Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Réponses individuelles de brebis Romane soumises à un challenge nutritionnel sévère après mise bas
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
40 brebis vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes rendues ensuite à la production. Le porteur soumet des brebis venant de mettre bas à deux jours de paille de faible valeur nutritive, puis leur prélève du sang huit fois en dix-neuf jours, pour étudier leur adaptation à un manque alimentaire lié au changement climatique. Il indique qu'une perte de poids et une mobilisation des réserves corporelles sont possibles, sans danger annoncé. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible car l'étude porte sur une race ovine précise.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme européen. Des expérimentations similaires sont en train de se dérouler dans d'autres installations expérimentales, avec d'autres races ovines et une autre espèce, les caprins, dans les pays membres du consortium (Egypte, Espagne et Tunisie). L’objectif global est d’étudier les réponses des petits ruminants face aux effets du changement climatique, plus particulièrement les effets des challenges nutritionnels en faisant varier quantité et qualité de l’offre alimentaire. L'objectif du projet est d'évaluer, d'une part, les capacités adaptatives des brebis de race Romane face à un challenge nutritionnel sévère après la mise bas. D'autre part d'étudier, pour le caractère efficacité alimentaire, les effets de la lignée génétique (une lignée de brebis efficaces et une lignée de brebis inefficaces) sur la réponse au challenge nutritionnel et de décrypter les mécanismes de l'organisme qui sont reponsables de cette réponse. Ainsi une meilleure compréhension de la réponse des animaux aux stress alimentaires nous permettra de proposer aux éleveurs des pratiques de conduites ciblées pour des catégories ou types d’animaux spécifiques et de maintenir la performance productive des brebis dans des situations extrêmes par exemple imposées par le changement climatique où l’offre de ressources est variable ou limitée et/ou la qualité (valeur nutritionnelle des fourrages) est dégradée.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'étudier comment des brebis de race Romane qui appartiennent à une lignées génétique divergente, pour le caractère efficacité alimentaire, font face à un challenge nutritionnel pendant la période critique de la mise-bas. Il permettra également de déterminer la variabilité individuelle des brebis.
Procédures
Prélevements sanguins pour dosage des métabolites et hormones métaboliques. La prise de sang se fera au niveau des jugulaires en alternant gauche/droite. Cela 8 fois durant les 19 jours de mesures.
Impact sur les animaux
Il n’y a pas d'effets indésirables attendus avec le déroulement de ce projet. Néanmoins, un minimum d’effet est prévu concernant l’impact instantanée sur le bilan énergétique des brebis soumises à un challenge nutritionnel pendant deux jours avec de la paille de faible valeur nutritionnelle. Donc des effets « cascade » à court terme sur le métabolisme, avec une perte éventuelle de poids vifs et d'état corporel (mobilisation des réserves corporelles) seront envisageable, sans représenter un danger pour les brebis.
Devenir
Tous les animaux retourneront en production dans leur environnement naturel.
Remplacement
Il s'agit d'un projet qui cherche à développer de la connaissance fondamentale pour l'espèce ovine, plus particulièrement, pour la race Romane (ancien INRA401) et les deux lignées divergentes développées pour l'éfficacité alimentaire. Donc, pas de remplacement possible avec d'autres animaux ou méthodes alternatives.
Réduction
Le nombre d'animaux prévus a été calculé avec la formule statistique : n=(2SD/p)² avec N = nombre d’animaux, SD=écart type, P=la précision souhaitée pour l’analyse. Au final, nous avons 10 brebis par lignée, par parité, il s'agit du minimum d'observations possibles pour arriver à une puissance statistique minimale pour les interprétations à prévoir dans ce projet.
Raffinement
Les animaux sont en groupe sur aire paillée. Pendant toute la durée de l'expérimentation, le personnel qualifié observera quotidiennement les brebis et leurs agneaux lors des 2 distributions de l'alimentation ainsi que lors de son passage dans la matinée et l'après-midi. Les brebis seront dressées au fonctionnement des portillons électroniques pendant quelques jours au milieu de la gestation, pour éviter la phase critique de la fin de gestation. Le milieu sera enrichi, pour les brebis, par des objets (chaine ou disque) accrochés qui seront alternés au cours de la semaine . Lors du paillage la paille sera mise en tas et ce sont les brebis qui l'étaleront. Pour les agneaux une table, de petite taille dont les pieds ont été ajustés à leur hauteur, sera mise à disposition. Le matériel de contention pour les prélèvements est adapté aux ovins et les animaux y sont habitués.
Choix des espèces
Il s'agit d'un projet destiné à la filière des petits ruminants, notamment les ovins. Les brebis seront utilisées après la mise bas et au début de la lactation. A ce stade physiologique la brebis démarre sa lactation qui permettra d'assurer la croissance des agneaux. En élevage selon les périodes d'agnelage des déficits nutritionnels (quantité et/ou qualité) peuvent avoir lieu pendant cette période. L'objectif est d'évaluer les capacités adaptatives des petits brebis.
Etude du rôle d’une nouvelle protéine impliquée dans la sénescence et l’inhibition de l’initiation tumorale pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur les irradie à faible dose et suit le développement d'adénomes pulmonaires par scanner sous anesthésie, pour tester le rôle protecteur d'une protéine contre le cancer du poumon. Il indique que des difficultés respiratoires sont possibles mais prévoit la mise à mort avant que les lésions ne soient trop importantes. Il affirme qu'il est "nécessaire" de démontrer l'effet à l'échelle d'un "organisme entier" et développe en parallèle des organoïdes de poumon.
Objectifs
Le patrimoine génétique de nos cellules est constamment soumis à des stress qui induisent des anomalies. Les cellules se sont dotées d’un arsenal de molécules permettant de réparer ces anomalies. Ces molécules agissent en tant que barrière anti-tumorale. Au cours du processus par lequel une cellule devient tumorale, il est fréquent que plusieurs de ces molécules soient inactivées, et ceci permet l’émergence de mutations. Le but du projet proposé ici est de démontrer qu’un nouvel acteur de ces voies de réparation agit comme une barrière anti-tumorale pour protéger le tissu pulmonaire in vivo. Les résultats obtenus pourraient ouvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le cancer du poumon non à petites cellules reste un cancer fatal et la résistance aux traitements est fréquente. Découvrir de nouveaux acteurs impliqués dans les mécanismes de protection du patrimoine génétique des cellules et de nouveaux gènes suppresseurs de tumeur est donc primordial pour accroitre les connaissances et ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du cancer du poumon
Procédures
Les animaux seront imagés avec un scanner sous anesthésie gazeuse. La durée de l’acquisition au scanner est de 2 min et l’anesthésie de 5 min.
Impact sur les animaux
Les souris seront irradiées à des doses faibles ce qui réduira le risque d’affecter les épithéliums à fort taux de renouvellement tels que la muqueuse intestinale. Des difficultés respiratoires seront possibles du fait du développement d’adénomes dans le tissu pulmonaire mais le protocole prévoit une mise à mort pour analyse des tissus avant que les lésions ne soient trop importantes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyse des tissus pulmonaires.
