Oncologie

126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales osseuses ou cartilagineuses, puis des séances d'échographie sous anesthésie, avant d'être tuées même si aucune tumeur ne s'est développée. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur osseuse implantée près du tibia peut être douloureuse et provoquer un boitement, et que la tumeur cartilagineuse sous-cutanée peut s'ulcérer. Il affirme qu'après des essais in vitro il est "indispensable" de tester la méthode d'imagerie chez l'animal pour l'amener en clinique.

Objectifs

Le projet a pour objectif de valider une nouvelle technique d’imagerie la spectrosocpie ultrasonore quantitative. Actuellement, la caractérisation du type et du grade d’une tumeur passe par la biopsie. Cet examen, est cependant invasif, local et une source de stress pour le patient. Il y a donc un besoin de développer de nouvelles techniques de caractérisation non-invasives, globales et rapides du cancer afin de déterminer à la fois la nature d’une tumeur et le type de cancer. Les tumeurs présentent des différences dans leurs microstructures tissulaire et vasculaire avec les tissus sains et entre elles : différences de propriétés mécaniques à l’échelle cellulaire, différences morphologiques , et structurelles (répartition plus compacte ou désordonnée des cellules) Des biomarqueurs de la microstructure tissulaire peuvent être évalués par ultrasons par la technique de spectroscopie ultrasonore quantitative. Ce projet a donc pour premier objectif d’évaluer la spectroscopie ultrasonore pour la caractérisation de tumeurs solides

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider in vivo dans des modèles mimant des évolutions cliniques de tumeurs osseuses, une méthode de détection et de suivi des tumeurs non invasive. Cette validation permettra de poursuivre le développement de cette imagerie et servira à l'amener vers les étapes de validations cliniques pour bénéficier aux patients.

Procédures

Les animaux vont tous etre soumis à une implantation de cellulles tumorales soit en position sous cutanée soit en position paratibiale. Cette implantation se fait par injection des cellules et est réalisée une fois en début de procédures, les animaux étant maintenus sous anesthésie gazeuse (5 min) et ayant reçu de la buprénorphine en préopératoire dans le cas des injections paratibiales. En fin de procédure, les animaux vont etre soumis à 2 examens d'imagerie: échographie et spectroscopie ultrasonore quantitative. Ces deux examens sont réalisés de manière consécutive les animaux étant sous anesthésie (20 et 2 min, respectivement).

Impact sur les animaux

L'ostéosarcome est une tumeur osseuse ; le modèle utilisé est implanté en position paratibiale (entre l'os et le muscle). De ce fait la croissance tumorale peut être douloureuse. Le boitement peut survenir ce qui est surveillée et est un des points limites. En cas de boitement douleureux, de la buprénorphine pourra être administrée (0,05mg/kg). A noter que nous choisissons la buprénorphine comme analgésique car le carprofène est un antiinflammatoire non stéroïdien qui peut influencer l’environnement inflammatoire des tumeurs osseuses. Le chondrosarcome est une tumeur cartilagineuse ; le modèle utilisé est implanté en position sous cutanée. C’est une tumeur de progression lente qui du fait de sa position d’implantation pourrait ulcérer. Ce point est particulièrement surveillé et est d’ailleurs un point limite.

Devenir

A l'issue de chaque procédure tous les animaux, même ceux n'ayant pas développé de tumeur à J25 ou atteints de point limite, seront mis à mort.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées sur des culots cellulaires et des sphéroides et ont montré l’intérêt de la spectroscopie ultrasonore quantitative pour détecter les différences dans les structures cellulaires (zones de nécrose par exemple). Cette approche in vitro a permis de remplacer des études in vivo. Maintenant afin de pouvoir valider la spectroscpie ultrasonore quantitative et de l’emmener en clinique il est indispensable de tester cette méthode d’imagerie dans des modèles animaux mimant la clinique humaine.

Réduction

Des études in vitro préliminaires ont été réalisés et ont déjà permis de repousser le passage chez l’animal et de réduire le nombre d’animaux à inclure. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum mais dans des mesures satisfaisantes pour pouvoir conclure sur l’efficacité de la spectroscopie ultrasonore quantitative pour détecter, caractériser les tumeurs musculosquelettiques et leurs changements en réponse à des thérapies.

Raffinement

Tout au court de ce projet, les précautions seront prises pour ne pas stresser l’animal. En cas de douleurs, les médicaments contre la douleur seront administrés par la voie intra-péritonéale ou intra-veineuse. L'administration des médicaments et de l'anesthésie pendant l'epxérimentation est effectuée seulement par un personnel formé à ces actes. A note que ce cas de figure ne s'est jamais présenté dans nos précédentes expérimentations. De l'enrichissement est ajouté dans les cages (nids, croquettes déposée dans la cage en cas de difficulté d'accès à la grille de croquettes).

