Oncologie

688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypothyroïdie leur est induite par un régime carencé et un antithyroïdien, associée à une chirurgie cérébrale et à un hébergement en obscurité constante ou en cycle jour-nuit atypique, en cage individuelle. Le porteur attend une bradycardie, une température abaissée et un état d'anxiété supérieur à la normale, évalué par des tests comportementaux, avant la mise à mort pour prélèvement de tissus. Les débouchés annoncés pour les patients, une luminothérapie ou des thérapies comportementales, restent conditionnés à la mise en évidence d'un dérèglement de l'horloge interne.

Objectifs

L'hypothyroïdie correspond à un déficit en hormones thyroïdiennes. Toutes causes confondues, l'hypothyroïdie touche près de 10% de la population. Les patients souffrent de fatigue chronique, de bradycardie, d'une sensibilité accrue au froid, et de prise de poids. Ils présentent aussi des troubles liés à l'humeur tels qu'irritabilité, anxiété ou dépression, dont l'étiologie reste mal comprise. Plusieurs observations sur des patients et des modèles animaux suggèrent que l'hypothyroïdie pourrait perturber l'horloge circadienne. Cette horloge biologique coordonne les rythmes physiologiques et comportementaux avec le cycle jour-nuit. Comme le dérèglement de l'horloge cause des troubles de l'humeur tels que ceux observés chez les patients hypothyroïdiens; il est tentant de supposer un lien de causalité entre ces troubles et les rythmes biologiques au cours de l'hypothyroïdie. Nous souhaitons tester cette hypothèse dans un modèle murin d'hypothyroïdie induite.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de mieux comprendre l'étiologie des troubles de l'humeur souvent associés à l'hypothyroïdie, et d'envisager des approches thérapeutiques au-delà du traitement hormonal de substitution. En effet, la prise d'hormone thyroïdienne est efficace pour le traitement de l'hypothyroïdie sur le long terme, mais définir et ajuster la dose optimale de chaque patient s'avère souvent très long et laborieux. La mise en évidence d'un dysfonctionnement de l'horloge circadienne ouvrirait de nouvelles possibilités d'accompagnement des patients dysthyroïdiens pendant cette période d'ajustements hormonaux, par exemple par la mise en place d'une luminothérapie ou de thérapies comportementales pour resynchroniser les rythmes biologiques.

Procédures

Induction d'une hypothyroïdie par régime hypo-iodé et traitement anti-thyroïdien. Maintenue pendant 2 à 3 semaines. Prélèvement unique de 3µl de sang, à la pointe de la queue de souris vigiles. Chirurgie cérébrale ciblée, sous anesthésie générale. Hébergement en cycle jour-nuit atypique (11.5 heures de lumière, 11.5 heures d'obscurité; ou obscurité constante pendant 2 semaines). Hébergement en cage isolée, avec contacts sociaux visuels.

Impact sur les animaux

La présence d'un agent anti-thyroïdien dans l'aliment hypo-iodé le rend moins appétant. Les souris mangent moins mais continuent à prendre du poids, et se stabilisent à environ 90% du poids des souris nourries avec l'aliment contrôle. Les souris hypothyroïdiennes présentent aussi une température corporelle légèrement abaissée par rapport aux souris contrôles (uniquement pendant leur phase d'inactivité), ainsi qu'une bradycardie (ralentissement de la fréquence cardiaque d'environ 25%). Comme cela est le cas chez les patients, nous nous attendons aussi à un état d'anxiété supérieur à la normale, qui sera évalué au travers des tests comportementaux. Le fonctionnement de l'horloge interne sera testé par mesure de l'activité locomotrice volontaire en absence de repères temporels (suppression du cycle jour-nuit). Cette étape requiert un hébergement des souris en cages individuelles équipées d'une roue d'activité, dans l'obscurité constante pendant une vingtaine de jours. Un prélèvement sanguin unique sera réalisé pour évaluation du statut thyroïdien par dosage hormonal. Cela nécessite la collecte d'une goutte de sang suite à une incision à la pointe de la queue (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement de tissu.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour étudier l'impact d'une perturbation systémique (l'hypothyroïdie) sur le fonctionnement du cerveau et ses conséquences en terme de comportement. La souris constitue un excellent modèle d'étude des rythmes circadiens chez les Mammifères, pour lequel la physiologie générale, les comportements, et le fonctionnement de l'horloge interne sont suffisamment bien décrits pour servir de référence dans le cadre de ce projet. Notre objectif sur le long terme est d'établir un modèle mathématique suffisamment riche et prédictif pour anticiper le devenir de l'horloge circadienne dans différentes situations physiopathologiques en complément/remplacement des modèles animaux. Les données que nous obtiendrons dans ce projet s'inscrivent dans cette ambition et serviront à préciser et compléter une version initiale du modèle que nous avons proposé.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux impliqués dans les tests comportementaux a été estimée par un calcul de puissance a priori (n=26 souris par groupe). Chaque souris sera évaluée de façon longitudinale dans plusieurs tests, permettant de réduire le nombre total d'animaux. Pour la procédure d'imagerie in vivo, chaque souris sera testée sous régime contrôle et sous régime hypothyroïdien. Chaque souris étant son propre contrôle, le nombre d'animaux impliqués sera réduit. Notre expérience démontre qu'il faut opérer 6 à 8 souris pour obtenir n=4 souris avec un signal suffisamment fort afin de décrire le fonctionnement de suffisamment de neurones horloges dans une condition donnée (un minimum de 10 neurones visibles dans le champ optique par animal.