Remplacement
Jusqu’à présent ce projet a été mené sur des lignées de cellules humaines in vitro. Afin de démontrer le rôle anti-tumoral du gène d’intérêt dans l’objectif de publier ces résultats, il est nécessaire de démontrer l’effet à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l’expérience sera suffisant pour permettre une interprétation statistique des résultats. L’utilisation d’un appareil d'imagerie de type scanner permettra de suivre l’évolution des lésions de manière longitudinale sur les mêmes groupes d’animaux et d’éviter le maintien inutile d’animaux en souffrance respiratoire. La mise en place de procédures pilotes contribuera à réduire le nombre d’animaux utilisés pour la phase expérimentale.
Raffinement
Une définition précise des points limites et une surveillance adaptée des souris permettra d'éviter toute souffrance, en particulier l'aspect des poils, la prostration, des difficultés respiratoires et l’isolement social seront les paramètres majeurs pris en compte. L’analyse par imagerie ainsi que les procédures d’inhalation seront réalisées sous anesthésie. De la nourriture hydratée sera fournie aux groupes de souris irradiées. Les expériences de détermination de la dose des irradiations à utiliser seront menées de façon séquentielle. Si la première dose donne des résultats satisfaisants, nous ne procéderons pas avec le 2ème test. En parallèle nous établissons des cultures organoïdes de poumon. Il s’agit de cellules primaires dérivées des animaux, maintenues et propagées en culture tridimensionnelle. Nous testerons si les réponses sont similaires in vivo et ex vivo. Le cas échéant, nos futures expériences pourraient être réalisées sur organoïdes.
Choix des espèces
La souris est le modèle mammifère comportant le plus grand nombre d'outils génétiques développés (technologie de transgénèse . Les modèles tumoraux pré́-cliniques sont bien établis. Les expériences seront réalisés sur des animaux adultes
Etude de l’origine des cancers pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur déclenche chez elles un cancer du poumon par instillation dans la trachée, pour étudier l'origine et la progression des tumeurs selon le rôle d'une protéine. Il indique que les souris développent une maladie pulmonaire avec des difficultés respiratoires en stade avancé, et fixe des points limites sur le rythme respiratoire. Il affirme que les cultures cellulaires ne récapitulent pas la complexité de l'organe et qu'il faut "valider in vivo".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer les facteurs modulant l’initiation et la progression tumorale en fonction de l’origine des tumeurs (alvéolaire ou broncho-alvéolaire) en utilisant des modèles murins exprimant la mutation KRAS caractérisés dans la littérature. Notre hypothèse de travail étayée par de nombreux résultats obtenus au laboratoire est que CD98hc module l’initiation et la progression tumorale en fonction de l’origine alvéolaire ou broncho-alvéolaire des tumeurs. Ce projet a été évalué de manière positive par plusieurs comités d'experts, des financements ont déjà été obtenus. Des demandes d'autorisation expérimentale sur l'animal ont été préalablement accordées pour caractériser le rôle de CD98hc dans l’apparition et la progression des cancers pulmonaires. Les résultats obtenus suite à cette étude ont permis de mettre en évidence une expression différentielle de CD98hc dans les cellules broncho-alvéolaires ou alvéolaires.
Bénéfices attendus
L’adénocarcinome pulmonaire est un cancer très agressif, dont l’espérance de vie à 5 ans est d’environ 5%. De plus, les cancers exprimant une mutation KRAS sont réfractaires aux traitements anti-cancéreux actuels. Ainsi, trouver un traitement est primordial pour soigner ces cancers. CD98hc a été décrit comme étant impliqué dans l’initiation et le maintien des leucémies. De plus, nos résultats préliminaires suggèrent un rôle de CD98hc dans l’initiation et la progression des adénocarcinomes pulmonaires dépendants de KRAS et la survie des cellules cancéreuses. Cette étude in vivo va nous permettre de mieux comprendre le rôle de CD98hc en fonction non seulement de l’origine des tumeurs mais également du génotype tumoral. De plus, comme CD98hc est une protéine transmembranaire pouvant être inhibée in vivo par l’utilisation d’anticorps anti-CD98hc, cela pourrait représenter une cible de choix dans le traitement des cancers pulmonaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - anesthésie (procédure 1) 20 min - instillation intratrachéale (procédure 1 ), 1x 1 minute environ - injection intrapéritonéale (procédure 2/3) , procédure 2: 5x 1min. procédure 3: 1x 1min - prélèvement sanguin (procédure 1 et 2), pour le modele KRAS/P53 uniquement, tout les 15 jours, 200ul de sang, temps d'intervention: 5min.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer un cancer pulmonaire avec les nuisances liées a cette pathologie comme une difficulté respiratoire en stade avancé. Cette difficulté respiratoire s'observe par un ralentissement et un changement de la respiration (accélération ou ralentissement). Au moindre signe de détresse respiratoire et/ou de douleurs associées (prostration), les animaux seront euthanasiés.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés en fonction des cinétiques de chaque procédure.
Remplacement
Les lignées cellulaires humaines et murines seront utilisées dès que possible. Quelques publications décrivent les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude de l'initiation tumorale. Elles sont actuellement mises en place et seront envisagées aussi souvent que possible. Cependant, ces cultures sont encore très expérimentales et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe, c’est pourquoi nous avons besoin maintenant de valider nos résultats in vivo en ayant recours à des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum en utilisant la méthode statistique prédictive de Monte Carlo. Nos groupes expérimentaux sont composés de 20 animaux (10 animaux pour l’étude statique (les resultats seront analysés avec un t test corrigé (logiciel Prism)) et 10 animaux pour les analyses de cytométrie, d’extraction d’ARN et d’extraction protéique) en accord avec la pénétrance de la procédure et aucune distinction de sexe n’est nécessaire. Néanmoins, si après l'analyse de la première expérience nous constatons une différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons alors que l'un ou l'autre des sexes en fonctions des résultats obtenus.
Raffinement
Ces expériences ont été pensées en tenant compte du bien-être animal. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect de la réglementation européenne en cours afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront également suivis quotidiennement . Les points limites ont été définis comme suit : -Respiration rapide > 250 bpm (compter pendant 1 minute les mouvements de la cage thoracique). -Respiration lente < 80 bpm -Suffocation : la souris ne peut plus respirer, les mouvements de la cage thoracique sont amples. -Halètement (à confirmer 20 minutes plus tard) : La respiration est forte et saccadée.
Choix des espèces
La mutation KRAS représente environ 25% des adénocarcinomes pulmonaires, la mutation p53 représente 50 à 70% de ces cancers. Ainsi, l'utilisation de ces modèles murins (KRAS G12Dflox/+ et KRAS G12Dflox/+; p53flox/flox) permet une bonne représentation génétique des cancers pulmonaires humains. Une comparaison pourra être établie entre nos travaux et la littérature abondante dans ce domaine. Ces modèles permettent une très bonne approche des processus impliqués dans l’initiation et la progression tumorale. L'inhibition de CD98hc dans ces modèles se fera soit par adénovirus soit en croisant ces modèles avec les souris K14 et K19 et injection de Tamoxifen 4OHT. Nous utiliserons des souris adultes âgées d’au moins 8 semaines (souris adultes).
