplacées" in vitro, tout en signalant un modèle mathématique réduisant le nombre d'animaux.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de comprendre les mécanismes par lesquels une neuroinflammation précoce peut conduire à des déficits neurologiques ou des maladies psychiatriques, en utilisant le poisson-zèbre comme modèle animal. D’une part, nous étudierons les conséquences de cette inflammation dans le contexte d’une infection virale neuroinvasive, comme modèle d’encéphalite virale du nouveau-né. Nous utiliserons pour cela le modèle d’infection par le virus de Sindbis (SINV), bien établi, et nous développerons un autre modèle par le virus de herpès simplex (HSV-1). Nous chercherons à distinguer les impacts du virus lui-même sur ceux de l’inflammation dans les déficits neurologiques observés. D’autre part, nous analyserons les impacts d’une inflammation stérile sur le système nerveux en cours de développement ou de réparation. L’inflammation peut se manifester de diverses façons avec l’induction du plusieurs cytokines (molécules permettant la communication entre cellules) aux effets parfois antagonistes. Pour clarifier notre analyse, nous aurons essentiellement recours à l’injection de cytokines recombinantes. Nous développerons par ailleurs des systèmes optogénétiques pour induire l’expression de cytokine in vivo sans avoir recours à une injection. Afin de disséquer les mécanismes impliqués, nous aurons recours à différents mutants dans les voies de signalisation des cytokines ou dépourvus de certains types cellulaires importants. Nous vérifierons d’éventuelles modifications neurologiques chez ces mutants adultes. Nous étudierons le comportement de nos animaux ainsi que la morphologie et la composition cellulaire du système nerveux, avec un intérêt plus particulier pour le système dopaminergique (système particulier de transmission nerveuse) impliqué dans plusieurs maladies psychiatriques qui ont été liées à des infections précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux appréhender le rôle de la neuroinflammation dans les déficits neurologiques constatés après une encéphalite d’origine infectieuse ou stérile. Ceci devrait aider à décider du bien-fondé des traitements anti-inflammatoires dans ces situations. L’identification de gènes protecteurs contre l’infection sans effet indésirables lors d’une surexpression par des neurones ouvrira de nouvelles pistes vers le traitement ou la prévention des encéphalites virales par thérapie génique.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigile. Pour du génotypage de routine, des prélèvements d'un fragement de nageoire seront réalisés sous anesthésie. Microscopie intravitale effectuée sous anesthésie (durée maximale une heure, avec des sessions quotidennes pendant 10 jours au plus). Tests de comportement: enregistrement de la locomotion spontanée ou après stimuli lumieux ou sonore (durée maximale 1 heure, avec deux sessions par semaine au plus). Suivi d'une infection virale établie par microinjection sous anesthésie (pendant 7 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par microinjection de protéines sous anesthésie (pendant 14 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par activation optogétique (pendant 3 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par transgénèse (pendant 7 jours au plus). Suivi de le régénération du cerveau après arrêt d'une infection virale (pendant 17 jours au plus).
Impact sur les animaux
Les infections virales des larves sont susceptibles d’entraîner les effets suivants : perte d’équilibre, hyperactivité, apathie, hémorragies localisées, arythmies cardiaques, oedèmes, et ceci tant que l’infection persiste. Dans les cas d’infection létale (attendue chez certains mutants notamment) un assombrissement du cerveau sera préalablement observé, traduisant un début de nécrose, qui entraînera une anesthésie profonde évitant tout décès non traité. Les injections de cytokines inflammatoires (ou leur équivalent optogénétique) devraient causer hyperactivité ou apathie, comportements anxieux, arythmies cardiaques. Ces effets devraient être transitoires (moins de 24 heures) pour la plupart. Lors des tests de surexpression des ISGs (gènes induits par les interférons, qui sont des cytokines antivirales) par des neurones, ces effets sont attendus pour les ISGs qui seraient neurotoxiques. Dans les cas les plus extrême une nécrose localisée pourrait être observée, entraînant là aussi une anesthésie définitive. Dans les expériences de régénération du cerveau chez les juvéniles, une perte d’appétit et une apathie globale est attendue. Chez les adultes mutants pour les gènes immunitaires d’intérêt, une susceptibilité aux infections opportunistes peut se traduire par l’apparition plus précoce de signes classiques tels que cachexie, lordose, pétéchies, ou nage anormale.
Devenir
Les animaux utilisés à des fins d'élevage et entrant dans les procédures de génération de lignées transgéniques, de génotypage de routine, ou de caractérisation de lignées potentiellement délétères, seront conservées pour servir de géniteurs. Tous les autres animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
Nous travaillons sur des interactions complexes entre les nombreux types cellulaires du système nerveux, du système immuntiaire, et un pathogène, qui ne peuvent être totalement remplacées par des modèles in vitro ou in silico. Nous avons toutefois développé un modèle mathématique de la progression virale et de la réponse interféron de type I dans le système nerveux et la périphérie, à partir de nos données d'imagerie et de mesure d'expression des gènes par biologie moléculaire. Ce modèle permet de déduire certains paramètres expérimentaux, comme l'évolution du titre viral, réduisant le nombre d'animaux nécessaires à certaines de nos expériences.
