Oncologie

238 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de cadmium cinq jours par semaine, des greffes sous-cutanées de cellules de cancer du pancréas ou du foie et des injections de candidats-médicaments. Le porteur indique qu'un point limite est fixé au volume tumoral de 1 500 mm3, à une perte de poids dépassant 20 % ou à une ulcération de la tumeur, seuils au-delà desquels les souris qui se dégradent sont mises à mort. Il affirme que la cinétique de cette progression cancéreuse ne peut être reproduite in vitro et prélève tumeurs et organes après la mise à mort.

Objectifs

Les différents objectifs sont de tester l’effet du cadmium sur l’apparition et la progression des stades néoplasiques (appelés pancreatic intraepithelial neoplasia = PanIN) et de caractériser les rôles des gènes d’intérêt et de tester de nouveaux candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires du cancer et identifier à terme de proposer de nouveaux candidats médicaments dans une pathologie qui manque de traitement efficace.

Procédures

Nous réaliserons un modèle d'exposition au Cadmium (par injection intrapéritonéale) sur des souris normales et sur un modèle préclinique de lésion néoplasique pancréatique . (Procédure 1) Lot1: Effet Cadmium sur souris contrôles. Injection 5x par semaine pendant 2 (4 condtions = 24 souris) ou 4 semaines (24 souris) Lot2: Effet Cadmium sur souris développant des lésions néoplasiques dans le pancréas. Injection 5x par semaine pendant 1 mois (4 conditions = 40 souris) ou 3 mois (40 souris) Nous réaliserons un modèle de xénogreffe sous cutanée de cellules d'adénocarcinome pancréatique (par injection sous cutanée sur le flanc des souris) (Procédure 2). Certaines de ces souris recevront des injections hebdomadaires de candidats médicament (ciblant des interactions de recepteurs à la surface cellulaire) (Procédure 3). Lot3 à 6 xénogreffes de cellules de cancer pancréatiques (panel de 4 lignées représentatives de l'hétérogénéité des cancer pancréatiques) non traité (PBS) et molécule X (traitement 1 fois par semaine pendant 6 semaines). Les lots 7, 8 et 9 sont un modèle de xénogreffe sous cutanée de cellules de cancer du foie. (Procédure 2). Ces souris sont ensuite suivies pendant 2 mois jusqu'à la fin de l'expérience (mesure du volume tumoral). Le Lot10 concerne des souris développant des lésions néoplasiques dans le pancréas pour lesquelles une injection heddomadaire du candidat médicament est réalisé (procédure 3). 2 conditions (traitées, non traitées) = 20 souris suivies pendant 2mois. Récapitulatif des durées: procédure 1: 4 semaines à 3 mois (selon la condition, voir ci dessus); procédure 2: 6 à 8 semaines (selon la condition); procédure 3: 2 mois

Impact sur les animaux

Les injections de cadmim (procédure 1) sont réalisées en intra-péritonéal. induction éventuelle d'une douleur légère de très courte durée. Les xénogreffes sous cutanées (procédure 2) sont réalisées par une injection en sous cutanée. induction éventuelle d'une douleur légère de très courte durée. Les injections de candidat médicament (procédure 3) sont réalisées en intra-péritonéal. induction éventuelle d'une douleur légère de très courte durée. Concernant les xénogreffes, un point limite (1500mm3) sera appliqué (taille de la tumeur au-delà de laquelle, l’expérimentation est stoppée). (1) la masse de la tumeur ne devrait augmenter ni au point d’interférer significativement avec les fonctions normales du corps ni au point d’induire, du fait de son emplacement, souffrance et/ou détresse (tumeurs solides). (2) une perte de poids dépassant 20 % du poids du corps d’un animal normal (en tenant compte de la masse tumorale) ; (3) une ulcération/infection à l’emplacement de la tumeur ; - la charge tumorale ne devrait pas excéder 10 % (typiquement à un diamètre de 17 mm pour une souris de 25 g).

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures. Nous prélevons la tumeur et/ou le pancréas et les sites majeurs de métastases (foie, poumon) pour des études de biologie moléculaire et de biochimie.