Programmation de bactéries comme agents thérapeutiques contre le cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur greffe des tumeurs sous la peau, dans le côlon ou dans la rate, puis les infecte par des bactéries modifiées censées libérer des molécules anticancéreuses au contact de la tumeur. Il indique que la greffe et la croissance tumorale peuvent provoquer perte de poids, prostration et perte de poils en fin d'étude. Il affirme qu'aucune alternative en laboratoire ne permet de faire croître une tumeur tout en conservant la diversité de ses cellules.
Objectifs
Le projet consiste en une étude chez la souris, d’utilisation de bactéries non pathogènes issues de la flore intestinale, comme agents thérapeutiques anti-cancéreux. Dans ce but, les bactéries sont modifiées afin de libérer au niveau de la tumeur des molécules chimiques anti-cancéreuses. Ce projet sera réalisé dans deux modèles tumoraux : cancer colorectal et le fibrosarcome. Dans le cadre de nos recherches, nous avons travaillé sur la modification de lactobacilles qui, par leurs caractéristiques, se présentent comme une thérapie prometteuse. Notre objectif est de réaliser une étude d’infection par ces modèles bactériens afin de démontrer que leur utilisation est possible pour atteindre différents types de tumeurs et développer des molécules thérapeutiques innovantes.
Bénéfices attendus
La biologie permet aujourd’hui de concevoir et construire de nouveaux outils qui peuvent être utilisés afin de produire des composés d’intérêt ou de détecter des molécules (marqueurs ou contaminants environnementaux), d’assainir l’environnement et de créer de nouvelles thérapies. Notre projet s’inscrit dans ce dernier domaine et a pour objectif de développer de nouveaux modes de thérapie anti-tumorale. Les résultats attendus sont : (i) la validation de bactéries non pathogènes en tant qu’agent thérapeutique, (ii) la démonstration de l’efficacité anti-cancéreuse des molécules libérées par les bactéries au site tumoral et (iii) l’absence d’effets secondaires tels que ceux observés lors de chimiothérapies ou immunothérapies.
Procédures
Les animaux vigiles pourront être soumis à 3 types de procédures : - Greffe sous-cutanée, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 1) ou - Greffe intra caecale, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 2) ou Greffe intra splénique, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 3).
Impact sur les animaux
La procédure de greffe, le développement tumoral ou encore l’induction de molécules anti-tumorales peuvent entraîner : une perte de poids ou des effets indésirables chez les animaux tels que : prostration, dos courbé, ou perte des poils. Ces signes ne devraient apparaitre qu’en fin d’étude. Les animaux faisant l’objet d’un dépassement des points limites ou présentant des signes de souffrance clinique irréversibles seront systématiquement euthanasiés et sortis de l’étude.
Devenir
Tous les animaux ayant fait l’objet d’une des procédures seront euthanasiés par inhalation progressive de CO2 ou par dislocation cervicale, réalisée par du personnel formé et compétent.
Remplacement
- « Remplacer » les modèles animaux : pour ce projet, l'utilisation d'animaux à des fins expérimentales est indispensable. Il n'existe en effet pas d'alternative en laboratoire permettant de faire croître une tumeur isolée à partir d’une lignée cellulaire tout en maintenant la diversité des cellules qui composent cette tumeur.
Réduction
« Réduire » le nombre d'animaux en expérimentation. Nous avons prévu prévu de réaliser une étude pilote puis d'utiliser un nombre minimum mais suffisant d’animaux pour garantir l’obtention de résultats pertinents et utilisables pour la génération de nouvelles thérapies bactériennes anti-cancer.
Raffinement
« Raffiner » la méthodologie utilisée, ce qui implique les notions d’élevage en milieu enrichi et de points limites (critères d'interruption de l’expérience). Afin d’améliorer la qualité de vie des souris, elles seront hébergées dans des cages d’une superficie de 500cm2. La litière sera enrichie avec des frisottis ou des carrés de cellulose. Nous porterons une attention particulière au bien-être de nos animaux qui feront l’objet d’un suivi quotidien. Pour les greffes de lignées de cellules cancéreuses, toutes les mesures d’asepsie, d’anesthésie, d’analgésie et de confort lors du réveil des souris, seront prises. Les souris seront ensuite traitées par les bactéries qui seront injectées par voie intra-tumorale, intraveineuse ou orale. L’évolution des traitements sera suivie par imagerie. .
Choix des espèces
L’étude de l’effet des thérapies bactériennes y compris sur le système immunitaire se fera sur des souris immunocompétentes C57Bl/6 greffées avec différents modèles tumoraux (colon et fibrosarcome). Les souris seront réceptionnées à l’âge de 4 semaines puis greffées 1 semaine plus tard (temps d’acclimatation minimum après réception).
Conséquences de la salinisation des zones humides côtières sur la reproduction des amphibiens
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
320 crapauds épineux vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous relâchés sur leur lieu de capture. Le porteur maintient 80 adultes en captivité brève et 240 têtards environ trois mois, en les exposant à des niveaux de salinité proches de ceux du milieu naturel, pour étudier les effets sur la reproduction et le développement. Il indique s'attendre à une éclosion et à une croissance altérées, sans effet attendu sur la survie. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal et qu'il est "indispensable" d'obtenir les pontes au laboratoire.
Objectifs
La salinisation de l’environnement a été identifiée comme une menace globale pour les systèmes océaniques, dulçaquicoles et terrestres. Plus d’un quart des zones humides de la planète ont déjà été touchées par la salinisation, d’autres sont en voie d’être affectées par ce processus, notamment les zones côtières menacées par la montée des niveaux marins et l'augmentation de la fréquence d'évènements extrêmes (submersions marines). A l’échelle globale, l’impact de la salinisation sur la biodiversité est en voie de devenir un problème de conservation majeur. Il est connu que la salinisation du milieu peut avoir des conséquences importantes sur l’utilisation de l’habitat, les budgets énergétiques ou la reproduction chez de nombreux taxons. Certains de ces groupes taxonomiques possèdent des capacités de dispersion élevés qui leur permettent d’échapper à ces conditions négatives et de se reporter sur des habitats encore favorables (par exemple les oiseaux). D’autres groupes sont beaucoup moins mobiles et sont particulièrement soumis à ce type de perturbation. C’est typiquement le cas des amphibiens qui sont caractérisés par de faibles capacités locomotrices. Ils sont également caractérisés par une peau très perméable qui facilite les échanges avec le milieu ce qui peut poser des problèmes de maintien de l’équilibre osmotique. D’autre part, le développement des œufs et des têtards dans l’environnement aquatique (mares) les rend particulièrement susceptible à la salinisation des sites de reproduction, particulièrement en zones côtières. Toutes ces caractéristiques font des amphibiens des espèces particulièrement adaptés pour examiner l’impact de la salinisation de leur environnement sur la reproduction. Le projet consiste à évaluer l’impact de la salinité environnementale (évaluée par des mesures in situ) sur le développement embryonnaire et larvaire d’un amphibien répandu, le crapaud épineux (Bufo spinosus). Afin d’évaluer les capacités d’adaptation de ce taxon à la salinisation de l’environnement, nous comparerons les réponses d'individus capturés en zones côtières (présumés habitués à ces conditions) et de zones continentales (non soumis à cette contrainte environnementale) afin d’identifier si des mécanismes spécifiques permettent aux populations côtières de faire face à cette contrainte environnementale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de répondre à deux questions cruciales. Tout d'abord, ce projet permettra d'évaluer si la salinité environnementale affecte négativement les capacités de reproduction des amphibiens côtiers. D'autre part, ce projet permettra d'élucider les capacités d'adaptation des populations cotières a ce paramètre environnemental en comparant les réponses de populations soumises ou non à la salinité environnementale. Les données récoltées seront utilisables dans un objectif de conservation (protection contre les intrusions marines des sites de reproduction côtiers, aménagement de zones refuge ou tampon).