Raffinement

Dans un souci de raffinement du protocole, nous avons préféré mettre en oeuvre un modèle d'hypothyroïdie induite plutôt que de réaliser une ablation chirurgicale de la glande thyroïde. Cette approche ne nécessite pas d'adaptation particulière des conditions d'élevage. Toutefois, l'apport de matériel de nidification sera renforcé afin de permettre aux souris hypothyroïdiennes (en légère hypothermie) de mieux maitriser la température de leur environnement. Les animaux seront habitués à être manipulés par la personne en charge des tests comportementaux. En vue d'évaluer le statut thyroïdien de façon la moins invasive possible, nous avons développé un protocole de dosage ultra-sensible de l'hormone TSH, à partir d'un volume extrêmement faible de sang total (3 µl, à comparer avec 50 à 100 µl pour les kits commerciaux). La chirurgie préparatoire à la procédure d'imagerie est conduite sous anesthésie générale, avec médication post-opératoire pendant 48 heures. Toutes les souris hébergées en cage isolée conserveront un contact visuel avec d'autres congénères. L'hébergement dans les cages à roue constitue un enrichissement très apprécié, et la mesure de l'activité locomotrice volontaire fournira un index de l'état général des souris : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par les souris contrôles sera pesée et observée. En cas de perte de poids supérieure à 10% du poids initial, de prostration ou de poil hérissé, les souris auront accès à de la nourriture hydratée et/ou un anti-inflammatoire non-stéroïdien pendant 24 à 72 heures. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% à son poids initial, alors elle sera mise à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère de choix dont l'horloge circadienne et la physiologie thyroïdienne reposent sur les mêmes principes moléculaires et cellulaires que l'espèce humaine. Cette espèce donne accès à un large éventail d'outils génétiques et moléculaires pour manipuler les systèmes biologiques (ex : nous utiliserons ici des lignées exprimant des allèles modifiés de gènes de l'horloge), ou pour mesurer l'activité neuronale par imagerie in vivo. Jeunes adultes de 6-7 semaines en début d'expérimentation.

2 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une septicémie provoquée par ligature et perforation du caecum, un modèle que le porteur reconnaît induire une mortalité élevée, avant injection de cellules stromales dans la cavité péritonéale. Les souris sont réparties par âge, jusqu'à deux ans, pour évaluer l'effet du traitement au cours du vieillissement. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de confirmer in vivo des effets déjà montrés in vitro et qu'une étude chez la souris est "nécessaire".

Objectifs

L'objectif du projet est de mettre en évidence l'effet de différentes populations de cellules stromales sur la résolution d'une septicémie induit après une péritonite au cours du vieillissement et de comprendre les mécanismes d'action des différentes populations cellulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mettre en évidence l’effet des cellules stromales mésenchymateuses "naives" ou primées sur l’inflammation et la résolution d'une septicémie induite après une péritonite et d’étudier l’intérêt de ce traitement au cours du vieillissement. En effet, nous espérons que les cellules stromales mesenchymateuses diminueront l’inflammation induite par la péritonite augmentant ainsi la survie des animaux. De plus, notre étude nous permettra de mieux comprendre le mode d'action des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de péritonite.