Choix des espèces

Parmis les modèles d'ostéosarcome, le plus représentatif est un modèle murin obtenu par greffe de cellules aussi murines chez des souris immunocompétentes. L’évolution de ce modèle et sa réponse à des thérapies conventionnelles sont bien connues au niveau macroscopique et histologique. Ce modèle a déjà servi dans des études d’évaluation de thérapies et d’imageries. De part toutes ces caractéristiques et connaissances, il se prête donc parfaitement à une validation de technique d’imagerie nouvelle. Quant au chondrosarcome, peu de modèles sont disponibles. Pour des études d’imagerie, le modèle obtenu par greffe sous cutanée de cellules humaines sur des souris immunodéprimées est bien caractérisé et permettra d’avoir un accès facile à la tumeur pour assurer son suivi et réaliser la prouve de concept de l’utilisation de la spectroscopie ultrasonore quantitative. Cette technique serait utilisée pour le suivi de ces tumeurs cartilagineuses pour lesquelles aucune méthode d’imagerie ne permet à l’heure actuelle un suivi optimal.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages de tamoxifène pour inactiver un gène, subissent plusieurs tests métaboliques avec injections répétées de glucose et d'insuline, une partie étant soumise à un régime riche en graisses, avant une anesthésie sublétale suivie d'exsanguination. Une perte de poids progressive est attendue du fait de la destruction des cellules intestinales visées. Le porteur affirme que ces processus "n'existent que dans l'organisme entier" et conclut à la nécessité de la souris génétiquement modifiée.

Objectifs

La digestion, la glycémie, et l’appétit sont régulés par différentes hormones (telles que l'insuline pancréatique), produites par les cellules endocrines présentes dans le pancréas et l’intestin. Des pathologies sévères telles que diabète, obésité et malabsorption intestinale sont associées à des altérations des cellules endocrines. Notre laboratoire s’intéresse aux mécanismes responsables du développement des cellules endocrines pancréatiques et intestinales, afin de comprendre comment ces cellules très hétérogènes sont produites, en particulier dans l’intestin (où elles sont appelées cellules entéroendocrines (CEE)), et comment elles sont capables d’assurer leurs fonctions tout au long de la vie. Malgré leur grande diversité, les cellules endocrines sont toutes issues de cellules dites progénitrices qui expriment un gène spécifique commun. L’absence d’expression de ce gène dans l’intestin au cours du développement entraine une perte de l’ensemble des CEE et par conséquent de toutes les hormones qu’elles produisent, provoquant une malabsorption intestinale et des diarrhées chroniques. Ces altérations engendrent des atteintes très sévères chez l’Homme et entrainent une létalité périnatale dans des modèles murins, empêchant l’étude à des stades tardifs, lorsque l’intestin est pleinement fonctionnel. Les cellules de l'épithélium intestinal, y compris les CEE, sont continuellement renouvelées (tous les 3-4 jours chez l'Homme) durant toute la vie. Afin d'étudier le rôle des CEE et des hormones intestinales dans l’intestin mature au cours de ces processus et d'éviter la létalité périnatale, nous avons développé un modèle de souris où l’on peut induire, suite à l’administration d’une drogue (le tamoxifène), l’inactivation du gène responsable de la formation des CEE dans l’intestin. Dans ce projet, nous souhaitons induire l’inactivation de ce gène chez l’adulte afin de définir l’impact de la perte des CEE sur le métabolisme énergétique (en particulier la régulation de la glycémie) et l’absorption des nutriments, et de suivre les éventuelles conséquences sur la flore intestinale. Nous souhaitons également évaluer le rôle de l’alimentation sur le développement des CEE. Dans ce but, l’ensemble des analyses (métabolisme, flore intestinale) sera réalisé à la fois en présence d’une alimentation standard et d’une alimentation riche en graisses.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des CEE chez l'adulte, notamment dans le contrôle de la digestion, de l'homéostasie intestinale, du métabolisme glucidique et du microbiote intestinal. A long terme, ces données pourraient permettre d'améliorer la prise en charge des patients souffrant d'anendocrinose entérique, qui est une pathologie caractérisée par l'absence de CEE.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à : - 3 gavages de drogue (tamoxifène) par animal sur 5 jours (1 par jour à J0, J2, J4) (1min/gavage) - 1 gavage de glucose par animal (1min/gavage) avec suivi de la glycémie (à 0, 5, 15, 30, 60, 120min) et de l'insulinémie (à 0, 15 et 30min) par prélèvement sanguin au niveau de la queue (qlq secondes) - 1 injection intrapéritonéale de glucose (1min) par animal avec suivi de la glycémie (à 0, 5, 15, 30, 60, 120min) et de l'insulinémie (à 0, 15 et 30min) par prélèvement sanguin au niveau de la queue (quelques secondes) - 1 injection intrapéritonéale d'insuline par animal (1min) avec suivi de la glycémie (à 0, 15, 30, 60, 120min) (quelques secondes) - 2 injections intrapéritonéales de molécules (1min / injection, 22h entre les deux injections) permettant l'évaluation de la division des cellules de l'épithélium intestinal - 1 injection intrapéritonéale (1min) de produits anesthésiants.