Procédures
Les interventions sont limités à de la captivité transitoire (adultes : 48h, têtards : ~90 jours) et à des mesures morphométriques (quelques minutes).
Impact sur les animaux
Concernant les adultes, les effets indésirables potentiels sont limités à ceux induit par la captivité transitoire. Néanmoins, nos travaux précédents ont montré que les niveaux d'hormones de stress des individus reproducteurs adultes ne sont pas modifiées par la capture et la captivité ce qui semble suggérer des effets faibles de nos procédures. Les niveaux sublétaux de salinité testés dans ce projet sont similaires à ceux auxquels les individus font face dans l'environnement naturel (zones côtières). Les effets indésirable potentiels seront donc similaires à ceux auxquels les individus font face sur le terrain. Parmi les effets potentiels, nous nous attendons à des succès d'éclosion et des patrons de croissance altérés au traitements de salinité faible et modérée. Néanmoins, à la vue des niveaux de salinité testés, nous n'attendons pas d'effets sur la survie des individus. Tout sera mis en oeuvre pour limiter au maximum le stress et/ou la douleur possiblement induits par nos procédures. La durée de captivité des adultes sera réduite au minimum (la ponte ayant lieu en général dans les 24h qui suivent la capture). Les individus adultes seront relâchés sur leur lieu de capture dès que la ponte aura eu lieu. Les têtards seront maintenus dans des conditions optimales (nourriture ad libitum, pas de risque de prédation et de compétition, régime thermique stable). L'avis du vétérinaire référent sera sollicité tout au long de ces procédures (capture, captivité pour les adultes; captivité pour les têtards) en cas d'anomalie observée.
Devenir
Les niveaux sublétaux de salinité testés dans ce projet sont similaires à celux auxquels les individus font face dans l'environnement naturel (zones côtières). Les effets indésirable potentiels seront donc similaires à ceux auxquels les individus font face sur le terrain. Tous les individus seront donc maintenus en vie et relâchés sur leur site de capture.
Remplacement
L'étude de l'influence de la salinité environnementale sur les performances de reproduction a des implications importantes à la fois pour la recherche fondamentale en écologie et la recherche appliquée en conservation. Ce projet porte spécifiquement sur le crapaud épineux (Bufo spinosus) en conditions contrôlées. Il n'existe pas d'alternative à l'utilisation d'un modèle animal pour cette étude.
Réduction
Le nombre d'individus sera réduit au minimum (20 couples par sites soit 40 couples au total, soit 80 individus adultes). Seule une fraction des têtards issus de chaque ponte sera conservée pour monitorer le développement larvaire (6 individus par ponte, soit un total de 240 têtards). Les oeufs et les têtards qui ne sont pas impliqués dans ces suivis seront relâchés sur le lieu de capture des adultes dès la ponte ou l'éclosion. Les 240 têtards gardés au laboratoire seront relâchés sur le lieu de capture des adultes dès la métamorphose. L'étude concerne donc 80 individus adultes et 240 têtards (soit un total de 320 animaux). Un test de puissance (1-β) ainsi que nos travaux précédent valident que ces tailles d'échantillon sont suffisantes pour détecter des différences significatives. Les données obtenues seront analysées grâce aux techniques statistiques classiques : des modèles linéaires généralisés qui permettent de comparer des variables entre plusieurs groupes. Lorsque les analyses requièrent l'utilisation de plusieurs données par individus (parents), des modèles mixtes seront utilisés pour tenir compte de la non-indépendance des données (identité parentale en facteur aléatoire).
Raffinement
Tout au long des procédures, les adultes, les oeufs et les têtards disposeront de conditions de maintien en captivité optimisées. Les conditions d'hébergement sont adaptés aux différents stades. Le choix des dimensions des différentes boites sont tirées de la réglementation en vigueur ou de notre expertise et/ou celle de collègues quand ces informations ne sont pas disponibles. Les boites de transports permettent de limiter l’amplitude des déplacements (et donc le stress) pendant le transport. Les bacs de ponte dépassent la taille requise pour le 1/3 d’habitat aquatique requis pour les amphibiens terrestres de cette taille. Les têtards seront maintenus dans des aquariums dédiés, dans des conditions thermiques optimales (régime stable à 17°C), l'eau sera changée de façon hebdomadaire et les individus auront un accès à la nourriture ad libitum, sans compétition, sans prédation. Un suivi journalier de l'état de chaque individu et de son aquarium sera effectué. L'avis du vétérinaire référent sera sollicité le cas échéant.
Choix des espèces
L'étude de l'influence de la salinité environnementale sur les performances de reproduction a des implications importantes à la fois pour la recherche fondamentale en écologie et la recherche appliquée. Ce projet porte spécifiquement sur le crapaud épineux (Bufo spinosus), une espèce largement répandue à la fois en zones cotières et en zones continentales, ce qui en fait un modèle particulièrement bien adapté à nos investigations. Il n'existe pas d'alternative à l'utilisation d'un modèle animal pour cette étude. Il est nécessaire d'obtenir les oeufs dès la ponte pour éviter qu'une fraction significative du développement embryonnaire n'ait lieu dans des conditons non-maitrisées (i.e., sur le terrain) et pour évaluer de manière robuste les effets des traitements expérimentaux de salinité dès le début du développement embryonnaire. Dans ce cadre, il est indispensable d'obtenir les pontes au laboratoire. En outre, cela permet d'inclure des variables parentales (taille, masse corporelle) dans nos investigations. la salinité des milieux côtiers s'exprime en particulier sur les mares dans lesqeulles les amphibiens se reproduisent. Il est donc indispensable d'intégrer les effets de cette salinité environnementale sur le développement larvaire de ce groupe.