Remplacement

Il s’agit de l’étude d’un modèle physiopathologique préclinique de progression carcinogénétique dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro. Toutefois, la selection des gènes d'intéret et des candidats médicaments ciblant MUC4-ErbB2 sera réalisée au préalable sur des modèles in vitro et d'organoïdes d'adénocarcinomes pancréatiques ou hépatiques

Réduction

e nombre d’animaux par groupe est prévu pour avoir un effectif suffisant (suivant la règle des 3R) permettant une analyse statistique significative. Pour l'apparition de lésions néoplasiques (appelées PanIN), nous analyserons 6 souris par groupe car il s'agit d'une analyse qualitative (présence ou absence de PanIN). Pour l'étude de progression des lésions néoplasiques, nous analyserons 10 souris par groupe car les modèles transgéniques de cancer pancréatiqeus présentant une plus grande hétérogénéité de surface de lésions néoplasiques . Les effectifs ont été calculés statistiquement. Pour l'analyse Les xénogreffes donnant des résultats homogènes seront étudiées sur des cohortes de 6 souris par groupe.

Raffinement

Le nombre de cohorte a été optimisé pour réduire le nombre de souris. Une surveillance accrue est effectuée avec un suivi régulier de l'état général des souris. Nous serons particulièrement attentifs à la détection précoce de tout signe de douleur. Nous surveillerons les courbes de poids de souris et rechercherons les signes de stress et de douleur. Une injection sous cutanée de buprénorphine sera realisée en cas de douleur. Si les signes de douleur persistent, un sacrifice anticipé sera effectué. Pour les xénogreffes, un point limite sera appliqué (taille de la tumeur au-delà de laquelle, l’expérimentation est stoppée).

Choix des espèces

Modèle de souris transgénique référence pour l'apparition de lésions néoplasiques pancréatiques (appelées souris KC). Les expériences seront réalisées sur des souris agées de 3 mois pour les souris KC. Ces souris présentent une mutation Kras constitutivement active qui contruit à pancréas comportants des lésions néoplasiques (appelées PanIN). Modèle standard de xénogreffes en souris immunodéprimées (Scid) permettant l’implantation de lignées cellulaires

351 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une tumeur mammaire greffée sous la peau et reçoivent des injections intraveineuses répétées, réalisées sur animal vigile maintenu en contention, ainsi que des prélèvements sanguins. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une gêne et une douleur légère à la marche et que la contention vigile génère un stress modéré. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant" et justifie ainsi le recours à la souris pour tester des immunoconjugués ciblant HER2, dont l'intérêt pour les patientes reste renvoyé à une validation préclinique.

Objectifs

Le cancer du sein (CS) est désormais le cancer le plus fréquent chez les femmes européennes. Parmi tous les différents CS, 1 patiente sur 5 est affectée par un CS qui surexprime le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2). Si ces cancers ont longtemps été de mauvais pronostic, la survie globale s'est nettement améliorée grâce à l’avènement des thérapies ciblées anti-HER2. Cependant, il existe des problèmes de résistance à ces traitements, notamment au stade métastatique, nécessitant le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans la perspective de développer de nouveaux traitements, de nombreuses molécules prometteuses étudiées en phase clinique ont dû être arrêtées en raison d’une toxicité élevée, générée en partie par l’utilisation de molécules actives extrêmement cytotoxiques. Ces observations ont ouvert la voie à l’utilisation de plus petites molécules moins toxiques et plus sûres pour le patient. Dans ce contexte, nous avons développé et breveté deux nouvelles méthodes de synthèse de petites molécules stables présentant des propriétés thérapeutiques optimisées et ciblant HER2. Après avoir validé in vitro leur efficacité accrue sur différentes lignées cellulaires de cancers du sein le projet proposé vise à évaluer leur efficacité in vivo (biodistribution et activité anti-tumorale).

Bénéfices attendus

La validation préclinique des immunoconjugués novateurs développés pourrait rapidement aboutir au développement de thérapies ciblées permettant de traiter des cancers agressifs et métastatiques.

Procédures

Injection sous cutanée (anesthésie gazeuse-1 fois) + Injection intra veineuse (Contention - vigile -1 fois) J+28 n=261 Injection sous cutanée (anesthésie gazeuse-1 fois) + Injections intra veineuses (Contention - vigile - 5 fois maximum avec minimum 48h entre 2 injections et alternance des veines caudales) J+28 n=60 Injection intra veineuse (Contention - vigile -1 fois) + prélèvement sanguin (Contention - vigile - 1 fois / jours pendant 3 jours avec alternance des veines caudales) n=30

Impact sur les animaux

La mise en place du modèle (tumeur sous cutanée) peut entrainer une gêne voir une douleur légère en terme de déplacement de l'animal et de ressenti cutanée. Les injections IV se faisant sur animale vigil dans un appareil de contention (durée inférieur à 1 minute), l'animal peut ressentir un stress modéré pendant la procédure.

