Oncologie

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit dès l'âge de sept à dix jours une amputation d'orteil pour le génotypage, puis plusieurs séries d'injections et, pour une partie, un jeûne de vingt-quatre heures, dans un modèle génétique d'atrophie musculaire. Les souris sont mises à mort après les injections pour prélever les muscles et les organes. Le porteur affirme que l'analyse de la dégradation des protéines musculaires ne peut se faire sur cultures cellulaires et que le modèle souris est "essentiel".

Objectifs

Une fonte musculaire sévère est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme le cancer, les myopathies et le vieillissement. Cette perte de masse musculaire (atrophie) est très délétère pour le patient, affectant sa qualité de vie mais aussi réduisant la réponse aux traitements et la survie. Il n’existe aujourd’hui pas de traitement efficace permettant de freiner cette fonte musculaire. Un nouveau modèle de souris génétiquement a été généré, développant une perte de masse musculaire progressive, induite chez l’animal adulte, et récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Les travaux portent sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cette atrophie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. L’ atrophie est induite chez l'animal adulte par des injections intrapéritonéales d'une molécule inductrice. Avant ce traitement inducteur, les animaux ne présentent aucune pathologie. Les premiers résultats expérimentaux sur ce modèle, montrent que la perte de masse musculaire est causée par un déséquilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines musculaires. Pour valider ces résultats, il est nécessaire d'effectuer une exploration fonctionnelle du flux de dégradation des protéines chez l'animal. Une accélération du flux de dégradation des protéines comme un blocage de ce flux sont délétères pour le fonctionnement du muscle, car conduisant respectivement à une dégradation accrue des protéines musculaires et à la persistance de composants cellulaires endommagés. Cette évaluation nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie et la mesure de l’accumulation de protéines marqueurs dans le muscle des animaux. Les souris seront mises à mort 24 heures après les injections de l'inhibiteur. Les muscles seront prélevés et analysés. Cette évaluation sera effectuée sur les animaux en condition normale nourrie et aussi après induction du processus de dégradation des protéines par un jeûne de 24 heures. La durée de 24heures de jeûne est requise pour activer et détecter une augmentation de la dégradation des protéines dans le muscle d'animaux contrôles.

Bénéfices attendus

Ces résultats permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la perte de masse musculaire, essentielle pour le développement de traitements efficaces et qui représentent un réel enjeu clinique. Ces expériences complémentaires permettront de finaliser la caractérisation des altérations musculaires générées par notre mutation, responsable de l’activation d’une signalisation d’atrophie dans le muscle. Ces résultats seront valorisés par une publication scientifique et sont essentiels pour comprendre et anticiper les conséquences de la modulation de cette signalisation sur la physiologie musculaire chez les patients. Cette caractérisation est par ailleurs nécessaire pour tester dans un second temps le bénéfice de la modulation des processus dérégulés sur la limitation de la perte et de la dysfonction musculaire. Ainsi en fonction des résultats obtenus, les données seront essentielles pour déterminer s’il est préférable de développer une approche pour limiter la dégradation des protéines par le processus autophagique dans les muscles de ce modèle ou s’il est préférable de mettre au point des stratégies permettant de restaurer le processus autophagique, afin de prévenir l’accumulation de protéines et de composants cellulaires endommagés responsables d’une altération de la fonction musculaire, comme c’est observé au cours du vieillissement musculaire.

Procédures

Tous les animaux subiront une phalengectomie entre l’âge de 7 jours et 10 jours, nécessaire à l’identification et au génotypage et justifié d'un point de vue scientifique pour les objectifs du projet. Tous les animaux recevront 4 injections intrapéritonéales consécutives à l’âge de 10 semaines environ, espacées de 24heures. Ensuite, soit 1 semaine soit 4 semaines après ces injections, tous les animaux recevront 3 injections intraperitonéales, espacées de 12 heures. Les souris seront mises à mort après ces injections. Les animaux concernés par la procédure 2 seront soumis à un jeûne de 24 heures en parallèle des dernières injections.

Impact sur les animaux

Suite au traitement inducteur de notre mutation, chez la souris adulte, les animaux développent une perte de masse musculaire progressive récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Il ne présente pas de signe de souffrance avant 7 mois après cette induction. Nos expériences seront réalisées au plus tard 4 semaines après l’induction de l’activation du processus d’atrophie musculaire, à un stade où leur état général n’est pas altéré, aucune modification de leurs déplacements et prise de nourriture n’est observée. L’évaluation du flux de dégradation des protéines nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie. Les souris seront mises à mort maximum 2 jours après les injections de l'inhibiteur. Cette évaluation sera effectuée sur les animaux en condition normale nourrie et aussi après induction du processus de dégradation des protéines par un jeûne de 24 heures. La durée de 24heures de jeûne est requise pour activer et détecter une augmentation de la dégradation des protéines dans le muscle d'animaux contrôles.

Devenir

Les animaux seront mis à mort, les muscles et autres organes seront prélevés pour des analyses expérimentales.

Remplacement

L'analyse du flux de dégradation des protéines dans le muscle de notre modèle animal ne peut être effectuée sur des cultures de celllules. Le modèle murin est essentiel pour étudier fonctionnellement le muscle et également étudier l’impact des défauts musculaires sur le reste de l’organisme.

Réduction

Nous utiliserons le nombre d’animal minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le maximum de données pouvant être généré à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Les analyses en condition de jeûne (procédure 2) ne seront pas effectuées si les résultats obtenus en procédure 1 montrent des défauts autophagiques en condition basale nourri et sont suffisants pour conclure. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une consultation approfondie de la littérature permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Des effectifs de 8 animaux par groupe seront privilégiés. Des tests de comparaisons de moyennes (test-t) ou de rang (non-paramétrique) seront utilisés pour comparer deux groupes, des tests ANOVA ou Kruskall-Wallis (non-paramétrique) seront effectués pour les comparaisons multiples (groupes controles/mutants, traités colchicine ou non-traités, nourris/à jeun). Le personnel est formé à ces analyses. Nous souhaitons pouvoir étendre nos groupes à 12 animaux pour prévenir une potentielle hétérogénéité provenant de la réponse à la colchicine. Une adjonction progressive d'animaux supplémentaires sera envisagée jusque 12 animaux par groupes en s'appuyant sur une évaluation statistique.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée. Les animaux seront surveillés quotidiennement, pesés une fois par semaine et ensuite quotidiennement lors des injections d’inhibiteur autophagique et la mise à jeun. Aliment et eau gélifiée seront mis à disposition sur le sol de la cage en cas de diminution de la mobilité observée. La durée du jeûne pourra être ajustée en fonction du comportement, du poids et de l'état des animaux. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront mis à mort immédiatement si signes de souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d'animaux génétiquement modifiés grâce à la stratégie cre/lox. La physiologie musculaire des souris est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour que l’on puisse en tirer des données extrapolables. La souris est un modèle très accessible, de maintien aisé et manipulable génétiquement afin de répondre au questionnement scientifique Le projet porte sur la compréhension des mécanismes impliqués dans l'atrophie musculaire induite par l'activation de notre signalisation d'intéret, après la phase de croissance post-natale du muscle, dans le muscle adulte. L’induction de notre transgène par injection de tamoxifène est donc réalisée à la fin de cette croissance post-natale vers 10 semaines environ. Les injections d'inhibiteur de l'autophagie seront effectuées soit 1 semaine après les injections de tamoxifène (animaux de 11 semaines) soit 4 semaines après ajout de tamoxifène (animaux de 15 semaines). L'étude de ces deux stades 1 semaine et 4 semaines après l'induction de l'expression du transgène est motivée par nos résultats expérimentaux préalables suggérant une activation de l'autophagie au début de l'atrophie du muscle et ensuite un blocage qui conduirait à l'accumulation de mitochondries endommagées dans les fibres musculaires.