Etude du microenvironement dans les cancer pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur induit chez elles un cancer du poumon par instillation dans la trachée, puis administre des injections répétées pendant deux mois pour étudier si la rigidité de la tumeur modifie la réponse à l'immunothérapie. Il reconnaît que sa manipulation peut augmenter la dissémination des métastases et fixe un point limite à 10 % de perte de poids. Il affirme que les cultures cellulaires ne récapitulent pas la complexité de l'organe et qu'il faut "valider in vivo".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer si la modulation de la rigidité matricielle impacte la réponse des cancers pulmonaires aux immunothérapies et ce de plusieurs façons : 1)Soit en inhibant notre protéine d'interet (impliquée dans le remodelage de la matrice extracellulaire) au niveau des cellules tumorales à l’aide des modèles KRASG12Dfl/+ et KRASG12Dfl/+, p53fl/fl. Ces modèles sont très bien documentés et bien caractérisés. 2)Soit en inhibant cette protéine au niveau des fibroblastes pulmonaires à l’aide du modèle FSP1Cre. Ce modèle a été très bien décrit. Notre hypothèse de travail étayée par de nombreux résultats obtenus au laboratoire est que la modulation du microenvironement matriciel pourrait impacter la réponse de ces cancers à l’immunothérapie. Ce projet a été évalué de manière positive par plusieurs comités d'experts, des financements ont déjà été obtenus.
Bénéfices attendus
L'immunothérapie est une arme thérapeutique actuellement en plein essor dans le cancer du poumon. Néanmoins, bien que prometteuse pour certains patients, une grande majorité de patients ne répondent pas ou peu à l'immunothérapie. Notre projet, base sur des résultats préliminaires solides permettrait de mettre en évidence un levier thérapeutique potentiel. Non seulement CD98hc pourrait être un marqueur de résistance mais aussi une cible thérapeutique potentielle.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - instillation intratrachéale (1x au début de l'expérience - durée de l'intervention: 2 minutes) - injection intrapéritonéale (2x par semaine pendant 2 mois- duréee de l'intervention 1minute) - prélèvement sanguin (toutes les deux semaines pendant 2 mois - durée de l'intervention: 10 min) - injéction sous-cutanée (1x au début de l'expérience- durée de l'intervention: 10 min) Pour chaque intervention les animaux seront anesthésiés afin de diminuer le stress.
Impact sur les animaux
Il a été démontré que le "softening de tumeur" pourrait augmenter les metastases. En modulant l'expression de la protéine d'interet dans le compartiment tumoral ou dans le microenvironnement, le risque est une augmentation de la dissemination tumorale dans le groupe controle. C'est pourquoi nous allons suivre les cellules tumorales circulantes régulierement et analyser les differents organes en coupe histologique. Le marque mTmG pourrait également etre utile dans la détection des métastases.
Devenir
A la fin de l'étude, nous devons analyser la taille, le nombre et le grade des tumeurs pulmonaires. Les animaux seront tous euthanasiés en fonction des cinétiques de chaque procédure.
Remplacement
L’utilisation de lignées cellulaires humaines et murines seront utilisées dès que possible. Quelques publications décrivent les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude de l'initiation tumorale. Elles sont actuellement mises en place et seront envisagées aussi souvent que possible. Cependant, ces cultures sont encore très expérimentales et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe, c’est pourquoi nous avons besoin maintenant de valider nos résultats in vivo en ayant recours à des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum (analyse statistique prédictive selon la méthode de Monte-Carlo). Nos groupes expérimentaux sont composés de 20 animaux (12 animaux pour l’étude statique et 8 animaux pour les analyses de cytométrie, d’extraction d’ARN et d’extraction protéique) en accord avec la pénétrance de la procédure et aucune distinction de sexe n’est nécessaire. Néanmoins, si après l'analyse de la première expérience nous constatons une différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons alors que l'un ou l'autre des sexes en fonctions des résultats obtenus.
Raffinement
Ces expériences ont été pensées en tenant compte du bien-être animal. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect de la réglementation européenne en cours afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront également suivis périodiquement à l’aide d’une fiche de score. Toute alteration de la respiration (plus rapide, plus lente), ainsi qu'une perte de plus de 10% du poids de la souris sont considérés point limite entrainant la mise a mort de l'animal.
Choix des espèces
La mutation KRAS représente environ 25% des adénocarcinomes pulmonaires, la mutation p53 représente 50 à 70% de ces cancers. Ainsi, l'utilisation de ces modèles murins (KRAS G12Dflox/+ et KRAS G12Dflox/+; p53flox/flox) permet une bonne représentation génétique des cancers pulmonaires humains. Une comparaison pourra être établie entre nos travaux et la littérature abondante dans ce domaine. Ce modèle permet une très bonne approche des processus impliqués dans la l’initiation et la progression tumorale. Dans cette étude, nous utiliserons des souris agées d'au moins 3 semaines.
Création d’une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 700 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, destinées à d'autres protocoles selon leur phénotype, celles n'ayant pas le profil recherché étant tuées. Le porteur croise deux lignées génétiquement modifiées pour obtenir des souris exprimant une molécule d'étude sur leurs lymphocytes T. Chaque petit est identifié par une boucle d'oreille sous anesthésie, puis phénotypé par prise de sang à la mâchoire ou au sinus rétro-orbitaire. Il affirme que ce passage in vivo est une étape "indispensable" avant le recours aux gros animaux puis à l'homme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer le rôle d'une molécule spécifique sur la biologie des Lymphocytes T in vivo. CEtte molécule n’est pas exprimée chez les rongeurs, nous avons donc fait modifier génétiquement des souris de fond C56BL/6 afin que l’expression son expression soit sous le control du promoteur du CD3e, ainsi tous les Lymphocytes T exprimeront la molécule d'étude. Son ligand, est une molécule ubiquitaire, présent chez la souris mais la protéine étant légèrement différente, nous avons choisi de faire développer des souris hybrides exprimant la portion extracellulaire de la version humain du ligand tout en gardant la portion intracellulaire de la version murine de cette molécule. Cette souris « hybride » a également été créée sur un fond C56BL/6. Nous souhaitons désormais croiser ces 2 lignées pour obtenir des souris Hybrid pour le ligand exprimant également la molécule d'étude.
Bénéfices attendus
Une fois obtenues, ces souris seront incluses dans des projets ou le système immunitaire sera chalengé et le rôle de notre molécule d'intérêt sera évalué grâce au développement d’Ac bloquant spécifiquement l’interaction de la molécule à son ligand (version extra cellulaire humaine et intracellulaire murine) et déjà validés in vitro.
Procédures
Lors du sevrage, les souriceaux seront identifiés par la mise en place d'une boucle d'oreille numérotée. Pour cette mise en place l'animal reçoit une dose de charge d’Isoflurane. En fonction du caractère récessif ou dominant des modifications génétiques, et du génotype des parents les petits seront ou non phénotypés par analyse des cellules sanguine. Cette prise de sang sera réalisée soit, sur des animaux vigiles au niveau mandibulaire ou sur des animaux anesthésiés au niveau du sinus rétro-orbitaire sur animal anesthésié et ayant reçu une goutte de Tétracaine 1% .
