Oncologie

Une séance d'imagerie par semaine, chacune sous anesthésie gazeuse pendant quarante minutes, avec injection d'un agent de contraste dans la veine de la queue : 180 souris transgéniques qui développent spontanément des tumeurs mammaires vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une semaine sur deux s'y ajoutent trois prélèvements de sang à la queue en trente minutes. Le porteur liste les conséquences des anesthésies répétées, affaiblissement, perte de poids, déshydratation, hypothermie, et celles des ponctions répétées à la queue, lésions locales, risque d'infection, gêne pour se déplacer. Chaque semaine, quelques souris sont tuées après leur séance pour que leur tumeur soit analysée au microscope, et aucune ne reste en vie à la fin du projet.

Objectifs

Le cancer du sein est l’une des principales causes de mortalité chez les femmes, et son incidence continue d’augmenter. Aujourd’hui, son diagnostic et son suivi reposent en grande partie sur des examens utilisant des rayons X ainsi que sur des biopsies (prélèvements de tissu), qui sont invasives, parfois douloureuses et sources de stress pour les patientes. Ce projet vise à développer une alternative basée sur l’échographie, une technique : non invasive (sans chirurgie), sans rayonnement, plus confortable pour les patientes, et moins coûteuse. À terme, cela pourrait permettre de réduire le recours aux biopsies et d’améliorer significativement le confort et la prise en charge des patientes. Aujourd’hui, des informations essentielles pour évaluer une tumeur (comme sa rigidité, son réseau de vaisseaux sanguins ou l’organisation de ses fibres tissulaires) ne peuvent être obtenues qu’après prélèvement et analyse au microscope. L’IRM permet d’accéder partiellement à ces informations sans intervention, mais cette technique reste coûteuse, peu accessible, et contraignante pour certaines patientes. L’échographie ultrarapide, en revanche, est une technologie : plus accessible, portable, et adaptable à un usage à grande échelle. Elle pourrait donc permettre d’obtenir ces informations de manière simple et non invasive. Les avancées développées dans ce projet pourraient avoir plusieurs impacts majeurs : Améliorer le diagnostic en distinguant plus facilement les tumeurs bénignes des tumeurs malignes, Mieux caractériser les tumeurs pour choisir un traitement adapté, • Suivre plus rapidement l’efficacité des traitements, et éviter des thérapies inutiles ou inefficaces, • Réduire les contraintes pour les patientes, en limitant les examens lourds, invasifs ou stressants.

Bénéfices attendus

Le cancer du sein représente un enjeu majeur de santé publique. Les méthodes actuelles de diagnostic reposent sur des examens contraignants, incluant des biopsies invasives et des techniques d’imagerie coûteuses ou irradiantes. Ce projet vise à développer une approche d’imagerie par ultrasons non invasive, sans rayonnement et accessible, permettant de mieux caractériser les tumeurs. À terme, cette technologie pourrait réduire le recours aux biopsies, améliorer le confort des patientes et faciliter un diagnostic plus précoce et plus précis. Elle permettrait également d’adapter plus rapidement les traitements en identifiant précocement les thérapies inefficaces, contribuant ainsi à une médecine plus personnalisée. Enfin, grâce à son faible coût et à sa portabilité, cette approche pourrait être déployée à grande échelle, améliorant l’accès au diagnostic et la prise en charge des patientes.

Procédures

Les procédures réalisées dans ce projet impliquent des manipulations limitées et sont effectuées sous anesthésie ; Pour les acquisitions hebdomadaires d’imagerie de 40min environ, une injection intraveineuse sera réalisée au niveau de la queue de l’animal anesthésié. Cette injection concernera un agent de contraste utilisé en imagerie, ainsi qu’une solution de glucose, suivie d’une petite quantité de solution saline. Ces injections peuvent entraîner une gêne légère et transitoire liée à la manipulation et à l’injection. Dans le cadre de l’étude du métabolisme, 3 prélèvements d’une goutte de sang seront réalisés toutes les 10min sur une courte période (30 minutes). Ces prélèvements sont effectués à partir de la queue et représentent un volume total limité. Ils peuvent entraîner une gêne modérée liée aux manipulations répétées. Ils ne seront réalisés qu’une fois sur deux afin de permettre à l’animal de récupérer deux semaines entre deux séries de prélèvements.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables peuvent survenir au cours de ce projet. Le transport pour faire venir les animaux, le changement d’environnement et les manipulations répétées peuvent être source de stress pour les animaux, pouvant se traduire par des modifications de comportement. Les séances d’imagerie nécessitent une anesthésie générale par voie gazeuse. Bien que maîtrisée, cette anesthésie peut entraîner : • un affaiblissement transitoire, • une perte de poids au fil des séances, • un risque de déshydratation, • ainsi qu’un risque d’hypothermie, en particulier lors d’anesthésies prolongées. Les injections intraveineuses et prélèvements répétés au niveau de la queue peuvent également entraîner : • des lésions locales, • un risque infectieux au site d’injection, • et une gêne pouvant affecter la mobilité de l’animal, • une difficulté à récupérer entre les séances. Un risque exceptionnel mais grave d’embolie gazeuse existe en cas d’injection accidentelle d’air dans la circulation sanguine, pouvant entraîner la mort de l’animal. Enfin, le modèle animal utilisé développe des tumeurs mammaires, ce qui peut induire : • une douleur liée au développement tumoral, • une gêne locomotrice, • une altération de l’état général (perte de poids, diminution de l’activité), • et des modifications du comportement (isolement, agressivité, diminution de la prise alimentaire ou hydrique).

Devenir

Les animaux seront réutilisés chaque semaine pour imagerie, la procédure d’imagerie étant peu sévère et l’anesthésie limitée à 40min. Un petit nombre d’animaux sera euthanasié à l’issue de la séance d’imagerie chaque semaine pour prélèvement de la tumeur et analyse histologique. Aucun animal ne sera gardé en vie à la fin du projet.

Remplacement

Dans le cadre du développement de ces techniques d’imagerie, des méthodes alternatives à l’expérimentation animale sont utilisées autant que possible. Des modèles in vitro sont notamment mis en œuvre, tels que des gels (agar ou gélatine) dont les propriétés (rigidité, organisation interne) peuvent être contrôlées. Ces modèles permettent de tester et d’optimiser les techniques d’imagerie dans des conditions maîtrisées. Des simulations numériques peuvent également être utilisées dans certains cas. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité d’une tumeur dans un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas de représenter fidèlement : • l’organisation et le fonctionnement des vaisseaux sanguins, • les interactions entre la tumeur et les tissus environnants, • ni l’évolution dynamique de la tumeur dans le temps. Or, ces éléments sont essentiels pour répondre aux objectifs du projet, qui visent à caractériser les tumeurs dans des conditions proches de la réalité physiologique.

Réduction

Le projet est conçu de manière à utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. L’imagerie ultrasonore utilisée est peu invasive, ce qui permet de réaliser des mesures répétées chez les mêmes animaux au cours du temps. Cette approche longitudinale (une séance d’imagerie par semaine) permet de suivre l’évolution des tumeurs sans multiplier les groupes expérimentaux, et donc de réduire significativement le nombre total d’animaux. Une phase initiale de mise au point sera réalisée afin d’optimiser les paramètres d’imagerie et d’éviter la réalisation d’expériences non exploitables. Cette étape permettra de garantir la fiabilité et la reproductibilité des mesures, en particulier pour l’étude de nouveaux biomarqueurs. Par ailleurs, l’expérience acquise lors de projets précédents utilisant le même modèle animal permet de limiter les ajustements nécessaires, notamment concernant le modèle biologique, contribuant ainsi à réduire le nombre d’animaux utilisés pour les phases préliminaires. Enfin, le nombre d’animaux prévu est volontairement estimé de manière prudente. Toutefois, une adaptation en cours d’étude sera mise en place : si les résultats obtenus sont suffisants avant d’atteindre l’effectif initialement prévu, les expériences seront arrêtées de manière anticipée, permettant de réduire encore le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de réduire la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les animaux sont acclimatés à leur environnement, manipulés de manière douce (tunnels, prise à la main) et hébergés en groupe dans des cages enrichies. Les souris développant des tumeurs font l’objet d’une surveillance quotidienne, avec des points limites définis entraînant l’arrêt de l’expérimentation si nécessaire. Les procédures sont réalisées sous anesthésie, avec maintien de la température corporelle et surveillance des paramètres physiologiques. Les sites d’injection sont désinfectés et traités pour limiter la douleur. Après les séances, les animaux bénéficient d’un réveil encadré en environnement chauffé et sont remis avec leurs congénères après récupération complète. Une évaluation régulière de l’état de l’animal est réalisée : administration de substances à effet analgésique (Meloxicam) si nécessaire, et euthanasie anticipée en cas de douleur persistante ou importante.