Devenir

Des analyses ex vivo sont prévues à l'issue de chacune des procédures ainsi, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune d'entre elle.

Remplacement

Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques requière la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats en prenant en compte l’homogénéité du modèle. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. De plus, l’étude dose et schéma d’administration et les examens d’imagerie permettent également de réduire le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux est de 351 souris maximum sur une période de 5 ans.

Raffinement

Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques avant l'atteinte des points limites définis. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié. De plus, les examens d’imagerie médicale permettent également de raffiner l’étude grâce d’une part au caractère non invasif de la technique et d’autre part à la possibilité d’un suivi longitudinal ou un animal est son propre contrôle au cours du temps.

Choix des espèces

Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptées pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Souris adultes âgées de 5 à 6 semaines pour optimiser la prise de greffe.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, des injections répétées d'une cytokine et d'anticorps jusqu'à trois fois par semaine, parfois de la chimiothérapie, et des prélèvements sanguins répétés à la queue, une partie subissant un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que la croissance tumorale peut gêner la locomotion et provoquer une ulcération menant à un état moribond. Il affirme que les méthodes sans animaux ne peuvent pas remplacer la souris à ce stade et renvoie les retombées pour les patients, validation d'anticorps avant essais cliniques, au conditionnel.

Objectifs

Les avancées en termes d’immunothérapies dans les cas de cancers sont très encourageantes mais une recherche accrue est toujours de mise afin d’une part de découvrir de nouvelles cibles mais également d’améliorer les traitements déjà existants. Ce projet a ainsi pour but de continuer à approfondir nos données sur les actions de notre cible, une cytokine (protéine messagère et régulatrice du système immunitaire naturellement présente dans chaque organisme), de son blocage à l’aide d’anticorps candidats et ce dans un contexte de développement tumoral (multiplication des cellules tumorales) chez la souris. Grâce à nos modèles de développement tumoraux, nous pourrons analyser la biodistribution et la dégradation de cette cytokine ainsi que l’impact de son blocage en synergie (effet cumulé) avec d’autres immunothérapies et chimiothérapies déjà connues en clinique. Ces étapes sont indispensables pour valider les anticorps candidats avant de futurs essais cliniques antitumoraux.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal de ce projet, par des études de suivi de la cible en présence ou absence d’anticorps, sera de connaitre les cinétiques d’action de ces différentes molécules. Ces approches sont indispensables pour pouvoir amener ces technologies dans des essais précliniques réglementaires puis des essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet seront greffés une fois en injection sous-cutanée (15 secondes/souris). Les animaux recevront ensuite différents traitements en commençant par l’injection unique de la cible (la cytokine) (en injection intrapéritonéale : 10 secondes, en injection sous-cutanée : 10 secondes, ou en injection intraveineuse dans de rares cas : 3 minutes). L’anticorps dirigé contre la cible sera ensuite injecté jusqu’à 3 fois par semaine par l'une de ces trois voies. Dans certains cas, les souris auront également une injection de chimiothérapie en dose unique (en intrapéritonéale ou en intraveineuse suivie de l’immunothérapie 2 fois par semaine (en injection intrapéritonéales, en injection sous-cutanée ou en injection intraveineuse). Des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine de la queue en gestes répétés sur 24h (sans dépassement du volume maximum autorisé) ou une fois par semaine sur 4 semaines. La durée de chaque prélèvement est estimée à 1 minute / souris. Certains animaux subiront un prélèvement de sang terminal à la veine cave (animal sous analgésie + anesthésie profonde et sans réveil) afin de collecter un volume de sang suffisant pour des analyses plus fines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs chez la souris avec un problème de locomotion possible au-delà d'un certain volume ou une ulcération de la tumeur pouvant entrainer un état moribond de l’animal si elle évolue trop rapidement. Les injections de chimiothérapie et d’immunothérapie observées lors des études précédentes ne montrent quant à elles aucun effet délétère observable sur l’état clinique de l’animal

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, pour prélever la tumeur et les organes immunitaires périphériques afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments (à l’aide de technique d’histologie, de cytométrie ou encore de biologie moléculaire).