338 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une irradiation sublétale sur animal vigile suivie d'une greffe de moelle osseuse, d'autres des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie pendant quatre mois, pour étudier le rôle du microenvironnement médullaire dans la leucémie aiguë lymphoblastique B. Le porteur décrit un développement leucémique spontané pouvant entraîner une paralysie de l'arrière-train et des tumeurs ganglionnaires, et toutes les souris sont mises à mort. Il affirme que la coopération des cellules et le rôle du stroma ne peuvent être reproduits in vitro de façon satisfaisante.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques de type B (LAL-B), équivalents pathologiques des lymphocytes B (LB) en développement, sont la cause principale de cancer chez l’enfant, et bien que moins fréquentes, concernent un nombre de cas similaires chez l’adulte. Malgré l’amélioration des traitements de chimiothérapie, le pronostic reste mauvais dès le diagnostic chez l’adulte, et à la rechute chez l’enfant. De nombreuses études montrent que des cellules du microenvironnement de la moelle osseuse sont impliquées dans les mécanismes de résistance aux traitements mais leur identité précise et les mécanismes de protection mis en jeu restent mal connus. Pour ce type d’étude, puisqu’il est actuellement impossible d'obtenir des conclusions fiables in vitro nous ne pouvons pas nous passer des expérimentations conduites sur des animaux pouvant simuler les principales propriétés biologiques des leucémies humaines. Nos études précédentes nous ont permis de montrer que les cellules du microenvironnement qui soutiennent le développement des LB présentes de fortes similitudes entre l’homme et la souris. Peu de données sont par contre disponibles concernant l’influence de ce microenvironnement sur l’acquisition de mutations lors du développement pathologique des LB et sur son rôle de soutien de la leucémogénèse. Dans la présente demande d’autorisation, nous étudierons l’impact d'un facteur - produit par le microenvironnement et impliqué dans la prolifération des LB normaux – sur le développement leucémique.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus auront un impact sur la santé humaine. En effet, la littérature montre clairement l'influence du microenvironnement sur le développement des LAL-B mais ces données restent parcellaires et peu de cibles thérapeutiques ont été identifiées. Nos travaux s'appuie sur la découverte par notre équipe d'une protéine produite dans la moelle osseuse sur la prolifération d'un sous type de LAL-B. L'utilisation du modèle de souris humanisé de développement leucémique nous permettra de comprendre les mécanismes de régulation et l'identification à moyen terme de facteurs représentant des cibles thérapeutiques potentielles.

Procédures

Trois types d'intervention seront effectuées sur les animaux. Pour le suivi du développement leucémique, des prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie gazeuse au niveau du sinus rétro orbital ou de la veine faciale afin d’espacer au maximum les prélèvements à un même site et permettre ainsi une parfaite cicatrisation. Ces prélèvements seront espacés de 2-3 semaines sur un maximum de 4 mois et seront effectués sur 248 animaux. Des transplantations de cellules de moelle osseuse seront aussi effectuées sur 108 souris. Le protocole implique tout d'abord une irradiation sublétale sur animaux vigiles suivie le lendemain d'une injection intra veineuse des cellules de moelle au niveau du sinus rétro orbital sous anesthésie gazeuse. Ce geste ne sera effectué qu'une fois pour chaque souris.

Impact sur les animaux

Notre projet implique des souris génétiquement modifiées (expression d'une protéine de fusion identifiée dans des LAL-B humaines) pour lesquelles on observe un développement leucémique spontané. Les symptomes les plus couramment observés sont une paralysie du train arrière ou des tumeurs ganglionnaires visibles. Le développement leucémique peut aussi s'accompagner d'une diminution du taux d'hématocrite. La cinétique de développement leucémique dans ce modèle étant connue, nous effectuerons des prélèvements sanguins de suivi avant l'apparition de ces symptômes pour limiter tant que possible l'inconfort de l'animal. Ces sympômes seront considérés comme points limites et seront de plus complétés par une grille de score tenant compte des éventuels changement de poids corporel, de l'apparence physique, de signes cliniques objectifs, de comportement non provoqué et des réponses comportementales aux stimuli.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue de chacune des procédures

Remplacement

La régulation de l’hématopoïèse normale et pathologique implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux (extrinsèques) et propres aux cellules hématopoïétiques (intrinsèques). Seuls ces derniers peuvent être appréhendés in vitro. Ainsi, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, du contexte cytokinique, sont cruciaux et ne peuvent actuellement pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.

Réduction

Réduction du nombre d'animaux: lorsque possible et utile, un calcul d’effectif pour chaque groupe a été réalisé sur le site BiostaTGV (voir partie 3.4.10, justification du nombre d’animaux). Réduction du stress: présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et coton), maintien des animaux en groupes de 4-5 afin d’éviter l’isolement et les expérimentations seront débutées 7 jours après réception des souris dans la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation.

Raffinement

la détection précoce et encore asymptomatique du développement leucémique se fera à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront suivis quotidiennement. Ainsi, l’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score de douleur spécifique de ces modèles de pathologies hématologiques. Afin de réduire le stress et d’améliorer le cadre de vie des animaux, nous optimiserons les conditions de leur hébergement, par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et/ou coton), et par le maintien des animaux en groupes de 4 à 5 afin de respecter leur instinct grégaire.

Choix des espèces

Le modèle souris est celui utilisé majoritairement par la communauté scientifique pour mimer les altérations génétiques à l’origine des leucémies chez l’homme. Ainsi, dans le modèle de souris que nous utiliserons, il a été démontré que les lymphocytes B qui se développent en cellules leucémiques acquièrent les même mutations que chez l’homme. Par ailleurs, nous avons montré que les cellules qui supportent le développement des lymphocytes B sont similaires entre l’homme et la souris. Ces résultats montrent la relevance du modèle souris pour l’étude de la biologie des LAL-B humaines. Les études proposées nécessiteront l’utilisation d’animaux avant l’apparition de symptômes, c’est à dire entre 4 et 8 semaines et dans la tranche d’âge ou apparaissent les symptômes c’est-à-dire entre 13 et 34 semaines. Nous pourrons également utiliser des cellules issues de ces animaux pour tester des thérapeutiques innovantes en accord avec leurs altérations génétiques. Ces cellules seront issues d'animaux pré-leucémiques (avant 8 semaines) ou leucémiques (après 13 semaines).

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur mammaire greffée, reçoit des injections répétées de luciférine et des séances d'imagerie sous anesthésie pendant deux semaines et demie, pour étudier le rôle de la MMP11 des adipocytes dans la croissance tumorale. Les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale ou au CO2 pour prélever les tumeurs. Le porteur affirme que l'animal est "nécessaire" pour reproduire la croissance tumorale du cancer du sein sur "l'organisme entier".

Objectifs

Dans ce projet, nous allons étudier le rôle de la métalloprotéase matricielle-11 (MMP11) sécrétée par les adipocytes dans la croissance tumorale par imagerie en bioluminescence. Au début du projet, après avoir répété la même expérience 3 fois, il a été montré que la MMP11 sécrétée par les adipocytes accélère de manière significative la croissance tumorale à un stade précoce du développement tumoral. Pour montrer cela, nous avons implanté des cellules cancéreuses mammaires en localisation orthotopique dans la glande mammaire des souris transgéniques déficientes et surexprimant la MMP11 dans le tissu adipeux. Puis, nous avons mesurer le volume des tumeurs mammaires dans ces souris à l'aide d'un pied à coulisse durant 2 semaines et demi. Etant donné que la MMP11 agit à un stade précoce du développement tumoral, nous souhaitons analyser précisément ce qui se passe au stade précoce grâce à une méthode d'imagerie sensible qui détecte les tumeurs à un stade infra clinique. Cette méthode nous permet donc de quantifier précisément les tumeurs de petite taille, de visualiser et de suivre en temps réel et de manière non invasive les cellules cancéreuses bioluminescentes afin de compléter les données obtenues avec le pied à coulisse. Nous pouvons ainsi visualiser de manière beaucoup plus précoce et fonctionnelle, la cinétique de développement des tumeurs à partir des cellules cancéreuses, ainsi que la dissémination locale des cellules tumorales. Nous n'attendons pas de dissémination à distance des tumeurs formées (métastases) car notre expérience se limite au stade précoce du développement tumoral.