Choix des espèces

L’étude nécessite un modèle in vivo, car les caractéristiques des tumeurs (vascularisation, structure et interactions avec les tissus environnants) ne peuvent être reproduites en dehors d’un organisme vivant. La souris est choisie comme modèle expérimental car elle permet : • la mise en œuvre de modèles tumoraux pertinents, incluant des tumeurs apparaissant dans un environnement physiologique, • la possibilité d’études longitudinales, • et l’utilisation de modèles génétiques bien caractérisés. Ce modèle transgénique est particulièrement adapté à l’étude du microenvironnement tumoral, qui est central dans ce projet, car il permet d’étudier le développement spontané d’une tumeur dans son environnement. Par ailleurs, le laboratoire dispose d’une expertise solide sur ce modèle, ainsi que de l’ensemble des équipements adaptés à l’imagerie du rongeur. Nous avons choisi d’accueillir les souris au stade pré-pubère pour avoir le temps de les acclimater et de réaliser l’imagerie sur des petites tumeurs, avant qu’elles deviennent palpables.

Une instillation nasale de virus grippal ou une injection de cytomégalovirus dans le péritoine, puis une série de tâches non nommées mesurant anxiété, humeur et mémoire : 856 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque un syndrome fébrile pouvant durer sept jours, avec perte de poids et anxiété, et chaque souris passe jusqu'à dix jours seule en cage pour l'évaluation individuelle. Le porteur écrit pourtant que "les tests comportementaux ne génèrent aucun stress" et qu'il n'a pas noté d'état de stress lié à l'isolement, dans un projet dont l'objet est précisément de mesurer un état d'abattement et d'isolement provoqué par l'infection. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever organes et sang.

Objectifs

Le système immunitaire est requis pour la défense de l’hôte contre les agressions de corps étrangers (virus, bactéries, etc..). Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs clés du système immunitaire, en première ligne dans la reconnaissance des microbes. Lorsqu’elles détectent un corps étranger, les DC produisent des molécules véhiculées dans tout le corps pour orchestrer l’activation de tous les autres acteurs du système immunitaire. Une production de ces molécules spécifiques dérégulée en temps et/ou en quantité peut avoir un rôle délétère, parfois fatal, sur l’individu infecté, comme observé récemment dans le cadre du Covid. Au cours des infections virales, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC), sont la principale source de molécules spécifiques qui signalent l'infection et sont source d'inflammation appelées Interférons (IFN). Les IFN sont indispensables pour limiter la propagation de virus. Cependant, lorsque les pDC sont absentes ou incapables de produire des IFN, l'hôte infecté contrôle toujours efficacement l'infection. La capacité des pDC de produire des IFN est retrouvée dans la majorité des vertébrés, cette capacité est donc probablement très ancienne. Il est alors possible que cette fonction ne serve pas uniquement à combattre des infections virales, mais aussi à remplir d'autres fonctions importantes dans l'organisme. Notre objectif est de tester si les molécules produites par les pDC induisent un état d'abattement, d’isolement et d'affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement à court ou long-terme, comportement qui ressemble aux états dépressifs. Les pDC pourraient aussi participer à la mise en place d'une détérioration des cellules du cerveau dans la maladie d'Alzheimer (AD), la première maladie neurodégénérative qui affecte plus d'1 million de personnes en France, a un poids sociétal lourd pour les familles et reste sans traitement efficace. Afin de tester cette hypothèse nous induirons la perte des cellules pDC dans un modèle de souris, combinée ou non à des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer et que nous infecterons avec deux types de virus : la souche A du virus de la grippe (IAV) qui induit une infection restreinte du système respiratoire, ou le cytomégalovirus murin (MCMV) qui induit une infection dans tout l'organisme et persiste sous forme latente, cachée. Nous évaluerons l’impact de ces infections sur le comportement des souris par des tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les interactions entre systèmes immunitaire et nerveux. Si notre hypothèse est correcte, il sera envisageable de cibler la production d'agent participant à l'inflammation pour développer de nouvelles stratégies de thérapie pour les patients dépressifs, ou souffrant d'un affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement progressifs. Ces nouvelles approches seront d’abord validées dans un cadre infectieux, ensuite elles pourront être étendues à d’autres contextes inflammatoires, les maladies impliquant une dégénérescence des cellules du cerveau et en particulier la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Des souris seront infectées soit par une courte injection par voie intrapéritonéale à l'état vigile d'un faible volume de liquide physiologique contenant du virus. D'autres souris recevront une faible dose de virus par instillation nasale réalisée une seule fois sous anesthésie générale gazeuse de courte durée. Une prise de sang sera effectuée sur les souris infectées, une seule fois sur animal vigile. Il s'agit d'un geste rapide (moins de 5 minute par souris). Un point de compression sera ensuite réalisé à l'aide d'une compresse stérile jusqu'à arrêt d'un saignement potentiel. Les souris effectueront ensuite une séquence de tâches afin d'évaluer leur comportement et plus précisément leur niveaux naturels d'anxiété, leur humeur motivée ou déprimée, et leurs capacités d'apprentissage et de mémoire. La séquence durera moins de deux semaines et comprendra la séparation des animaux pour leur évaluation à l'échelle individuelle sur une durée correspondant à moins de 30 minutes au total par jour pendant 4 jours, ou pendant moins de 10 jours dans le cas de l'évaluation de la mémoire à long-terme. Les souris seront libres de leurs mouvements et en capacité d'explorer dans des cages au cours de chaque test comportemental. Aucune tâche nécessite un effort particulier, ou génère quelque douleur ou angoisse, du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives.

Impact sur les animaux

Dans le cas d'infection par les virus, les animaux présentent un syndrome fébrile, associé à des symptômes généraux comme de la fièvre indiquant que l'organisme lutte contre une infection. Ce dernier peut durer jusqu'à 7 jours et entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les injections ne sont source d'aucun stress particulier, du fait qu'elles ne sont pas répétées, du faible volume injecté, et du fait de la manipulation journalière préalable des souris par le personnel qualifié dans la semaine précédente. La prise de sang peut généré un stress léger du fait de la contention. Dans le cadre d'un test d'évaluation du comportement, les animaux sont hébergés temporairement en cage individuelle. Du fait de l'enrichissement de leur habitat, du caractère temporaire (moins de 10 jours), il n'a pas été noté d'état de stress lié à l'isolement, mais ces manifestations seront étroitement surveillées. Les souris étant libres d'exploration, non restreintes et les tâches étant toutes effectuées dans la salle d'hébergement où elle ont été acclimatées, les tests comportementaux ne génèrent aucun stress et du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives, ceci afin de pouvoir justement mesurer leur état d'anxiété naturel.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser divers prélèvements d'organes et/ou de sang utilisés pour des analyses complémentaires. Ces prélèvements sont essentiels pour étudier les paramètres inflammatoires et les mécanismes cérébraux entrant en jeu dans ce projet.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades moléculaires impliquées dans les capacités cognitives et la réponse adaptative des comportements. Les études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition, et sont ainsi complétées par l'utilisation de l'animal qui seule permet d'étudier la coordination des différentes régions du cerveau entre elles et leurs intéractions avec le reste de l'organisme et en particulier le système immunitaire.

Réduction

Tous ces animaux seront sous un même fond génétique homogène (gènes communs) pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que l'analyse d'un total de 12 animaux par groupe répartis sur deux expériences reproduites étaient nécessaires. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 2 fois de manière indépendante.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés de 2 à 5 individus compatibles. Un animal sera euthanasié en cas de mal-être trop important évalué par l'utilisation d'une grille de scoring. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont : respiration anormale, perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, aspect du poil anormal. Les souris sont préalablement familiarisées avec l'aliment de convalescence (gel) dans les jours précédant l'infection, ce qui optimise leur convalescence. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids). Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Lors des prélèvement de sang, avec utilisation de tubes de contention, l'animal sera surveillé et le geste sera réalisé rapidement afin de limiter l'évènement stressant, les souris seront replacées avec leurs congénères et il sera vérifié que le prélèvement ne les a pas affaiblies ou perturbées (changement de comportement). Enfin, les tests comportementaux sont choisis et menés en respectant les besoins écologiques des modèles: la recherche spatiale est motivée par récompense positive, les souris sont acclimatées à tous les tests et habituées aux dispositifs au moins une semaine avant chaque test. Les tests ne requièrent que mobilité, exploration libre d'objets, d'eau de boisson sucrée ou stimulus sonore de niveau équivalent à celui auquel elles peuvent être exposée lors du change de cage.