Procédures

La péritonite est induite chez certains animaux par ligature et ponction du caecum. Les souris sont endormies par inhalation d’un gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. La profondeur de l’anesthésie est évaluée par l’absence de réponse à la stimulation des extrémités. Une incision cutanée au niveau de l’abdomen est réalisée puis l’ouverture de la cavité péritonéale est réalisée au ciseau. Le caecum est ligaturé et perforé à l’aide d’une aiguille. Après injection de différentes populations de cellules stromales mésenchymateuses dans la cavité péritonéale encore ouverte, la fermeture du péritoine en deux plans est réalisée. Réalisée par une personne entrainée, la chirurgie dure entre 7 et 10 min. Avant l'intervention, un analgésique est injecté sur animaux endormis Pour les animaux chez qui la péritonite sera induite par injection de composés protéiques, les animaux auront 2 injections intrapéritonéales l’une contenant le composés protéiques l’autres les cellules thérapeutiques. Avant l'intervention, une injection sous cutané d’analgésique est réalisée sur animaux vigiles. L'injection d'analgésique sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours

Impact sur les animaux

Le modèle de péritonite induit par ligature et ponction ceacale est un modèle qui induit une mortalité assez élevée chez les animaux opérés. La douleur induite par la chirurgie et par l'induction de la péritonite est gérée par administration d'analgésiques.

Devenir

Tous les animaux suivant ces différents protocoles seront mis à mort afin de permettre l'analyse de l'effet des différents traitements sur la réponse immunitaire, l'inflammation générale et les lésions des différents organes de la cavité péritonéale.

Remplacement

L'effet immunomodulateur des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses a été démontré in vitro mais il est indispensable de confirmer ces résultats in vivo, en ayant une vraie situation d’inflammation mettant en jeu l’ensemble des partenaires cellulaires qui interviennent lors de l’inflammation. Une étude chez la souris s’avère donc nécessaire.

Réduction

Notre expérience nous permet de déterminer que le nombre de 5 souris par groupe et la réalisation en triplicat de l'expérience nous permettra d'évaluer l'effet de nos différentes populations cellulaires et de diminuer ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nous inclurons suffisamment de souris par groupe et effectuerons trois expériences indépendantes pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’expérience de notre laboratoire nous permet de déterminer le nombre optimal de souris à utiliser par lot.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés sous gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. Un antalgique est placé dans l'eau de boisson des animaux 24h avant l'intervention puis de manière continue après la chirurgie. Vu la stabilité de la molécule, le biberon sera changé tous les jours. De plus, une injection d’un analgésique sera effectuée au moment de la chirurgie sur animaux endormis afin de diminuer la douleur. Cette injection sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours. Les animaux seront élevés à 5 animaux par cage) afin de limiter le stress lié à la chirurgie et à l'isolement. Du papier type kleenex ainsi que des cabanes type "igloo" seront ajoutés dans la cage afin de respectivement permettre la formation du nid et d’enrichir l’environnement de vie des animaux. Des croquettes imbibées d'eau contenant un analgésique seront placées directement dans la cage afin de limiter au maximum l'extension des animaux opérés. De plus, une grille de score et l’utilisation de point limite adaptés permettront de définir les critères d’arrêt de souffrance et d'entraîner la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle complexe qui nous permettra d'évaluer l'effet de nos cellules d'intérêt sur la réponse inflammatoire locale mais également en systèmique. De plus, le modèle de sepsis chez la souris est très bien décrit nous donnant des informations essentielles au bon déroulement de notre procédure. Enfin, les outils techniques et biochimiques nécessaires à l'analyse des données obtenues sont développées chez cette espèce. Les personnes âgées présentent un risque accru de mortalité lors d’une évolution négative d’une péritonite. L'utilisation d'animaux à différents âges (8 semaines, 1 an, 2 ans) nous permettra d'évaluer l'intérêt d'utiliser les différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses comme traitement d'un sepsis induit après péritonite au cours du vieillissement.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire humaine est greffée dans leurs glandes mammaires, puis elles reçoivent des injections de traceurs radiomarqués et passent plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie avant une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que l'inoculation de la tumeur peut engendrer du stress, que la croissance ou la nécrose tumorale peut provoquer une gêne et que les anesthésies répétées peuvent affecter les animaux. Il affirme que les résultats in vitro ne suffisent pas et qu'un modèle animal porteur de tumeurs est "indispensable" pour valider le ciblage de ces peptides.

Objectifs

Le récepteur NeuroTenSine-1 (NTS-1) a été précédemment identifié comme étant une excellente cible dans les tumeurs primaires et les métastases ganglionnaires chez des patients atteints d’un cancer de la prostate et de cancer du sein avec un pronostic plus sombre. Des résultats prometteurs ont été obtenus au cours d'études d'imagerie préclinique PET (Tomographie par Emission de Positons) avec des analogues peptidiques radiomarqués au 68Ga (émetteur beta+). Afin d’optimiser ces séries d’analogues, 2 peptides radiomarqués au gallium-68 et au fluor-18 pour le diagnostic PET et 1 peptide radiomarqué au lutétium-177 pour la radiothérapie ont été étudiés et validés in vitro. Le présent projet de recherche préclinique vise à tester in vivo ces radiopeptides sur des modèles murins de cancers du sein exprimant ces récepteurs NTS-1.