Bénéfices attendus

Cette procédure permettra d'avoir une vision beaucoup plus précoce et fonctionnelle des tumeurs obtenues à partir des cellules mammaires cancéreuses, en présence et en absence de la MMP11, dans la quatrième glande mammaire inguinale des souris et ainsi de mettre en évidence la contribution des adipocytes dans la progression des tumeurs mammaires.

Procédures

Lors de ce projet, les souris seront soumises à un total de 3 interventions réalisées par le manipulateur : 1. L'acquisition d'images bioluminescentes par l'imageur nécessite d'endormir les souris grâce à un mélange d'isoflurane et d'oxygène dans une boîte à induction en plexiglas puis de maintenir cette anesthésie durant toute la période d'imagerie (30 minutes maximum). 2. Afin d'imager les souris, pour une souris de 20-25g, 100µL de luciférine est injecté par voie intrapéritonéale afin d'injecter environ 3.3mg de luciférine par souris pour une dose de 150mg/kg. 3. Pour finir, au bout de 2 semaines et demi, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale par une personne habilitée ou par inhalation de CO2, afin de prélever les tumeurs pour réaliser des analyses moléculaires.

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections répétées de luciférine, nous n'attendons pas d'effets indésirables de la luciférine mais du fait de la répétition des injections, par précaution, nous surveillerons les animaux. Notre protocole d'observation des tumeurs est établi sur une courte durée (2 semaines et demi) ce qui permet d'observer les premières étapes de la cancérogénèse, ainsi les tumeurs seront de petite taille durant tout le protocole, et nous ne devrions pas observer d'effets indésirables (nécroses, métastases etc), mais les tumeurs seront tout de même surveillées tout au long du projet.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie pour un suivi de la croissance tumorale durant 2 semaines et demi, puis les souris seront sacrifiées afin de prélever les tumeurs pour réaliser des analyses moléculaires. Aucun animal sera donc maintenu en vie au terme de ce projet.

Remplacement

L'utilisation des animaux est nécessaire pour mimer le plus fidèlement possible la croissance tumorale observée chez les femmes atteintes d'un cancer du sein, notamment du fait de la présence de glandes mammaires différenciées et fonctionnelles présentant du tissu adipeux, mais également du fait que la progression tumorale implique tout l'organisme et que les souris présentent un système immunitaire fonctionnel qu'il est impossible de récapituler in vitro. C'est pourquoi nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de croissance tumorale est semblable à celui de la femme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude.

Réduction

Au début du projet, après avoir répété la même expérience 3 fois, il a été montré que la MMP11 sécrétée par les adipocytes accélère de manière significative la croissance tumorale à un stade très précoce du développement tumoral. Ces résultats solides permettent la mise en place d'une expérience complémentaire sur un nombre limité de souris qui viendront compléter et confirmer les données obtenues. Cela signifie également que les modèles de souris génétiquement modifiées sont déjà disponibles. Les paramètres mesurés nécessitant l'utilisation de tests statistiques sont la taille des tumeurs et le poids de l'animal. Ces paramètres seront mesurés 2 jours par semaine pendant 2 semaines et demi après l'injection des cellules cancéreuses, et les analyses statistiques se feront de manière indépendante pour chacun de ces jours. Vu que nous travaillons seulement avec des groupes de 5 souris, nous utilisons un test non paramétrique (Mann-Whitney) de comparaison entre deux groupes (souris mutantes et souris contrôles appariées) avec le logiciel PRISM qui s'appliquent aux petits échantillons.

Raffinement

Les animaux seront placés dans des cages leur assurant un bien-être avec de la sciure de bois comme litière. Celle-ci est remplacée de manière hebdomadaire pour une hygiène optimale. Le stress est diminué au maximum en hébergeant les souris dans des cages transparentes permettant la visualisation des autres souris et en les habituant à la vue de l'opérateur expérimental qualifié pour les procédures liées à l'expérimentation animale. La taille de l'aiguille permettant l'injection de la luciférine sera adaptée au poids de l'animal afin de réduire le risque de lésion induite par l'aiguille. L'occurence de blessure éventuelle et le risque d'infection au niveau de la zone d'administration de la luciférine seront pris en considération. Pendant l'imagerie, les souris sont anesthésiées afin d'éviter tout stress. De plus, les souris seront placées sur un support chauffant afin d’éviter toute déperdition de chaleur causée par l’anesthésie. Elles seront ensuite suivies dans les heures suivant l'injection. Des visites quotidiennes seront effectuées afin de vérifier le niveau d'inconfort et les signes de douleur des animaux dans la cage (diminution des comportements d'exploration, diminution de la prise de boisson et/ou de nourriture, perte de poids, posture voutée, etc...). Autrement, nous n'attendons pas de signes cliniques péjoratifs lors de la procédure expérimentale, mais nous surveillerons tout de même : la réaction des souris suite à des injections répétées de luciférine, l'aspect des tumeurs, la difficulté des souris à se déplacer à cause d'une gêne occasionnée par la taille et la localisation des tumeurs. En cas de souffrance visible ou de douleur apparente des animaux, un avis vétérinaire sera sollicité pour décider de la continuité ou de l'arrêt de l'expérience.

Choix des espèces

Le modèle de souris a été retenu car c'est le seul pour lequel il est possible de manipuler le niveau d’expression de la MMP11 en employant des souris transgéniques déficientes et surexprimant la MMP11 de manière tissu-spécifique. Ces modèles permettent de répondre directement à notre objectif. A notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle animal plus simple permettant de répondre à la problématique inhérente à ce projet. Les souris utilisées pour ce projet seront âgées de 8 semaines au moment de l’expérimentation de manière à étudier la progression tumorale mammaire dans un organe différencié et fonctionnel.

2 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une à trois injections et une greffe de cellules tumorales pour induire un mélanome, la plupart des injections étant faites sans anesthésie, que le porteur juge plus traumatisante que l'acte lui-même. Il décrit comme principal risque l'ulcération de la tumeur, et toutes les souris sont mises à mort en fin d'étude pour des analyses post-mortem. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'existe et que ces expériences sont "indispensables" car les interactions in situ ne peuvent être modélisées in vitro.

Objectifs

Notre projet vise à déterminer le rôle précis d’un récepteur de signal de danger dans les réponses immunitaires anti-tumorales dans un modèle de mélanome chez la souris. Pour cela nous utiliserons des modèles de souris conditionnellement déficientes pour ce récepteur et nous leur injecterons des cellules tumorales suivi ou non de transfert adoptif de lymphocytes T protégeant ou attaquant la tumeur et nous étudierons la pousse tumorale, le phénotype des cellules immunitaires recrutées au sein de la tumeur et des ganglions drainants. Enfin nous évaluerons l’influence de traitements immunothérapeutiques dans ces modèles de souris.