Choix des espèces

Les réactions physiologiques de la souris face à des corps étrangers, ici des virus, sont suffisamment proches de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire et nerveux de ces 2 espèces. Ce point est maintenant formellement établi dans la littérature en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires, notamment pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. Seuls des animaux adultes seront étudiés ici de façon à ce que leur système immunitaire soit mature. Enfin dans le cas des modèles de la maladie d'Alzheimer, une maladie neurodégénérative dont le premier facteur de risque est l'age, des animaux adultes plus mûrs mais non vieillissants seront étudiés pour correspondre au mieux au métabolisme d'un humain de 45 ans ou plus.

Quatre lignées de souris à phénotype dommageable développent des lymphomes spontanés à partir de cinq mois, et des tumeurs intestinales à partir de six mois en condition d'obésité. 720 souris de ces lignées vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une alimentation qui les rend obèses, un traitement injecté dans le péritoine, des palpations abdominales deux fois par semaine, et pour les tests métaboliques une mise à jeun la veille puis des prélèvements de sang répétés à la veine de la queue après incision. Le porteur décrit des masses tumorales pouvant entraîner diarrhées, prolapsus, signes d'anémie, et annonce la mise à mort en fin d'expérimentation "afin de réaliser des prélèvements terminaux".

Objectifs

Le cancer colorectal est l'un des cancers les plus fréquents et représente un enjeu majeur de santé publique. Bien que plusieurs facteurs génétiques jouent un rôle dans son initiation, la majorité des cancers colorectaux sporadiques sont imputables à des facteurs environnementaux tels que l'obésité, le tabagisme et les carcinogènes alimentaires. Il est bien connu que le risque de développer un cancer colorectal augmente avec l'obésité. Cependant, les mécanismes biologiques par lesquels les régimes alimentaires occidentaux influencent le développement du cancer colorectal ne sont pas bien compris. Ce projet de recherche a pour objectif global d’identifier comment les perturbations métaboliques déclenchées par une alimentation obésogène promeuvent la progression du cancer colorectal et de caractériser les liens complexes entre l'obésité et le contrôle du métabolisme.

Bénéfices attendus

Ce projet représente un enjeu majeur de santé publique et permettra de développer de nouvelles voies thérapeutiques pour les patients obèses atteints de cancers digestifs.

Procédures

Les souris seront soumises ou non à un régime alimentaire les rendant obèse, puis un traitement leur sera administré intra-péritonéalement (temps estimé : 15 secondes). Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien et seront pesés 2 fois par semaine (temps par pesée : 10 secondes). Afin de suivre l’évolution tumorale, les souris seront, à l'occasion de la pesée, palpées au niveau abdominal (temps estimé : 15 secondes). Pour les tests métaboliques, les animaux seront mis à jeun la veille. Ensuite, les souris recevront une injection intrapéritonéale de glucose ou d'insuline (temps estimé : 15 secondes). A l’issue de l'injection, des prélèvements sanguins seront effectués (temps estimé : 30 secondes) à la veine caudale après incision transversale légère au niveau de la queue à intervalles de temps réguliers pour mesurer la glycémie ou une éventuelle intolérance à l’insuline.

Impact sur les animaux

Le phénotype attendu des animaux est le développement le développement spontané de lymphomes à partir de 5 mois de vie et en condition d’obésité, des tumeurs intestinales, à partir de 6 mois de vie. Les nuisances associées à ce développement de tumeurs peuvent être les suivantes : développement d’une masse tumorale pouvant entrainer des troubles digestifs (diarrhées, prolapsus notamment), des signes d'anémie, ou troubles du comportement. À ces effets liés au modèle s’ajoutent les nuisances expérimentales : les manipulations et contentions répétées peuvent être sources de stress pour les animaux. L’administration de tamoxifène est également susceptible d’induire des effets indésirables transitoires, tels qu’une gêne locale. Enfin, les prélèvements sanguins répétés peuvent engendrer une douleur légère à modérée au point de prélèvement, ainsi qu’un stress associé à la manipulation, et, en cas de répétition rapprochée, un risque d’affaiblissement ou d’anémie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées en fin d'expérimentation afin de réaliser des prélèvements terminaux

Remplacement

Les questions posées dans ce projet portent sur la manière dont les tumeurs apparaissent et évoluent au fil du temps. Pour y répondre, il est nécessaire d’utiliser des souris, car elles permettent d’étudier le fonctionnement du corps dans son ensemble. En effet, le comportement des cellules cancéreuses, notamment leur métabolisme, peut être très différent entre des expériences en laboratoire (sur cellules isolées) et un organisme vivant. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier ces phénomènes de façon aussi complète. L’utilisation de souris reste donc indispensable, en particulier pour comprendre les premières étapes de formation des tumeurs. Enfin, ce projet vise aussi à étudier les interactions entre différents organes et la tumeur, ainsi qu’à identifier des marqueurs détectables dans le sang. Ces objectifs nécessitent obligatoirement une étude sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables, tout en évitant de devoir refaire les expériences. Seuls les régimes alimentaires ayant montré les effets les plus marqués seront testés. Chaque groupe comprendra 20 souris (10 par type d’alimentation), ce qui permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour tirer des conclusions solides. Pour analyser les résultats, nous comparerons la croissance des tumeurs entre les différents groupes au fil du temps, ainsi que les caractéristiques biologiques des tumeurs prélevées. Des méthodes statistiques adaptées seront utilisées pour comparer les données entre groupes. Au total, sur les 5 ans du projet, jusqu’à 720 souris pourront être utilisées, réparties en plusieurs groupes expérimentaux. Ce nombre repose sur des calculs statistiques ainsi que sur l’expérience du laboratoire avec des modèles similaires

Raffinement

Ces 4 lignées à phénotype dommageable présentent des caractéristiques phénotypiques spécifiques liées à l’émergence de lymphomes spontanés dont il faudra tenir compte. Un examen journalier des animaux inclus dans les groupes expérimentaux sera effectué pour renseigner dans des fiches de suivi individuelles les premiers signes comportementaux associés à une douleur liée à l’émergence de tumeurs (ataxie, troubles de la respiration, isolement, absence de mobilité ou agitation anormale, modification de l’embonpoint, hérissement des poils, dos voûté…). La sévérité de ces signes sera déterminée selon une grille d’évaluation jointe en annexe qui permettra la mise en place de soins éventuels ou conduira à l’euthanasie des animaux. Les souris seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 animaux maximum par cage. Dans chaque cage nous ajouterons de l'enrichissement (bâtonnets en coton (safe roll), frisottis, cabane en carton)). Les groupes expérimentaux seront réalisés de telle sorte à limiter la présence d’animaux isolés.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères qui sont un modèle représentatif de l’homme et présentant une reproduction rapide, ce qui permet de raccourcir le temps des projets. De plus, les modèles de souris ont été validés dans l'étude de la physiopathologie intestinale car elles développent des tumeurs proches de celles observées chez l'Homme. Nous utiliserons des souris avec ou sans système immunitaire fonctionnel, traitées à partir de 7 semaines, âge correspondant à leur maturité sexuelle.

Une injection de cellules cancéreuses directement dans le foie, par un acte chirurgical de quinze minutes sous anesthésie, ouvre le protocole. 5 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre elles génétiquement modifiées pour avoir un système immunitaire compromis. Les tumeurs hépatiques attendues se développent "sans affecter de manière importante l'animal", indique le porteur, qui explique aussitôt que le foie est peu innervé et que les tumeurs sont collectées tant qu'elles restent petites. La mise à mort intervient à la fin de chaque procédure, pour collecter les foies.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le principal cancer primitif du foie, dont l'incidence est en croissance constante. Il constitue la troisième cause de mortalité due au cancer dans le monde. Cela est notamment dû à un manque d’options thérapeutiques efficaces, et la survie à 5 ans est inférieure à 10% des patients. Il est donc crucial de développer de nouveaux médicaments pour cette maladie. Notre projet de recherche vise au développement de nouveaux outils thérapeutiques anti-tumoraux basés sur l’activation du système immunitaire contre la tumeur. Il s’agit d’établir une preuve de concept de l’efficacité de ces molécules dans le contexte du carcinome hépatocellulaire et de réaliser les études précliniques préalables au développement d’un essai clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de valider l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques contre le cancer du foie, qui provoque plus de 900 000 décès par an à l’échelle mondiale, et de tester leur absence de toxicité pour le foie. Ces étapes sont requises avant de pouvoir lancer un essai clinique chez l’homme. Par ailleurs, si ces composés se confirment être efficaces, leur utilisation pourra possiblement être étendue au traitement d’autres cancers.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection des cellules dans le foie, nécessitant un acte chirurgical sous anesthésie (15 minutes par souris), ou bien à une injection de solution saline contenant de l’ADN (30 secondes par souris). Les animaux recevront les différents composés thérapeutiques par une injection unique. Quelques gouttes de sang seront prélevées au cours des procédures pour réaliser des analyses de marqueurs plasmatiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont l’apparition et la croissance de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elles sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte que modérément le fonctionnement de l’organe. Il existe également un stress induit par la contention de l’animal, et une gêne possible liée à la cicatrice. Enfin, le composé thérapeutique peut entrainer un léger état fiévreux pour l’animal dans les 24 heures suivant son administration. Il existe également les effets transitoires de l'anesthésie (ralentissement des fonctions physiologiques et baisse de la température corporelle). Les animaux sont évalués quotidiennement pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies et analyser le développement de tumeurs dans cet organe.