Remplacement

Il s’agit du suivi de croissance tumorale, il n’existe pas de méthode alternative à ces expériences in vivo. Ces preuves de concept et ces études de mécanismes d’action ne peuvent s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui a démarré par des études bibliographiques, suivies d’études In Vitro approfondies ayant permis d’affiner et de réduire efficacement les pistes de recherches. Cependant, compte tenu des avancées actuelles, à ce stade du projet, il n’est pas possible de substituer l’animal par un modèle in vitro pour continuer ces recherches.

Réduction

L’analyse statistique permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés est réalisée en collaboration avec une équipe de recherche spécialisée dans les études de biostatistique. L’étude de l’efficacité des traitements testés induit deux types d’analyse : -modélisation de la croissance tumorale et -analyse de la survie des animaux. Compte tenu de ces analyses et des données obtenues lors de précédentes expériences réalisées au sein du laboratoire le nombre de souris est limité à 10 par groupe et chaque étape est reproduite une fois afin de supprimer le biais pouvant être induit par un problème technique et ainsi avoir un résultat de deux expériences indépendantes.

Raffinement

Pour la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats obtenus dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis dans chaque procédure expérimentale et le suivi clinique des animaux se fera quotidiennement sur la base de la fiche de scoring. Les souris seront surveillées quotidiennement y compris les week-ends et jours fériés : suivi du développement de la tumeur (point limite volume >1500 mm3 ou nécrose tumorale précoce), pesée (toute perte de poids ne devra pas excéder 20% du poids normal attendu de l’animal) et détection du moindre signe de souffrance et/ou de détresse de l’animal. En fonction des observations, des décisions allant de l’adaptation des conditions d’hébergement à l’injection d’analgésique jusqu’à une décision d’euthanasie, seront prises. D’autre part, une fiche de soins est utilisée pour la prise en charge des animaux. Pour l’ensemble du projet nous avons prévu un nombre total de 1440 souris incluant (par type de souris = 480) : 480 souris immunodéprimées et 960 souris immunocompétentes.

Choix des espèces

Ce projet nécessite des modèles de souris immunocompétentes et immunodéficientes afin de comprendre le rôle du système immunitaire et de suivre la cinétique de la cible au sein de la tumeur et dans la circulation sanguine. Le choix s’est porté sur les modèles les plus caractérisés et sur lesquels nous avons déjà un recul important : C57Bl/6, BalbC (immunocompétentes) et athymic nude (immunodéficientes). Les souris seront au stade de développement adulte et âgées de 6 à 12 semaines afin d’avoir des animaux d’âge mûr avec un système immunitaire complètement fonctionnel (pour les souris immunocompétentes) et permettant une prise tumorale optimale.

56 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sevrées puis soumises à un régime pauvre en protéines modélisant la malnutrition infantile, elles reçoivent jusqu'à vingt-cinq injections sous-cutanées d'un analogue hormonal, un test de tolérance au glucose par gavage avec prélèvements à la queue, puis une laparotomie pour prélever le sang de la veine porte avant mise à mort. Le porteur affirme que le régime carencé n'induit ni faim ni stress anormal chez les jeunes souris. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit un "organisme entier" en contexte de malnutrition et rattache les retombées à la prise en charge des enfants.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études récentes ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté par l'appauvrissement en nutriments et qu'une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permettait de compenser partiellement le retard de croissance dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits dans le contexte de la malnutrition, un déficit en protéines pendant l'enfance résulte en des déficits neurocognitifs, métaboliques et immunitaires sévères qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations métaboliques exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique chronique, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique dans ces conditions, sont encore mal connus. Des études portant sur les cellules productrices d’hormones de l’intestin (appelées entéroendocrines), ont permis d’identifier une sous-population de cellules particulièrement impactée par la malnutrition protéique juvénile. Le but de ce projet est 1) D’évaluer comment les effets bénéfiques d’une intervention probiotique en contexte de malnutrition sont dépendants de ces cellules et 2) de caractériser plus finement les modifications de la signalisation d’une hormone produite par ces cellules dans un contexte de malnutrition protéique juvénile par rapport à un régime contrôle. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d’un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l’étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C’est pourquoi cette étude nécessite l’expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s’agit d’un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets bénéfiques pour la santé au-delà des effets nutritionnels classiques). De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi que, pour certains animaux, à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. La moitié des animaux recevra 5 jours par semaine pendant la durée de la procédure une injection sous-cutanée d’un analogue hormonal (soit 25 injections au total). L’autre moitié des animaux recevra, une seule injection sous-cutanée d’un antagoniste de cette même hormone. Un test de tolérance au glucose durant 120 minutes sera réalisé sur les animaux vigiles (voie orale par gavage) et 7 prélèvements sanguins de 2-3 μL (5 prélèvements toutes les 15 minutes puis 2 prélèvements toutes les 30 minutes) et 3 prélèvements de 20 µL post gavage seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer respectivement la glycémie ou l’insulinémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé en fin de procédure. Pour cela, 30 minutes après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. Le prélèvement en veine porte durera deux minutes. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 56 animaux femelles appartenant à deux procédures.