Bénéfices attendus

Si un patient métastatique est imagé avec succès par tomographie par émission de positons suite à une injection de radiopharmaceutique dédié, celui-ci pourrait alors bénéficier d’un traitement ciblé par radionucléides (TRT : Targeted Radionuclide Therapy) utilisant le même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique. Le projet vise à optimiser une série d’analogues en modifiant le radionucléide associé à un peptide sur un modèle de cancer du sein triple négatif.

Procédures

Les différentes interventions sur les 80 souris Balb/c nude sont les suivantes : - xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales (cancer du sein) dans les glandes mammaires sous anesthésie gazeuse (10min) - 2 Injections intraveineuses au niveau de la queue de 200µl de solution saline contenant les radiotraceurs sous anesthésie gazeuse pour les 80 souris (5 min) - 1 acquisition PET/CT (18F-FDG) pour les 80 souris sous anesthésie gazeuse (5min CT + 15 min PET) - 1 acquisition PET/CT pour 1 souris sur 2 soit 20 souris du groupe "diagnostic" sous anesthésie gazeuse (5min CT + 15 min PET) - 1 acquisition SPECT/CT pour les 40 souris du groupe "thérapie" sous anesthésie gazeuse (5min CT + 20 min SPECT) - 1 ponction cardiaque terminale pour les 80 souris sous anesthésie gazeuse 3% (5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau des glandes mammaires pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies répétées pour la mise en place du modèle et pour l'imagerie ([18F]FDG et du radiopeptide étudié) peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 80 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur NTS1 est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique des 3 peptides.

Réduction

les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. 2 peptides « diagnostic PET » et 1 peptide «thérapie » seront étudiés. Pour chaque peptide « diagnostic PET », il est nécessaire de visualiser leur biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs NTS-1. Ainsi, 10 souris seront injectées avec le radiopeptide seul et 10 souris avec le radiopeptide + 150 µg de neurotensine pour le « blocking ». Pour l’étude du peptide thérapeutique radiomarqué au 177Lu, 40 souris seront incluses dans le protocole de biodistribution : 1 lot « radiopeptide seul » et 1 lot « blocking » ; 4 temps par lot ; 5 souris par temps.

Raffinement

Les souris sont placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour/nuit 12h/12h, enrichissement des cages) au sein d’une animalerie de recherche agréée. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la greffe orthotopique de tumeur humaine. Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les études seront initiées à 10 semaines de développement. L’induction des tumeurs se fera à 10 semaines. Le suivi de la croissance tumorale peut être réalisée en externe par mesure à l’aide d’un pied à coulisse. Lorsque les tumeurs atteindront un volume minimum de 150 mm3, une première acquisition [18F]-FDG sera effectuée pour suivre la croissance tumorale et les métastases potentielles. Les études de 3 radiopeptides pourront être initiées minimum 2j après la première étude PET.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le lendemain de leur naissance, les souriceaux reçoivent deux injections quotidiennes d'une molécule inflammatoire pendant cinq jours, puis subissent des tests de tolérance à l'insuline et au glucose avec prélèvements de sang à la queue et un isolement d'une semaine en cage métabolique. Le porteur indique une mortalité de 5 à 10 % pendant les injections, un retard de croissance, des troubles du comportement et une douleur locale. Il affirme qu'aucune approche in vitro ou informatique ne peut reproduire les connexions entre le cerveau et le métabolisme et tue tous les animaux pour prélever leurs organes.

Objectifs

La naissance prématurée (avant la fin normale de la grossesse) est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons prématurés qui survivent au-delà de l’enfance est en hausse. Il existe néanmoins une inflammation importante chez 20 à 40% de ces enfants à la naissance, qui peut entraîner des lésions du cerveau. Ces lésions sont à l’origine de handicaps, de déficits des certaines capacités intellectuelles et de troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte et sont regroupées sous le terme d'Encéphalopathie du Prématuré (EDP). En plus de ces déficits, des études récentes ont démontré qu’1 enfant prématuré sur 5 développe de l’obésité pendant l’enfance. L'obésité est le principal facteur de risque pour le diabète de type 2. Pour comprendre comment une inflammation au moment de la naissance peut favoriser le développement d’une obésité et du diabète, nous utiliserons un modèle de EDP chez le souriceau combiné avec un régime hypergras. Les mères seront soumises jusqu’au sevrage de leurs petits soit à un régime hypergras soit à un régime contrôle sous forme de croquettes plus ou moins riches en graisse.