Réduction
Les nombres d'animaux employés dans les expériences sont basés sur notre expérience passée pour des tests comparables, nous permettant de prédire la variance attendue et donc de réaliser des tests de puissance statistique. Lorsqu'il n'y a pas d'nterférence attendue entre deux tests, les animaux sont réutilisés pour plusieurs mesures.
Raffinement
Grâce à la transparence de la larve de poisson-zèbre, il nous est possible de mesurer la localisation de l'infection et la charge virale par des approches d'imagerie intravitale non-invasives. Pour limiter la douleur liée à l'infection de la larve sans interférer avec le déroulement de l'expérience, nous suivons les larves infectées en mesurant un score clinique quotidien; si l'infection est avancée avec atteinte de point limite, les larves sont anesthésiées pour éviter toute souffrance, tout en nous permettant de continuer à suivre l'évolution de l'infection.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle animal bien établi. En tant que vertébré, les principes de fonctionnement de ses systèmes nerveux et immunitaire sont semblables aux nôtres. Sa manipulation génétique est aisée et la petite taille, la transparence, et l’anesthésie facile de ses larves en fait un excellent système pour la microscopie intravitale. De nombreuses lignées transgéniques fluorescentes permettent d’observer la localisation et/ou l’activité de diverse populations neurales ou immunes. Combinées avec des pathogènes eux-mêmes porteurs de gènes fluorescents, on peut suivre en temps réel la propagation d’une infection et la réponse immune et neurale. La très grande majorité de nos expériences seront réalisées au stade larvaire, qui se prête le mieux à la microscopie et requiert le moins d’espace. Toutes les infections, notamment, seront réalisées à ce stade, avec des animaux maintenus en plaques multi-puits en incubateur dans un laboratoire de sécurité de niveau 2, facilitant le confinement des pathogènes. L’élevage de poissons adultes aura pour finalité principale la production des larves destinées à nos expériences. Si le(s) transgène(s) et/ou la mutation portés par ces adultes sont potentiellement dommageables, nous mesurerons cela aux stades juvénile et adulte. Les conséquences à long terme de certaines manipulations au cours du stade embryonnaires seront évaluées chez des poissons juvéniles.
Etude de la physiopathologie du syndrome de Marfan dans un modèle de poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
2 814 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Porteurs de mutations reproduisant le syndrome de Marfan, ils subissent des prélèvements de nageoire, des exercices de nage forcée pour mesurer vitesse et endurance et un protocole d'entraînement de plusieurs semaines, pour étudier les atteintes musculo-squelettiques de la maladie. Le porteur décrit une possible émaciation et des comportements d'anxiété ou de résignation, avec arrêt du protocole au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme que le poisson zèbre est le modèle vertébré "le plus simple" pour cette étude, plus rapide et moins coûteux que le rongeur.
Objectifs
Le syndrome de Marfan (SM) est une maladie génétique rare (1/5000), touchant aussi bien les hommes que les femmes. Les patients présentent des atteintes cardiovasculaires, oculaires et musculo squelettiques. Les anomalies cardiaques sont responsables d’une mortalité précoce, qui est maintenant contrôlable grâce aux progrès dans la prise en charge de la maladie. Par contre, la fatigue chronique et la moindre endurance physique sont des affections fréquentes des patients atteints de SM avec un impact important sur la qualité de vie, aussi l’intérêt de recherche s’est tourné vers une meilleure compréhension des atteintes musculosquelettiques. Une fragilité des tissus de soutien et un déficit musculaire, à l’origine d’un stress accru sur le système musculosquelettique, pourraient participer à ces symptômes. Une étude clinique a rapporté un déficit en masse maigre dès l'enfance et s'aggravant avec l'âge, et la pertinence d'un programme d'entraînement est actuellement évaluée. Comprendre les mécanismes à l’origine de ce déficit musculo-squelettique pourrait permettre l’identification de cibles thérapeutiques spécifiques et le développement de traitements. Nous proposons donc de développer un modèle animal original de la maladie et d’explorer les paramètres osseux et musculaires. Le poisson zèbre représente le système vertébré le plus simple disponible à ce jour pour évaluer l’impact d’une mutation d'un gène associé à une maladie génétique sur le système musculo squelettique à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire et de pouvoir évaluer les bénéfices éventuels d’un entrainement. Nous souhaitons donc développer et caractériser des lignées de poisson zèbre portant des mutations équivalentes aux mutations responsables du SM chez l'Homme. Leur comparaison permettra de mieux comprendre la physiopathologie du SM, afin d’identifier de possibles cibles thérapeutiques et d’optimiser les protocoles d’entrainement personnalisé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux documenter la physiopathologie du SM, qui est à l’heure actuelle mal comprise, et d’identifier des stratégies thérapeutiques allant de programme d’entrainement à des approches pharmacologiques qui pourront toutes deux être testées dans ce modèle poisson -zèbre de la maladie.