Impact sur les animaux

Une perte de poids progressive est attendue suite à la perte des cellules entéroendocrines. Des procédures sont réalisées successivement sur les animaux : 3 gavages de tamoxifène (1/jour à J0, J2, J4), 1 gavage de glucose, 1 injection intrapéritonéale de glucose, 1 injection intrapéritonéale d'insuline, 2 injections intrapéritonéales de marqueurs de prolifération cellulaire (à 22h d'intervalle) et 1 injection intrapéritonéale d'anesthésiants. En plus de ces procédures, le groupe B est soumis à un régime riche en graisses depuis le sevrage. Outre le stress causé par les procédures, nous n'attendons pas d'effets indésirables particuliers.

Devenir

- Groupes A et B : A l'issue de la PE1 : les animaux seront réutilisés pour les PE 2 à 6 succesivement. La PE6 (anesthésie sublétale) est suivie d'un prélèvement sanguin intracardiaque (exsanguination) et d'un prélèvement d'organes (intestins, pancréas, foie). Les tissus prélevés seront utilisés pour des analyses histologiques et de biologie moléculaire. Le sang prélevé en intracardiaques sera utilisés pour réalisés des analyses biochimiques (glucose, cholestérol, ...). - Groupe B : A l'issue de la PE7 (groupes B) : les animaux seront réutilisés pour les PE 1 à 6 successivement et mis à mort lors de la PE6. Pour plus de détails voir point mentionnée ci-dessus. - Groupe C : Tous les animaux sont mis à mort (inhalation de CO2 ou dislocation cervicale) après la PE1 pour dissection.

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer comment les cellules endocrines intestinales, sécrétrices d'hormones, sont générées dans l'intestin adulte et comment ces cellules sont capables de contrôler le métabolisme énergétique, l'absorption intestinale et la flore intetsinale. L'ensemble de ces processus nécessite non seulement des régulations au sein du tissu mais également des communications inter-organes et avec l'environnement, qui n'existent que dans l'organisme entier. De plus, la génétique de la souris est bien connue et nous permet d'inactiver le gène d'intérêt uniquement dans les cellules étudiées. Par ailleurs, des études antérieures ont révélé que les mutations du gène d'intérêt (Ngn3) chez la souris entrainent des pathologies très proches de celles observées chez l'Homme.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans cette étude a été calculé en tenant compte notamment de la variabilité inter- individus (élevée dans le cas de tests métaboliques) mais également pour l’application de tests statistiques adéquats (tels que le t-test ou le test non paramétrique de Mann Whitney). La répétition des études sera jugée nécessaire uniquement si les résultats d'une expérience ne peuvent être correctement interprétés (nombre de points mesurés trop faible).

Raffinement

Les procédures expérimentales seront réalisées par un personnel compétent effectuant couramment les différentes procédures et respectant l’ensemble des règles relatives au bien-être animal, limitant ainsi au maximum le stress de l’animal. Par ailleurs, les animaux seront maintenus dans des cages incluant litière et enrichissement. En outre, des phases de repos de 15 jours seront respectées entre les différents tests métaboliques. Les procédures mises en oeuvre impliquent un suivi régulier, notamment une pesée hebdomadaire; en cas de souffrance d'un animal, l'avis du vétérinaire sera demandé.

Choix des espèces

La souris (Mus Musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son temps de génération permet de réaliser des études relativement rapides et de récapituler de manière assez fidèle les mécanismes chez l’humain. La nécessité d’utiliser des souris génétiquement manipulées est liée à l’absence de toute mutation spontanée dans cette ou d’autres espèces de mammifères qui correspondrait à la maladie humaine. De plus, la génétique de la souris est bien connue et nous permet d'inactiver le gène d'intérêt uniquement dans les cellules étudiées. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 8 et 30 semaines), l'invalidation du gène d'intérêt, Ngn3, dans l'intestin au cours du développement étant létale dans la période périnatale. Le modèle murin utilisé permet de contrôler l'invalidation du gène d'intérêt, qui ne se produit qu'après traitement au tamoxifène.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries seize semaines avec un régime riche en gras et en sucre, elles subissent des jeûnes, des gavages ou injections et des prélèvements de sang à la queue lors de tests de tolérance, avant une mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. Le porteur affirme que ce régime n'engendre ni douleur ni anxiété d'après l'observation du comportement, et classe en modéré la souffrance liée au jeûne, au gavage et aux prélèvements. Il affirme que l'usage d'animaux est "essentiel", une enzyme clé n'étant pas exprimée par les lignées cellulaires.