Bénéfices attendus

Le cancer est un problème de santé publique majeur, et la 2ème cause de mortalité dans le monde. Récemment, des traitements développés chez la souris visant à lever les phénomènes de tolérance immunitaire contre le cancer ont prouvés leur efficacité chez l’Homme et redonnés un espoir de réduire la mortalité liée à cette maladie. Ces traitements n’ont néanmoins pas encore permis d’éradiquer la maladie. Ce projet permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer les immunothérapies visant à inhiber la tolérance immunitaire aux tumeurs et augmenter l’efficacité des vaccins contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis à des Injections sous cutanées, intra péritonéales, intraveineuses. Chaque animal recevra entre 1 et 3 injections selon la procédure: procédure 1 : 1 seule injection sous-cutanée; procédure 2: une injection sous-cutanée et une injection intraveineuse (sur animal anesthésié) 1 à 3 jours plus tard; procédure 3: 1 injection sous-cutanée et 2 injections intrapéritonéales, chacune à 7 jours d'intervalle. Sauf cas indiqué, les procédures ne justifient pas l’utilisation d’anesthésiques. Une procédure de sédation rendrait en effet l’ensemble de la procédure plus traumatisante pour l'animal que la procédure expérimentale elle-même.

Impact sur les animaux

Les procédures de notre projet sont bien établies et réalisées par du personnel expérimenté pour leur réalisation. Les nuisances et effets indésirables possibles ont donc peu de chance de se produire. Etant donné les précautions prises dans l’exécution du projet, les risques comportent principalement l’ulcération de la tumeur chez les animaux porteurs de tumeurs et les éventuelles réactions secondaires (irritations cutanées, diarrhées, poil hirsute, perte de poids) aux traitements immunothérapeutiques. Pour éviter leur apparition, le comportement des animaux sera contrôlé régulièrement (tous les jours par le zootechnicien et 3 fois par semaine par l’expérimentateur). Nous serons vigilants aux changements de comportement et d’aspect des souris et les évalueront au moins 3 fois par semaine à l’aide d’un système de scoring détaillé. L’apparition de nuisance ou d’effet indésirables donnera lieu à une réponse graduée en fonction du score. Parmi les actions à prendre, figurent le traitement des animaux par des analgésiques ou la mise à mort des animaux qui atteidraient un point limite.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique que l’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l’étude de façon éthique par des personnes expérimentées.

Remplacement

En termes de remplacement, aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'étant disponible pour cette recherche, ces expériences chez la souris sont indispensables car les interactions complexes se déroulant in situ ne peuvent être modélisées in vitro. Mais pour les tests fonctionnels nous remplacerons chaque fois que possible l’utilisation des animaux par des tests in vitro. Il est à noter que parmi les 10 molécules les plus efficaces en cancérologie développées depuis 20 ans, toutes ont été découvertes grâce aux modèles murins. En particulier les découvertes de James Allison et de Tasuku Honjo leur ont valu le Prix Nobel en 2018, signe que l’immunothérapie est un espoir contre le cancer et que les avancées majeures passent par l’étude de modèles animaux.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons établi des procédures expérimentales tenant compte de l'effectif minimal pour atteindre une puissance statistique suffisante. L’utilisation de techniques modernes de phénotypage et les tests in vitro développés par notre équipe permettra également de réduire le nombre de souris utilisées. Des études exploratoires sur un petit nombre de souris seront réalisées pour sélectionner les meilleures stratégies avant d’évaluer leur impact sur un nombre plus important d’animaux. Pour mener à bien le projet sur l'ensemble des lignées, 2860 souris seront étudiées.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous avons mis en place des points limites précis et un système de score afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux. Les animaux seront contrôlés régulièrement et scorés par du personnel formé et compétent afin de détecter les changements de poids d’aspect et l’apparition de comportements associés à la douleur. En cas de signes précoces d’ulcération tumorale ou de souffrance, les animaux recevront des antidouleurs, et s’ils présentent de l’hypothermie ou des difficultés à se nourrir, ils seront placés dans des cages chauffées ou en présence de nourriture humidifiée respectivement. Ils seront mis à mort si le diamètre tumoral dépasse une valeur seuil ou s’ils perdent une valeur seuil de leur poids. Les souris âgées de 7 à 15 semaines seront hébergées en groupe en accord avec la législation en vigueur avec un nombre maximum de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (lanières de papier permettant la nidification) avec un accès illimité à la nourriture et l'eau de boisson au sein d’une animalerie A2 avec surveillance informatique du respect des paramètres environnementaux (température, hygrométrie). Les animaux seront anesthésiés pour la réalisation des procédures les plus stressantes pour l'animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle valide en immunologie, en immunologie des tumeurs et particulièrement dans les études visant à mieux décrire une voie de signalisation. L’homme et la souris ont un système immunitaire proche et partagent les mêmes sous-populations de cellules immunitaires. Les modèles mimant le développement tumoral existent et sont très bien caractérisés. Nous pourrons facilement implémenter ces modèles et ainsi minimiser le nombre de souris nécessaires pour notre étude. Par ailleurs, le modèle souris offre l’avantage de pouvoir utiliser des outils immunologiques puissants permettant de suivre les cellules spécifiques d’antigène. Du fait de l’utilisation de ces modèles très spécifiques, le projet tel qu’il est ne pourrait pas être réalisé dans une autre espèce animale. Nous utiliserons des souris adultes de 7 à 15 semaines d’âge, conditions favorables permettant d’obtenir un stade de maturité immunitaire suffisant tout en limitant le temps d’hébergement total.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hors animaux reproducteurs et de maintien de la lignée. Porteuses d'une mutation reproduisant l'ataxie de Friedreich, les homozygotes développent une ataxie vers trois mois et sont suivies par des tests comportementaux réguliers et des électromyogrammes, avant l'injection d'un vecteur de thérapie génique et une mise à mort à neuf mois pour analyses. Le porteur qualifie ces tests de comportement d'"indolores et sans stress" pour l'animal. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer cette approche et qu'une validation in vivo est "indispensable".

Objectifs

L’ataxie de Freidreich (AF) est une maladie génétique rare qui se caractérise par une maladie neurologique avec une dégradation progressive des fonctions motrices et sensorielles qui conduit à une perte des mouvements volontaires. La maladie est dû a une perte de frataxine, une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Les approches thérapeutiques pharmacologiques développées ciblant principalement les effets secondaires sont à ce jour faiblement efficaces et l’AF reste une maladie incurable. Une approche de thérapie génique permettant de restaurer les taux physiologiques de frataxine est en cours de développement. Un nouveau modèle murin avec une mutation ponctuelle dans la frataxine a été généré, afin de mimer les effets d’une mutation ponctuelle identifiée chez certains patients. Ce modèle est en cours de caractérisation, mais nous savons que ce modèle développe un phénotype neurologique progressif entre 3 et 9 mois, similaire à la maladie humaine. Ce modèle murin nous permettra donc de comprendre les états précoces de la maladie, et de développer une approche préclinique de thérapie génique. Le projet a 2 axes : 1) caractériser le phénotype neurologique du modèle au cours du temps, notamment au cours des trois premiers mois et 2) appliquer et optimiser un protocole de thérapie génique avec un vecteur permettant d’exprimer la frataxine à des niveaux proches de l’endogène.

Bénéfices attendus

Il y a plusieurs bénéfices attendus de ce projet. Le premier sera de valider ce nouveau modèle qui présente des faibles taux de frataxine de façon ubiquitaire et une mutation retrouvée chez l’Homme. Ce modèle pourra être utiliser pour continuer à comprendre la pathophysiologie de la maladie afin de développer des nouvelles approches thérapeutiques. Le deuxième bénéfice sera de continuer à développer au niveau préclinique une approche de thérapie génique.