Remplacement

Nous avons réalisé le plus d’expériences possible en laboratoire sur des cellules en culture. Cela nous a permis d’obtenir des résultats importants tout en limitant l’usage d’animaux. Cependant, pour tester l’efficacité de nos candidats-médicaments pour le cancer du foie, nous, nous devons maintenant passer à des expériences chez la souris. En effet, la formation et la croissance des tumeurs dépendent de nombreux facteurs qu’on ne peut pas reproduire entièrement dans une boîte de culture : l’environnement du foie, les interactions avec d’autres organes, et la réponse globale de l’organisme. De plus nos composés fonctionnent via l’activation des défenses immunitaires contre les tumeurs, ce qui impose d’étudier leur efficacité au niveau de l’organisme entier.

Réduction

En collaboration avec notre service de statistiques, nous avons soigneusement calculé le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Il en ressort qu’il nous faut 10 animaux par groupe expérimental pour pouvoir répondre de manière rigoureuse à notre question scientifique. Par ailleurs, nous avons restreint nos expériences au strict nécessaire, en nous focalisant rapidement sur les trois composés thérapeutiques les plus prometteurs et en réduisant le nombre de moments d’analyse, afin de réduire au maximum l’impact sur les animaux tout en conservant la validité des résultats.

Raffinement

Nous avons soigneusement planifié et optimisé notre protocole expérimental, en suivant les recommandations européennes, afin de réduire au maximum les contraintes pour les animaux. Concrètement, nous avons choisi de combiner un analgésique avec une anesthésie plus légère, nous avons réduit la durée de la chirurgie et nous utiliserons un tapis chauffant pour stabiliser la température corporelle, ainsi que l’application d’une crème réparatrice pour favoriser la cicatrisation. Après la chirurgie, nous donnons aux souris une pâtée enrichie, énergétique, pour favoriser leur récupération. Ensuite, grâce à une grille de surveillance, nous suivrons les animaux quotidiennement pour intervenir si nécessaire et éviter qu’ils ne développent un inconfort lié à la tumeur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie et de la physiologie hépatique. Le modèle proposé est proche de la maladie humaine. Ces approches sont soutenues par de multiples publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. . Nous utiliserons également des souris génétiquement modifiées, avec un système immunitaire compromis, pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse aux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (cancer de l'adulte).

Toutes les femelles qui ont mis bas seront tuées, leurs petits aussi, pour prélèvement de structures du cerveau, tandis que les femelles non fécondées restent en vie et seront réutilisées. 350 souris vont être utilisées au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 d'entre elles étant gardées vivantes. Les femelles gestantes sont hébergées seules pendant toute la gestation, puis soumises à trois séances de stress de 45 minutes par jour pendant sept jours, les descendants recevant ensuite des injections dans le péritoine, jusqu'à cinq chez les adultes, et quatre gavages espacés de douze heures. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe pas de culture in vitro capable de reproduire "l'environnement complexe caractéristique de l'hippocampe en développement".

Objectifs

Le stress prénatal, subi durant le développement foetal, est associé à un risque accru de développer des troubles comportementaux, caractérisés notamment par des déficits de mémoire et une altération émotionnelle, et à une vulnérabilité à développer des troubles psychiatriques (dépression, stress post-traumatique, troubles anxieux...). Il a été montré que ces troubles dépendent d'une altération des neurones dans une région clé du cerveau impliquée dans le controle de la mémoire et des émotions. Notre objectif est de comprendre les mécanismes par lesquels le stress prénatal peut impacter ces neurones en utilisant un modèle animal. Pour cela, nous utiliserons 2 approches: dans la première nous comparerons la croissance des neurones entre les animaux contrôles et stressés à 2 moments clés du développement (premières semaines de vie et âge adulte); dans la seconde, nous déterminerons si le stress prénatal modifie l'expression de molécules clés durant le développement des neurones.

Bénéfices attendus

En caractérisant l’effet du stress prénatal sur le développement des neurones de l'hippocampe, cette étude pourrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels un stress précoce peut entrainer des modifications à long terme dans la structuration d'une structure clé pour la gestion de nos émotions et de nos capacités cognitives. L'objectif ultime est de repérer des biomarqueurs ouvrant la voie à des stratégies de prévention et d'intervention ciblées.

Procédures

Hébergement individuel des femelles gestantes pendant la duré de la gestation. Stress: 3 sessions de 45 min par jour pendant 7 jours. Injections intrapéritonéales : 1 pour les animaux en développement, 5 pour les animaux adultes, espacées de 24h. Chaque injection dure moins d'1 minute, préhension de la cage inclue. Gavage: 4 espacées de 12h . Chaque intervention dure moins d'1 minute, préhension de la cage inclue.

Impact sur les animaux

1) l'hébergement individuel des femelles gestantes engendre une nuisance légère en limitant les interactions sociales directes; 2) Le stress appliqué aux femelles gestantes engendre un état de stress transitoire avec une baisse de la prise de poids associée à la gestation. 3) Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer un incomfort de courte durée. 4) Le gavage nécessite une préhension de l'animal et peut générer un inconfort modéré de faible durée.

Devenir

Toutes les femelles ayant mis bas sont mises a mort, parce qu'elles ne peuvent être réutilisées. Les femelles non fécondées sont maintenues en vie. Les animaux issus des reproduction et utilisées en expérience sont mises à mort pour prélèvement de structure.

Remplacement

L’objectif de ce projet étant d’étudier les propriétés des neurones de l'hippocampe après exposition à un stress prénatal, il est nécessaire de réaliser ces manipulations sur des animaux vivants. De plus, les caractéristiques des neurones sont dictées en partie par l'environnement cérébral et dépendent donc de l'intégrité du cerveau. Il n’existe pas à l'heure actuelle de modèle en culture ou in vitro permettant de reproduire l’environnement complexe caractéristique de l'hippocampe en développement. Ceci justifie donc l’utilisation des animaux pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Nous nous engageons à utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour garantir la robustesse et la fiabilité des analyses statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les frères et soeurs d’une même portée seront répartis entre les différents lots. Enfin, les femelles mises en reproduction mais non gestantes seront conservés en vie et réutilisés pour des expériences ultérieures, ce qui contribuera à limiter le nombre total d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet.

Raffinement

Pour l'ensemble des animaux, un suivi sera assuré en utilisant des grilles permettant de scorer de façon objective le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence physique (poil hérissé, apathie...) et du comportement (comportements répétés, vocalisations..) . Ces grilles permettent d'établir des points limites au-delà desquels une décision de traitement ou de retrait de l'expérience est prise. Ainsi, si un animal montre des signes de détérioration rapide de son état de santé évalué sur ces critères avant la fin des procédures, celles-ci seront ajustées ou stoppées pour éviter toute souffrance prolongée ou excessive.

Choix des espèces

La neurogenèse (création de nouveaux neurones) a été largement étudiée chez les rongeurs, lesquels représentent un modèle pertinent en raison de la similitude de leurs réponses physiologiques au stress avec celles des humains. Ils permettent ainsi une exploration intégrée des effets comportementaux, neurobiologiques et génétiques du stress. La souris a été choisie dans ce projet car 1) les études précédentes sur lesquelles il se base ont été réalisées sur des souris , et 2) une partie du projet repose sur l'utilisation de souris transgéniques, seul modèle disponible pour isoler les cellules d'intérêt et mener à bien le projet. Les souris utilisées pour la reproduction ont entre 7 et 8 semaines puisqu'il s'agit de l'âge optimal pour la reproduction. Les descendants étudiés seront âgés de 3 jours à 5 mois puisque nous étudions les neurones pendant le développement précoce et à l'âge adulte.