Objectifs

Les points de contact entre les mitochondries et le réticulum endoplasmique (RE), appelés MAMs pour Mitochondria-Associated Membranes, ont un rôle crucial dans le contrôle de l'homéostasie glucido-lipidique de l’hépatocyte. Ces plateformes dynamiques peuvent être régulées par différents facteurs, notamment les nutriments. Des données récentes montrent que les MAMs sont altérées dans le foie de modèles murins d'obésité, de résistance à l’insuline et de stéatose hépatique, faisant des MAMs une cible thérapeutique privilégiée pour la prévention ou le traitement des désordres métaboliques hépatiques associés à l’obésité. Ces derniers sont étroitement associés à une diminution de la concentration plasmatique en certains acides aminés comme l'arginine, la glycine et la bétaine. Par ailleurs, des travaux in vitro ont démontré que les acides aminés arginine, citrulline, glycine et bétaine sont capables de réguler les MAMs par des voies de signalisation que l'on peut cibler par des molécules pharmacologiques comme la tetrahydrobioptérine (pour arginine et citrulline) et la S-adenosyl-méthionine (pour la glycine et la bétaine). L'objectif de ce projet consistera à 1) valider l'intérêt d'une supplémentation en acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques (résistance à l'insuline, stéatose) associés à l'obésité, 2) démontrer que les bénéfices santé sont associés à une restauration de d'intégrité des MAMs dans le foie des souris traitées et 3) valider in vivo les voies de signalisation impliquées par l'utilisation de molécules pharmacologiques.

Bénéfices attendus

Le projet présenté vise à apporter des preuves de concept, d'une part sur l'intérêt de certains acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité, d'autre de l'intérêt des MAMs comme cible thérapeutique pour la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité chez l'Homme. Le projet apportera des connaissances mécanistiques solides pour soutenir une approche très originale et porteuse de potentiel d'innovation pour la santé humaine pour le futur proche.

Procédures

L'intervention principale sur les animaux consistera en de petits prélèvements sanguins au niveau de la queue lors de tests de tolérance au glucose et au pyruvate qui seront réalisés sur animal vigil, à jeun depuis 6h (tolérance au glucose) ou 10h (tolérance au pyruvate), respectivement. Après anesthésie locale (crème lidocaïne) et incision au scalpel à l'extrémité de la queue, des ponctions de 4-5 µL de sang seront réalisées à la veine caudale avant et 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes après gavage oral (pour la moitié des souris) ou injection intrapériotonéale (pour l'autre moitié des souris) de glucose (2mg/g) ou injection intrapériotonéale (pour toutes les souris) de pyruvate (1.5 mg/g) pour suivre la glycémie à l'aide d'un glucomètre. Après le premier prélèvement, les suivants seront réalisés par simple grattage du caillot sanguin. La durée du jeune avant chaque test a été optimisée afin de limiter la nuisance infligée à l'animal tout en garantissant l'obtention d'un résultat métabolique fiable et reproductible, donc interprétable. Les protocoles se termineront par un jeune de 10h avant la mise à mort des animaux. Cette durée de jeune est indispensable pour garantir la qualité des mesures réalisées sur le foie de animaux.

Impact sur les animaux

D’après les premiers protocoles réalisés, 16 semaines de régime riche en gras et en sucre n’engendrent pas de douleur ou d’anxiété comme évalué par l’observation régulière du comportement des animaux, et n'empêchent pas les animaux de bouger dans la cage, notamment pour se nourrir et boire. Par ailleurs, selon les connaissances actuelles, il est peu probable que les interventions nutritionnelles testées aient des effets indésirables sur la santé et le bien-être des animaux. Lors de la mise à mort, l’utilisation de la dislocation cervicale sur animal anesthésié est une méthode rapide qui respecte les réglementations en vigueur pour les petits rongeurs. La douleur associée à la mise à jeun, au gavage ou aux injections intrapéritonéales, et aux prélèvements sanguins à la queue sont des contraintes dont le degré de sévérité est évalué de classe modérée.

Devenir

Les protocoles se termineront après anesthésie des animaux (kétamine/xylazine: 100/20 mg/kg soit 220µL de mélange pour une souris pesant 20g) et mise à mort par dislocation cervicale pour pouvoir récupérer différents tissus et organes. La nécessité de faire des anlayses histologiques et biochimiques justifie la mise à mort pour récupérer les tissus et organes.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse des effets de régimes sur un organisme complexe, et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées, qui n'expriment pas une enzyme clé impliquée dans nos mécanismes, la GNMT.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles.