Procédures
-Prélèvement unique à la nageoire caudale pour génotypage sous anesthésie -Mesure mensuelle de la taille et du poids sous anesthésie -Analyse locomotion et comportement; durée 3h avec acclimatation; isolement -Exercice de nage forcée pour détermination de la vitesse maximale; durée
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus concernent essentiellement le phénotype associé à la perte de fonction du gène muté chez les patients atteints du syndrome de Marfan, qui devrait reproduire le syndrome de Marfan humain, et associe des malformations cardiovasculaires, oculaires et musculo-squelettiques. D’après les quelques données de la littérature, le développement du phénotype chez le poisson zèbre ne s’observe qu’à l’état homozygote (c'est-à-dire quand les 2 exemplaires du gène sont mutés) ou sur des doubles mutants. Cependant, le SM étant une maladie dominante (c'est-à-dire que la mutation sur un seul exemplaire du gène suffit à déclencher la maladie) chez l’Homme, une attention sera portée sur les hétérozygotes (un seul exemplaire du gène muté). En lien avec ces atteintes, les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnée de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qui sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Pour les procédures expérimentales, le prélèvement caudal pour le génotypage est réalisé sous anesthésie et les animaux recouvrent leur capacité à nager normalement dès le réveil. L’analyse du comportement de nage nécessite l’isolement du poisson dans le bac où le film est réalisé, isolement qui est maintenu pendant une durée maximale de 3 heures. Pour la nage forcée, la durée de nage à la vitesse maximale est une source de stress, mais ne pourra excéder 3 minutes. L'ensemble des points limites est détaillé dans chaque procédure.
Devenir
A l'issue des différentes procédures les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus pour des analyses histologiques et de l'expression génique (taille des fibres musculaires, structure des tissus de soutien, analyse du squelette, inflammation).
Remplacement
Comprendre la physiopathologie du SM nécessite l’utilisation d’un organisme intégré dans lequel l’étude des différents systèmes (cardiovasculaire, musculosquelettique) altérés dans cette maladie soit possible de même qu’une évaluation comportementale transposable à l’Homme. A ce jour, ces informations ne peuvent être obtenues à partir de modèles non animaux (cultures cellulaires ou organoïdes). Le poisson -zèbre représente pour cela le modèle vertébré le plus simple à ce jour, avec de nombreux systèmes moléculaires et cellulaires conservés avec les mammifères, et présente l’avantage de pouvoir facilement réaliser de la mutagenèse in vivo et produire des lignées transgéniques d’intérêt.
Réduction
A notre connaissance, 3 équipes ont développé des modèles de SM (perte de fonction) mais qui ne sont pas rendus disponibles à ce jour. De plus, dans l’idée de réaliser des corrélations phénotype/génotype entre ces mutations perte de fonction et des mutations ponctuelles générées de façon originale par notre équipe, il est essentiel de comparer des animaux de même fond génétique afin de s’affranchir de l’effet de gènes influenceurs pouvant différer d’un fond génétique à un autre. Nous effectuerons cependant une veille régulière des différents dépositaires afin de stopper la production de modèles redondants avec ceux disponibles. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observés au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 8 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour le suivi longitudinal des cohortes, des sous-groupes de 4 animaux seront nécessaires pour documenter les différents phénotypes au cours du temps. Les différents tissus seront biobanqués (congélation et inclusion paraffine) afin d’optimiser l’utilisation des animaux. Si un phénotype est présent sur les lignées simple mutation, les autres lignées ne seront pas produites. De même, si un phénotype est présent dès le stade hétérozygote, les élevages seront réalisés de façon à ne pas produire d’homozygotes. Afin de réduire le nombre d’animaux, les expérimentations n’ayant pas d’impact les unes sur les autres seront réalisées sur les mêmes animaux.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres pourra induire une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% du poids de référence de l'animal (poids maximal atteint) conduira à l'arrêt du protocole expérimental. Lors des expérimentations, des phases d’isolement ou des mises en reproduction, les bacs seront posés sur des photos représentant des fond aquatiques. Pour les suivis longitudinaux nécessitant une séparation des différents animaux d’une même ponte, les animaux d’intérêt seront maintenus avec des animaux d’un autre fond génétique afin de ne pas rester isolés. Pour les tests fonctionnels (tunnel de nage), une phase d’habituation au nouvel environnement sera systématiquement réalisée. Tous les poissons sont nourris deux fois par jour, avec notamment des artémies (crevettes fraiches) vivantes, cultivées sur place, qui représentent une source de nutriments frais et une forme d'enrichissement, puisque les poissons les chassent dans le bac.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est génétiquement modifiable, rendant aisé la génération de mutant d’un gène d’intérêt reproduisant une maladie génétique humaine comme le SM, et permet des études de grande envergure tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses que celles menées chez le rongeur. Le poisson zèbre est aussi un modèle pertinent pour étudier les dysfonctions musculo- squelettiques et cardiovasculaires, et récapitule les processus physiopathologiques observés chez l'Homme. De plus, beaucoup d’événements biologiques sont analysables par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées rapportrices ont été générées et sont facilement disponibles dans la communauté scientifique, permettant de répondre à de vraies questions biomédicales. Pour toutes ces raisons, le poisson zèbre est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies avec la possibilité d'aller très en profondeur pour l'exploration mécanistique. Un suivi du développement des signes de la maladie sera réalisé depuis le stade larvaire jusqu’au stade adulte, le SM étant une maladie se développant dès l’embryogenèse mais évoluant tout au long de la vie. De plus, une finalité du projet étant d’identifier des leviers thérapeutiques potentiels, l’évaluation du potentiel curatif d’approches thérapeutiques sur des traits cliniques installés est nécessaire.