Impact sur les animaux
Ce nouveau phénotype ne devrait pas engendrer d’effet nuisible pour les souris
Devenir
Les souris issues de l’élevage seront incluses dans des expériences en fonction de leur phénotype ou bien sacrifiées si le phénotype escompté n’est pas obtenu.
Remplacement
Des données préliminaires in vitro ont été obtenues mais le rôle exact de la molécule que nous étudions n’a pas encore été totalement clarifié. Un passage à l’in vivo dans des souris génétiquement modifiées pour exprimer les molécules d’intérêts permettra de mieux comprendre le rôle de ces molécules et les conséquences de leur blocage spécifique. Il s’agit d’une étape indispensable avant le passage aux gros animaux puis à l’homme.
Réduction
L’élevage sera dimensionné en fonction des expérimentations prévues.
Raffinement
Les couples seront hébergés dans des cages contenant des frisottis papiers et du coton leur permettant la nidification. Une fois sevrées, les souris seront hébergées dans des cages contenant des frisottis papiers. Une surveillance journalière par les animaliers nous permettra de surveiller que les souris n’ont pas de phénotype dommageable. La prise de sang pour phénotyper les souris sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 4%/air comprimé) en ayant préalablement déposé une goutte de Tétracaïne 1% collyre.
Choix des espèces
Les souris issues de cette nouvelle lignée seront ensuite incluses dans des protocoles que nous maitrisons pour questionner le système immunitaire. La molécule d’intérêt pourra ou non être bloquée à l’aide d’Ac spécifiques pour questionner son rôle dans différentes situations expérimentales mettant en jeux le système immunitaire. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5-6 semaines pour maintenir l’élevage
Conception de modèles d’hémopathies malignes chez la souris immunodéprimée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur greffe à des souris immunodéprimées des cellules humaines rendues cancéreuses, puis suit la prise de greffe par des ponctions dans le fémur sous anesthésie chaque mois, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Il indique surveiller la perte de poids, une croissance tumorale pouvant s'accompagner de nécrose ou d'ulcère cutané. Il affirme avoir "besoin" d'un "organisme entier" pour étudier le développement des tumeurs et conclut que la souris n'est remplaçable par aucune autre méthode.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la conception de deux modèles de cancer du sang, associés a des altérations chromosomiques, chez des souris immunodéprimées. Pour cela les souris recevront des cellules humaines exprimant, après manipulation, des acteurs clés de la transformation d'une cellule normale en cellule cancéreuse. Ce projet se déroulera uniquement après validation in vitro du caractère cancéreux des cellules générées afin de limiter le nombre d'animaux nécessaires à ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra pour la première fois le développement de deux modèles de cancer du sang associés à des altérations chromosomiques. En mettant à jour le rôle clé de certaines molécules, iIl pourrait mettre en évidence de nouvelles combinaisons thérapeutiques. pour ces deux cancers.
Procédures
La greffe chez les souris recevant une injection par voie retro-orbitale sera suivie par ponction médullaire tous les mois. En pratique les souris sont anesthésiées sous anesthésie gazeuse, après désinfection à l'alcool de la patte, un trou est effectué dans le fémur, la ponction s'effectue par aspiration dans ce trou à l'aide de seringue . Au moment opportun les souris seront sacrifiées par dislocation cervicale pour être disséquées
Impact sur les animaux
La prise de greffe devra etre surveillée car elle peut engendrer une perte de poids importante et rapide et une modification du comportement des animaux. Une croissance tumorale en sous-cutanée peut etre également associée à une nécrose/ulcère de la peau. Ainsi, après toute application d'une procédure, les critères de surveillance généraux seront appliqués : une perte de poids atteignant les 20%, un comportement anormal grave, un arrêt d’alimentation, une baisse de la température corporelle ou un mutisme de plus de 24 h conduiront à un arrêt de l’expérimentation. Dans ce cas, l’animal sera immédiatement euthanasié.
Devenir
A la fin de l'expérimentation, euthanasie par dislocation cervicale.
Remplacement
La souris est le modèle expérimental le plus utilisé dans la littérature pour l’étude de la tumorigenèse et pour évaluer les effets de molécules anti-cancéreuses. En effet l'expérimentation in vivo est non substituable à aucune autre méthode car nous avons besoin d'un organisme complet pour étudier le développement des tumeurs. Les expériences sur les souris ne sont faites que après avoir testé in vitro les differents ARN non codants et la translocation NPM_ALK. Seuls les « acteurs » ayant un intérêt biologique seront testés sur l'animal. Cette étape est nécessaire en cancérologie car il est crucial de connaitre le devenir des cellules cancéreuses dans un organisme entier afin d'étudier les risques de genèse, de metastases ou de rechutes après traitement.
Réduction
Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée afin d'optimiser nos protocoles pour réduire au maximum le nombre d'animaux. Des études statistiques nous permettent également de déterminer le nombre minimum de souris nécessaires afin que l'expérience ait une valeur scientifique et n'est pas besoin d'être reproduite.
Raffinement
L'évaluation quotidienne de la souffrance nous permet de déterminer si l'expérience doit être arrêtée. Pour cela des points limites et une methode d'évaluation pour la prise en charge des animaux sont identifiés. Les experimentations seront réalisées sous anesthésie et avec utilisation d'analgésie.
Choix des espèces
La souris est le modèle expérimental le plus utilisé dans la littérature pour l’étude de la tumorigenèse et pour évaluer les effets de molécules anti-cancéreuses. En effet l'expérimentation in vivo est non substituable par aucune autre méthode car nous avons besoin d'un organisme complet pour étudier le développement des tumeurs. Ce modèle expérimental nécessite l’utilisation d’animaux immuno-déprimés (pour permettre la croissance des cellules humaines). La souches murine de référence pour l’implantation des cellules primaires humaine et les cancers hémathologiques est la souris NSG. Animaux adultes à partir de 6 semaines. L’utilisation d’animaux adultes est justifiée par le fait que les deux hémopathies malignes que nous étudions sont des cancers de l'adulte.
Analyse de l’activité et la physiologie de l’aorte descendante chez le rat chez la descendance suite à un régime hypercalorique maternelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
277 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie réutilisée pour d'autres projets et le reste tué pour prélèvements. Des rates sont soumises à un régime gras avant et pendant la gestation, puis leur descendance est suivie de la naissance au sevrage pour étudier les effets sur l'aorte et le métabolisme. Le porteur décrit des prélèvements de sang répétés à la queue et des mesures de pression artérielle, et fixe un point limite à 20 % de perte de poids chez les adultes. Il affirme qu'une culture cellulaire ne reproduirait pas la complexité de ce tissu et juge certaines expérimentations "absolument indispensables".