Bénéfices attendus

Comprendre pourquoi la naissance prématurée et l’inflammation à la naissance peuvent favoriser ensuite l’apparition d’une obésité et d’un diabète peut permettre de proposer des régimes alimentaires ou des traitements pour prévenir et éviter ces maladies chez l’homme.

Procédures

Les souriceaux recevront deux injections intrapéritonéales (au niveau de l’aine) par jour de la molécule inflammatoire ou du contrôle (matin et fin d’après-midi) du jour après la naissance (P)1 à P4, puis une le matin du P5. Cette injection prend quelques secondes. Pour savoir si les animaux développent un diabète, un lot de souris recevra de l’insuline et la glycémie sera mesurée à t=0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 30’, 40’, 60’, 90’ et 120’ sur une goutte de sang récupérée par légère piqure au bout de la queue (animal éveillé). Le même test sera reproduit 48h plus tard, en remplaçant l’insuline par du glucose. D’autres animauxseront utilisés pour l’analyse de leur métabolisme. Ceci nécessite leur isolement pendant 1 semaine dans des cages individuelles spéciales appelées « cages métaboliques », permettant le recueil des urines, des selles et des gaz. Une semaine d’habituation en cages individuelles classiques sera réalisée auparavant.

Impact sur les animaux

Site 1: - Une mortalité de 5 à 10% peut survenir en période d’injection de la molécule inflammatoire. - LUne douleur due à infection locale dans la zone d’injection intra-péritonéale - Un retard de croissance, - des manifestations de stress : troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible...), accélération de la fréquence respiratoire. Lors du test de résistance à l’insuline ou au glucose réalisé à 4 semaines : sensation modérée de faim due à la privation de nourriture pendant 5h, puis douleur légère au bout de la queue pour permettre les prélèvements de sang. Comme il y a une seule incision, il y aura peu d’inconfort pour les animaux, à part le stress généré par la manipulation répétée. - Site 2 uniquement : L’isolement en cage métabolique peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prélèvement des organes et du sang, et comprendre si l’inflammation au début de la vie peut causer un diabète. Le rôle du cerveau, du foie, du pancréas et du système immunitaire sera analysé.

Remplacement

Notre étude s’intéresse aux liens entre le cerveau et l’utilisation des lipides par l’organisme. Il est impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques) toutes les connexions concernées.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été obtenu grâce aux données du laboratoire, de la littérature et d’une estimation statistique. Si les résultats obtenus à mi-projet sont suffisamment clairs, il sera réduit de moitié.

Raffinement

Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Des grilles de surveillance en fonction de l’âge des animaux seront utilisées pour s’assurer de leur bien-être et déterminer l’atteinte éventuelle des points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, et jusqu’à P10, on surveillera quotidiennement l’apparence, le poids, et le positionnement des animaux au sein du nid. A partir de P10, avant sevrage, la surveillance aura lieu deux fois par semaine. Les scores de surveillance prendront également en compte une éventuelle prise de poids susceptible de gêner la locomotion de l’animal. Si le score atteint le niveau du point limite, l’animal sera euthanasié selon les méthodes réglementaires. Le transport d’une partie des animaux entre deux laboratoires sera nécessaire à 3 semaines. Il sera assuré par un transporteur agréé, garantissant les bonnes conditions de trajet pour les animaux. Une semaine d’habituation en cage individuelle classique sera réalisée avant celle passée en cage métabolique.