Impact du microbiote intestinal sur le métabolisme énergétique des cellules hôtes : rôle dans la santé et dans les maladies inflammatoires de l’intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
12 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles subissent des gavages et des injections répétés et, pour certaines, une colite provoquant une inflammation intestinale douloureuse et des diarrhées, pour étudier l'effet du microbiote sur le métabolisme des cellules intestinales. Le porteur justifie ce nombre par la variabilité inter-animale et quinze ans d'usage de ces modèles, chaque animal étant euthanasié pour prélever plusieurs organes entiers. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne recrée la complexité d'un "organisme entier", ce qui rendrait le recours à l'animal "nécessaire".
Objectifs
Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI), dont la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des maladies caractérisées par une inflammation intestinale inappropriée. Leur incidence a augmenté de façon spectaculaire dans les pays occidentaux au cours des dernières décennies, ce qui démontre le rôle des facteurs environnementaux. Malgré le développement de nouveaux traitements, les MICI sont insuffisamment contrôlées chez une grande partie des patients, induisant une altération de la qualité de vie et un fardeau socio-économique. Il est donc urgent de mieux comprendre leur origine et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, le microbiote intestinal a été reconnu comme un acteur important au cours des MICI. Pour leur bon fonctionnement, nos cellules humaines ont besoin d’énergie et dépendent pour cela de plusieurs voies d’approvisionnement possibles que l’on appelle le « métabolisme énergétique ». Au cours des MICI, il a été observé une altération du métabolisme énergétique dans les cellules intestinales et immunitaires et cela pourrait jouer un rôle dans la maladie. Le métabolisme énergétique joue un rôle crucial dans la mise en place de la réponse immunitaire appropriée, et des données émergentes indiquent que le microbiote intestinal peut l'affecter directement. L'hypothèse principale est que l'altération du microbiote intestinal dans les MICI contribue à l'altération du métabolisme énergétique des cellules humaines intestinales et immunitaires, et au développement de la maladie. Le projet, en s’appuyant sur des expériences in vivo sur souris, a pour objectif (i) d'identifier les composant du microbiote ayant un impact sur le métabolisme énergétique des cellules et les mécanismes impliqués, (ii) de déchiffrer les conséquences des altérations du microbiote intestinal sur le métabolisme énergétique dans les maladies inflammatoires de l'intestin, et (iii) de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur le microbiote pour manipuler l'état énergétique cellulaire. La compréhension du rôle du microbiote intestinal dans la physiologie est d'une importance cruciale, car il est impliqué dans de nombreuses maladies humaines, notamment les MICI, mais aussi, le cancer, le syndrome métabolique et les troubles neuropsychiatriques.
Bénéfices attendus
Ce projet représente un programme de recherche complet avec de multiples bénéfices susceptibles de découler de ces travaux : (i) la caractérisation de la modulation fine du métabolisme énergétique des cellules hôtes par le microbiote intestinal ; (ii) l'identification des principaux acteurs microbiens dans ces processus ; (iii) l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles dans les maladies inflammatoires de l'intestin et probablement dans plusieurs autres maladies humaines affectées par le microbiote intestinal (maladies inflammatoires rhumatologiques, maladies métaboliques, cancer…). Les résultats obtenus chez la souris seront confrontés à des données obtenues à partir d’échantillons humains, ce qui ouvrira la voie au développement de nouvelles interventions thérapeutiques. Ce projet va donc relever des défis importants en produisant des résultats d’avant- garde pour une meilleure compréhension du dialogue entre microbiote et cellules humaines. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements dans les maladies inflammatoires de l'intestin d'abord, puis pour de nombreuses autres maladies affectées par une altération du microbiote.
Procédures
Les différents gestes réalisés sur les souris en fonction des groupes concernés seront les suivants : * Gavage (2 secondes) une fois par jour durant un à 20 jours * une injection unique (2 secondes) +/- un gavage (2 secondes) une fois par jour durant 1 jour à 12 semaines
Impact sur les animaux
Le projet comprend différentes interventions (gavages, injections intrapéritonéales ou encore intraveineuse) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale. Il peut s’y associer une diarrhée.