Impact sur les animaux

Ces procédures devraient entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de ces procédures a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’agressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poids sera surveillé de façon régulière et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière quotidienne. Le test de tolérance au glucose implique des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection sous-cutanée peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée. Pour la procédure impliquant des injections sous-cutanées de sémaglutide : les injections sous-cutanées peuvent induire de l’inflammation, les points d’injection seront surveillés quotidiennement.

Devenir

L'ensemble des femelles ayant subi la procédure expérimentale seront mises à mort à la fin de la procédure. En effet, la mise à mort est nécessaire afin de réaliser des prélèvements de sang et d'organes qui seront analysés par la suite.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition, nécessaire pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité entre individus. Le nombre de 7 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité au vu de nos résultats précédents. Dans une optique de réduction, l'ensemble des organes impliqués dans le métabolisme, mais qui ne seront pas directement utilisés dans le cadre de ce projet, seront conservés au congélateur pour d'éventuelles analyses ultérieures. Le protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agréé. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée en pesant la nourriture présente pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. A la suite des injections, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection sous-cutanée ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés cinq fois par semaine et pourront donner lieu à l’application locale d’antiseptiques le cas échéant. Des points limites suffisamment prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. Les animaux recevront une analgésie et une antalgie avant le prélèvement en veine porte.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). L'objectif du projet est d'étudier la signalisation GLP-1 en condition de malnutrition pendant la période juvénile. Il faut donc utiliser des animaux juvéniles après leur sevrage.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection unique dans la veine de la queue destinée à faire répliquer le virus de l'hépatite D, certaines développant des tumeurs du foie avant d'être tuées pour prélever le foie et le sang. Le porteur affirme que ces tumeurs n'affectent guère l'animal, le foie étant peu innervé, et qu'il les collecte avant qu'elles ne gênent. Il indique avoir mené le maximum d'expériences sur lignées cellulaires et présente le passage in vivo comme nécessaire à l'étude de l'inflammation hépatique.

Objectifs

Le virus de l’Hépatite D (VHD), infecte le foie humain et cause de profondes modifications de l’organe. Une co-infection avec le virus de l’hépatite B (VHB) mène souvent au développement d’une cirrhose puis d’un cancer du foie (carcinome hépatocellulaire). Ce cancer, dont l’incidence est en constante augmentation, constitue la troisième cause de mortalité due au cancer dans le monde, du fait d’un manque de traitement efficace. Bien qu’il existe un vaccin qui protège contre le VHB et VHD, les personnes déjà infectées (environ 20 millions de personnes dans le monde infectées par le VHD) n’ont aucune option thérapeutique. Le but de notre projet est de développer un modèle de réplication du VHD chez la souris afin de : 1- étudier les perturbations du foie liées à la réplication de ce virus, notamment déterminer les perturbations de la cellule infectée par le virus, l’hépatocyte. 2- évaluer dans ce modèle la pathologie causée par des virus de la même famille, découverts récemment dans plusieurs espèces animales (rongeur et serpent pour ce projet).