Choix des espèces

Dans le cas de l’étude de l’inflammation cérébrale, les études scientifiques montrent que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau, car les régions principales de cet organe (qui correspondent aux fonctions motrices et intellectuelles), et ses cellules sont très proches de celles de l’homme. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; les observations pourront donc être extrapolables au nouveau-né humain. Les différents temps d’exploration et de prélèvements choisis ensuite permettent de suivre les animaux jusqu’au stade jeune adulte.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colique humaine est greffée sous leur peau, puis elles reçoivent une injection quotidienne cinq jours par semaine pendant trois semaines et sont suivies plusieurs mois. Le porteur indique une possible douleur d'injection, une perte de poids et des tumeurs pouvant gêner la locomotion ou se nécroser. Il affirme que les mécanismes d'échappement à la chimiothérapie sont "impossibles à recréer in vitro" et vise à tester des nanoparticules d'acheminement de médicaments anticancéreux.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'optimiser les propriétés pharmacocinétiques et la vectorisation sous forme de nanoparticules de silices de molécules induisant la dégradation ciblée d'un facteur transcriptionnel. La dégradation de cette proteine est cruciale car elle a été identifiée comme un marqueur de mauvais pronostic dans de nombreux cancers dont le cancer colorectal. Nous avons démontré que ce facteur de transcription était préférentiellement activé dans les cellules souches cancéreuses et qu’une diminution de son niveau d’expression sensibilise ces cellules à la chimiothérapie et retarde significativement la récidive tumorale. A ce jour il n’existe aucun inhibiteur pharmacologique utilisable en clinique. Ainsi, l’optimisation de molécules capables d'induire sa dégradation ciblée serait une avancée très prometteuse afin d’améliorer l'efficacité thérapeutique des traitements anti tumoraux.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra dans un premier temps de tester et d’optimiser l’efficacité in vivo de nanoparticules dans un modèle préclinique murin. A plus long terme, si ces résultats sont concluants, ils pourront potentiellement bénéficier aux patients comme stratégies adjuvantes afin d’optimiser l‘efficacité des traitements actuels.

Procédures

A l’âge de 7 semaines, les souris seront dans un premier temps greffées (une intervention de

Impact sur les animaux

Nous anticipons de légères nuisances (douleurs provoquées par la piqure avec une aiguille) liées à l'injection de cellules tumorales en sous-cutanée ou aux injections intrapéritonéales des molécules testées, ainsi qu'une possible perte de poids (

Devenir

A l'issue des procédures expérimentales, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever et d'analyser les tumeurs résiduelles : analyses histologiques, analyses moléculaires et étude du potentiel tumorigène.

Remplacement

La croissance tumorale et les mécanismes d’échappement aux chimiothérapies sont des phénomènes complexes, mettant en jeu une multitude de paramètres, impossible à recréer in vitro d’où la nécessité de poursuivre la validation de ces stratégies avec une étude préclinique chez la souris immunodéprimée, modèle permettant de réaliser des greffes de cellules humaines. Cependant nous avons préalablement optimisé les informations obtenues, via notamment la mise en place de procédures de remplacement par des modèles in vitro et in cellulo afin de confirmer et de renforcer les résultats obtenus.

Réduction

Grâce à nos études antérieures, nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux requis pour ces expériences sans que cela se traduise par l'obtention de résultats moins fiables.

Raffinement

Les souris étant des animaux sociaux et nerveux, voici les conditions de raffinement qui seront mises en place: - elles seront hébergées en groupe, à raison de 5 souris cage, - l'environnement sera enrichie avec de la litière absorbante, la présence d'une petite maison en carton et ainsi que du matériel (copeaux, cotons) afin qu'elles puissent se fabriquer des nids. Nous allons aussi évaluer au moins deux fois par semaine l'état de santé de chaque souris (poids, taille des tumeurs, locomotion, posture) afin de déceler toute douleur subie. Nous avons aussi identifié des points limites justifiant l'euthanasie des animaux si nécessaire.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est le modèle utilisé couramment pour étudier l’initiation tumorale ou l’efficacité de traitements sur la croissance tumorale. Ne possédant pas de thymus, elle accepte la greffe de cellules tumorales humaines sans présenter de phénomène de rejet. Nous utilisation des souris adultes , âgées de 7 semaines minimum, afin de pouvoir réaliser des greffes avec une bonne prise de greffe tout en assurant aussi la bonne récupération des animaux après l'injection des souris ou les traitements par chimiothérapie.

1 224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de mélanome leur sont injectées et laissées proliférer pendant douze à quatorze jours, avec des injections complémentaires et un prélèvement de sang par incision de la queue le jour de la mise à mort. Le porteur indique que la croissance de la tumeur peut provoquer du stress et une douleur et altérer l'état général des animaux. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier ces structures immunitaires tumorales et prélève tumeurs et organes après dissection.