Ouvertes par laparotomie pendant une heure pour atteindre les embryons, les femelles gestantes servent de voie d'accès à une greffe d'interneurones humains injectés in utero. D'autres souris sont greffées à deux ou quatre jours de vie, brièvement séparées de leur mère, d'autres encore à l'âge adulte par une chirurgie de trois heures qui ouvre le crâne et y scelle une fenêtre permanente. Suivent des séances d'imagerie répétées, tête immobilisée, sur des souris parfois éveillées, à un, trois et sept mois après la greffe. 998 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, le prélèvement du cerveau interdisant, écrit le porteur, toute réutilisation, replacement ou adoption.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment un gène propre à l’être humain, influence la formation et le fonctionnement des réseaux cérébraux. L’objectif général est de déterminer comment ce gène modifie la survie, la migration, la maturation, l’intégration synaptique et l’activité d’interneurones humains greffés dans un cerveau vivant. Ces cellules jouent un rôle de « frein » et limitent les excès d’activité. Deux contextes pathologiques seront étudiés séparément : la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer. Dans l’axe « Schizophrénie », le projet s’appuie sur les associations génétiques rapportées entre le gène et cette pathologie. La schizophrénie est associée à des anomalies de maturation des circuits corticaux inhibiteurs. Le projet testera si la présence, l’absence ou le dosage de ce gène modifie le développement d’interneurones humains greffés avant ou juste après la naissance, en étudiant leur migration, leur maturation, leur capacité à établir des connexions et l’organisation de leur activité. Dans l’axe « Maladie d’Alzheimer », les effets de ce gène seront étudiés dans un cerveau adulte présentant un environnement amyloïde. Le projet déterminera si le gène augmente ou réduit la vulnérabilité fonctionnelle et moléculaire de ces cellules. Le projet n’a pas d’objectif comportemental, car le nombre de cellules humaines greffées est insuffisant pour modifier le comportement de la souris. Les conclusions reposeront sur des analyses cellulaires, histologiques, transcriptomiques et sur des mesures répétées de l’activité calcique, complétées par des analyses du cerveau en fin d’étude. Les bénéfices attendus sont l’identification de mécanismes reliant le gène à la fragilité ou à la résistance des circuits, ainsi que de signatures pouvant orienter les stratégies ciblant les réseaux impliqués dans la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

À l’échelle du projet, les bénéfices attendus sont d’abord mécanistiques. Dans l’axe « Schizophrénie », les expériences permettront de déterminer si le gène étudié modifie la migration, la maturation, l’identité et l’activité d’interneurones humains pendant des fenêtres précoces du développement cérébral. Elles permettront de distinguer un effet sur la survie d’un effet sur la vitesse ou la qualité de maturation. Dans l’axe « Alzheimer », le plan déterminera si le gène étudié modifie spécifiquement la réponse des interneurones humains à un environnement amyloïde, notamment les programmes de stress, de maturation synaptique et l’activité calcique. La combinaison de l’histologie, de la transcriptomique et de l’imagerie longitudinale doit produire des résultats interprétables à plusieurs niveaux : localisation et maturation des cellules, mécanismes moléculaires et fonctionnement au cours du temps. Les résultats pourront identifier des signatures de vulnérabilité ou de résilience dépendantes de ce gène et améliorer la pertinence des modèles précliniques portant sur le récepteur α7, puisque les souris ne possèdent pas naturellement de ce gène. Aucun bénéfice thérapeutique immédiat ni effet comportemental n’est attendu. À plus long terme, les mécanismes identifiés pourront orienter des études pharmacologiques ciblant l’axe étudié et aider à sélectionner des marqueurs cellulaires ou fonctionnels pour de futurs projets. L’utilisation des animaux imagés pour les analyses terminales maximise les informations obtenues et pourra réduire les effectifs de travaux ultérieurs.

Procédures

- Chirurgie abdominale chez la souris gestante. Chaque chirurgie dure environ 60 min, en excluant les temps de préparation de l’animal et les temps post-opératoires. - Greffe de cellules chez l’embryon de souris au dernier tiers de gestation : injection 30 secondes au total. - Greffe de cellules chez la souris nouveau-né au dernier tiers de gestation : injection 45 secondes au total par hémisphère. - Greffe de cellules chez la souris adulte par injection dans le cerveau : injection 60 min /souris. - Pour les animaux inclus dans le suivi d’imagerie longitudinale, une fenêtre crânienne chronique est implantée au moment de l’intervention adulte; la chirurgie complète (craniotomie, injection éventuelle, pose de fenêtre et fixation) dure au maximum 3 heures, hors préparation et réveil.

Impact sur les animaux

Chez les nouveau-nés, les effets indésirables attendus sont liés à la manipulation et au geste d’injection d’une durée courte (quelques minutes) : stress transitoire associé à une courte séparation d’avec la mère (et réciproquement, stress de la mère vis-à-vis de la portée), ainsi qu’une douleur modérée (de quelques jours, lié à la chirurgie). Chez les femelles gestantes subissant une chirurgie abdominale (laparotomie pour accès in utero), les nuisances attendues comprennent une douleur post-opératoire modérée et une gêne transitoire liées à la cicatrisation. Chez les adultes subissant une chirurgie stéréotaxique, les effets indésirables attendus correspondent principalement à une douleur post-opératoire modérée, une baisse transitoire d’activité et, plus rarement, une perte de poids modérée immédiatement après l’intervention. Pour les animaux qui sont inclus dans la procédure d’imagerie avec fenêtre crânienne, des nuisances additionnelles sont attendues. Dans les jours suivant la craniotomie et la pose de la fenêtre, certains animaux peuvent présenter un inconfort local et un grattage autour de la zone opérée ou du matériau de scellement ; ce comportement est généralement transitoire et diminue au cours de la première semaine. Enfin, l’imagerie in vivo nécessite une phase d’habituation (manipulations répétées, installation sur le dispositif et, lorsque l’enregistrement est réalisé chez l’animal éveillé, contention légère et immobilisation de la tête). Ces étapes peuvent entraîner un stress et un inconfort léger, surtout lors des premières séances, parfois suivis d’une irritabilité transitoire.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Les objectifs du projet reposent sur l’analyse détaillée du cerveau ce qui nécessite le prélèvement des tissus cérébraux et donc ne permet pas de conserver l’animal en vie. En conséquence, les animaux ne peuvent pas être réutilisés, replacés ni proposés à l’adoption, car le prélèvement du cerveau est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

L’objectif central du projet est de recréer un contexte cérébral in vivo pour analyser le développement, l'intégration et le fonctionnement de neurones d'origine humaine au sein de réseaux nerveux intacts, et leur modulation dans des contextes pathologiques pertinents pour la maladie d'Alzheimer et la Schizophrénie. Ce niveau d'organisation (architecture tridimensionnelle, vascularisation, interactions cellulaires, connectivité à longue distance, activité des circuits) n'est pas accessible in vitro. Les protocoles nécessitent des méthodes standardisées chez les rongeurs, avec des outils robustes. La souris est un modèle de choix : élevage maîtrisé, lignées génétiques, suivi longitudinal. La xénogreffe de neurones humains permet d'étudier des gènes humains dans un cerveau vivant, indispensable pour relier mécanismes cellulaires et phénotypes de réseau. Les organoïdes cérébraux et les systèmes microphysiologiques sont des avancées majeures, mais ne reproduisent pas un cerveau fonctionnel intact. Ils modélisent certaines étapes du développement et des interactions locales, mais sans vascularisation perfusée, système immunitaire, innervation périphérique ou interactions systémiques. Ces limites restreignent leur maturation et empêchent d'étudier la connectivité à longue distance, la régulation neurovasculaire, les réponses métaboliques/hormonales et les propriétés pharmacocinétiques/pharmacodynamiques. Outils complémentaires in vitro, ils demeurent insuffisants pour la dynamique fonctionnelle, la plasticité et les interactions de réseaux dans un cerveau vivant. Les approches in vivo restent indispensables pour comprendre l'intégration de cellules humaines dans un environnement cérébral complet, en conditions physiopathologiques réalistes.

Réduction

Le projet combine des approches transversales (prélèvements terminaux à des temps définis pour différents analyses) et longitudinales (suivi répété des mêmes animaux, notamment par imagerie fonctionnelle), afin de maximiser l’information obtenue par animal. Une partie des animaux suivis longitudinalement est ensuite utilisée pour les analyses terminales, ce qui permet de relier des phénotypes fonctionnels à des mesures tissulaires et moléculaires sans augmenter les effectifs. Les tissus non immédiatement analysés peuvent être conservés dans des conditions adaptées afin d’éviter de nouveaux prélèvements. Les analyses sur cellule ou noyau unique reposent sur des protocoles déjà établis, capables de générer une grande quantité d’information à partir d’un nombre limité d’échantillons, ce qui contribue directement à la réduction du nombre d’animaux. Pour les greffes in utero, la taille des portées permet de limiter le nombre de femelles gestantes nécessaires. Le stade d’injection retenu a été optimisé lors d’études précédentes et assure une bonne survie de la progéniture. Les mâles et les femelles sont inclus avec une répartition aussi équilibrée que possible. Les animaux sont mis à mort en fin de protocole car les objectifs nécessitent le prélèvement du cerveau ; ils ne peuvent donc pas être réutilisés.