Procédures

A partir de la naissance les animaux seront observés 2x /semaine (pour surveiller leur poids et taille). Des tests de comportement indolores et sans stress pour l’animal, effectués par le même expérimentateur, nous permettront d’identifier avec précision les défauts locomoteurs et de suivre l’évolution du phénotype. Les tests seront utilisés en conformité avec la littérature et les procédures établies au laboratoire. Ces tests seront effectués tous les 15 jours jusqu’à 12 semaines, et ensuite 1 fois par mois jusqu’à l’âge de 9 mois. Des mesures d’électrophysiologie par électromyogramme (EMG) seront effectués afin de mesurer la réponse proprioceptive des animaux et de corréler ses résultats aux données comportementales à 2 et 3 mois, puis 1 fois tous les 2 mois. A 9 mois, les souris seront mises à mort et les tissus d’intérêt seront prélevés pour des analyses biochimiques et histopathologiques. (Procédure 1) Une deuxième cohorte de souris sera générée pour le prélèvement de tissus pour une caractérisation biochimique et histopathologique, à différents temps (naissance, 7 jours, 3 semaines, 6 semaines, 3 mois et 6 mois), ce qui correspond à différentes phases clés dans la progression de la maladie. Le point de 9 mois sera obtenu à partir de la cohorte de la procédure 1. (Procédure 2) Enfin deux autres cohortes seront générées pour évaluer une approche de thérapie génique, d’abord en pré-symptomatique puis en postsymptomatique. Après injection intraveineuse du vecteur médicament (vecteur exprimant la frataxine) soit avant symptômes (Procédures 3) ou après l’apparition des symptômes (Procédure 4), des tests de comportements ainsi que des mesures d’électrophysiologie seront effectués comme en procédure 1 pour évaluer l’effet thérapeutique. A 9 mois, les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus pour des analyses.

Impact sur les animaux

Les lignées utilisées pour l'élevage sont maintenues à l’état hétérozygote, portant un seul allèle muté et un allèle sauvage. Elles n'ont pas de phénotype dommageable et ne nécessitent donc pas de surveillance particulière. Seuls les animaux homozygotes pour la mutation du gène de la frataxine issues des croisements entre deux souris hétérozygotes ont une réduction de la taille globale et développent des symptômes d’ataxie vers le 3ème mois, aspect qui nécessite d’être affiné. De la nourriture gélifiée sera proposée aux animaux dès l’apparition des signes de la maladie, détectés par les tests de comportement que nous effectuerons.

Devenir

Pour des analyses biochimiques et histologiques une mise à mort est nécessaire en fin de procédure en respectant les points limites et la progression de la maladie.

Remplacement

Ce projet vise à optimiser une approche de thérapie génique pour l’ataxie de Friedreich afin d’améliorer la vie des patients et de ralentir la progression de la maladie, voire la stopper de façon pérenne sans induire des effets secondaires invalidants. Tous les outils moléculaires utilisés ont été testés dans des cellules en culture mais il est indispensable de réaliser une validation in vivo sur un modèle murin de la maladie. Ce modèle est le premier modèle qui reproduit génétiquement une mutation ponctuelle retrouvée chez l’homme.

Réduction

Il est estimé que le projet mobilisera sur 5 ans un maximum de 720 animaux hors animaux reproducteurs et maintien de la lignée. Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant en compte du nombre minimum nécessaire pour pouvoir appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires de nos collaborateurs nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (20 souris par condition pour les tests de comportement et 10 souris par condition pour les analyses biochimiques et histologiques). Autant que possible, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les analyses fonctionnelles, histologiques, moléculaires et biochimiques. Si aucun phénotype moléculaire/histologique n'est observé à 6 semaines, les cohortes prévues pour les points plus précoces ne seront pas générés. En l’absence de différence entre les mâles et les femelles, les données seront combinées afin de diminuer de moitié l’effectif.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et leur poids et taille seront mesurés 2x / semaine. Dès les premiers signes cliniques (défauts à la locomotion ou perte de poids), de la nourriture gélifiée sera mise à leur disposition dans la cage. Des points limites prédictifs sont déjà établies et validés par la communauté scientifique avec un « scoring » adapté aux modèles d’ataxie.

Choix des espèces

Il n’existe à ce jour pas de méthodes alternatives pour évaluer la pertinence d’une approche de thérapie génique pour le traitement de l'Ataxie de Friedreich, notamment de la composante neurologique de la maladie. Il est alors nécessaire d’utiliser un modèle animal pour comprendre et proposer des approches thérapeutiques de la pathologie. La frataxine humaine sauvage est capable de compenser l’absence de frataxine murine endogène dans des modèles cellulaires et murins. Malgré l’existence de modèles cellulaires, une étude chez l’animal est indispensable pour déterminer la pertinence de cette approche de thérapie génique et afin d’établir une preuve de concept et l’innocuité de cette stratégie. Cette étape préliminaire est cruciale avant de pouvoir considérer une application chez l’Homme. Les études aux stades post-nataux débuteront à la naissance et se termineront à 9 mois au plus tard, et avant d’atteindre les points limites fixés dans cette étude. Nos collaborateurs ont déjà établi que les animaux avaient un phénotype à 3 mois, mais n’ont pas testé les stades avant.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéficientes greffées de tumeurs humaines de sarcome, elles reçoivent deux injections par semaine d'anticorps ciblés et de chimiothérapie pendant tout le suivi tumoral, avec des nécroses de tumeur en surface et une cachexie possible menant à la mise à mort. Le porteur affirme que la diversité cellulaire des sarcomes ne se retrouve pas en culture mais seulement dans les greffes chez la souris. Il écarte d'autres modèles comme le poisson zèbre au motif que les schémas d'administration y sont moins standardisés.

Objectifs

Les sarcomes constituent une maladie rare qui touche environ 1000 personnes par an en France. Ils affectent majoritairement les sujets jeunes et présentent un profil métastatique et un taux de récurrence élevé, conduisant à un pronostic réservé . Actuellement les patients sont traités par amputation additionnée de chimiothérapie et/ou radiothérapie. Il convient donc de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques. L'objectif principal de ce projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec une chimiothérapie sur le développement de certaines formes de sarcomes dans des modèles humains greffés chez la souris. Les expérimentateurs en charge des animaux sont expérimentés dans la mise en œuvre des modèles animaux présents dans les 3 différentes procédures.

Bénéfices attendus

L'hypothèse de ce travail est que la cible thérapeutique étudiée joue un rôle dans le développement des sarcomes. Ceci est basé sur l'évaluation de l'expression de la protéine ciblée dans les tumeurs de patients atteints de cette maladie. Dans le cadre de cette étude, l’effet anti-tumoral d’une thérapie ciblée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie sera évalué dans des modèles murins. Un projet d’essai clinique portant sur le traitement de ces sarcomes avec la thérapie ciblée est actuellement à l’étude. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement du candidat médicament et de son fonctionnement en association avec des chimiothérapie. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Injections sous-cutannées de lignées cellulaires (une seule fois). Toutes les injections sont réalisées dans un volume de 100μL ou 200µL. Injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral) et/ou chimiothérapies (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral).

Impact sur les animaux

Dans les trois procédures il est possible d’observer des phénomènes de nécrose des tumeurs à la surface de la peau. Dans les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids). Les individus concernés seront mis à mort.

Devenir

Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet. Les animaux ne présentant pas de prise tumorale seront mis à mort 2 mois après la greffe.

Remplacement

Les sarcomes nous intéressent pour la diversité des cellules qui les composent. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension des mécanismes d’action de notre thérapie ciblée. Les modèles retrouvés dans la littérature montrent que cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires mais uniquement dans les greffes chez la souris.