Objectifs

Le mélanome est une tumeur maligne agressive de la peau dont l’incidence ne cesse d’augmenter, représentant aujourd’hui près de 4% des cancers chez l’homme. L’immunothérapie est un nouveau traitement qui représente aujourd’hui l’un des piliers de la prise en charge thérapeutique du mélanome. Malgré les progrès de la prise en charge clinique et thérapeutique au cours des dix dernières années, les réponses obtenues restent insuffisantes et les patients échappent aux traitements lorsque la tumeur est métastasique. Aujourd’hui, des thérapies alternatives plus ciblées sont envisagées en prenant en compte le micro-environnement tumoral. Dans certains types de cancers et notamment dans le cas du mélanome, il a été montré la présence de structures particulières au sein même de la tumeur (TLS) qui sont des agrégats de cellules immunitaires très organisés. Ces structures se forment lors d’une inflammation notamment associée à la croissance tumorale. La présence, le nombre et l’organisation de ces TLS sont des facteurs prédictifs de la réponse au nouveau traitement par immunothérapie Le système endocannabinoïde (ECS) a montré un potentiel anticancéreux en modulant plusieurs voies impliquées dans la croissance, la différenciation, la migration et l'angiogenèse cellulaires et est, de fait, une nouvelle voie thérapeutique potentielle lors de pathologies cancéreuses. Nous avons récemment découvert au laboratoire un nouvel acteur dans l’ECS, l’enzyme GDE3. Nous avons montré que cette enzyme joue un rôle clé dans la migration de cellules immunitaires lui conférant un rôle protecteur lors de pathologies infectieuses et inflammatoires. Le but de ce projet est d'étudier le rôle de l'enzyme GDE3 dans les évènements clés de la progression du mélanome telles que la prolifération cellulaire, la migration des cellules tumorales et immunitaires ainsi que la résistance aux traitements anticancéreux par immunothérapie.

Bénéfices attendus

La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du mélanome et notamment pour l'amélioration de la réponse au traitement de patients montrant une résistance lors d'une immunothérapie.

Procédures

Les animaux utilisés dans ces procédures seront soumis à une injection de cellules en intra-péritonéale ou en intradermique suivies en fonction des lots par une injection en intra-péritonéale. Ils pourront être soumis à un prélèvement de sang par légère incision de la queue afin de réaliser des dosages biochimiques le jour de la mise à mort. Après la mise à mort, les tumeurs et les organes tels que la rate, les ganglions et la peau seront prélevés.

Impact sur les animaux

Durant l'expérimentation, les animaux seront soumis à 1 injection en intra-péritonéale ou intra-dermique suivie, en fonction des lots par 1 injection en intra-péritonéale pouvant provoquer du stress chez l'animal. D'autre part, des cellules tumorales de mélanôme murin étant injectées et laissées proliférer durant 12 ou 14 jours, il est possible que l'augmentation du volume tumoral induisent des nuisances telles que du stress et une douleur chez les animaux. L'état général des animaux pourrait être de ce fait altéré.

Devenir

Tous les animaux inclus dans chaque procédure seront mis à mort et disséquer afin de collecter les organes et la tumeur pour les différentes analyses.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative pour analyser le rôle du système endocannabinoïde dans la progression du mélanome et de la réponse immunitaire anti-tumorale. La formation des structures lymphoïdes tertiaires associées à l'efficacité de la thérapie de point de contrôle immunitaire ne peuvent avoir lieu que sur des modèles in vivo.

Réduction

Nous utiliserons des souris C57BL6 sauvages ou génétiquement modifiées permettant le développement de tumeurs par injection de cellules murines cancéreuses. Le nombre de 12 animaux par groupe expérimental avec 3 expériences indépendantes semble être le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs adaptés.

Raffinement

Pour les 2 procédures, et dans le but d'éviter et atténuer toute forme de souffrance des animaux, un contrôle quotidien sera effectué durant les 14 jours d'expérimentation. Après une pesée initiale le jour de l’injection des cellules tumorales, les animaux seront pesés tous les 2 jours. Durant toute la période d'expérimentation, l'état général et le comportement des animaux seront évalués quotidiennement par le personnel de zootechnie. Un enrichissement du milieu sera ajouté (igloo, carrés de coton) pour permettre aux animaux de faire leur nid. Dans le cas où un animal montrerait une altération de son état général, il sera euthanasié. Tout le personnel de zootechnie et les expérimentateurs sont particulièrement bien formés et attentifs au bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle du fait de la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés déjà disponibles au laboratoire. Pour les deux procédures expérimentales, nous utiliserons des souris âgées d'au moins 8 semaines, c'est à dire adultes et matures notamment pour leur système immunitaire et qui correspond à ce qui est décrit dans la littérature.