Raffinement

Les chirurgies seront réalisées dans un laboratoire dédié exclusivement à la chirurgie. L’élevage sera en cage individuelle par portée et des mesures seront prises pour éviter tout animal isolé au-delà d’une période de 24h. Les animaux seront placés sur dispositif chauffant pour maintenir une bonne température corporelle avant, pendant et après l’expérience et seront étroitement surveillés après chirurgie sous anesthésie et analgésie multimodale. Les points limites spécifiques et précoces pour chaque étape du projet serons appliqués. Dans les procédures expérimentales, les souris feront l’objet d’une surveillance renforcée, de soins pré- et post-opératoires adaptés, des mesures de gestion de la douleur seront entreprises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris. De façon générale et pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, nous rechercherons à minimiser la douleur par antalgiques, ajout de gel hydrique, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Un renforcement des mesures de bien-être animal sera systématiquement appliqué à chaque étape. Il inclut une surveillance accrue durant la période critique post-opératoire, une évaluation plus fréquente de la douleur et de l’état général des animaux, et l’intervention rapide en cas de signes de gêne ou de souffrance. Le renforcement de l’enrichissement des cages sera intensifié par l’ajout de matériaux de nidification, de dômes en carton et d’éléments favorisant le comportement naturel. L’utilisation et l’état des cotons et nids seront surveillés pour s’assurer du confort thermique et comportemental des animaux.

Choix des espèces

L’évaluation du rôle du système nicotinique et d’un récepteur particulier chez l’homme dans les processus associés à la maladie d’Alzheimer et la Schizophrénie ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages), et de la manipulation plus aisée. La souris représente un des meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également analyser et manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre de ce projet). La Procédure 1 utilise des femelles adultes en fin de gestation. Cette intervention permet l’accès aux embryons à E17.5 et la réalisation des greffes in utero décrites dans la Procédure 2. Les descendants sont ensuite analysés à 1, 3 et 7 mois post-greffe. Ces temps correspondent respectivement à la prise de greffe et à la migration initiale, à une phase intermédiaire de différenciation et de maturation, puis à une maturation plus avancée et à l’intégration fonctionnelle. La Procédure 3 utilise des souriceaux à P2-P4. Ce stade postnatal précoce reste compatible avec une forte plasticité cérébrale, tout en permettant d’étudier la survie, la maturation et l’intégration d’interneurones humains dans un hôte immunodéficient permissif. Les analyses sont réalisées aux mêmes temps, à 1, 3 et 7 mois post-greffe. La Procédure 4 utilise des souris adultes âgées d’au moins 2 mois, dont les circuits cérébraux sont établis. Les analyses à 3, 4 et 7 mois post-greffe permettent d’évaluer successivement l’intégration initiale, les réponses précoces, puis les effets plus tardifs sur la maturation et l’activité des cellules greffées. Les modèles embryonnaire, néonatal et adulte répondent ainsi à des questions complémentaires et ne seront pas interprétés comme une comparaison reposant uniquement sur l’âge de greffe.

Greffées avec des adipocytes bruns, puis exposées jusqu'à quatre fois à une température de 4 degrés pendant vingt-quatre heures, 1 238 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent des prélèvements sanguins répétés, des chirurgies sous anesthésie et un isolement pouvant durer deux semaines en cage métabolique. L'objet est de tester si une greffe de tissu adipeux brun corrige les troubles métaboliques et reproductifs du syndrome des ovaires polykystiques, que le porteur dit toucher 13 % des femmes en âge de procréer. Cent soixante femelles et cinquante-quatre mâles passent d'une procédure à l'autre et sont réutilisés pour les tests de fertilité avant d'être mis à mort, le porteur indiquant que le prélèvement des organes interdit de les garder en vie.

Objectifs

Le présent projet vise à évaluer les effets de la transplantation d’adipocytes bruns, obtenus à partir de tissu adipeux murin ou d'adipocytes bruns humains obtenus in vitro en 3 dimensions (BAToïdes), sur les altérations métaboliques, hormonales et reproductives associées au syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Le SOPK est une pathologie fréquente, touchant environ 13 % des femmes en âge de procréer. Elle se caractérise par des troubles métaboliques, hormonaux et reproductifs, souvent associés à une altération de la qualité de vie. À ce jour, il n’existe pas de traitement curatif, et la prise en charge repose principalement sur des approches symptomatiques. L’objectif est de déterminer si cette approche de thérapie cellulaire permet de moduler les déséquilibres physiopathologiques observés dans cette pathologie, en particulier au niveau des interactions entre les systèmes métaboliques, endocrinien et reproducteur. Le recours à un modèle animal est indispensable à ce stade afin d’évaluer, dans un organisme entier, la faisabilité, la tolérance et les effets de cette approche. En effet, la complexité des interactions systémiques impliquées dans le SOPK ne peut pas être reproduite de manière fiable par des approches in vitro ou in silico. Cette étape préclinique constitue un préalable nécessaire à l’évaluation de la pertinence de cette stratégie dans une perspective translationnelle. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d’explorer une stratégie innovante visant à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués et à identifier de nouvelles pistes d’intervention thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les troubles métaboliques et endocriniens, tels que ceux observés dans le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK), représentent un enjeu majeur de santé publique en raison de leur prévalence, de leur impact sur la qualité de vie et des coûts socio-économiques associés. Le SOPK est notamment caractérisé par des altérations métaboliques (dont la résistance à l’insuline) et des dysfonctionnements de la reproduction, pour lesquels les options thérapeutiques actuelles restent limitées et essentiellement symptomatiques. Dans ce contexte, ce projet vise à améliorer la compréhension des interactions entre les systèmes métabolique, endocrinien et reproducteur, en particulier le rôle du tissu adipeux brun dans la régulation de ces fonctions. En explorant les effets de la transplantation d’adipocytes bruns dans un modèle murin pertinent de SOPK, ce travail permettra d’identifier de nouveaux mécanismes physiopathologiques impliqués dans cette pathologie. Les connaissances générées pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles d’intervention et ouvrir des perspectives pour le développement de stratégies innovantes dans la prise en charge des troubles métaboliques et de la fertilité. Plus largement, ce projet s’inscrit dans les priorités actuelles de recherche en santé, notamment en lien avec la santé des femmes, et pourrait participer à l’amélioration de la prise en charge de pathologies chroniques ayant un impact important sur la qualité de vie et le bien-être à long terme.

Procédures

Pour l’ensemble des gestes décris dans les 3 procédures, nous aurons recours à l’utilisation d’anesthésiques (uniquement dans une procédure) et d’analgésiques aussi souvent que cela sera nécessaire. Les anesthésies seront réalisées par injection ou par voie gazeuse. Une injection d’analgésique adapté sera réalisée avant la chirurgie et/ou après si nécessaire. Les injections n’excèderont jamais 20 μl/g de poids corporel. Les animaux feront l'objet d'administration de traitements et de prélèvements selon les volumes et fréquences recommandées par la littérature et dans le respect de la réglementation en vigueur. Des prélèvements sanguins par différentes voies réalisés au cours des procédures de phénotypage seront effectués avec des fréquences et volumes inférieurs aux recommandations bibliographiques et à la réglementation en vigueur. Un isolement de maximum 2 semaines (sans rupture du lien olfactif ou visuel) sera nécessaire pour une partie des animaux afin de pouvoir mesurer des caractéristiques de manière individuelle.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations expérimentales sont susceptibles d’induire un stress, une fatigue ou un inconfort transitoire chez les animaux. Afin de limiter ces effets, l’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé et compétent, et les animaux seront préalablement habitués aux manipulations. Certaines interventions, telles que les injections, les prélèvements sanguins ou les procédures chirurgicales, peuvent entraîner des douleurs de courte durée. Celles-ci seront systématiquement limitées par l’utilisation de protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés, ainsi que par une surveillance attentive des animaux pendant et après les interventions. Dans le cadre de certaines analyses, notamment en cages métaboliques, les animaux pourront être hébergés individuellement pendant une durée limitée. Cet isolement sera restreint au strict nécessaire et réalisé dans des conditions permettant le maintien d’interactions sensorielles (contacts visuels, olfactifs et auditifs) avec les congénères, afin de réduire le stress associé. Plus généralement, une surveillance régulière de l’état général, du comportement et du poids des animaux sera mise en place tout au long du protocole, permettant d’identifier précocement tout signe de mal-être et d’adapter les conditions expérimentales si nécessaire. Afin d’étudier l’influence de la température sur la réponse métabolique, les animaux seront exposés à une température de 4°C (atteinte progressivement) pour une durée maximale de 24h et sous surveillance constante. Cette exposition sera effectuée au maximum 4 fois.