Raffinement

Nous aurons pour objectif d'optimiser les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et les stress subis par les animaux. En particulier, nous n'utilisons pas de procédures susceptibles d'induire un dépassement de point limite de souffrance. Le raffinement sera appliqué tout au long de la vie des animaux. Pour cela, nous planifierons les protocoles de façon à éviter les perturbations susceptibles de procurer le stress de l'animal. Les protocoles ont été prévus de façon à obtenir le plus d'informations possibles par animal en imposant en même temps, un "moindre coût" en terme de mal-être de l'animal. Nous utiliserons une procédure d'analgésie pour les prises de sang, et une procédure d'anesthésie et de mise à mort par dislocation cervicale. Enfin, nos procédures de raffinement nous permettront de générer des résultats de meilleure qualité et d'exploiter au mieux les résultats obtenus.

Choix des espèces

Le travail avec des animaux est indispensable pour mimer au plus près la réalité de la surnutrition, de l'obésité et des désordres métaboliques comme dans l’espèce humaine. Le travail en épidémiologie sur l’Homme permet, en effet, de faire des corrélations entre la surnutrition et l'apparition de l’obésité et des désordres métaboliques. Le travail sur l’animal nous permet de montrer un effet causal, des manipulations nutritionnelles sur les paramètres biologiques ciblés et leurs bénéfices métaboliques à l'échelle de l'organe et du corps entier.

2 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections induisant des tumeurs du foie et un suivi par échographie sous anesthésie, pour étudier le rôle des macrophages dans le cancer hépatique et la réponse aux immunothérapies. Le porteur indique qu'un quart des animaux peut développer une encéphalopathie foudroyante deux à quatre semaines après l'invalidation d'un gène. Il affirme que les lignées cellulaires ne permettent pas d'appréhender le foie dans sa globalité et présente le recours à Crispr comme une réduction du nombre d'animaux.

Objectifs

Notre objectif est d’étudier comment les macrophages du foie sont impliqués dans le développement du cancer du foie dépendant de la beta-caténine et modifient la réponse aux traitements d’immunothérapie dans des modèles murins de CHC (carcinome hépatocellulaire) relevants. Ce projet est divisé en 3 grands axes: 1) déterminer de manière cinétique au cours du processus tumoral comment une activation oncogénique de la beta-caténine dans les hépatocytes remodele le paysage immunitaire à son voisinage et notamment les macrophages embryonnaires. 2) comprendre comment les macrophages embryonnaires sont progressivement perdus au cours du processus tumoral pour être remplacés par des macrophages dérivés des monocytes et comment des événements oncogéniques associés à l'activation de la beta-caténine modifient ce remodelage macrophagique et 3) déterminer comment la réponse aux immunothérapies de ces cancers est modifié selon le remodelage des macrophages.

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des mécanismes de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie en s'intéressant à une population immunitaire qui fut longtemps peu étudiée et dont la diversité des sous-populations a récemment été mise en lumière grâce à l'utilisation du single RNAseq (scRNAseq), ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeants ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre.

Procédures

1) Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles durant 10 secondes, 2) Injection intraveineuse sous anesthésie durant 30secondes 3) échographie hépatique sous anesthésie durant 10minutes si l'animal ne présente pas de tumeurs jusqu'à 25minutes si les tumeurs sont nombreuses 4) prélèvement sanguin sous anesthésie durant 30secondes

Impact sur les animaux

Les modèles de CHC décrits dans ce projet sont des modèles créés au laboratoire et que nous utilisons depuis plusieurs années. Entre la 2ème et la 4ème semaine après invalidation d’Apc un phénotype délétère lié à une encéphalopathie foudroyante peut être observé chez 25% des animaux, sans perte de poids. Ce phénomène est aussi observé dans le modèle de déletion de l'exon 3 de la beta-catenine par Crispr/Cas9 mais un mois et demi à deux mois après édition du gène du fait du temps de latence plus long pour que la machinerie Crispr soit pleinement efficace. Les autres traitements sont sans nuisances sur les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet seront euthanasiés pour analyse de leurs tissus hépatiques et leurs tumeurs afin de comprendre les événements génétiques et immunitaires à l'origine du développement de ces tumeurs et si nos traitements ont pu modifier leurs caractéristiques (invasion, prolifération)