Devenir
L’ensemble des animaux (n=12540) seront euthanasiés à la fin des expériences afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements d’organes et réaliser les analyses nécessaires au projet de recherche. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.
Remplacement
Malgré le développement et l’utilisation de modèles non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation basales et inflammatoires. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu.
Réduction
Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Pour prendre en compte la variabilité biologique et assurer la robustesse des résultats obtenus, nous avons besoin de réaliser les expériences décrites dans des groupes expérimentaux de 10 souris et ce dans au minimum 2 expériences indépendantes (10 x2 = 20 souris en tout par condition, qui seront poolées dans les analyses statistiques si besoin). Le recours à une troisième expérience indépendante ne sera réalisé qu’en cas d’interprétation impossible des résultats après la 2eme expérience. Ce projet impliquera donc un maximum de 12540 animaux. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques (test de Kruskall-Wallis suivi par Mann-whitney) car les conditions de normalités ne sont fréquemment pas remplies.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Le personnel impliqué dans le projet est formé en continu pour garantir leur compétence et une veille scientifique et technique en continue. Il y aura une vérification quotidienne des animaux et une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (litière/abreuvement/nourriture). Les animaux seront hébergés dans des cages standards (4 à 5 souris par cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et du sizzlenest seront ajoutés dans les cages comme enrichissement de milieu. Les souris recevront ad libitum un aliment standard stérilisé par irradiation à 25 kGy et de l’eau autoclavée.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 14 semaines.
Etude d’un anticorps comme cible thérapeutique dans le traitement du mélanome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome humain, des gavages quotidiens pendant trois semaines et des injections d'anticorps, pour tester une cible thérapeutique contre le mélanome métastatique. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements et que les métastases pulmonaires peuvent provoquer perte de poids et troubles respiratoires, la mise à mort intervenant à 2 cm³ de tumeur. Il vise une collaboration avec l'industrie pharmaceutique et affirme que les méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la tumorigenèse.
Objectifs
Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que cibler une protéine exprimée de façon non conventionnelle par les cellules tumorales peut altérer la formation de mélanome et la progression des métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour démarrer des essais cliniques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre la validation préclinique d'une nouvelle approche thérapeutique pour le mélanome cutané. Si les résultats obtenus confirment ceux des précédentes expériences in vitro, des essais de xénogreffes de tumeurs provenant de patients humains dans un modèle murin, pourront être envisagées. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique afin d’étudier l’effet de notre approche d’immunothérapie lors d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le mélanome cutané.
Procédures
Toutes les souris seront injectées une fois avec des cellules tumorales humaines (200 microlitres). Les injections se font sous anesthésie gazeuse et durent une dizaine de secondes. Les injections d'anticorps (2 fois par semaine, 100 microlitres) ou de produit luminescent (une fois par semaine, 100 microlitres) sont faites sur animal vigile et durent quelques secondes. Le gavage oral sera quotidien à raison de 100 microlitres, est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes. Les traitements durent au maximum trois semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules per os. Une douleur peut apparaitre à cause de la répétition des gavages (1 fois par jour pendant 3 semaines maximum). L’introduction d’une aiguille pour les différentes injections entraine une légère douleur au point d’injection mais qui est brève. L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et/ou la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés notamment problèmes respiratoires liés aux métastases sur les poumons.
Devenir
Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.
Remplacement
Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’effet du traitement par un anticorps spécifique sur la croissance tumorale in vivo. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.
Réduction
Le nombre total de souris expérimentales sera de 200 réparti comme suit : 4 cohortes de 20 animaux injectés avec 4 lignées de cellules tumorales puis traités ou non avec l'anticorps et 3 cohortes de 40 animaux injectés avec 3 lignées cellulaires différentes, puis traités ou non avec l'anticorps en présence ou en absence d'une thérapie ciblée complémentaire. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Les paramètres étudiés seront la taille de la tumeur (mesurée avec un pied à coulisse) ainsi que sa vitesse de croissance et le développement des métastases pulmonaires. Les mélanomes humains sont des tumeurs hétérogènes dont les cellules ont un potentiel d’invasion plus ou moins important. Leur étude n'a pas permis d'isoler une lignée cellulaire modèle unique : il est donc nécessaire de tester plusieurs lignées cellulaires par différentes voies d'injection.
Raffinement
Des souris femelles seront utilisées : moins agressives que les mâles, elles seront hébergées en cohorte pour conserver l’interaction sociale. Les expérimentateurs établiront le contact avec les souris 8 jours avant le début de l’expérimentation les habituer à la manipulation et réduire leur angoisse. Les cages seront enrichies. Nous surveillerons quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. Nous mesurerons la taille de la tumeur primaire trois fois par semaine pour suivre la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. Nous adapterons la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées en fonction de la vitesse de croissance tumorale. La migration des cellules métastatiques sera suivie par l'utilisation du système d’imagerie in vivo (IVIS) une fois par semaine.