Devenir

Les animaux décrits en procédure 1 seront transférés en procédure 2 ou 3 et seront mis à mort à la fin de ces dernières. Les 160 femelles et 54 mâles du projet seront réutilisés pour les tests de fertilité en procédure 3 puis seront mis à mort à l’issue de celle-ci. La nécessité de prélever les organes pour analyses ne nous permet pas de les garder en vie.

Remplacement

Dans la mesure du possible, des approches alternatives seront utilisées afin de réduire le recours à l’expérimentation animale. Celles-ci incluent notamment des cultures cellulaires, des modèles dérivés de cellules souches ainsi que des modèles tridimensionnels de type organoïdes ou adipocytes bruns différenciés in vitro. Dans le cadre de ce projet, des adipocytes bruns humains générés in vitro seront également utilisés afin de limiter le recours à des tissus animaux. Par ailleurs, certains tissus et cellules issus des animaux utilisés dans les procédures expérimentales pourront être exploités ex vivo pour la réalisation de cultures primaires et d’analyses fonctionnelles, permettant ainsi de réduire le nombre de composés et d’expérimentations complémentaires à réaliser in vivo. Cependant, l’étude des interactions complexes entre les systèmes métabolique, endocrinien et reproducteur dans le contexte du syndrome des ovaires polykystiques nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme entier. Les effets attendus de la transplantation d’adipocytes bruns sur le métabolisme, la fonction hormonale et la fertilité impliquent des communications multi-organes (tissu adipeux, cerveau, gonades, foie) qui ne peuvent actuellement pas être reproduites de manière fiable par des systèmes in vitro ou in silico. Bien que des modèles cellulaires et computationnels soient en cours de développement et puissent contribuer à certaines étapes exploratoires, ils ne permettent pas à ce jour de reproduire la complexité des régulations systémiques étudiées dans ce projet. Ainsi, le recours au modèle animal demeure indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les connaissances générées pourront néanmoins contribuer au développement futur de modèles alternatifs et à la réduction progressive du recours à l’expérimentation animale dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à ce projet est réduit au maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’effectif de chaque groupe par procédure a été calculé à l’aide d’outils statistiques spécifiquesen tenant compte de (i) la définition de la taille minimale des groupes expérimentaux à utiliser pour obtenir des résultats probants, qui seront ajustés en fonction des différentes variables, elles-mêmes évaluées dans chaque expérience et (ii) la coordination des études à leur conception afin de permettre la collecte de plusieurs échantillons / tissus chez les mêmes individus ou d'entreprendre des analyses multiples chez des animaux individuels chaque fois que possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans le respect strict des conditions standard d’hébergement définis par la réglementation. L’eau et la nourriture sont fournies ad libitum. Un enrichissement est ajouté dans la cage (à minima des cylindres de coton pour stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation). Les périodes d’isolement sont limitées, justifiées et un enrichissement adapté est apporté. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé, et les animaux sont habitués aux manipulations afin de limiter le stress. Une attention particulière est accordée au principe de raffinement, en portant l’attention aux différentes procédures expérimentales appliquées aux animaux afin de minimiser la peur, l'angoisse (ex: regroupement et enrichissement de l'environnement) ou la souffrance (ex : soins péri-opératoires, asepsie, anesthésie et analgésie) qu'ils pourraient endurer. Toutes les procédures potentiellement invasives sont réalisées sous anesthésie adaptée, associée à une analgésie préventive et postopératoire lorsque nécessaire, afin de prévenir toute douleur. Une observation continue des animaux est assurée jusqu’au réveil complet après toute intervention nécessitant une anesthésie. Par la suite, une surveillance quotidienne de l’état général et du comportement est réalisée tout au long des procédures expérimentales, incluant l’évaluation de l’activité, de la posture, de l’aspect du pelage, de la prise alimentaire et hydrique ainsi que du poids corporel. Des critères d’arrêt sont définis et appliqués. Tout animal présentant des signes de souffrance, de détresse persistante, de perte de poids excessive ou d’altération de l’état général sera immédiatement retiré de l’étude et, si nécessaire, mis à mort.

Choix des espèces

Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à comprendre le lien entre les différents organes afin d’identifier de nouvelles thérapies pour des pathologies telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. La souris, modèle d’étude largement validé en physiologie intégrée, nous permet de nous appuyer sur un socle de connaissances scientifiques solide. De plus, le modèle que nous utilisons dans ce projet est un modèle établi dans le laboratoire (présentant l’avantage d’une durée de gestation courte dans le cadre de notre étude) et validé dans la communauté scientifique permettant ainsi les échanges internationaux. Des souris mâles et femelles seront utilisées à deux stades de développement correspondant aux greffes : P21 (post sevrage) et 6 semaines (jeunes adultes), afin d’évaluer l’impact du timing de transplantation d’adipocytes bruns dans un modèle murin de SOPK.

Tatouées sous anesthésie à leur arrivée, mises au régime hyperlipidique pendant quatorze à seize semaines à partir de trois mois, puis injectées dans le muscle, 80 souris traversent à pied deux établissements dans des valises de transport avant l'expérimentation terminale. Celle-ci comprend un test de transport de glucose, une injection d'insuline et, pour la moitié d'entre elles, trois prélèvements sanguins pendant le test, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'obésité induite comme une source d'inconfort significatif, et les prélèvements répétés comme pouvant provoquer stress, douleurs légères, œdèmes et gonflements. Toutes sont nécropsiées à l'issue, leurs tissus prélevés pour analyses histologiques et génétiques, une partie étant proposée aux autres équipes du centre.

Objectifs

Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la Souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire et l’homéostasie glucidique et ce chez des animaux adultes jeunes dans le contexte de l’obésité qui favorise le développement de la résistance à l’insuline. Ce projet est multisite sur deux établissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires dans le contexte de l’obésité et/ou du vieillissement. La compréhension du rôle de ces espèces de sphingolipides dans le muscle squelettique dans le contexte précité nous permettra d’envisager de nouvelles stratégies dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur (EU1/2), les animaux seront individuellement identifiés par tatouage sous anesthésie (moins d’une minute). Ensuite, ils recevront une injection par voie intramusculaire (env. 30 sec). Cette procédure sera réalisée une seule fois sur animaux anesthésiés et ayant reçu un antalgique ce qui diminuera grandement la douleur, avec une procédure de réveil adaptée. Les animaux ne subiront ensuite qu’une expérimentation terminale nécessitant une injection (env. 30 sec), effectuée par un expérimentateur maîtrisant le geste. Dans le second établissement utilisateur (EU2/2) et pour la moitié des animaux, l’expérimentation terminale nécessite le prélèvement de sang à 3 reprises durant le test (moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables allant de l’inconfort à des douleurs légères sur de courtes durées pourraient être observés au cours de la vie des animaux. Un inconfort, une mobilité légèrement réduite et une légère douleur pourraient être constatés suite à leur identification par tatouage. Le régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance, pourrait engendrer un inconfort significatif pour l'animal. Un inconfort et/ou un stress pourrait intervenir lors des pesées de suivi. Les injections intramusculaires pourraient entrainer des douleurs et une mobilité réduite pendant quelques minutes. Un stress et une légère douleur liée à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des expérimentations terminales (test de transport de glucose et injection d’insuline). Les prélèvements répétés de sang (3 prélèvements) lors du test terminal de flux de glucose radiomarqué peut provoquer du stress, des douleurs légères, œdèmes et gonflements. Enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre dans les cages d’origine des animaux peut entraîner de l’inconfort et/ou du stress même si la distance est restreinte et qu’il sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, ainsi que l'homéostasie glucidique, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en œuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.