Réduction

Procédure 1) Un nombre de 5 souris par condition, selon 3 différentes conditions de greffe, est suffisant pour évaluer la prise de greffe des différentes lignées cellulaires. Les souris seront greffées dans chaque flanc pour réduire le nombre d’individus nécessaires. Ces expérimentations seront réalisées sur les six lignées cellulaires. Procédure 2) Les lignées ne montrant pas de prise tumorale en procédure 1 ne seront pas utilisées en procédure 2 et 3 conduisant à une réduction. D'après notre expérience la variabilité des modèles de greffes traitées avec ces composés ne permet pas de voir l'effet de ces drogues seules ou en combinaison au-dessous d'un effectif de 10 souris. Compte tenu des aléas de prise tumorales combinés au fait que nous ne connaissons pas encore l'efficacité de prise de ces modèles, nous envisageons des lots de 45 souris par expérience de manière à pouvoir répartir au moins 10 souris par groupe de traitement (retrait des 5 tumeurs n’ayant pas pris et/ou de trop grosses tumeurs à l’inclusion). Procédure 3) Une fois l’efficacité anti-tumorale déterminée, nous nous intéresserons aux mécanismes d’action de notre thérapie dans les temps précoces du traitement. La procédure 2 sera donc répétée pour les lignées montrant une efficacité anti-tumorale mais avec une mise à mort plus précoce (environ 500mm3) des animaux pour réaliser des analyses biologiques. Des expériences in vitro seront menées sur les lignées pour déterminer leur sensibilité aux agents de chimio thérapie. Ces résultats conditionneront le maintien ou non des conditions de traitement avec ces agents dans les procédures 2 et 3, pouvant ainsi conduire à une réduction. Les traitements seuls ou associés ne montrant pas d’efficacité anti-tumorale dans la procédure 2 ne seront pas utilisés en procédure 3, conduisant également à une réduction. Des statistiques adaptées seront utilisées.

Raffinement

Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Dans toutes les procédures le volume tumoral sera évalué 2 à 3 fois par semaine avec un pied à coulisse. Le poids des animaux sera évalué 1 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance (prostration, propreté, cachexie, isolement social) seront surveillés à chaque mesure tumorale ou pesée soit 2 à 3 fois par semaine.

Choix des espèces

La souris est utilisée car elle permet de maintenir la diversité cellulaire dans les tumeurs qui est nécessaire à l'activité anti-tumorale de la thérapie ciblée étudiée. La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer du tissu humain pour éviter les rejets tout en permettant de faire des suivis de pharmacocinétique et pharmacodynamie dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps et chimiothérapies sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres modèles tels que le zebrafish. La cible thérapeutique étudiée n'est pas exprimée dans certaines espèce. On retrouve une forte homologie entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, les outils destinés à l'analyse des tissus post mortem n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément au modèle établi.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, puis un gavage cinq jours sur sept et des injections d'immuno-chimiothérapie, tout en étant contraintes de courir sur un tapis, pour tester si l'exercice améliore l'effet des traitements. Le porteur reconnaît que le gavage répété est stressant et que des ulcérations ou une tumeur trop grosse conduisent à la mise à mort. Il affirme n'avoir aucune autre possibilité que d'utiliser un "organisme entier".

Objectifs

Nous savons que réaliser de l’activité physique (AP) diminue la mortalité induite par différents types de cancer chez l’Homme. Cela a été montre dans des études chez l’humain et chez l’animal. Cependant, nous ne comprenons pas vraiment comment l’exercice agit pour diminuer la croissance de la tumeur. Notre projet chez la souris est associé à notre projet chez l’homme ou nous souhaitons voir si un exercice physique juste avant la prise des traitements anti-cancéreux améliorerait l’efficacité de ces traitements. Chez l’homme, nous ne pouvons pas souvent récupérer les tumeurs chez des patients en stade avances car il y a trop de risques pour les patients. Nous avons donc besoin de développer d’autres modèles pour étudier les effets sur la tumeur elle-même. L’exercice physique pourrait modifier la réaction du système immunitaire ou le nombre de vaisseaux sanguins sur la tumeur (vascularisation) et ainsi rendre la tumeur plus sensible aux traitements. Secondairement, nous savons que le cancer ainsi que les traitements contre cette maladie peuvent engendrer des effets secondaires. En particulier, il existe une fonte musculaire et une altération de leur fonctionnement. Cela diminue la qualité de vie des patients et serait synonyme d’un moins bon pronostic. Ainsi faire réaliser des exercices physiques aux patients permettraient de maintenir leur masse musculaire et améliorer les effets des traitements. Notre projet vise donc à étudier les effets d’un exercice physique aigu pré- traitements sur 1) le développement de la tumeur dans un modèle de cancer chez la souris ; 2) la fonte musculaire induite dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Le développement de la recherche dans le domaine de l'exercice appliqué à l’oncologie a permis de constituer une base de données importante sur le rôle de l’exercice physique dans la prévention et la gestion des effets indésirables du cancer. Néanmoins, il est essentiel de comprendre comment l'exercice diminue la progression tumorale. Sur le plan scientifique, ce projet permettra donc d’apporter des nouvelles données scientifiques sur les interactions entre l’exercice physique et les traitements anticancéreux des patients ainsi que les mécanismes potentiels par lesquels l’exercice physique pré-administration de l’immunochimiothérapie pourrait potentialiser l’efficacité des traitements. Aujourd’hui pour des questions de réduction de technique invasive chez les patients, de moins en moins de biopsie de la tumeur sont réalisées ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle murin à visée scientifique pour comprendre l’interaction biologique et moléculaire entre un exercice physique réalisé juste avant l’injection des traitements et le microenvironnement tumoral. Ce modèle nous permet donc d’accéder aux tumeurs et d’évaluer l’effet de l’exercice sur la taille de tumeur, les mécanismes immunitaire et vasculaire sous-jacent ainsi que le muscle squelettique. Grâce à cette étude nous pourrons rapidement apporter de précieuses données sur les interactions entre exercice et cancer. Sur le plan clinique, les mécanismes mis en évidence au cours de cette étude permettront d’envisager des essais cliniques futurs grandes ampleurs étudiant plus spécifiquement les effets de ce type d’intervention combiné sur le développement tumoral et la cachexie musculaire associée au cancer, deux paramètres majeurs dans la survie des patients. Ces résultats permettront ensuite de concevoir des essais cliniques plus poussées afin de déterminer et affiner la prescription de la dose d’exercice (durée, intensité, modalités) à utiliser en combinaison à un traitement anti-cancéreux. Ces différentes études permettront d’améliorer la prise en charge des patients et l’efficacité de la thérapie.

Procédures

Les animaux utilises dans ce projet seront tout d’abord soumis à une seule injection sous la peau au niveau du flan gauche de cellules capables de former une tumeur. Après avoir attendu quelques jours pour que la tumeur se forme, les animaux commenceront leurs traitements bases sur une immuno et chimiothérapie. Certains des animaux ne seront pas injectes avec des cellules tumorales et ne développeront pas de tumeurs. Ceux-ci correspondront aux groupes Non-Tumoraux (NT). Pour cela, les animaux recevront une fois par semaine une injection au niveau du ventre pour atteindre les organes (intrapéritonéale) ainsi qu’un gavage (insertion d’une sonde dans l’œsophage) quatre jours sur cinq pour recevoir la totalité des traitements. Une partie des animaux eux ne recevront pas le traitement mais un placebo. Au moment du début des traitements, les animaux commenceront de réaliser de l’exercice physique. Le premier exercice sera réalisé avant même l’injection des tumeurs pour établir le niveau de d’endurance physique des animaux grâce a un test de vitesse maximal de course (VMC) qui permettra d’adapter les exercices suivants. Ces derniers seront réalisés juste avant les traitements anti-cancéreux quatre jours sur cinq et dureront 50 minutes à une vitesse correspondant a 60% de la VMC. Ensuite une partie des animaux, seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs après quatre jours de traitement et/ou d’exercice. L’autre partie des animaux poursuivra le protocole (traitement + exercice) jusqu’à 30 jours. A la fin du protocole, une partie des animaux sera utilise pour évaluer si l’exercice a modifie la vascularisation des tumeurs, c’est-à-dire savoir si l’exercice a permis que la tumeur soit plus perfusée et reçoive plus de traitement. Pour cela, les animaux recevront une molécule capable de visualiser les zones qui ont une diminution de leur taux d’oxygène (hypoxie) qui est une caractéristique des tumeurs agressives. Après cette injection, soient les animaux resteront au repos soient ils seront mis à l’exercice, puis mis à mort pour récupérer les tumeurs. Une autre partie des animaux, sera utilise pour voir si la croissance tumorale et les traitements ont un impact négatif sur les muscles et étudier les mécanismes mis en jeu. Pour cela, nous testerons la capacite des souris à réaliser une contraction musculaire. Puis, les animaux seront mis a mort et les muscles récupérés pour être étudiés.