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la physiopathologie causé par le virus de l'hépatite D. Ils pourront aussi aider à mieux évaluer les pathologies qui pourraient être causées par les virus de la même famille (retrouvés chez les rongeurs ou les serpents), ce qui n’a jamais été évalué chez l'animal. Finalement, à plus long terme, le développement de ce modèle pré-clinique pourrait contribuer à accélérer le développement d’antiviraux très attendus, qui inhiberaient la réplication de cette famille de virus. Trouver des antiviraux efficaces contre cette famille de virus reste un besoin médical de première importance, sachant qu’aucune molécule actuelle n’arrive à éliminer complètement la réplication du VHD chez les patients infectés.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection dans la veine caudale (15 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets sont, pour certains animaux, le développement de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elles sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte pas le fonctionnement de l’organe. Les animaux sont évalués quotidiennement (avec une grille d’évaluation) pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies et du sang pour analyses.

Remplacement

Nous avons effectué le maximum d’expériences sur des lignées cellulaires en testant la réplication des réplicons de différentes espèces, il est désormais nécessaire de réaliser les expériences in vivo, notamment pour l’étude de l’inflammation dans le tissu hépatique. Dès que possible, nous rebasculerons sur les lignées cellulaires pour caractériser les perturbations de la cellule induites par la réplication virale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique. Nous avons calculé avec le service de statistiques de notre institut que le nombre minimal d’animaux par groupe doit être de 10. Nous nous sommes limités aux expériences indispensables, notamment en réduisant le nombre de points analysés après l'injection.

Raffinement

Nous avons planifié rigoureusement (notamment en suivant les recommandations européennes) et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences précédentes montrent que les procédures expérimentales proposées préservent le bien-être animal. Une grille de score a été mise en place pour l’observation quotidienne des animaux afin de d’euthanasier les animaux et collecter les foies avant le développement éventuel de gêne liée à la présence de tumeurs.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie et de la physiologie hépatique. Le modèle proposé est le plus proche de la maladie humaine, permettant d’analyser les premières étapes du développement de tumeurs. La souris est également un modèle d’étude classique pour tester de nouveaux médicaments dans les cancers. Ces approches sont soutenues par de nombreuses publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (cancer de l'adulte).

2 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses puis des chimiothérapies et immunothérapies répétées, la tumeur pouvant gêner leurs déplacements, avant d'être tuées quand elle dépasse un seuil ou pour prélèvement. Le porteur fixe des points limites, perte de poids supérieure à 20 %, léthargie ou ulcération de la tumeur, déclenchant la mise à mort. Il présente l'organisme vivant comme le seul cadre "prédictif" pour évaluer des combinaisons thérapeutiques en oncologie.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer le rôle de CXCL10 (une chimiokine permettant le recrutement des lymphocytes T CD8) sur l’efficacité antitumorale d’une immunothérapie (anti-PD-1), des chimiothérapies ou d’une association des deux thérapies utilisées en clinique, dans différents modèles de cancers chez la souris. Nous étudierons également les infiltrats immunitaires dans les tumeurs. Ainsi nous pourrons 1) évaluer l’efficacité des traitements en présence ou non de CXCL10 et 2) déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiée en fonction du traitement. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

En 2018, les cancers du côlon du pancréas et du poumon font partie des cancers les plus fréquents avec le cancer de la prostate et du sein. Ces 3 types de cancers représentent les cancers causant le plus de décès. Actuellement, le traitement des cancers colorectaux, du pancréas et du poumon repose sur l’utilisation de chimiothérapies. Bien que ces chimiothérapies aient un effet antitumoral avéré, elles ne conduisent pas systématiquement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. En effet, l’activation de certaines cellules immunitaires pourra favoriser la réponse des patients au traitement, alors que leur blocage conduira à son inefficacité. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas et pour certains cancers colorectaux. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de CXCL10, une chimiokine impliquée dans le recrutement des lymphocytes T CD8 cytotoxiques, sur l’efficacité anti-tumorale de l’immunothérapie ou de la chimiothérapie ou d’une association des deux thérapies, utilisées en clinique dans différents modèles de cancers murins. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par l’immunothérapie et/ou la chimio-immunothérapie (immunomonitoring, Nanostring). L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser l’immunothérapie, la chimiothérapie et/ou la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.