Remplacement

Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire (cellules immunitaires, cellules endothéliales...). L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité, d’autant plus que les CHC mutés pour la beta-caténine sont peu proliférants et donc difficiles à maintenir en culture. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, nous optons pour la technique des ciseaux moléculaires ou crispr/cas9. 1290 animaux sur les 2650 nécessaires au projet suivent ce protocole, le quadruple ayant été nécessaire sans l’utilisation de cette stratégie. Nous suivrons le développement des tumeurs par suivi échographique, un appareil ayant été acquis récemment au sein de l'animalerie, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral évitant d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à nos expériences précédentes et à un calcul de puissance pour obtenir des résultats robustes : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Nous suivrons le développement des tumeurs par échographie, ce qui permet un suivi longitudinal depuis les phases précoces du développement tumoral évitant la souffrance des animaux liée à un développement tumoral trop important. Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée - les animaux étant euthanasiés si le score de souffrance est trop élevé. Les injections stressantes et les échographies seront réalisées sous anesthésie et les animaux mis sur tapis chauffant pour limiter l’hypothermie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum.

Choix des espèces

Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèle murin. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les CHC humains. Pour toutes les procédures, des souris mâles âgées de deux mois seront utilisées pour induire les délétions géniques d'intérêt (par Cre/lox ou Crispr/cas9) afin de réaliser un suivi longitudinal de l’initiation et du développement tumoral chez la souris adulte jeune et de les traiter avec les immunothérapies

35 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de tumeur cérébrale humaine leur sont implantées dans le cerveau, puis des nanoparticules sont injectées avant irradiation, certaines souris dites satellites étant tuées de façon précoce pour l'analyse des tissus. Le porteur classe l'étude en gravité modérée du fait des anesthésies et des transports répétés vers le site d'imagerie. Il affirme que le remplacement par des méthodes alternatives n'est "clairement pas possible", le développement d'une tumeur cérébrale relevant selon lui de phénomènes trop complexes.

Objectifs

ll s'agit de valider le bénéfice d'une thérapie photodynamique activée par des rayons X sur un modèle de tumeurs cérébrales orthotopiques implantées chez la souris. L'utilisation de souris satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) permettra de caractériser par histologie les effets du traitement X-PDT régulièrement après l'adminitration du traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet mené en recherche préclinique permettra d'estimer si cette approche expérimentale est applicable par la suite chez l'Homme. Il permettra à long terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ce type de tumeurs cérébrales très aggressives (glioblastome) en médecine humaine.

Procédures

Procédure 1 : Xénogreffe intracérébrale : implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral (35 souris au total pour une durée d'1h environ par animal, répété une seule fois en début d'étude) Procédure 2 : Administration intra-veineuse des nanoparticules sur souris vigiles 1h avant les irradiations : cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie, la technique étant parfaitement maitrisée par les membres du laboratoire (durée 1min, 19 souris concernées avec 2 réitérations)

Impact sur les animaux

Anesthésie chimique ainsi que transport sur site d'imagerie répétés d'où passage de la saisine en classe modérée.

Devenir

Procédure 1 "xénogreffe intracérébrale" (implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral) : tous les animaux sont gardés en vie (implantation tumorale étant l'étape clé indispensable du projet) Procédure 2 "administration des traitements" : tous les animaux sont gardés en vie (pour permettre par la suite d'évaluer l'efficacité des traitements) Procédure 3 "suivi par imagerie" : tous les animaux sont gardés en vie sauf si un animal a atteint un des points limites décrit précédemment, il sera dans ce cas mis à mort à l'issue de la procédure. En outre, les animaux satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) pour lesquels le temps cinétique prévu est atteint (Jn+4, Jn+11, Jn+18) seront mis à mort à l'issue de la procédure en vue d'analyses histologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse au traitement in vivo de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (intravasation, extravasation, envahissement du parenchyme cérébral, angiogénèse...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules endothéliales, stroma...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. L’évolution de l’intensité de bioluminescence sera un indicateur d’efficacité des traitements. De plus, chaque groupe sera caractérisé par une courbe de survie. Les survies moyennes seront comparées par test de Kruskal-Wallis suivi d’un test post-hoc si la différence entre tous les groupes est significative.

Réduction

Nos données nous ont permis de réaliser un premier suivi en imagerie de la croissance des cellules U251 -Luc implantées en stéréotaxie (procédure chirurgicale permettant d'implanter les cellules tumorales directement dans une région bien précise du cerveau), en traitant par la voie X-PDT. Néanmoins, il est cependant nécessaire de compléter les effectifs pour avoir une meilleure fiabilité statistique mais les premiers données seront également exploitées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette étude. L'estimation de l'efficacité de la thérapie par imagerie par Bioluminescence nécessite un suivi longitudinal des souris. Chaque animal sera son propre témoin ce qui constitue une stratégie permettant une utilisation judicieuse des animaux et assure une rigueur scientifique

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger. De plus, une analgésie sera administrée lors des procédures invasives (chirurgie d'induction tumorale)

Choix des espèces

Souris : pour nos expérimentations, nous travaillerons sur des modèles de tumeurs humaines implantées chez des rongeurs immunodéprimés. Ces modèles sont très pertinents dès lors qu'il s'agit d'évaluer de nouveaux agent diagnostiques ou thérapeutiques Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie de Paxinos et Franklin.