Impact sur les animaux

Le modèle de tumeur sous la peau ne présente pas de métastases ni d’atteintes musculaires trop importantes. De plus, la localisation sous-cutanée de l’implantation de la tumeur permet de minimiser les douleurs associées à la croissance tumorale de par l’espace disponible et l’élasticité de la peau. La douleur ou gêne occasionnée lors de celle-ci sera néanmoins surveillée, en particulier si les animaux en évaluant une possible gêne à se mouvoir ou a se nourrir. Il est possible que les animaux présentent une plaie au niveau de la tumeur et dans ce cas les animaux touches seront mis à mort dans les plus brefs délais pour arrêter leur souffrance. De même si la croissance tumorale est trop importante et que la tumeur atteint une taille trop importante, les animaux seront sacrifiés. Les intensités d’exercice sont modérées et se rapprochent des intensités utilisées chez des patients atteints de pathologies chroniques. Elles sont donc connues pour induire des adaptations physiologiques bénéfiques sans effets négatifs chez l’homme comme chez la souris. Les différents traitements utilisés au cours de ce protocole ont déjà été validés au cours d’études précédentes et permettent une réduction du volume tumoral tout en minimisant la toxicité liée au traitement. Les traitements sont administrés par gavage ou injection dans le ventre. Les animaux seront donc exposés au stress induit par la contention et à la douleur de la manipulation. Ces gestes seront de très courte durée pour minimiser l’impact négatif sur les animaux. Ces procédures ont été choisies car utilisées dans le modèle tumoral utilise et déjà valide et n’ont pas été modifié pour ne pas changer l’efficacité des traitements. Le gavage 5 jours sur 7 est reconnu comme stressant. L’injection IP altère les tissus autour de la zone d’injection mais celle-ci n’ayant lieu qu’une fois par semaine, cela limitera les effets délétères de ce geste. La mesure de la force chez l’animal est réalisée sous anesthésie générale afin de ne pas induire de stress chez l’animal. Les contractions des muscles induites lors du test n’entraînent pas d’altérations de la fonction et de l’intégrité du muscle squelettique (i.e. crampe et/ou déchirement musculaire).

Devenir

Les animaux seront mis à mort après l’expérimentation car l’utilisation des muscles et de la tumeur sont nécessaires pour répondre aux questions émises dans le projet.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier les interactions complexes des traitements combinés immuno/chimiothérapie et de l’exercice physique au sein de la tumeur et le rôle joue par le système immunitaire. De plus le second objectif est d’évaluer l’altération des muscles induits par ces différentes interventions. Nous n’avons donc aucune autre possibilité que d’utiliser un organisme entier. Toutes les découvertes faites lors de ce projet feront ensuite l’objet d’approfondissement dans des modèles de cellules n’utilisant pas d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir de nos expériences passées pour mettre en évidence des différences en utilisant le minimum d’animaux. Dès lors que nous obtiendrons des différences entre nos conditions, nous arrêterons les expérimentations chez l’animal afin de maintenir le nombre d’animaux utilises au strict minimum.

Raffinement

Nous veillerons à améliorer au mieux les conditions d’hébergement des animaux en leur donnant accès a des zones cachées pour s’isoler, des jeux et en favorisant les interactions entre les animaux. Si leur condition physique rend difficile leur accès a la nourriture ou à l’eau en hauteur, nous adapterons leur environnement en leur mettant a disposition eau et nourriture au sol. Pour être sûr que la croissance tumorale reste acceptable pour l’animal, nous surveilleront le développement de la tumeur et mettrons a mort les animaux si la tumeur devient trop grosse. Nous surveillerons aussi le poids des animaux pour veiller à ce qu’ils ne subissent pas une perte de poids trop importante et synonyme de leur souffrance. Dans le cas d’une trop forte perte de poids, les animaux concernes seront mis à mort. Le protocole d’exercice physique est d’intensité modérée (60% des capacités maximales). A la suite du test de vitesse maximale de course, la récupération des souris sera vérifiée par observation de leur capacite à bouger le jour de l’intervention et le suivant avec un intervalles de 2h entre deux observations. Les différentes procédures peuvent induire du stress et nous veillerons donc à adapter au mieux nos manipulations pour limiter les actes stressants. Par exemple, nous limiterons le nombre de fois où nous toucherons les animaux en réalisant au même moment la mesure de la taille de la tumeur et les injections des traitements anti-cancéreux ; ou lors du transfert des cages au tapis de course et inversement ou nous pouvons les transférer sans les toucher avec l’aide d’une petite boite. Normalement le modèle ne devrait pas induire de douleur particulière sauf lors de l’atteinte d’un point limite (ulcération ou taille tumorale trop importante) menant à la mise à mort des animaux. Cependant, dans le cas où il semble que les animaux souffrent, nous prendrons contact avec le vétérinaire réfèrent pour évaluer les possibilités d’utiliser des médicaments pour réduire la douleur.

Choix des espèces

Le modèle de cancer sous la peau et les traitements anti-cancéreux que nous utilisons ont été valides préalablement sur les souris. Ces animaux sont très souvent utilisés dans les études en cancérologie ou dans les études portant sur l’exercice physique. Ce modèle permet donc d’obtenir des résultats nouveaux sans avoir à répéter des expériences déjà réalisées avant (nous limitons donc le nombre d’animaux ainsi que les procédures subites par ces animaux). De plus, les outils techniques dont nous avons besoin pour répondre aux questions ont bien été valides chez l’animal augmentant la probabilité d’obtenir de nombreux résultats en utilisant un minimum d’animaux. L’âge des animaux a été déterminé par des études précédentes qui ont valide le modèle que nous utilisons. Nous savons qu’a cet âge, nous obtiendrons un développement de la tumeur suffisant pour répondre à notre question. A cet âge, les animaux ont une fonction musculaire bonne qui permet de diminuer le nombre d’animaux ne voulant pas courir (pourcentage augmentant avec l’âge). Ainsi, a ce stade nous pouvons répondre aux différents questionnements du projet.

4 995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des bactéries, greffées de cellules tumorales ou exposées à des substances cancérigènes, puis traitées par antibiotiques, immunothérapies ou phages, pour étudier la réponse immunitaire de la vessie. La description des procédures reste très générale et le porteur reconnaît des douleurs d'infection et un risque d'obstruction urétérale par les tumeurs. Il justifie ce nombre élevé par la nécessité d'organes intacts et affirme n'avoir "aucune autre alternative pertinente".

Objectifs

Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection, au cancer et aux immunothérapies dans la vessie. Cette compréhension nous permettra d'identifier des cibles pour les futures imunothérapies afin d'améliorer le traitement des infections, des cancers et d'autres maladies de la vessie.

Bénéfices attendus

Nous espérons avoir une meilleure compréhension du fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie et comprendre les mécanismes par lesquels les approches thérapeutiques, telles que la vacciantion ou la phagothérapie, améliorent l'immunité contre la maladie.