Raffinement

A l’arrivée des animaux en zootechnie, ils seront répartis en cages de 4 à 5 individus et acclimatés à minima 5 jours. Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés en accord avec la SBEA du site. Un suivi quotidien sera réalisé soit par les zootechniciens soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permet une habituation à l'Homme ce qui diminue le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées ; ce paramètre permet également de se rendre compte de l’état de l’animal. Si des lésions cutanées apparaissent suite à des bagarres, une pommade sera appliquée. 30 minutes avant l’injection des AAV, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’antalgique. Le réveil de l'animal, après anesthésie et injection des AAVs, se fera dans une cage posée sur tapis chauffant. Du collyre sera appliqué sur les yeux de l’animal. Une vérification de l’absence d’œdème ou de rougeur au point d’injection des AAV sera effectuée dans les 48 heures post-injection. Si le cas se présentait nous consulterions le vétérinaire référent afin de soigner les animaux ; l’utilisation d’une crème type Cortanmycétine ou Meloxicam sont envisagés. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring en annexe. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du score obtenus, le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU 2/2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d’origine des animaux incluant des enrichissements type igloos ou tunnels sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est prédéterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (8 semaines lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) seront utilisés, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes rendus obèses par un régime nutritionnel approprié pour lesquels une insulino-résistance peut se développer. Les animaux seront hébergés entre 8 semaines et 7 mois, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. La mise en régime obésogène débutera à 3 mois, afin d’induire une obésité et une insulino-résistance chez la souris adulte.

2 181 souris vont être utilisées, chacune greffée de cellules tumorales ovariennes humaines chimiorésistantes puis transportée entre deux sites distants de trois kilomètres pour environ 45 minutes d'imagerie TEP sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur écrivant qu'elles le seront "pour récupération et valorisation des tissus". Les procédures d'un niveau de souffrance modéré comprennent l'injection de radiotraceurs, des prélèvements sanguins à la veine saphène sous contention, et une irradiation localisée possible des organes où les traceurs s'accumulent, le seul suivi comportemental décrit étant une inspection quotidienne notant la prostration, la rupture du lien social et une grimace scale. Les retombées annoncées pour les patientes atteintes de cancer de l'ovaire séreux de haut grade sont formulées dans "l'espoir d'augmenter leurs perspectives de survie", quand le projet en est encore à vérifier où se distribuent quatre familles de molécules.

Objectifs

Dans le domaine de la médecine nucléaire, la thérapie par radioligand (TRL) représente une avancée majeure pour le traitement des cancers. Cette approche théranostique repose sur l’utilisation d’agents biologiques, tels que des peptides ou des anticorps, ciblant spécifiquement des protéines exprimées à la surface des cellules tumorales, couplés soit à un radioisotope d’imagerie pour le diagnostic, soit à un radioisotope thérapeutique. Cependant, aucun agent théranostique n’existe encore pour des cancers agressifs tels que le cancer de l’ovaire séreux de haut grade dont le sombre pronostic est généralement associé à des résistances à la chimiothérapie. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouveaux radioligands, développés pour cibler de façon spécifique différentes protéines membranaires surexprimées à la surface des cellules tumorales ovariennes. À ce jour, quatre cibles dont les ligands naturels sont déjà bien caractérisés ont été identifiées. Le premier objectif de ce projet consistera à évaluer la biodistribution de différentes molécules dirigées contre ces quatre cibles d’intérêt, après couplage à un radioisotope d’imagerie, afin de vérifier leur spécificité. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité thérapeutique de ces molécules en les couplant avec un radioisotope thérapeutique émettant des rayonnements ionisants afin de créer des dommages à l’ADN des cellules tumorales ciblées et de provoquer leur mort. Des souris porteuses de tumeurs ovariennes humaines (chimiorésistantes) seront ainsi utilisées soit pour réaliser des imageries par Tomographie à Emission de Positron (TEP) après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope d’imagerie ; soit pour étudier le suivi de la croissance tumorale après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope thérapeutique. Cette étude a pour but d’évaluer la spécificité et l’efficacité thérapeutique de radioligands ciblant des protéines surexprimées dans les cancers de l’ovaire. Cela permettra de sélectionner les candidats les plus prometteurs qui pourraient avoir un intérêt dans le traitement de ces cancers.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de déterminer la faisabilité d’une approche théranostique, chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire, en fournissant de précieuses informations sur la distribution des radioligands au sein de l’organisme, son excrétion et stabilité dans le sang, connaissances indispensables pour le choix des radioligands possédant la meilleure efficacité thérapeutique, tout en minimisant les effets sur les tissus sains. Ainsi, cela permettrait d’envisager de nouvelles méthodes de prise en charge des patientes atteintes de cancer de l’ovaire grâce à la théranostique, dans l’espoir d’augmenter leurs perspectives de survie et d’améliorer leur qualité de vie pendant et après le traitement, par la diminution des effets secondaires. De plus, les 4 récepteurs d’intérêt étant également surexprimés dans d’autres types de cancers, cela pourrait étendre les bénéfices de ces composés innovants à d’autres patients.

Procédures

Injection de cellules tumorale (5minutes sous anesthésie gazeuse). Transfert entre les deux sites : moins de 3 km (environ 10 minutes). Injection de radiotraceurs (2 minutes) sous anesthésie gazeuse suivi d'imagerie TEP sous anesthésie gazeuse : environ 45 minutes. Prélèvements sanguin (veine saphèene) sous contention : 1 minute.

Impact sur les animaux

Une inspection détaillée et quotidienne dans les périodes critiques, i.e. après implantation et après traitement, de chaque animal est effectuée afin d’observer le comportement et les symptômes cliniques de l’animal : rupture du lien social, prostration, grimace scale. De plus, de l’aliment gélifié leur sera proposé Les animaux ressentiront de l’inconfort, voire de la douleur, en raison de la nécessité de procéder à des injections de cellules tumorales ou de radiotraceurs : - stress de la préhension des souris pour l'implantation des tumeurs : environ 2 minutes - inconfort associé au développement tumoral : légère gêne au niveau moteur : maximum 2 semaines - au moment du tranfert des animaux : stress du au changement d'environnement : environ 3 jours - injection des radiotraceurs sous anesthésie : pas de stress en dehors de celui de la préhension pour sédation - imagerie TEP : pas de stress ni douleur prévu, car non invasif et réalisé sous anesthésie. Les signes de toxicité possibles des radio ligands sont principalement liés à l’accumulation des radiotraceurs dans certains organes qui peut entrainer une irradiation localisée. Ces toxicités seront évaluées via les études de bio distribution (et comptage gamma après prélèvements d’organes). Nous serons tout de même attentifs aux pertes d’appétit, de diarrhée et de perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupération et valorisation des tissus.

Remplacement

Bien que de nombreux modèles in vitro, de plus en plus poussés, existent et qu’il s’agisse d’un champ de la biologie en essor, il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer un organisme vivant par une puce microfluidique ou un organoïde. En effet, dans le cadre de l’étude présentée ici, il est nécessaire d’évaluer des paramètres tels que la distribution au sein d’un organisme entier ainsi que l’excrétion des radioligands. Tout ceci nécessite des systèmes circulatoires et excrétoires, dont toute la complexité ne saurait encore être retranscrite artificiellement. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle murin. Les étapes de recherche de récepteurs cibles ont été menées in silico. Par ailleurs, les étapes de validation des cibles ainsi qu’une première sélection des ligands présentant les meilleures caractéristiques (liaison spécifique au récepteur cible et capacité d’internalisation) ont été réalisées in vitro, sur des lignées cellulaires de cancer ovarien. Cela permet ainsi de réduire l’utilisation d’animaux et leur utilisation n’arrive qu’à la fin d’un processus réfléchi et optimisé, de sorte à en minimiser l’usage.

Réduction

Les différents tests in vitro permettent de sélectionner uniquement les composés ayant montré les meilleures caractéristiques pharmacologiques avant l’utilisation d’animaux. La quantité d’animaux utilisée a été réduite au minimum nécessaire, en limitant la quantité de ligands testés grâce à une analyse « en entonnoir ». Ainsi, le nombre d’animaux annoncé est un nombre maximum est pourra être réduit si un des radioligands testés répond à tous les paramètres étudiés. De plus, le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Concernant l'hébergement les cages sont insérées dans un portoir ventilé, permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et leurs yeux lubrifiés afin d’éviter toute sècheresse ou irritation oculaire. Les conditions d’anesthésie sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Afin de diminuer l'effort en convalescence, de aliment gélifié est placé dans les cages après chaque anesthésie (il aura été présenté en amont aux souris pour les habituer et passer l’étape de néophobie alimentaire). En fin de protocole, les souris seront placées dans une salle isolée du reste des souris pour la mise à mort et les manipulations post-euthanasies seront également réalisées dans une autre pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements (3 km) suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Les antalgiques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens sont prévus et pourront être utilisés si nécessaire. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur progression et/ou l'apparition de zones de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

La souris demeure un modèle de choix pour les études précliniques en oncologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme permet d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit entre deux et six mois. Les expériences sur adultes permettent de garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser.