Oncologie

1 490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Selon les lots, elles subissent une à trois chirurgies, chirurgie stéréotaxique, injection virale et vagotomie, puis portent des fibres optiques ou un cathéter gastrique pour des tests de comportement et de métabolisme. Le porteur indique des douleurs et infections postopératoires possibles et un stress lié aux dispositifs, et précise que tous les animaux sont mis à mort pour prélever des tissus. Il affirme que les expériences ne peuvent se faire in vitro car il a "besoin" d'observer une physiologie intégrée, et que les invertébrés n'ont pas les structures équivalentes aux mammifères.

Objectifs

La régulation de la prise alimentaire repose sur la balance entre besoins énergétiques et la valeur renforçatrice de la nourriture. Cette régulation résulte de l'intégration dynamique de plusieurs signaux qui façonnent collectivement les stratégies adaptatives pour le maintien de l'apport calorique et du poids corporel. Cependant, notre environnement alimentaire moderne fait évoluer les ajustements physiologiques vers des dysfonctionnements de la récompense et du métabolisme qui peuvent conduire au syndrome métabolique (obésité). Les composantes de la prise alimentaire (énergie et récompense) ont été souvent décrites et étudiées en termes de régulation par le cerveau. Cependant, dans les dernières années l’axe vagal (intestin-cerveau) a émergé comme un régulateur clé de la prise alimentaire en modulant à la fois le métabolisme énergétique et les processus de récompense. Le nerf vague représente un relai neuronal capable d’assurer le transfer de l’information intéroceptive entre les organes périphériques et le cerveau. Malgré ce rôle critique, les mécanismes sous-jacents à cette régulation en conditions physiologiques et/ou pathologiques (obésité) restent largement inconnus. Ce projet de recherche vise donc à étudier le rôle de l’axe vagal dans les processus de récompense et de métabolisme énergétique. Le projet est construit autour de 4 objectifs principaux. 1. Étudier la plasticité structurale et neuronale des neurones du système de la récompense suite à vagotomie. 2. Établir le rôle des afférences vagales intestin-cerveau dans les réponses adaptatives du circuit de récompense dans l'obésité : de l'alimentation à la détection des nutriments. 3. Interroger l'axe vagal intestin-cerveau pour restaurer les fonctions hédoniques et métaboliques 4. Explorer la signature moléculaire des neurones vagaux pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'obésité

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes d'inadaptations physiopathologiques en aval. Malgré les progrès et les efforts récents, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. En fait, à ce jour, les approches thérapeutiques les plus durables de l'obésité et des dysfonctionnements qui lui sont liés sont représentées par les chirurgies bariatriques, très efficaces mais extrêmement invasives et dangereuses, dont les mécanismes d'action restent largement inexplorés. Le développement récent de technologies de pointe et l'émergence de concepts révolutionnaires dans le domaine de la physiologie intégrative, comme le propose le projet, vont certainement élargir notre quête de connaissances et de solutions thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis : -pour 5 lots à une chirurgie d'injection virale (environ 1h), puis après une période de repos de 3 semaines minimum, à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles (175ul, 35ul et 35ul sur 3j à interval d'une semaine) seront fait sur deux de ces lots. -pour 4 lots à deux chirurgies (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, ou stéréotaxie 30min et après 15j de repos une vagotomie 40min), puis après une nouvelle période de repos de 15j, à des tests de comportements. -pour 1 lot à trois chirurgies qui se feront en deux fois pour le bien être de la souris (stéréotaxie 30min et injection virale en périphérie 40min, puis après 15j de repos une vagotomie 40min). Puis après une période de repos de 15 jours à nouveau, il seront soumis à des tests de comportements.

Impact sur les animaux

Pour l'ensemble des procédures il peut y avoir des douleurs ou infections post opératoires qui seront traitées par analgésie et antibiothérapie si nécessaire. Pour les procédures 1-2-3, le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement. De même pour les animaux portant un cathéter gastrique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.

Réduction

Oui selon le dessin expérimentale et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nous utiliserons les tests suivant: Student T Test ; One-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; Two-Way Anova (Bonferroni post-hoc multiple comparaison) ; régression linéaire. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests non-paramétriques.

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux sont bien en place.

80 souris pygmées (Mus minutoides) vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur décrit une étude qu'il présente comme "non invasive et indolore", mesure de l'activité locomotrice par caméra et de l'activité métabolique par calorimétrie sur trois jours, tout en isolant chaque animal en cage individuelle, ce qui peut provoquer un mal-être qu'il reconnaît. À l'issue, les souris sont mises à mort et prélevées de nombreux organes, cœur, rein, tête, muscle, pour des mesures complémentaires, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent rejoindre l'élevage sous peine d'être rejetées ou tuées par leurs congénères. Sur le remplacement, il affirme que l'étude "nécessite des organismes vivants dans leur intégralité" propres à cette espèce.

Objectifs

Chez les mammifères, le déterminisme sexuel XX/XY reste très conservé, à quelques exceptions près, car toute déviation mène généralement à la stérilité des organismes hybrides. Certaines espèces comme Mus minutoides échappent à cette règle. Chez cette espèce, il existe une inversion sexuelle due à un chromosome X mutant, le chromosome X*, qui féminise les individus. Par conséquent, il existe des femelles XX, XX* et X*Y et des mâles XY chez cette espèce. Outre l’inversion sexuelle, ce troisième chromosome X* entraine de nombreuses différences phénotypiques. Les femelles X*Y ont un meilleur succès reproducteur que les autres femelles, i.e. une première portée plus précoce, une taille de portée plus grande et plus de descendants au cours de leur vie. De plus, elles présentent un comportement très masculinisé, sont plus agressives et moins anxieuses que les femelles XX et XX*. Ainsi, les études jusqu’alors menées chez Mus minutoides se sont surtout intéressées aux différences génotypiques et comportementales observées entre les différents génotypes sexuels. Peu d’études ont investigué la physiologie et encore moins l’influence du génotype sexuel sur celle-ci, chez cette espèce. Ce présent projet a donc pour objectif de poursuivre le phénotypage chez Mus minutoides en réalisant de nouvelles mesures comportementales et physiologiques (de l’animal entier jusqu’à la cellule). Pour cela, 16 femelles XX, 16 femelles XX*, 16 femelles X*Y et 16 mâles XY seront utilisés. Après deux semaines d’acclimatation, les paramètres listés ci-après seront mesurés durant 3 jours consécutifs (mesures répétées) : - L’activité locomotrice par caméra infrarouge. Pour cette analyse comportementale, la durée, la fréquence et le type de déplacement seront considérés. - L’activité métabolique grâce à un système de calorimétrie indirecte. Cette mesure permettant alors d’obtenir des mesures complémentaires à celle de l’activité locomotrice en quantifiant, par exemple, l’énergie utilisée dans les fonctions vitales pour l’animal et celle impliquée dans d’autres fonctions (comme la locomotion) sur 24h. De même, il sera possible de calculer le quotient respiratoire, la prise alimentaire et la prise hydrique des individus étudiés. Cette étude, non invasive et indolore, constitue une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences physiologiques et comportementales entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet est une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences cérébrales et comportementales entre sexes et sur le rôle de l’antagonisme sexuel dans l’évolution des chromosomes sexuels. Nous sommes également dans une excellente configuration pour comprendre les bases génétiques encore largement méconnues du déterminisme sexuel chez les mammifères, qui pourrait apporter des éléments utiles à la recherche clinique. Les animaux ne pourront pas être réintroduits dans leur élevage initial sous peine d’être rejetés voire tués par leurs congénères. Ils seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires (mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, activités enzymatiques, analyse morphométrique, etc) afin de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides et d’apporter de nouvelles connaissances sur cette espèce encore peu méconnue d’un point de vue physiologique.

Procédures

Après deux semaines d’acclimatation, les souris seront placées en cage expérimentales dans les mêmes conditions de stabulation (enrichissement précédent conservé). Pour chaque individu, les paramètres listés ci-après seront mesurés durant 3 jours consécutifs : - L’activité locomotrice par caméra infrarouge. Pour cette analyse comportementale, la durée, la fréquence et le type de déplacement seront considérés. - L’activité métabolique grâce à un système de calorimétrie indirecte. Cette mesure permettant alors d’obtenir des mesures complémentaires à celle de l’activité locomotrice en quantifiant, par exemple, l’énergie utilisée dans les fonctions vitales pour l’animal et celle impliquée dans d’autres fonctions (comme la locomotion) sur 24h. De même, il sera possible de calculer le quotient respiratoire, la prise alimentaire et la prise hydrique des individus étudiés. Cette étude est non invasive et indolore. Elle constitue une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences cérébrales et comportementales entre sexes et sur le rôle de l’antagonisme sexuel dans l’évolution des chromosomes sexuels. Nous sommes également dans une excellente configuration pour comprendre les bases génétiques encore largement méconnues du déterminisme sexuel chez les mammifères, qui pourrait apporter des éléments utiles à la recherche clinique. Les animaux ne pourront pas être réintroduits dans les élevages initiaux sous peine d’être rejetés voire tués par leurs congénères, il seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires (mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, etc) qui permettront de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides.

Impact sur les animaux

Le projet est conçu de sorte à ne pas entrainer de nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux. Néanmoins, les souris seront seules dans leur cage, pour un souci d’agressivité et de conditions expérimentales, ce qui peut mener à un mal-être de l’animal. Par conséquent, nous porterons une attention particulière au comportement et à l’état physique des souris pour éviter qu’un animal ne se retrouve en souffrance. De même, les cages seront placées les unes à côté des autres pour que les souris puissent au moins se voir et ne pas se sentir isolées. Les observations faites lors du dernier projet réalisé sur cette espèce ont permis de mettre en évidence que les souris ne montrent pas de signes de stress lorsque leur cage se situe à côté de celles de leurs congénères.

Devenir

L’élevage initial ne reprendra pas les individus utilisés dans cette procédure expérimentale pour des raisons sanitaires et également de réinsertion. La souris pygmée Africaine Mus minutoides est une espèce sociale qui vit en petit groupe. A l’issu de l’expérimentation, il sera difficile de reconstituer des groupes d’individus qui auront été isolés plusieurs jours (même si le contact visuel est maintenu entre les individus), plus particulièrement avec les mâles XY et les femelles X*Y qui peuvent se montrer très agressifs. Enfin, il existe peu d’informations sur la physiologie de cette espèce et sur les différents génotypes existants chez celle-ci : femelles XX, X*X et X*Y et mâles XY. A l’issu de ce projet, les animaux seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires : mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, activité enzymatique, analyse morphologique, etc. Des mesure qui permettraient de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides, sans mettre à mort d’autres individus. Les échantillons biologiques prélevés seront nombreux (i.e cœur, rein, tête, queue, muscle squelettique, foie, muscle, tissu adipeux brun, etc) pour répondre à diverses questions soulevées au sein de notre laboratoire et dans d’autres laboratoire (Montpellier notamment). En guise d’exemple, le muscle squelettique sera utilisé par notre laboratoire pour des analyses de bioénergétique mitochondriale et les têtes des souris seront, quant à elles, envoyées à Montpellier pour des analyses de la morphologie des cavités nasales de cette espèce.

Remplacement

Ces expérimentations nécessitent des organismes vivants dans leur intégralité, en particulier une espèce, Mus minutoides, qui ne peut pas être remplacée par une approche substitutive.

Réduction

Les manipulations sont optimisées statistiquement pour réduire le nombre d’individus utilisés : 16 individus par génotype sexuel, soit 64 individus au total. En effet, un test de puissance, à partir de données préliminaires, indique que 16 individus par condition sont nécessaires pour détecter une différence : power.anova.test (groups = 4, between.var = 1, within.var = 4, power = 0.80). Chaque individu sera utilisé à la fois pour les mesures d’activité physique, de taux métabolique et d’autres mesures complémentaires (prises alimentaire et hydrique, bioénergétique mitochondriale, etc). 4 individus supplémentaires de chaque génotype seront aussi maintenus en réserve et ne seront utilisés que dans le cas où des individus seraient écartés de la procédure expérimentale ou morts. Ainsi, dans le cas où les individus supplémentaires venaient à être étudiés, 80 animaux seraient utilisés pour ce projet. Les données obtenues à l’issu de ce projet seront alors analysées statistiquement à l’aide d’une ANOVA sur mesures répétées puisque plusieurs mesures auront été réalisées sur un même individu.

Raffinement

Les mesures nécessitent ni injection, ni manipulation des individus, excepté lors du changement de cage. Les cages d’hébergement seront enrichies de nids et de jeux, et la nourriture ainsi que l’eau seront disponibles ad libitum pour limiter la solitude des individus dans la cage. Ce même enrichissement sera conservé dans les cages expérimentales et aucun changement de cage ne sera effectué lors des mesures pour limiter le stress des animaux. Une attention particulière sera portée sur diverses manifestations : les prises hydrique et alimentaire, la présence ou non de toilettage, la modification de comportement ou de posture, l’apparition d’une hypothermie et la consistance des selles. Un individu en souffrance sera écarté de la procédure et placé dans sa cage d’hébergement initiale, plus enrichie. Si son état venait à s’aggraver, l’animal serait mis à mort par dislocation cervicale précédée d’une sédation.

Choix des espèces

L’étude de l’activité physique et du taux métabolique nécessite des organismes vivants dans leur intégralité, et en particulier des femelles et des mâles Mus minutoides. En effet, ce projet cherche à comparer quatre génotypes sexuels différents : trois génotypes féminins existant chez cette espèce (XX, XX* et X*Y) et un génotype mâle (XY). Ainsi, aucune méthode alternative n’existe pour réaliser ce projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes reproducteurs. Les mesures de taux métabolique (consommation d’oxygène) et d’activité nécessitent de choisir des individus d’âge relatif similaire afin d’éviter les variations en lien avec le stade de développement. Prendre des adultes, par exemple, évite de mesurer le taux métabolique (consommation d’oxygène) alloué à la croissance des individus en développement et de mesurer par conséquent le taux métabolique basal de l’individu.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur de mélanome mesurée deux fois par semaine jusqu'à un centimètre cube, suivie avec ses métastases par bioluminescence sous anesthésie gazeuse, pour caractériser le rôle du gène BAHCC1. Le porteur reconnaît un inconfort lié à la tumeur et aux métastases, avec perte de poids et d'appétit, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la nature agressive du mélanome. Il décrit les objectifs et les bénéfices du projet en une seule phrase quasi identique, centrée sur la caractérisation de la croissance tumorale.

Objectifs

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 in vivo.

Bénéfices attendus

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 dans un contexte plus physiologique comparé aux conditions in vitro.

Procédures

Tous les animaux vivants seront suivis pour évaluer deux paramètres : 1- taille de la tumeur primitive au moins 2 fois par semaine pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : les animaux seront éveillés et la taille de la tumeur sera évaluée au pied à coulisse. Durée de intervention 5 minutes pour souris. 2- taille de la tumeur primaire et des lésions secondaires 2 fois par semaine par bioluminescence pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : durant cette procédure les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (2% d'isoflurane). Durée de intervention 15 minutes pour souris.

Impact sur les animaux

Inconfort généré par la présence de la tumeur primitive et des métastases pouvant entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés par la métastase tumorale.

Devenir

Lot A : 20 animaux subiront les procédures 1 et 2 pour caractériser la cinétique tumorale des 4 lignées cellulaires utilisées pour cette étude (5 souris pour la lignée cellulaire pour générer une étude statistique de base). Lot B : 120 animaux subiront les procédures 1 et 2 qui sont combinées pour analyser la croissance et la cinétique métastatique des tumeurs en présence ou en l'absence de BAHCC1. En raison de la nature agressive du mélanome, toutes les souris seront sacrifiées afin d'éviter tout type de souffrance et de douleur (par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale).

Remplacement

Nous avons effectué l'inactivation de BAHCC1 dans des lignées cellulaires humaines in vitro, démontrant son importance pour la prolifération des mélanomes. Cependant, ce modèle a des limites et ne prend en compte ni la croissance dans des conditions tridimensionnelles, ni le rôle du microenvironnement tumoral. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que dans un modèle in vivo tel qu'une souris immunodéficiente, facile à manipuler et capable d'héberger des cellules humaines. De plus, notre xénogreffe de souris sera comparée à d'autres modèles de mélanome de souris utilisés par nos collaborateurs de laboratoire.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 140. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Par ailleurs, plusieurs expériences sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'analyse statistique sera effectuée avec le software GraphPad (Prism 9) avec unpaired t-test ou avec One-way ANOVA non-parametric.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale et confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) pour chaque lignée cellulaire injectée à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 1 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des quatre lignées cellulaires utilisées. Toutes les lignées expriment la luciférase, nous pourrons donc surveiller en parallèle le développement et la taille des métastases en mesurant l'activité de la luciférase avec le système IVIS tous les lundis et vendredis de la semaine. La mesure de l’activité luciférase sera effectuée tout au long de la cinétique tumorale avant d'atteindre la taille limite de la tumeur de 1 cm3. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance liée au phénotype, les animaux seront suivis régulièrement et des critères d'évaluation appliqués si nécessaire.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance de BAHCC1 dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc.

3950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections d'un composé supprimant l'autophagie, puis une injection de cellules leucémiques, des prélèvements sanguins répétés, parfois une ponction osseuse, et un traitement oral ou intrapéritonéal, pour étudier le rôle de l'autophagie dans la leucémie aiguë myéloïde. Le porteur indique des effets possibles comme du stress, une perte de poids ou une gêne de mobilité après ponction osseuse. Les souris sont tuées par prélèvement sanguin intracardiaque sous anesthésie pour les analyses.

Objectifs

Malgré un taux élevé de rémission après un traitement conventionnel par chimiothérapie, les rechutes sont fréquentes chez les patients atteints de leucémies aigües myeloïdes (LAM). Comme pour d'autres types de cancer, l'un des mécanisme impliqués dans la résistance des LAM est la reprogrammation métabolique. L’autophagie est un processus catabolique impliqué dans la dégradation et le recyclage des organelles et protéines endommagées pour participer au métabolisme. La dérégulation de l’autophagie est impliquée dans de nombreuses maladies telles que le cancer. Récemment, l’importance de l’autophagie dans les cellules du microenvironnement tumoral a également été mis en évidence. En effet, cette autophagie de l’hôte favorise la croissance des mélanomes, cancer du poumon ou cancer du pancréas en fournissant les substrats nécessaires aux cellules cancéreuses. Ainsi, ce projet s’intéresse à l’étude de l'implication de l’autophagie de l’hôte dans la régulation du métabolisme des cellules de LAM et leur chimiorésistance.L

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie dans le dévelopement et la résistance des LAM et les mécanismes moléculaires exacts impliqués. Cette meilleure compréhension pourra permettre le développement de thérapies ciblant directement l'autophagie ou des voies moléculaires régulées par ce mécanisme. Ce projet permettra également la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées existantes dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 injections d'un composé permettant d'induire une déplétion de l'autophagie dans l'ensemble des organes de la souris. Les animaux seront ensuite soumis à une injection unique de cellules leucémiques par voie intraveineuse, puis à des prélèvements de sang sous anesthésie espacés de plusieurs semaines afin d'évaluer la prise tumorale et de récolter du matériel biologique (plasma) pour des analyses ultérieures. En cas de non-diffusion des cellules leucémiques, nous ferons une ponction osseuse de cellules sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement de durée variable selon le type de thérapie, allant de une à quatre semaines, par voie orale ou intrapéritonéale. Les animaux seront soumis à une présence humaine quotidienne afin d'observer leur état de bien-être et manipulés de façon hebdomadaire pour un suivi pondéral.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress, une perte de poids, une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne par exemple. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir un gêne temporaire au niveau de la mobilité même si la douleur est inhibée avec l'analgésie. En revanche, tout signe de douleur observé mettra fin à l'expérimentation pour l'animal concerné.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chaque étude contenant plusieurs procédures. Pour les procédures suivantes: injedction intraveineuse, intrapéritonéale, orale ainsi que le prélèvement sanguin mandibulaire et jugulaire, les animaux seront gardés en vie pour continuer l'étude. Pour la procédure de prélèvement de sang par voie intracardiaque sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés sans réveil après la procédure.

Remplacement

Dans le but d’évaluer la contribution de l’autophagie dans le développement leucémique et la résistance thérapeutiques, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier de façon fidèle les interactions entre la tumeur et son microenvironnement ainsi que son évolution au sein d’un organisme vivant. Bien que certains modèles in vitro (notamment de co-culture) permettent d’obtenir une première compréhension des mécanismes, ils ne sont pas suffisants. Par exemple, nous avons montré une absence de corrélation entre la réponse in vitro et in vivo à l’AraC, rendant nécessaire l’utilisation de modèle in vivo. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité in vivo.

Réduction

Les effectifs des cohortes seront calculés et limités par un logiciel de simulation et l'outil statistique. Les études antérieurement effectuées permettront d'optimiser le nombre d'animaux et le nombre d'échantillons issu de l'animal.

Raffinement

L'expérimentation fait l'objet d'une procédure de suivi du bien-être des ainmaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée s'il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à la procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites. La plupart des procédures décrites dans ce projet ont déjà obtenu l'accord d'un comité d'éthique pour l'expérimentation animale.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du cancer et du rôle de l’autophagie dans de nombreuses pathologies. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements et à la compréhension des fonctions de l’autophagie. Ils présentent des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Dans l’étude de la LAM, nous utilisons des souris immunodéficientes et immunocompétentes contrôle ou déficiente en autophagie systémique afin d’étudier l’importance de la composante immunitaire. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe leucémique. Le traitement au tamoxifène pour induire la délétion est également plus efficace à cet âge-là. De plus, les souris de cet âge sont moins susceptibles de ressentir la douleur, la souffrance et l’angoisse.

255 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une laparotomie pour accéder au pancréas et y créer une tumeur, ainsi que trois injections intrapéritonéales, pour étudier le stroma de l'adénocarcinome pancréatique. Le porteur indique des risques d'infection, d'hypothermie liée à la durée de la chirurgie et d'effets digestifs de la tumeur. Toutes les souris sont tuées pour prélever des organes vitaux.

Objectifs

L’adénocarcinome pancréatique (ADK) qui a un taux de survie global de 2-9%, est actuellement la quatrième cause principale de décès liés au cancer dans le monde industrialisé et d’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunités de traitements thérapeutiques. La plupart des approches thérapeutiques jusqu’à présent se sont intéressées à cibler directement les cellules tumorales et ont jusqu’à récemment, ignoré les réactions stromales adjacentes qui sont une des caractéristiques importantes des cancers pancréatiques humains. Depuis quelques années, le dépôt de ce stroma massif a émergé en tant qu'acteur nouveau et contributeur dans l'initiation et la progression pancréatique de la tumeur. Il a été mis en évidence la présence d’une sous-population cellulaire souche péricytaire dans le stroma du pancréas de souris atteintes d’ADK. Ces cellules ont été isolées et mises à proliférer en culture pour établir une lignée permettant son étude. Par ailleurs, il a été montré une augmentation significative de macrophages spécifique dans différents modèles de cancer pancréatique. Cette population a été décrite comme pro-tumoral dans le cancer du sein et du poumon. Nous pensons que ces macrophages spécifique jouent un rôle important dans la mise en place de l’immunosuppression présente dès le début du cancer pancréatique en étant recrutés et programmés par les cellules entourant le cancer, notamment les cellules stromal. Nos objectifs seront 1) de dépléter ces macrophages spécifiques via l’utilisation de souris génétiquement modifiées 2) D’étudier cette déplétion au niveau de la masse tumorale mais aussi de l’infiltrat immunitaire.

Bénéfices attendus

On estime à environ 10.000 le nombre de nouveaux cas de cancer du pancréas en France. L'incidence dans le monde, varie entre 1 et 10 cas pour 100 000 personnes et reste globalement stable dans le temps mais en croissance dans les pays développés. D’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Le cancer du pancréas est difficile à diagnostiquer et particulièrement compliqué à traiter. Il résiste en effet à plusieurs traitements antitumoraux (Thérapie ciblée, immunothérapie, chimiothérapie). L’accès des traitements antitumoraux au sein de la tumeur est empêché par la nature du microenvironnement qui soutient les cellules cancéreuses mutées. Ce microenvironement est modifié par les macrophages. Ces derniers représentent près de 40% des cellules immunitaires infiltrées, comprendre le rôle d’une population potentiellement immunosuppressive de macrophages permettrait de développer de futur traitement contre le cancer du pancréas.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéale ainsi qu’une procédure chirurgicale de laparotomie permettant d’accéder au pancréas. Chaque souris sera soumise à 3 injections intra-péritonéale 1 avant la chirurgie, 2 après la chirurgie, chacune dure environ 1 minute. Chaque souris sera soumise à une laparotomie permettant d’accéder au pancréas. La durée estimée est entre 15 et 20 minutes.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables dues à l’injection intra-péritonéale peuvent être ressentis. Les autres principaux risques sont l’infection due à la chirurgie ainsi que l’hypothermie due à la durée de l’acte chirurgicale. Également, la tumeur peut avoir des effets sur la souris, notamment sur son système digestif.

Devenir

L’ensemble des animaux étant soumis aux procédures seront mis à mort car notre projet nécessite le prélèvement d’organes vitaux pour analyse.

Remplacement

Des études in vitro ont préalablement été effectué afin de déterminer le rôle des cellules stromal dans la différenciation des macrophages spécifique ainsi que le rôle de ces macrophages spécifique. Ainsi, l'utilisation d'un modèle murin afin de vérifier si ces observations ont lieu dans un environnement complexes ne peut être remplacé.

Réduction

Le nombre de souris sera réduit à minima pour permettre une analyse statistique et l’obtention de conclusions interprétables qui conduiront à ne pas répéter les expériences que nous mettons en place sur les animaux.

Raffinement

Afin de respecter le bien-être animal, les souris sont dans des cages avec un milieu enrichi et du coton pour qu’elles se fassent un nid (quotidien de l’animalerie). Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Les animaux seront observés au minimum 3 fois par semaine durant la durée de l’expérience afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur douleur ou leur détresse et ainsi améliorer leur bien être Afin de maximiser l’obtention des données scientifiques et raffiner nos approches expérimentales, nous établirons un suivi attentif des souris et fixerons des points limites pour réduire au maximum la souffrance des animaux et éviter l’apparition de tout signe de souffrance Dans ce cadre, un analgésique sera également utilisé dans les procédures de chirurgie afin d’enrayer la douleur chez l’animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études en cancérologie du fait de l’existence de nombreux modèles bien caractérisés. Spécifiquement, il n’existe pas d’autre espèce que la souris permettant une déplétion conditionnelle des macrophages spécifique. Les souris adultes de 6 semaines ayant un système immunitaire compétent et un pancréas développé et fonctionnel seront utilisées pour ce projet.

240 hamsters syriens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections répétées de mélatonine, une autre subit une chirurgie d'implantation d'un système d'infusion continue d'hormones thyroïdiennes dans le cerveau, pour étudier la prolifération cellulaire saisonnière de l'hypothalamus. Le porteur indique que la chirurgie est douloureuse, que le passage en jours courts provoque une perte de poids d'environ 15 % et que l'isolement en cage individuelle peut générer du stress. Tous les animaux sont ensuite tués pour prélever le cerveau, le sang et les testicules.

Objectifs

L’hypothalamus est une partie du cerveau qui contrôle les fonctions métaboliques et reproductives. Chez les mammifères, il a été montré que les changements saisonniers des hormones thyroïdiennes et de la mélatonine régulent l’activité de l’hypothalamus pour ajuster les fonctions métaboliques et reproductives avec les saisons. Notre projet déterminera quel est le rôle des hormones saisonnières (mélatonine et hormones thyroïdiennes) dans la prolifération cellulaire saisonnière de l’hypothalamus du hamster syrien, un mammifère saisonnier. Des études chez le mouton ont montré que l'exposition à des jours courts d’hiver (avec un pic long de mélatonine), qui induit une activation de leur reproduction, est associée à une augmentation de la prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Nos données préliminaires chez le hamster syrien montrent que l'exposition à des jours courts (qui, à l’inverse du mouton, inhibent sa reproduction) induit également une prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Ces observations suggèrent que la prolifération saisonnière des cellules hypothalamiques se produit en réponse au signal saisonnier, indépendamment de la stratégie de reproduction de l'animal. Notre projet testera quelles hormones saisonnières (mélatonine et/ou hormones thyroïdiennes) induit la prolifération cellulaire hypothalamique en jours courts chez le hamster syrien mâle.

Bénéfices attendus

Ce projet nous aidera à mieux comprendre la nature du signal saisonnier endocrine (mélatonine et/ou hormones thyroïdiennes) qui contrôle la prolifération cellulaire saisonnière dans l'hypothalamus du cerveau adulte d’un mammifère. Les résultats obtenus nous permettront ensuite d’envisager de futures expériences pour 1) établir la nature des cellules hypothalamiques nouvellement formées suite au changement des saisons, 2) analyser le rôle physiologique de la prolifération cellulaire adulte saisonnière et 3) d’étudier l’effet de perturbateurs saisonniers (réchauffement climatique, pollution lumineuse nocturne) sur la prolifération cellulaire saisonnière. Ces travaux ont des implications cliniques potentielles car des études récentes montrent que la physiologie humaine présente aussi des variations saisonnières d’hormones liées au métabolisme, à la reproduction et à la croissance.

Procédures

Dans la première expérience où nous testons l’effet d’un allongement du pic nocturne de mélatonine en jours longs, chaque hamster recevra une injection de solvant ou de la mélatonine (durée de la préhension plus injection : 2 min) chaque jour pendant 2 ou 4 semaines. Un jour avant la fin de l’expérience, une injection intrapéritonéale d’une substance qui permet la visualisation des cellules nouvellement formées (durée de la préhension plus injection : 2 min) sera donnée sur chaque hamster vigile. Toutes les injections se feront sur animal vigile. Les hamsters seront stabulés à raison de de 3 individus par cage enrichie (tunnel, nid, bâton en bois). Dans la deuxième expérience où nous testons l’effet d’une augmentation des concentrations des hormones thyroïdiennes en jours courts, chaque hamster aura une chirurgie pour implanter un système permettant l’infusion continue de solvant ou d’hormones thyroïdiennes dans le cerveau (durée de la chirurgie sous anesthésie profonde : 30 min) pendant 2 ou 4 semaines. Un jour avant la fin de l’expérience, une injection intrapéritonéale d’une substance qui permet la visualisation des cellules nouvellement formées (durée de la préhension plus injection : 2 min) sera donnée sur chaque hamster vigile. Les hamsters seront stabulés en cages individuelles enrichies (tunnel, nid, bâton de bois) car la situation de jours courts les rend naturellement agressifs et les animaux pourraient s’attaquer les uns aux autres, notamment au niveau des plaies des implantations. A la fin de l'étude, tous les animaux seront mis à mort après anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Le hamster syrien peut être stressé par les manipulations/préhensions qu’il devra subir régulièrement. Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer une douleur locale mais de courte durée. L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse per se (douleur modérée) et peut également entrainer des inflammations. Le transfert en jours courts entraine naturellement une perte de poids d’environ 15%, mais il est possible que la perte de poids soit supérieure. Les hamsters opérés et leurs contrôles sont suite à l'impantation transférés en jours courts et sont placés en cage individuelle (car étant naturellement plus agressifs en jours courts, ils pourraient s’attaquer, notamment au niveau des plaies) ce qui peut conduire à un stress de l’isolement.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour prélèvements 1) du cerveau post-mortem dans le but d’analyser la prolifération cellulaire grâce à la visualisation par une technique de coloration de cellules nouvelles nées par immunohistochimie ; 2) du sang pour doser les hormones de la reproduction, 3) des testicules dont la masse indique le statut reproducteur de l’animal.

Remplacement

Le projet vise à étudier l’effet de plusieurs hormones de la saisonnalité sur les processus de prolifération cellulaire dans l’hypothalamus. Ce sont des fonctions intégrées typiques des mammifères qui par conséquent ne peuvent pas être étudiées chez des organismes non-mammifères, des lignées cellulaires ou des modèles biomathématiques, et qui nécessitent des organismes entiers. Dans ce contexte il n'est encore pas possible de proposer d’alternatives pour des études préliminaires dans des modèles hors-champs.

Réduction

Le nombre de animaux a été calculé sur des connaissances du modèle et une méthode mathématique en intégrant la variabilité inhérente au modèle et aux gestes réalisés. Ce nombre permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Les tests statistiques utilisés pour comparer les groupes ont été choisis pour permettre d’évaluer l’effet de plusieurs hormones de la saisonnalité sur les processus de prolifération cellulaire dans l’hypothalamus.

Raffinement

Tous les hamsters seront dans des cages enrichies avec du matériel de nidation, un bâton à ronger, et tunnel de refuge. Avant et pendant les traitements, les hamsters, qui sont des animaux sociaux, seront placés en cage collective (3 individus par cage). Il y aura une exception pour les hamsters stabulés en jours et ayant eu une intervention chirurgicale qui seront isolés car il y a des risques qu’ils soient agressifs entre eux. Les hamsters soumis à des traitements seront traités avec des analgésiques et anesthésiques adaptés pour réduire leur souffrance induite par les procédures à un niveau minimum. Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début des injections pour limiter le stress généré par celles-ci. Ils seront observés quotidiennement pour détecter tout signe de souffrance. Des points-imites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance durant la durée de l’étude.

Choix des espèces

Le hamster syrien est un modèle de rongeur dont la physiologie saisonnière est bien caractérisée. Des résultats récents chez le hamster syrien ont montré l’existence d’une prolifération cellulaire hypothalamique augmentée lors du transfert en jours courts type hiver. De plus les procédures expérimentales proposées chez cette espèce sont bien maitrisées, ce qui contribuera à en limiter les effets dommageables pour l’animal. Pour ce projet seuls les mâles seront utilisés car la bonne intégration de l’information photopériodique est facilement observable par la modification de la taille des testicules. Nous utiliserons des hamsters mâles post-pubères âgés entre 3 et 8 mois, car notre expérience nécessite que les hamsters aient un âge où la maturation sexuelle est optimale.

4320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des injections répétées d'anticorps et d'inhibiteurs deux à trois fois par semaine, avec un risque de nécrose de la tumeur, de cachexie et d'isolement. Le porteur, une société, indique évaluer l'efficacité anticancéreuse de ses anticorps monoclonaux en combinaison, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet ce test faute de système immunitaire fonctionnel. Les animaux dont la tumeur ne prend pas sont eux aussi mis à mort.

Objectifs

Ces dernières années l’immunothérapie a connu un essor important dans la prise en charge des cancers. Elle a montré une efficacité conséquente dans diverses indications, cependant un certain nombre de patients présentes des résistances spontanées ou acquises. Notre société développe des anticorps monoclonaux à visée thérapeutique dans le cancer. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’efficacité anti-cancéreuse des anticorps monoclonaux en combinaison avec des inhibiteurs de point de contrôle dans des modèles de souris. L’objectif secondaire est d’appréhender les mécanismes d’action de ces anticorps par l’évaluation des modulations du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Notre hypothèse est que nos cibles thérapeutiques jouent un rôle dans le développement tumoral. Notre société évalue l’effet anti-tumoral de thérapies ciblées seules ou en combinaison avec des inhibiteurs de point de contrôle dans le cadre de plusieurs projets cliniques. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement des candidats médicaments et de leur fonctionnement en association avec des inhibiteurs de point de contrôle. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Toutes les souris prévues dans le protocole subiront des injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral, soit du jour d'inclusion dans un groupe de traitement jusqu'à l'obtention d'un point limite) et/ou inhibiteurs de point de contrôle (3 injections espacées de 4 jours à partir de l'inclusion des animaux dans les groupes de traitement). Une injection sous-cutannée de lignées cellulaires est réalisée lors de la greffe (une seule fois). Toutes les injections sont réalisées dans un volume de 100μL. Elles sont faites sur animal vigile dans un délais de 20 secondes à partir de la contention.

Impact sur les animaux

Dans les deux procédures il est possible d’observer des phénomènes de nécrose des tumeurs à la surface de la peau. Les individus concernés seront mis à mort. Des signes de fatigue, cachexie et d'isolement sociale sont également possibles. Des mesures d'enrichissement du milieu et de nourriture semi-liquide dans la cage seront mises en œuvre dans un premier temps. Si les point limites sont atteints, les animaux seront mis à mort et une autopsie sera effectuer de manière à évaluer la présence potentielle de métastases. Si de telles observations sont avérées, les surveillances des animaux restants seront accrues.

Devenir

Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet. Des prélèvements tumoraux postmortem seront effectués afin d'analyser le mécanisme d'action des différentes combinaisons de traitements. Etant donné la variabilité de prise de greffe des différents modèles cellulaires, certains animaux peuvent ne pas présenter de tumeur. Ayant subi une injection de cellules, il ne peuvent être considérés comme naïfs de traitement et réutilisés dans d'autres procédures.Les animaux ne présentant pas de prise tumorale seront mis à mort 2 mois après la greffe, en fin de procédure. Des prélèvements biologiques postmortem pourrons également être réalisés sur ces animaux afin d'obtenir des tissus contrôles sains en référence de nos expérimentations

Remplacement

La présence de tous les acteurs micro-environnementaux est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité de nos anticorps monoclonaux. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de l'efficacité des inhibiteurs de point de contrôle car ils nécessitent la présence d'un système immunitaire fonctionnel.

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience, les études déjà publiées utilisant ces modèles ainsi que pour de disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Pour les procédures 1 et 2) D'après notre expérience la variabilité des modèles de greffes sur souris immunocompétentes traitées avec ces composés ne permet pas de voir l'effet de ces drogues seules ou en combinaison au-dessous d'un effectif de 12 souris. Compte tenu des aléas de prise tumorales, nous envisageons des groupes de 15 souris. Dans l’analyse des résultats, nous porterons une attention à la fréquence des animaux répondeurs. Une réduction a été opérée dans les différentes procédures en mutualisant les bras contrôle pour plusieurs lignes de traitement. Une réduction sera opérée dans la procédure 2 sur la base des réponses observées en procédure 1.

Raffinement

Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Dans toutes les procédures le volume tumoral sera évalué 2 fois par semaine avec un pied à coulisse. Le poids des animaux sera évalué 1 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance (prostration, propreté, amaigrissement, isolement social) seront surveillés à chaque mesure tumorale ou pesée soit 2 fois par semaine. Des signes de fatigue, cachexie et d'isolement sociale sont également possibles. Des mesures d'enrichissement du milieu et de nourriture semi-liquide dans la cage seront mises en œuvre dans un premier temps. Si les point limites sont atteints, les animaux seront mis à mort et une autopsie sera effectuer de manière à évaluer la présence potentielle de métastases. Si de telles observations sont avérées, les surveillances des animaux restants seront accrues.

Choix des espèces

Certaines de ces molécules sont des anticorps dirigés contre des cibles de souris. La souris compétente est le modèle le plus approprié pour greffer du tissu de cette même espèce tout en permettant de faire des suivis de pharmacocinétique et pharmacodynamie dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux et de inhibiteurs de point de contrôle. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres modèles tels que le zebrafish. Par conséquent, les modèles immunocompétents tels que les souris BalbC ou C57b6 sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément aux modèles établis.

16 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches embryonnaires leur sont injectées dans les testicules par chirurgie pour y former des tumeurs bénignes, analysées ensuite au microscope. Le porteur indique que l'ensemble du projet a jusqu'ici été mené sur cellules en culture, sans animaux, et que le recours à la souris vise à démontrer un résultat réclamé dans la phase de finalisation pour publication. Les souris sont mises à mort au plus tard huit semaines après l'injection ou dès l'atteinte des points limites.

Objectifs

Contexte. Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) apparaissent au début de l’embryogénèse et sont à l’origine de la formation de tous les tissus qui constituent les embryons. Les cellules ES peuvent être cultivées en laboratoire indéfiniment, tout en conservant leurs 2 propriétés principales. 1) l’auto-renouvellement qui permet à une cellule ES de se diviser en 2 cellules filles identiques. 2) La pluripotence, c’est à dire la capacité à changer d’identité pour se transformer en toutes les cellules constituant les organes. Comprendre comment les cellules ES conservent leur identité ou en changent est donc essentiel pour différents champs d’application de la biologie et de la médecine car cela contribue aussi bien à améliorer la médecine de la reproduction qu’à mieux comprendre certaines pathologies humaines telles que le cancer. Hypothèse. Depuis 2018, une protéine a été identifiée pour son implication dans un mécanisme biologique essentiel qui aboutit à la fabrication des protéines, appelé traduction. Il a été établi que cette protéine est très exprimée dans les cellules ES et est essentielle pour qu’elles conservent leur capacité à se diviser à l’identique mais pas pour leur capacité à changer d’identité (pluripotence). Toutes les expériences ont été réalisées sur des cellules ES en culture et doivent maintenant être confirmées par des expériences in vivo qui miment le développement embryonnaire. Description du modèle. Toutes les expériences in vitro ont été réalisées sur des cellules ES de souris, aussi les tests in vivo doivent être réalisés chez la souris afin de limiter les biais d’analyse entre différentes espèces. Le test in vivo consiste à injecter des cellules ES dans les testicules de souris mâles adultes. Les cellules ES injectées vont former des tumeurs bénignes non disséminantes et constituées, non pas de cellules cancéreuses, mais de cellules ES qui auront changé d’identité. L’enjeu principal de ces tests est donc d’identifier les types cellulaires différenciés une fois la tumeur bénigne formée, grâce à des analyses au microscope des tumeurs collectées. Objectif. Le projet a pour finalité de déterminer si la perte de la protéine impliquée dans la traduction dans les cellules ES entraîne une modification de leur capacité à changer d’identité in vivo afin de confirmer les nombreuses observations qui ont été réalisées sur des cellules ES de souris in vitro.

Bénéfices attendus

L’étude des processus responsables du développement précoce des embryons chez l’homme et chez les mammifères contribue à l’amélioration de la prise en charge de l’infertilité (par ex., fécondation in vitro). Un des modèles biologiques les plus étudiés pour mieux comprendre ces processus sont les cellules souches embryonnaires (ou cellules ES). Les cellules ES présentent le gros avantage de pouvoir être cultivées en laboratoire tout en conservant leur capacité à former tous les tissus qu’on retrouve dans les embryons qui se développent. Pour améliorer nos connaissances de la biologie du développement des embryons, il est donc essentiel de décortiquer les mécanismes qui contrôlent l’activité des cellules ES et donc les mécanismes qui contrôlent l’expression des gènes dans ces cellules ES. De plus, ces mécanismes fondamentaux peuvent être conservés dans d’autres types de cellules souches à l’origine de pathologies humaines telles que le cancer. En conséquence, approfondir la connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent l’identité des cellules ES présente un enjeu majeur aussi bien pour la recherche fondamentale en biologie, pour la médecine de reproduction et pour la cancérologie. Au cours d’une étude portant sur le rôle du mécanisme responsable de la synthèse des protéines dans les cellules ES chez la souris, et un tout nouveau facteur a été identifié comme jouant un rôle essentiel dans ce mécanisme. Grâce à des approches in vitro, c’est à dire, sur des cellules en culture en laboratoire, ce facteur a été montré comme essentiel pour préserver les propriétés des cellules souches. Ce facteur est présent dans d’autres types de cellules souches (cellules ES humaines, cellules souches adultes, cellules souches cancéreuses) et pourrait donc jouer un rôle important dans le développement des embryons humains et dans certains types de cancers tel que le cancer du colon où il est fortement exprimé.

Procédures

Les souris seront soumise à une unique procédure chirurgicale d'une durée de 10-15 min sous anesthésie générale et traitement entalgique pour éviter toute douleur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui sont attendus pour les animaux sont ceux qui peuvent découler : i) de la procédure chirurgicale (inflammation, infection et douleurs localisées), ii) de la présence de sutures cutanées qui peuvent entrainer des blessures cutanées à postériori causées par l’animal lui-même par démangeaisons, iii) de douleurs et de modifications du comportement de la souris (perte de poids) liées à la procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale dès l'atteinte des points limites ou après une période maximale de 8 semaines après l'injection des cellules ES dans les testicules.

Remplacement

Jusqu’à présent, tout le projet a complètement été réalisé grâce à des expériences en laboratoire sur cellules ES de souris, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Dans sa phase de finalisation pour publication, il nous est demandé de démontrer par d’autres approches que les cellules ES que nous étudions, maintiennent leur capacité à générer des embryons. Cela ne peut être réaliser sans le recours à des modèles animaux.

Réduction

Le nombre de souris utilisées sera réduit à 16 (2 groupes de 8 souris) pour les raisons suivantes : 1) Le choix des testicules comme site d’injection permet de doubler le potentiel de développement de tumeurs bénignes sans augmenter le nombre d’animaux. 2) Le résultat attendu de ce projet est l’observation qualitative de tissus adultes au sein des tumeurs bénignes mais nous ne recherchons d’effet statistique, permettant ainsi de réduire la taille des groupes d’animaux. Notre expérience antérieure nous permet de prédire que 2 souris sur 3 injectées avec des cellules ES développent des tumeurs bénignes dans les testicules. Ceci, combiné aux données de la littérature, nous permet de réduire le nombre de souris receveuses à 8 par condition pour obtenir un nombre suffisant de tératomes analysables et ne pas reproduire l'expérience inutilement.

Raffinement

Durant toute la procédure, et en particulier dès le réveil post-chirurgie, les souris seront observées régulièrement (2 à 3 fois par semaine) afin de détecter tout signe de souffrance qui conduirait à la mise à mort de ces souris. De plus, anesthésiques et analgésiques seront utilisés pendant l’expérimentation avant, pendant et après la procédure opératoire.

Choix des espèces

L’ensemble du projet est focalisé sur l’étude de la biologie des cellules souches embryonnaires de souris. Bien que nous ayons montré que le rôle de la protéine candidate est conservé dans les cellules souches embryonnaires humaines et dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de souris, il nous apparaît donc plus opportun de réaliser les expériences de formation de tératomes chez la même espèce afin de récapituler au mieux les voies de signalisations qui vont induire la différenciation des cellules souches embryonnaires dans les tératomes. Toutes les expériences seront réalisées avec des souris adultes de 6 à 8 semaines, qui est l'âge habituellement utilisé pour l’induction de tératomes.