Objectifs
La programmation foetale est un concept qui montre la relation entre le faible poids de naissance et le développement de maladies métaboliques à l'âge adulte telles que les maladies cardiovasculaires, le diabète, le syndrome métabolique, l'obésité et l'hypertension. Les individus qui avaient un faible poids de naissance et qui sont restés petits au début de l'enfance ont rapidement développé une hypertension. Le rebond précoce de l'adiposité est fortement lié à un indice de masse corporelle élevé au cours de l'enfance qui s'est avéré être le facteur de risque du diabète de type 2. Bien que ces maladies ont une part génétique, il y a également une part environnementale. Un régime maternelle hypercalorique (enrichi en graisse) pendant la grossesse va avoir des conséquences sur la descendance. Ce régime aura des impacts directs sur l'ensemble des gènes de la descendance mais également lors de son développement par sa nutrition via le placenta en favorisant l'hyperméthylation du génôme. En effet, l’état nutritionnel de la mère pendant la gestation et/ou la lactation, sont des déterminants clés du développement foetal et postnatal. Dans notre étude nous allons utiliser un modèle de rates Wistar nourries en régime gras pendant 2 mois qui nous permettra d'étudier les conséquences fonctionnelles et métaboliques au niveau des vaisseaux sanguin pendant des périodes spécifiques de développement embryo-foetal. Le projet vise à répondre aux questions: un régime précoce en régime gras entraîne-t-il des modifications de la structure et de la physiologie de l’aorte ? Quels seraient les mécanismes moléculaires et tissulaires responsables de ces éventuelles modifications ? Existe-t-il des fenêtres d'exposition critique pour expliquer l'apparition des altérations moléculaires? L’objectif du projet est d’évaluer l’intégrité des fibres élastiques (élastogenèse et élastolyse) en tant que facteur déterminant des fonctions vasculaires chez la progéniture issue de mère nourie avec un régime riche en gras.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de la mise en place de la matrice extracellulaire vasculaire chez le rat et par extension à l'Homme. Ces connaissances fondamentales permettront d'appréhender de façon plus précoce les maladies cardiovasculaires d'un point de vue vétérinaire et humaine mais aussi d’identifier les phases d’exposition critique pour la descendance.
Procédures
Pour la procédure 1: dans la cadre d'une prévention la glycémie sera mesurée tous les 7 jours en prélevant 10 μl de sang par incision (< 2 mm) d’une veine de la queue. La glycémie devra être située entre 50 et 400 mg/dl. Les rats n'étant pas à jeun les valeurs sont plus élevées. Pour la procédure 2: la pression artérielle sera mesuré de manière non invasive sur animal vigile pour les ratons de 21jours. Cette mesure ne provoque aucune douleur ni prélévement.
Impact sur les animaux
L’objectif est d’obtenir un déséquilibre métabolique dont les conséquences chez les ratons nés de mères surnutri nous sont déjà connues : hypertrophie myocardique, stéatose hépatique, troubles du développement du système nerveux central, diabète... Pour les femelles surnutrie nous obtiendrons un surpoids et pas d’IRES (insulino-résistance) pour un régime de 2 mois.
Devenir
Pour les animaux sous régime HFD, Un retour a un état physiologique d'origine étant trop compliqué après un HFD. Les femelles progénitrices HFD (16 femelles/phase => 4 phases 21jours, 14jours, 7 jours et 24H => 64 femelles HFD) seront euthanasié et les organes seront prélévés. Les animaux sous régime normal (les males progéniteurs 13, 3-4/phase et les femmes progénitrice 40, 10femelles/phase) seront réutilisé pour d'autre projet de recherche ou enseignement. Les ratons témoin et HFD seront euthanasié pour prélèvements. Les ratons surnuméraires obtenus seront réutilisés pour d'autre projet de recherche ou enseignement.
Remplacement
Nous souhaitons étudier les conséquences d’une sur-nutritionnelle maternelle (régime riche en graisse HFD) sur le développement et la fonction de l’aorte descendante chez la descandance. Un modèle de cultures cellulaires ne permet pas d’étudier la complexité et la dynamique de ce tissu.
Réduction
Les procédures ont été réalisées afin de se limiter aux expérimentations jugées absolument indispensables pour cette étude. Une réflexion biostastistique (G-power) a été intégrée à la création de ce projet afin de réduire le nombre d’animaux tout en assurant la fiabilité scientifique. En raison de la petitesse des animaux et des approches biochimiques, moléculaires ou d'imagerie envisagées nécessitant une quantité certaine de matériels, nous constituerons des groupes d’étude à raison de 20 individus. De plus, entre chaque procédure, un système GO/NOGO sera mis en place afin d’utiliser le nombre d’animaux strictement nécessaire. Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un test Mann-Whitney.
Raffinement
En amont des procédures, les animaux seront hébergés dans des cages de dimensions réglementaires avec un enrichissement adapté. L’eau et la nourriture seront données de façon ad libitum. Les cycles de jour de 12h seront réalisés. Chaque protocole expérimental débutera par une période d'acclimatation de 2 semaines à nos locaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une procédure d’estimation de la douleur est mise en place (grille de score RAT GRIMACE SCALE). Le point limite est fixé à 20% de perte/prise du poids corporel (chez les adultes). En fin de protocole les animaux seront mis à mort et des prélèvements (sang aortes) seront effectués. D'autres tissus seront également prélevés et congelés pour d'autres projets scientifiques et pour l'enseignement. Les mâles reproducteurs et les femelles sous régime normal, seront replacés pour d'autres protocoles expérimentaux.
Choix des espèces
Le projet de recherche fait appel à des analyses physiologiques, biochimiques et moléculaires en lien avec des régimes nutritionnels spécifiques. Les rats Wistar sont classiquement utilisés dans la littérature scientifique pour ce type d’étude. Le projet se concentre sur les effets transgénérationnels dans les stades précoces de la vie du régime HFD responsable d'une hyperméthylation du génome de la descendance et vise en particulier à étudier les effets de cette hyperméthylation dans l'élastolyse, l'insuffisance cardiaque et le diabète. Nous regarderons donc les conséquences sur la descendance à 24h, 7J, 14J et 21J moment du sevrage. Les stades de développement utilisés sont: • Rats adultes pour le reproduction (13 males et 104 femelles) • Ratons nouveau nés maintenus à 21 jours, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle) • Ratons nouveau nés maintenus à 14 jours, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle) • Ratons nouveau nés maintenus à 7 jours, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle) • Ratons nouveau nés de moins de 24 heures, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle)
Mise en place d’un modèle de glioblastome opéré et validation par imagerie de bioluminescence. (EU porteur ; EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
28 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur greffe des cellules de glioblastome humain dans leur cerveau par chirurgie stéréotaxique, suit la tumeur par imagerie de bioluminescence sous anesthésie, puis pratique une ablation chirurgicale classée sévère. Il décrit un recours à des analgésiques et un hébergement en cage individuelle après l'opération, qui prive les souris de contacts directs. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne convient car le développement tumoral ne peut être appréhendé qu'in vivo.