Choix des espèces
In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques environnementales de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. La souris est un modèle reconnu dans la communauté scientifique pour la greffe de lignées cancéreuses humaines afin de tester des traitements potentiellement transférables en médecine humaine. Pour éviter le rejet des cellules humaines de mélanomes après injection, nous utiliserons des souris immunodéprimées NOD/SCID/IL2GammaR. Ces souris présentent un système immunitaire déficient et nécessitent des conditions d'élevage stériles. Nous utiliserons des souris ayant atteint le stade adulte (6 semaines) qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc ou intraveineuse rétro-orbitale. La croissance tumorale ne devrait pas être impactée par l'âge des souris. Il est cependant préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes n'entravent pas leur capacité de mouvement.
Rôle de l’axe somatotrope dans l’homéostasie tissulaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène pour inactiver un gène, puis des prélèvements réguliers de touffes de poils et de fèces pendant six mois, pour étudier le rôle des hormones somatotropes dans le maintien des tissus au cours du vieillissement. Le porteur qualifie ces gestes de peu invasifs et compare la douleur du prélèvement de poils à celle d'interactions entre souris. Il affirme que la souris est la seule espèce vertébrée permettant cette approche transgénique et qu'un "organisme entier" est "indispensable".
Objectifs
Vieillir en bonne santé est un objectif majeur de notre société. La découverte de traitements anti-âge efficaces ou de comportements nutritionnels mieux adaptés pourrait avoir un impact spectaculaire sur la santé publique, en réduisant les problèmes de santé liés à l'âge tels que la démence, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies cardiaques. Cette découverte devrait permettre de maintenir une qualité de vie acceptable au sein d’une population de plus en plus vieillissante. Plusieurs caractéristiques d’un vieillissement en bonne santé ont été identifiées à ce jour. Notamment, au cours du temps, il est connu que les tissus constituant les organes s’altèrent et ont donc besoin d’être renouvelés voire remplacés. Ce maintien tissulaire dépend fortement de l’alimentation, qui peut être considérée comme le premier stress environnemental d’un organisme à travers l’action des nutriments sur les tissus. D’ailleurs, une restriction calorique montre en effet une meilleure longévité dans des modèles animaux. L’expression des hormones somatotropes qui participent à la détection des nutriments est diminuée lors de cette restriction alimentaire. Ces hormones somatotropes et leurs récepteurs cellulaires ont été clairement identifiées comme étant des facteurs qui influencent la durée de vie des mammifères. Elles ont de plus des rôles critiques dans le développement, la croissance et le métabolisme des organismes. Le blocage de cette régulation hormonale somatotrope conduit à une augmentation de longévité. Selon notre hypothèse, cet accroissement de longévité devrait s’appuyer sur un meilleur maintien des tissus au cours du vieillissement. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces hormones somatotropes dans le maintien et le renouvellement tissulaire au niveau de différents organes. Le rôle de ces récepteurs hormonaux dans le maintien tissulaire sera exploré dans des modèles où cette signalisation somatotrope est altérée. Notamment, nous ferons varier les taux de blocage du récepteur impliqué et nous suivrons le devenir des cellules inactivées au sein des tissus au cours du vieillissement par des mesures longitudinales des taux d’inactivation sur des souris transgéniques mutantes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre comment l’axe somatotrope influence le devenir des cellules souches responsables du bon maintien des tissus au cours du vieillissement. Cette étude ne peut être effectuée qu’in vivo sur des modèles animaux de mammifères proches de l’homme où les tissus/organes sont dans un contexte permettant à différents types de cellules d’interagir entre eux au cours du temps. L’aspect intégré du modèle est essentiel pour comprendre dans son ensemble les mécanismes gérant l’activité des cellules souches dans les processus de régénération et de maintien à l’équilibre des tissus constitutifs d’organes. L’évaluation du rôle du récepteur hormonal dans l’homéostasie tissulaire proposée ici sera bénéfique en santé humaine, car elle permettra de proposer des pistes dans la prévention d’une meilleure santé humaine dans notre population vieillissante.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les souris seront injectées en intrapéritonéale avec contention sur animal vigile par trois doses différentes de tamoxifène afin d’induire l’inactivation du gène cible (environ 30 secondes par animal). Les poils et les fèces seront prélevés sur l’ensemble des animaux vigiles sur une période de 6 mois à raison d’un prélèvement par quinzaine, soit au total 14 prélèvements de touffes de poils et de crottes par souris (nombre maximum). Ces prélèvements ne durent pas plus de quelques minutes par animal (environ 2 minutes). A la fin de la période de maintien, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales de tamoxifène nécessaire pour induire le modèle implique une contention qui entraine un léger stress et une douleur de courte durée liée à l’injection. La récolte de fèces nécessite un isolement de quelques minutes qui peut également être source d'un léger stress mais n’a aucun impact sur le comportement global de l’animal. Le prélèvement de poils sera effectué par prise de petites touffes avec une pince plate et sera espacé d’au moins deux semaines. Ce type de prélèvement induit une légère douleur similaire à celle des interactions sociales entre deux souris.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour limiter la souffrance animale et pour l’étude histologique ou biochimique des tissus. La récupération des tissus post-mortem permettra une analyse des taux d’inactivation du gène cible par amplification quantitative de l’ADN.
Remplacement
Dans la mise en œuvre de ce projet, utiliser l’animal vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le maintien des tissus d’un organisme au cours du vieillissement. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu, notamment pour caractériser les compétitions/interactions existant entre des cellules inactivées pour le récepteur hormonal au sein des tissus d’un organisme multicellulaire. De plus la stimulation de croissance suite à l’inhibition de la voie de signalisation ne peut être obtenue que dans des modèles in vivo où les régulations hormonales peuvent se mettre en place. Notre objectif étant d’évaluer la possibilité de remplacement cellulaire au sein d’un tissu complexe, il ne peut être atteint que dans notre modèle de souris transgénique.
Réduction
Le projet impliquera un total de 130 animaux. Nous limitons systématiquement le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque souris est utilisée pour un maximum de protocoles expérimentaux, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. La procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris comme un ajustement des doses de tamoxifène à injecter. Le suivi longitudinal du taux d’inactivation du récepteur qui sera effectué par prélèvement de petites touffes de poils et de fèces au cours de la vie de la souris, permet de réduire substantiellement le nombre de souris nécessaire pour l’étude proposée. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée tout en tenant compte des impératifs de réduction. Les taux d’inactivation seront comparés au sein de chaque groupe par un test statistique adapté.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi en continu à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés quand cela est possible/nécessaire. Les prises de touffes de poils prélevés seront réduites au minimum nécessaire pour les analyses par amplification quantitative de l’ADN et les volumes injectés de tamoxifène seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce vertébrée qui permet une approche par transgénèse avec élaboration de modèles génétiques complexes. Dans le cadre d’une étude intégrée au sein d’un organisme du devenir du maintien des tissus, elle représente un modèle de choix. De plus, l’utilisation de souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles les gènes de l’axe somatotrope peuvent être invalidés. La souris représente un modèle de choix pour l’analyse exploratoire de ces gènes impliqués dans l’homéostasie tissulaire au cours du vieillissement. Les premières études menées sur ces modèles transgéniques ont permis d’aborder des questions fondamentales au niveau du maintien de la fonctionnalité des organes qui n’auraient pas pu être obtenues à partir de lignées cellulaires. Les expériences seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 3 mois ou d’un an, et seront suivies pendant six mois. Les deux âges choisis sont les plus adaptés à l’étude du maintien tissulaire au cours du vieillissement et sont assez éloignés des stades du développement où la croissance de l’animal peut perturber le remplacement tissulaire.
Évaluation d’un traitement anti-tumoral sur la réponse immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections répétées de quelques secondes, une vaccination et un inhibiteur dérivé d'une toxine bactérienne, pour mesurer l'effet de ce traitement anti-myélome sur la réponse immunitaire. Le porteur n'attend qu'une douleur légère au point d'injection et présente le projet comme une étude préliminaire répondant à une question posée par des industriels. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire doit être analysée sur un "organisme entier".
Objectifs
Le myélome multiple (MM) est un cancer caractérisé par l’expansion de plasmocytes. L'introduction des chimiothérapies reposant sur les inhibiteurs du protéasome (IP) et sur des immunomodulateurs (IMID) a amélioré la survie des patients. Cependant, ces molécules induisent des effets secondaires sévères et développent de chimiorésistances. Le MM reste donc un cancer incurable et il est essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons démontré qu’une toxine bactérienne bloque le translocon (Sec61) qui est le canal protéique assurant l’import dans le réticulum endoplasmique de la majorité des protéines secrétées ou membranaires synthétisées. En bloquant cet import, cette toxine entraîne leur dégradation par le protéasome et déclenche un stress protéotoxique conduisant à l’apoptose. Nous avons montré que le blocage de Sec61 par la mycolactone potentialisait les activités anti-MM des IP et des IMID et que la trithérapie associant mycolactone aux IP et IMID était supérieure aux mono- et bithérapies dans le contrôle de la croissance tumorale chez la souris, sans induire d'effets secondaires. Ces travaux ont donc révélé que le blocage de Sec61 constituait une piste thérapeutique innovante et prometteuse pour le MM. Cependant, par ces capacités à bloquer la production des protéines, un traitement basé sur l’utilisation de ce type d’inhibiteur pourrait avoir un effet délétère sur l’induction d’une réponse immunitaire. Étant donné que cette réponse joue un rôle important dans le contrôle de la croissance tumorale, il est donc essentiel de déterminer l’effet d’un tel traitement sur cette réponse. L’objectif de ce projet consistera donc à déterminer l’influence de ce traitement aux doses précédemment établies sur l’induction d’une réponse immunitaire chez des souris immunocompétentes. Ce projet constitue donc une étude préliminaire car, s’il s’avérait que les doses déjà identifiées de cet inhibiteur permettant de réduire la croissance tumorale bloquait, dans un même temps, la réponse immunitaire, il sera alors essentiel par la suite, d’établir un nouveau projet afin d’analyser le développement de cancer et la réponses immunitaire antitumorale chez des souris immunocompétentes porteuses de tumeur afin d’adapter le traitement pour obtenir un réel bénéfice. Ce projet répondra à une question demandée lors des évaluations par les industriels impliqués pour l’utilisation éventuelle de notre approche dans le traitement de cancers.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’évaluer in vivo si le traitement par l’inhibition de la translocation des protéines sécrétées et transmembranaires à des doses thérapeutiques déjà établies ont une influence sur la réponse immunitaire. Ce projet constitue une étude préliminaire sur la réponse immunitaire et les résultats obtenus nous permettrons d’établir un nouveau projet sur les conséquences d’un tel traitement sur les réponses anti-tumorales et d’établir s’il y a un réel bénéfice de développer une telle stratégie thérapeutique et d’en déterminer les conditions. Dans l’ensemble, les résultats nous permettrons de définir une stratégie thérapeutique basée sur l’inhibition de la translocation dans le cadre de traitement de certains cancers et tout particulièrement sur le Myélome multiple.
Procédures
Injections répétées de quelques secondes (5 à 10 secondes).
Impact sur les animaux
D’après notre expérience, la vaccination et le traitement ne devrait pas induire de douleur particulière, de stress ou d’inconfort mise à part une douleur légère sur le site d’injection lors de la vaccination et de l’administration du traitement qui se fera par injections à l’aide de seringue.
Devenir
Tous les animaux du projet, comprenant une procédure unique, seront mis à mort car le projet nécessite de faire des analyses sur des organes vitaux et donc de les prélever après leur mise à mort.
Remplacement
Nos études ont mis en évidence un effet thérapeutique des traitements sur des lignées et des cellules primaires humaines tumorales de MM in vitro. Ce projet vise maintenant à caractériser et comprendre les effets thérapeutiques d’un inhibiteur de la translocation des protéines sur l’induction des réponses immunitaires, réponses essentielles dans le contrôle de la croissance tumorale lors de développement de cancers. L’induction d’une réponse immunitaire est un phénomène complexe faisant intervenir de nombreux types cellulaires dans différent organes et ne peut être étudié que dans sa globalité. En effet, il existe de nombreux éléments inducteurs et régulateurs impliquées dans ces réponses et certains ne sont pas encore connus. L’effet d’un tel inhibiteur sur la réponse immunitaire devra donc être analysé et validé sur un organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur notre expérience de la conception d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé et nous utiliserons des techniques expérimentales nous permettant d’analyser sur un seul individu plusieurs facteurs caractérisant la réponse immunitaire pour obtenir le maximum d’information en utilisant le moins d’animaux possible. Une analyse statistique sera réalisée afin de valider les résultats. Le protocole de vaccination établi et utilisé depuis une quinzaine d’année nous assure que 100% des souris répondent à la vaccination en donnant de faibles variations sur les tests utilisés pour l’évaluer. Ceci nous permet alors d’utiliser le strict minimum de souris sans avoir le besoin d’utiliser des souris supplémentaires pour palier le fait que des souris seraient susceptibles de ne pas répondre.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans un environnement protégé et hébergées en groupe, avec une litière appropriée, des matériaux de nidification. Suivant notre expérience, la vaccination et le traitement ne devrait pas induire d’effets indésirables mise à part une douleur légère lors de la vaccination et de l’administration de l’inhibiteur qui se fera par injections à l’aide de seringue ne nécessitant pas de procédures particulières. La durée et les doses sont calculées pour ne pas induire d’effet indésirable, tout en atteignant les objectifs scientifiques. Néanmoins les souris seront attentivement observées lors de l’expérience, et si des animaux présentaient le moindre signe de douleurs ou de stress, ils seront mis à mort.
Choix des espèces
La souris présente le meilleur compromis éthique entre modèle mammifère, résultats le plus proches de l’humain. Les métabolismes sont bien caractérisés et largement comparables à ceux de l’homme. En conséquence, les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. D’autre part, de nombreux outils très performants sont disponibles pour l’analyse de réponses immunitaires chez la souris (anticorps monoclonaux, marqueurs) nous permettant d’avoir des réponses claires et précises en utilisant de faibles quantités d’échantillons et permettant ainsi d’analyser différents facteurs. De plus de nombreuses données sont déjà disponibles (par notre expérience et dans la littérature) nous permettant de valider les résultats par comparaison. Les cancers ciblés se développant généralement chez l’adulte, nous n’utiliserons que des individus adulte (> 10 semaines).