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues dépourvues de microbiote, elles sont inoculées par voie orale avec des souches d'Escherichia coli dont une pathogène, puis tuées 72 heures après pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la souche pathogène peut provoquer faiblesse, diarrhée et déshydratation, les souris atteignant le point limite étant mises à mort par anticipation. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale capable de simuler un organisme constitué de plusieurs organes, comprendre ces mécanismes étant selon lui "indispensable" pour la santé publique.

Objectifs

Les Escherichia coli producteurs de shigatoxines (STEC) sont des bactéries responsables d’infections humaines. Les symptômes vont de la diarrhée bénigne à la colite hémorragique et au syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les principaux modes d’infection sont la consommation d’aliments contaminés, la transmission interhumaine, le contact avec des animaux porteurs. Les infections à STEC constituent un problème majeur en raison de l’extrême sévérité possible des symptômes. Le SHU est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. La mortalité est de 3 à 5 % et plus d’1/3 des malades ont des séquelles rénales à long terme. L’Argentine a l’incidence la plus élevée au monde de ce syndrome. Compendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique lié à ces bactéries. La shigatoxine est une protéine formée de 2 sous-unités codées par les gène stxA et B. Ces 2 gènes font partie du génome d’un bactériophage (virus infectant les bactéries), qui infecte spécifiquement E. coli. Le génome du bactériophage peut s’intégrer au chromosome des bactéries infectées. On parle alors de prophage. Le plus étudié des prophages des STEC est le prophage 933W. Expérimentalement, chez la souris, une souche d’E. coli dont le chromosome porte le prophage 933W est pathogène. Á l’inverse, les STEC chez lesquelles le prophage a été éliminé ne sont plus pathogènes. Les gènes stxA et B sont précédés d’une séquence d’ADN qui contrôle leur expression. Cette séquence est reconnue par la machinerie cellulaire de la souris ou de l’Homme, ce qui amène à faire l’hypothèse que l’infection se déroule ainsi : libération des prophages dans l’intestin sous l’action d’un facteur environnemental qui stresse les bactéries porteuses ; les particules virales libérées traversent la muqueuse intestinale et pénètrent dans les cellules cibles de l’organisme (ex : cellules rénales) ; la séquence d’ADN qui contrôle l’expression des gènes stxA et B est reconnue par la machinerie cellulaire ; ces gènes sont alors exprimés et la shigatoxine est produite. L’objectif du projet est de tester cette hypothèse en comparant des souris inoculées avec l’une des souches d’E. coli suivantes : C600:933W (prophage et sa séquence d’ADN contrôlant les gènes stxA et B, souche pathogène), C600:933W delta-pr1 (prophage sans la séquence de contrôle, souche non pathogène), C600 (pas de prophage, souche non pathogène).

Bénéfices attendus

Les bénéfices obtenus sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC, en particulier dans l’expression des gènes stxA et stxB in vivo. L’utilisation de souris axéniques, c’est-à-dire dépourvues de microbiote intestinal, permettra de s’affranchir de facteurs confondants (transmission possible du prophage à d’autres souches d’E. coli présentes naturellement dans le microbiote intestinal), et de facteurs pouvant affaiblir le pouvoir pathogène de la bactérie modèle étudiée (effet « barrière » possible du microbiote intestinal). Les infections à STEC constituent un problème majeur de santé publique en raison de l’extrême sévérité de certaines de leurs manifestations cliniques. La forme la plus grave, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. Si la dialyse a permis de réduire la mortalité, celle-ci reste non négligeable (3-5 %) et beaucoup de ces jeunes malades conservent des séquelles rénales à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique de ces bactéries pathogènes, en particulier lors d’infection par les denrées alimentaires. Cette évaluation est très importante pour l’Argentine, qui a l’incidence de SHU la plus élevée au monde chez l’enfant.