Procédures

- Injection par voie sous-cutanée de cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée 5 minutes - Nombre de souris : 2800 - Traitements par chimiothérapie par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée 1 minute - Nombre de souris : 2400 - Traitements par immunothérapie par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée 1 minute - Nombre de souris : 2400

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. On note que lorsque le volume tumoral est supérieur à 2000 mm3 (~300mm2), ou que la tumeur parait gêner le déplacement de la souris celle-ci sera sacrifiée. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. Donc surveillance régulière du poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage… Si un point limite est atteint, la souris sera sacrifiée. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies et immunothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. Surveillance régulière de l’état général et des points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, soit parce que la taille de la tumeur dépassera 2000mm3, soit parce que les tumeurs seront prélevées pour les tests biologiques.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Le nombre de souris par groupe a été estimé en utilisant un test bilatéral et en considérant qu’un traitement sera efficace s’il modifie la moyenne des valeurs de 20% avec une différence significative (test de Student). Si l’un des modèles ne donne pas les résultats escomptés (absence de recrutement de lymphocytes CD8 dans les tumeurs surexprimant CXCL10 visualisé par immunomonitoring dans la partie I) ou s’il s’avère que les points limites sont atteints prématurément, celui-ci sera abandonné dès la partie I.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe. Points limites : - perte de poids dépassant 20% par rapport au poids maximum enregistré : arrêt des traitements ; si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - posture ou autre expression de la douleur : arrêt des traitements ; si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - absence de toilettage : arrêt des traitements et surveillance de l’apparition d’autres points limites ; - léthargie, immobilité : si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - une mauvaise cicatrisation ou une ouverture des sutures : mise à mort de l’animal. - Points limites spécifiques à la présence de tumeurs et dont l’atteinte entrainera l’euthanasie des animaux : - volume tumoral supérieur à 2000 mm3 (300mm2) ; - tumeurs gênant les fonctions vitales et motrices ; - ulcération ou nécroses de la tumeur sous-cutanée supérieure à 20% de la surface totale de la tumeur ; - difficultés respiratoires. Le projet se déroule en 3 parties. L’absence de faisabilité (points limites atteints) ou de résultats (absence de recrutement de CD8 dans les tumeurs surexprimant CXCL10) conduira à l’arrêt de certains modèles.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis subissent injections, gavages, huit prélèvements sanguins, neuf séances d'imagerie et des mesures de tumeur, avant d'être tuées pour les analyses. Le porteur reconnaît une douleur liée à la croissance tumorale, souvent associée à une perte de poids. Il présente la souris comme "le modèle de choix et de référence" pour valider in vivo un agent censé renforcer les lymphocytes T contre le cancer.

Objectifs

Ces dix dernières annéees, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus in vitro montrent une potentialisation des outils cellulaires à la base des immunothérapies dans le contexte du cancer.

Procédures

Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : - 8 prélévements sanguins (1 goutte), la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 9 séances d'imagerie, la durée de ce geste est évaluée à 3 minutes - 6 mesures de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse, la durée de ce geste est évaluée à 2 minutes - 4 administrations par gavage, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes - 9 injections intrapéritonéales, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 injection sous-cutanée, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 séance de rasage du flanc droit à l'aide d'un rasoir électrique, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes - 1 injection intraveineuse, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute

Impact sur les animaux

Des nuisances potentielles pourraient résulter du stress généré lors des injections et plus globalement par la manipulation hebdomadaire des animaux, mais également de la douleur résultant de la croissance tumorale qui est souvent associée à une perte de poids

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.

Remplacement

Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une potentialisation des fonctions antitumorales après traitement par un inhibiteur pharmacologique nouvellement identifié. Le recours aux modèles animaux permettra de valider in vivo, dans des modèles précliniques, le gain résultant de l'utilisation de cet inhibiteur sur des approches d'immunothérapies au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base de nos travaux antérieurs et de la littérature montrant que 18 à 24 souris par groupe permettent de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les interventions (injections intraveineuses et prélèvements sanguins) seront précédées d'une anesthésie générale, afin de prévenir la douleur. Nous utiliserons l'imagerie pour un suivi de la charge tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basé sur cette approche pour les études ultérieures. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entraina une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix et de référence pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Les modèles murins permettent en effet d'apprehender la complexité de la réponse tumorale. Ces modèles permettent notamment d'apprehender la possibilité de rencontre des cellules de l'immunité et des cellules tumorales au sein de l'organisme. Ces modèles permettent également de prendre en compte la survie des cellules immunes et le maintien de leur activité antitumoral au sein du microenvironement tumorale, qui le plus souvent met en place des mécanismes pour inhiber la réponse immune. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).