1 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes, une infection chronique par le parasite Toxoplasma pouvant provoquer un syndrome fiévreux de sept jours, jusqu'à deux chirurgies sous anesthésie dont une injection intracrânienne bilatérale, puis des tests comportementaux d'anxiété, d'activité locomotrice, de force et de mémoire. Le porteur indique que les chirurgies stéréotaxiques peuvent entraîner angoisse ou prostration et que les souris sont tuées par dislocation cervicale pour prélever le cerveau. Il affirme que le remplacement "n'est pas applicable" car les études in vitro ne renseignent pas sur le comportement et la cognition.

Objectifs

La réponse aux cassures double-brin de l'ADN (CDB) et les facteurs qui y sont associés jouent un rôle majeur dans les mécanismes liés à l'apprentissage et la mémoire. Dans ce cas, les cassures sont transitoires et efficacement réparées par des mécanismes encore mal compris dans les neurones. Des dérégulations de la production ou de la réparation de ces cassures, qui aboutissent à leur accumulation, contribuent directement aux troubles mnésiques dans la maladie d'Alzheimer. Le projet a pour objectifs de déterminer l’importance de la détection, ou de la réparation des CDB dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, et les processus pathologiques liés à la neuroinflammation chronique ou à des infections du système nerveux central, que ce soit dans un modèle trangénique entrainants les symptomes de la maladie d'Alzheimer, ou d'une infection par Toxoplasma ou par l'expression isolée de médiateurs de l'inflammation.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle de la détection des CDB, et de leur réparation dans les neurones au cours des infections du système nerveux central et la réponse neuro-inflammatoire, permettra, sur le plan fondamental d'élucider les mécanismes clés de la réponse aux CDB mis en jeux dans les neurones et leur importance pour la fonction cognitive. Sur le plan médical, ces recherches pourraient déboucher sur de nouvelles stratégies thérapeutiques contre des maladies neurodégénératives dont la maladie d'Alzheimer pour laquelle aucun remède n'est connu.

Procédures

Les interventions concerneront: i) des injections intrapéritonéales répétées journalièrement pendant 5 jours, sur animaux vigiles (Proc 1+2+3=648 souris, 5 jours, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection intrapéritonéale d'un parasite, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (Proc 2=216 souris, une injection de quelques secondes); iii) à deux types de chirurgies sous anesthésie générale: une de moins de 15 minutes (chirurgie cutanée, Proc 2+5= 324 animaux), ou/et une de moins de 40 minutes par animal (injection intracrânienne bilaterale, Proc 3+4+5 = 972 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété, l'activité locomotrice, la force et les processus cognitifs ( toutes les souris = 1296, sur 15 jours au total), la perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde terminale (sans réveil, 1296 animaux, moins de 2 minutes).

Impact sur les animaux

Entre nos mains, nous n'avons observé aucun phénotype dommagable du fait de l'expression de transgène entrainant les symptomes de la maladie d'Alzheimer. Les souris iH2A.X KO ne présentent aucun phénotype délétère au cours de leur vie, ce que nous avons confirmé lors de leur utilisation dans le cadre du premier protocole APAFIS autorisé pour cette lignée. Dans le cas d'infection par Toxoplasma ou l'infusion chronique de cytokines pro-inflammatoires par implantation de pompes sous cutanées, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies stéréotaxiques peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Du fait que les animaux sont acclimatés à l'environnement des tests comportementaux et sont habitués aux expérimentateurs par manipulations régulières des animaux dans les semaines précédents les tests, aucune nuisance n'est constatée durant les tests comportementaux. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes, où les souris doivent être hébergées individuellement, l'hébergement pourrait devenir anxiogène mais des mesures d'enrichissiment du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.

Devenir

Quelle que soit la procédure de 1 à 5, les 1296 animaux au total seront en fin de procédure mis à mort par dislocation cervicale. La mise à mort est nécessaire afin de prélever les organes en post-mortem (dont le cerveau) des animaux pour comprendre ensuite au niveau cellulaire et moléculaire, les causes et mécanismes des changements observés au niveau comportemental, et limiter le double-emploi au maximum. Ces prélèvements post-mortem sont aussi nécessaires afin de confirmer l'efficacité de la procédure (KO de H2A.X, infection chronique par le parasite du cerveau, présence de cytokine dans le parenchyme cérébral, expression localisée de l'amyloid beta ou des FR).

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant aux cassures doublebrins de l’ADN. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 3 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 3 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement, cachettes et objets à ronger) . Une surveillance journalière par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences).

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel du parasite Toxoplasma gondii, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques la réponse aux CDB dans les neurones dans le cadre d’une infection naturelle. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés (KO inductibles, et modèles exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux déficients pour H2A.X n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieurs à 4 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulation sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.