Procédures

En début de procédure, les animaux sont soumis à un jeûne hydrique de 4 heures, suivie d'une unique inoculation par voie orale. Puis deux prélèvements de fèces à 24 h d’intervalle après l’inoculation sont réalisés. La procédure s’arrêtera 72 h après l’inoculation. Les animaux recevront une injection sous-cutanée d’un analgésique ayant une action puissante sur les douleurs viscérales. Une heure plus tard, ils seront profondément anesthésiés à l’isoflurane (dose létale). La paroi abdominale sera incisée, une ponction de la veine cave (située dans l’abdomen) sera faite pour prélever du sang, puis une perfusion intra-cardiaque sera faite pour éliminer le sang restant dans le système circulatoire afin de pouvoir prélever des tissus sans trace de sang, condition nécessaire pour des analyses histochimiques de bonne qualité. L'ensemble de cette procédure durera entre 5 et 10 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les groupes recevant la souche C600 ou la souche C600:933W delta-pr1 sont réduites. En effet, la seule intervention invasive sera une inoculation orale avec 150 µL de culture bactérienne. D’une part, ces souches ne sont pas pathogènes. D’autre part, l’inoculation sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Les nuisances attendues dans le groupe recevant la souche pathogène C600:933W sont l’expression d’un syndrome infectieux : faiblesse ; possible diarrhée ; possible déshydratation consécutive à la diarrhée et aggravée par la difficulté des souris à s’abreuver du fait de leur faiblesse. Des contre-mesures et des points limites seront mis en place : ramequins d’aliment gélifié déposés sur la litière pour leur permettre alimentation et abreuvement sans effort physique ; surveillance 3 fois par jour pour détecter l’apparition du syndrome infectieux. Fréquence de surveillance accrue aux premiers signes cliniques, et mise à mort anticipée si les symptômes atteignent le point limite indiqué dans la procédure expérimentale. Les souris sont mises à mort au plus tard 3 jours après l’inoculation, ce qui exclut toute nuisance à long terme. Pendant toute la durée de l’expérience, les souris seront maintenues en groupes sociaux de 3 individus, dans un environnement enrichi ; de l’eau stérile, des croquettes de nourriture stérile de formulation standard et de l’aliment gélifié stérile de formulation standard seront mis à leur disposition à volonté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Celle-ci est nécessaire pour l’obtention des organes et tissus dans lesquels seront pratiquées des analyses destinées à étudier l’effet de la production de shigatoxine par la souche d’Escherichia coli introduite dans le tube digestif des souris.Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L'analyse des mécanismes du pouvoir pathogène des STEC, qui se traduit par l’envahissement de différents organes par une toxine, n’est actuellement possible que chez des animaux vivants. Il n’existe en effet pas d’alternative non animale suffisamment sophistiquée pour simuler un être constitué de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies.

Réduction

L’expérience de nos partenaires argentins dans le domaine étudié permet de considérer que 6 souris par groupe sont un effectif suffisant pour comparer des résultats d’immunohistochimie de manière robuste entre groupes. Nous utiliserons donc 6 souris par groupe dans les deux groupes témoins. Dans le groupe inoculé avec la souche pathogène, la survenue d’un syndrome infectieux pourra amener à mettre à mort des souris de manière anticipée, si les points limites définis à l’avance sont atteints. Les analyses de tissus seront tentées sur ces animaux. Mais, si la mise à mort est très anticipée par rapport à la date prévue pour mettre à mort toutes les souris, les résultats pourraient ne pas être comparables à ceux des groupes témoins. Nous prévoyons donc 6 souris supplémentaires dans ce groupe, qui seront utilisées si nécessaire. Le protocole comportera donc 3 groupes de 6 souris, plus 6 souris supplémentaires, ce qui aboutit à un total de 24 animaux.

Raffinement

Il n’y a pas de souffrance liée à l’hébergement en isolateur. Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 3 individus par cage, sur une litière de copeaux. Croquettes de nourriture de formulation standard et eau stériles seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, bûchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher. Cet enrichissement est similaire à celui dont auront préalablement disposé les souris dans les cages d’élevage, elles y seront donc habituées. De plus, des ramequins d’aliment gélifié de formulation standard (gel diet) seront déposés sur la litière. Ce raffinement permettra aux souris de pouvoir s’alimenter plus facilement en cas de faiblesse et fatigue induites par un syndrome infectieux (possible dans le groupe inoculé avec la souche pathogène C600:933W). De plus, du sérum physiologique stérile à 37°C pourra être injecté par voir sous-cutanée aux souris si elles montrent des signes de déshydratation (1 ml par injection, 3 fois par jour). Les animaux seront visités 3 fois par jour après l’inoculation bactérienne pour détecter au plus vite les premiers signes d’un syndrome infectieux et décider d’une mise à mort anticipée si les points limites sont atteints. L’inoculation orale des souris avec les souches bactériennes sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Préalablement à la mise à mort des souris, au cours de laquelle une laparotomie et une perfusion intra-cardiaque seront réalisées, un analgésique sera administré par voie parentérale (flunixine ; 2,5 mg/kg ; puissante action analgésique sur les douleurs viscérales).

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour l’étude du pouvoir pathogène des STEC, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des jeunes souris (semaine suivant le sevrage). Chez l’Homme, les infections à STEC touchent principalement les très jeunes enfants.