Procédures

les animaux seront infectés par des bactéries, ou implantés avec des cellules tumorales, ou recevront des substances cancérigènes pour développer des tumeurs. Ensuite, les animaux seront traités avec des médicaments, tels que des antibiotiques, des immunothérapies ou des phages.

Impact sur les animaux

Bien que nous ayons mis en place un plan pour éviter les effets néfastes, il est possible que les animaux ressentent des douleurs dues à une infection, comme c'est le cas chez l'homme, ou que des tumeurs à croissance rapide provoquent une obstruction urétrale. Nous pouvons surveiller ce scénario pour éviter cette possibilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est absolument nécessaire pour ce projet puisqu’il n’existe aucune autre alternative pertinente pour ce genre de projet. En outre, ces études doivent être effectuées in vivo, parce qu’il est nécessaire que les organes et les systèmes impliqués soient intacts afin de bien comprendre la migration cellulaire et la réponse immunitaire (innée et adaptative).

Réduction

Réduction : Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'analyse statistique, sur la base d'expériences antérieures. Dans la mesure du possible, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes expérimentaux afin de réduire le nombre total de souris nécessaires, sans compromettre l'intégrité de l'expérience.

Raffinement

Raffinement : Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela comprend une surveillance régulière, l'administration de médicaments antidouleur approuvés si les souris souffrent (aspect voûté, piloérection) et la détermination de points limites avant de commencer l'expérimentation (perte d'un pourcentage prédéterminé de poids, par exemple) (le tout conformément à la réglementation européenne).

Choix des espèces

Les souris sont un bon modèle pour étudier les réponses immunitaires contre les bactéries. Il a été démontré empiriquement que les infections des voies urinaires chez la souris reflètent, dans de nombreux aspects essentiels, l'état de la maladie observée chez l'homme. Il a été démontré que la voie utilisée par les pathogènes identifiés comme uropathogènes chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme un modèle approprié pour l’infection des voies urinaires. Des travaux précédents de notre laboratoire ont démontré que la réponse des souris traitées par BCG-thérapie pour le cancer de la vessie est très similaire à celle observée chez l'homme, justifiant à nouveau la souris comme un modèle utile pour l'étude de l'immunothérapie dans la vessie. On va utiliser les souris de 6 à 24 semaines. Cet âge chez la souris équivaut à l’âge adulte chez l’homme. Dans un très petit nombre d'observations, nous analyserons la vessie de souris néonatales non manipulées qui n'ont pas encore été sevrées, âgées de 0 à 28 jours, afin d'identifier spécifiquement le moment où les populations de macrophages résidents dans la vessie divergent en deux populations distinctes et si cela dépend du passage de l'allaitement à l'alimentation solide. Nous pensons avoir besoin de 8 à 10 souris par point temporel, 4 points temporels étant prévus. Donc, 40 souriceaux femelles et 40 souriceaux mâles

1 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse ou dans la veine du foie, puis l'injection de radioéléments couplés à des vecteurs et jusqu'à huit prélèvements sanguins sur cinq mois, pour évaluer de nouveaux médicaments radioactifs contre le cancer. Le porteur affirme que ces phénomènes complexes ne peuvent être étudiés in vitro et que le recours aux animaux est "indispensable". Les bénéfices annoncés, un transfert en clinique, restent formulés comme une perspective.

Objectifs

L’objectif principal de notre plateforme est de développer de nouveaux traitements contre le cancer. Nous disposons de différents vecteurs (Anticorps, affitines, liposomes, etc…) et de plusieurs radioéléments (Astate 211, Iode 131, zirconium, Yttrium 90 Scandium 47, cuivre 64 etc…), certains connus qui servent de références et des nouveaux, produits. La cible à détruire est la cellule tumorale, l’arme est le radioélément qui va émettre un rayon « toxique » pour cette cellule. Il faut accrocher le radioélément à un ligand et à un vecteur afin de former un radiopharmaceutique qui doit cibler et détruire la cellule tumorale tout en minimisant l’impact sur les tissus sains. Nos études suivent le même protocole. Le système vecteur- ligand-radioélément est d’abord testé sur des cellules tumorales en culture. Quand l’efficacité est démontrée, les cellules tumorales sont greffées à des souris. Le système vecteur- ligand-radioélément est injecté aux animaux porteurs de tumeurs pour étudier la distribution dans un organisme vivant, la fixation du radioélément sur la tumeur et tous les organes. La radiothérapie sera appliquée sur 2 types de modèles de métastases expérimentales : injection intraveineuse dans la veine latérale de la queue qui engendre un envahissement disséminé et injection dans la veine porte hépatique qui permet un envahissement du foie. Ces 2 procédures reflètent les propriétés de colonisation et de domiciliation des cellules tumorales. Elle permet d’évaluer l’efficacité anti-métastatique des traitements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de produire un radiopharmaceutique capable de détruire les cellules tumorales dans des modèles précliniques. En vue d'un futur transfert à la clinique.

Procédures

Greffe de cellules tumorale en intraportale (Procédure 2) : Cette procédure reflète les propriétés de colonisation et de domiciliation des cellules tumorales. Elle permet d’évaluer l’efficacité anti-métastatique des traitements. Injection unique. Concerne 700 souris sur souris analgésiées et anesthésiées. La procédure chirurgicale en elle même dure 15 minutes par souris. Les souris sont ensuite suivies jusqu'à 150jours. Prélèvement sanguins 50µl de sang à J-7,15,30,45,60,90,120, 150 pour évaluer toxicité hématologique (procédure 3). Lors des prises de sang, une goutte de tétracaïne 1% collyre unidose est appliquée au niveau de l’œil puis les souris sont anesthésiées sous isoflurane, et le sang est prélevé au niveau du sinus rétro orbital à l’aide d’un capillaire. Les prélèvements en eux mêmes ne durent qu'une trentaine de secondes et concernent 1750 souris.

Impact sur les animaux

Les procédures de modèles de métastases (procédure 1 et 2) sont modérées si les animaux sont bien suivis. Ils seront suivi quotidiennement selon une grille de score et de points limites (en annexe) qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. En palier 1 (un critère de la liste en annexe): AINS : Méloxicam 2.5 mg/kg/jour dans l’eau de boisson. En palier 2 (2 critères associés de la liste en annexe) : morphinique faible : Buprénorphine 0,05 mg/kg en sous-cutané matin et soir (soit 50 µL à 0,03 mg/mL pour une souris de 25 g). En palier 3 : mise à mort. La procédure de thérapie (3) pourrait entraîner des effets indésirables. Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. Enfin, la procédure d'imagerie (4) n'entraine pas d'effet indésirable

Devenir

Porocédure 1 : 1050 souris gardées en vie pour thérapie (procédure 3) dont 1/3 seront imagées pour suivi thérapeutique (procédure 4). Toutes sont mises à mort à l'issue de la thérapie. Procédure 2 : 700 souris gardées en vie pour thérapie (procédure 3) dont 1/3 seront imagées pour suivi thérapeutique (procédure 4). Toutes sont mises à mort à l'issue de la thérapie.

Remplacement

Les pathologies chroniques comme le cancer sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro de façon globale et intégrée, le recours aux animaux est indispensable. La spécificité des vecteurs est préalablement testée in vitro sur des cellules tumorales.

Réduction

Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Pour l'analyse des résultats, tous les tests statistiques seront réalisés sous Prism. Nous utiliserons des T-tests non paramétriques pour les analyses intergroupes, et un test Logrank pour l’analyse des courbes de survie.

Raffinement

L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par trois ou cinq en fonction des protocoles, avec des frisotis pour pouvoir faire un nid. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne selon une grille de score et de points limites qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé.

Choix des espèces

Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. A partir de 7 semaines car les souris sont adultes. Les greffes sont faites entre 7 et 12 semaines, le suivi se fait jusqu'à 150 jours après la greffe