Objectifs
Le projet se place dans le contexte clinique du traitement des tumeurs cérébrales très agressives : les glioblastomes. Si la tumeur est accessible, le traitement des glioblastomes commence par une ablation chirurgicale (ou exérèse), suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, l’ablation chirurgicale,ne permet dans la plupart des cas de n’enlever que partiellement la masse tumorale même si le bénéfice est indéniable. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet exploratoire se place dans un contexte de développement de modèles expérimentaux « in vivo » plus proches des conditions observées en clinique chez l’être humain. En effet, aujourd’hui, peu de modèles de glioblastome chez l’animal intègrent le traitement chirurgical de la pathologie. Nous souhaitons donc faire évoluer nos modèles pour nous rapprocher au mieux des stratégies thérapeutiques conduites chez l’Homme. Pour cela, notre laboratoire s’est doté d’un système d’imagerie original nommé « OptiMAX » permettant d’obtenir des images des tumeurs greffées chez la souris en « bioluminescence », c’est-à-dire par émission de lumière. En effet, nos cellules de glioblastome expriment la luciférase (lignées U87-Luc et U251-Luc ) et sont capables d’émettre un signal lumineux, que nous sommes capables de détecter et de quantifier grâce à notre appareil d’imagerie non invasive : ceci permet de suivre la croissance des tumeurs, et de détecter la présence de quelques cellules restantes. Cette technique a déjà été utilisée au laboratoire dans le cadre des projets précédents (Saisine APAFIS #22368-2019100915354084 v4 et Saisine APAFIS #26058-202006050946736 v5 pour les lignées respectivement U87-Luc et U251-Luc). Dans ce projet, l’imagerie par bioluminescence va nous permettre de suivre la première phase de croissance des tumeurs implantées et de définir le meilleur moment pour réaliser l’intervention chirurgicale, puis de valider la présence de cellules tumorales résiduelles après l’opération. Enfin, nous allons pouvoir ainsi caractériser la reprise de la croissance après chirurgie.
Bénéfices attendus
La transposition de la chirurgie d'exérèse (stratégie utilisée classiquement en clinique) et du phénomène de récidive sur modèle animal permettra de se placer dans les mêmes modalités qu'en clinique. La maitrise de cette technique est indispensable pour caractériser par la suite le phénomène de résurgence et évaluer l'implication de l'environnement tumoral dans ce phénomène. Une meilleure compréhension des processus associés à la résurgence tumorale sont indispensable pour le développement ultérieur de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
-Procédure 1: Xenogreffe intracérébrale stéréotaxique de cellules U87-Luc, U251-Luc : réalisé une fois au début de l'étude (durée de 1h) -Procédure 3 : Chirugie d'exerèse tumorale : réalisé une fois au milieu de l'étude (durée 1h)
Impact sur les animaux
Chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux (cf procédure 3) avec mise en place de soins post-opératoires rigoureux. Hébergement en cage individuelle après la chirurgie d'exerèse pouvant conduire à un stress des souris (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes.
Devenir
- Procédure 1 : Xenogreffe intracérébrale stéréotaxique de cellules U87-Luc, U251-Luc : animaux gardés en vie - Procédure 2 : Suivi par imagerie par Bioluminescence : animaux gardés en vie sauf si un des points limites cités précédemment a été atteint ou dans le cas d'un animal satellite mis à mort 3 jours après avoir retiré la tumeur en vue d'analyses histologiques - Procédure 3 : chirugie d'exérèse : animaux gardés en vie
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse à la chirurgie d’exérèse de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (influence du microenvironnement tumoral, activation de la microglie et des astrocytes, envahissement du parenchyme cérébral, angiogenèse...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules endothéliales, stroma...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Les données issues des études précédentes (Saisine APAFIS #22368-2019100915354084 v4 et Saisine APAFIS #26058-202006050946736 v5 pour les lignées respectivement U87-Luc et U251-Luc) nous ont permis de réaliser un premier suivi en imagerie de la croissance des lignées -Luc citées précédemment implantées en stéréotaxie, en l'absence de stratégie de traitement (groupe contrôle). Les données générées seront donc exploitées et permettront de réduire le nombre d'animaux utilisé dans les séries sans exérèse (5 souris par lignée au lieu des 8 nécessaires dans les séries avec exerèse)
Raffinement
La validation de la chirurgie d'exérèse partielle de la tumeur ainsi que le phénomème de résurgence par imagerie par Bioluminescence nécessite un suivi longitudinal des souris. Chaque animal sera son propre témoin ce qui constitue une stratégie permettant une utilisation judicieuse des animaux et assure une rigueur scintifique
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris athymiques présentant une lymphopénie T, sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines du fait leur immunodéficience, il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des souris femelles plus sociables, pour faciltier l'hébergement collectif. Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie de Paxinos et Franklin. George Paxinos, Keith B.J. Franklin, MA, PhD (eds). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 3rd Edition. Elsevier Science Publishing Co Inc, (2007).
Rôle de PRL2 dans le développement de glioblastome primaire et récurrent chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit l'implantation d'une tumeur cérébrale, sa résection chirurgicale, une irradiation et une chimiothérapie reproduisant le protocole administré aux patients, avec suivi par bioluminescence. Il indique que la tumeur et les traitements peuvent provoquer désorientation, perte d'équilibre, troubles de la mémoire et de l'apprentissage, les animaux étant tués par dislocation cervicale. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun test in vitro ne récapitule le microenvironnement tumoral et présente l'implantation chez la souris comme "indispensable".
Objectifs
Le projet vise à élucider le rôle de la phosphatase PRL-2 dans le développement de tumeurs cérébrales (appelées glioblastomes) primaires et récurrentes. La famille de gènes des protéines Tyrosine Phosphatases (PTP) comprend plus de 107 gènes dans le génome humain, dont beaucoup jouent un rôle important dans les cancers humains (PTEN et PTP1B). Dans cette famille, PRL-2 a été identifiée comme une protéine oncogène (qui stimule la tumeur) dans de nombreux types de cancer. Supprimer PRL-2 dans les cellules cancéreuses du sein entraîne une diminution de la croissance tumorale. Puisque PRL- 2 est élevée dans le glioblastome, nous avons examiner la contribution de cette phosphatase dans le développement de ce cancer. Nous avons observé que PRL-2 fournit une importante propriété cancéreuse aux tumeurs cérébrales et contribue au faible pronostique de survie chez les patients. L'inhibition de PRL-2 serait alors une nouvelle stratégie thérapeutique potentielle pour les tumeurs cérébrales. En utilisant l'implantation des cellules tumorales chez la souris, nous examinons l'agressivité des lignées cellulaires tumorales lorsque l’expression de PRL-2 est modifiée dans la souris (vaisseaux sanguins) ou dans les cellules tumorales. Aussi, après de nombreuses expériences préliminaires in vitro, et in vivo avec nos modèles de greffe de tumeurs, nous voulons valider nos modèles d’étude de radiothérapie et chimiothérapie (traitement temozolomide (TMZ) utilisé chez les patients) sur un minimum d’animaux in vivo pour tenir compte du contexte physiologique, du microenvironnement et répondre à la problématique des chirurgiens. En plus de la chimio-radio thérapie, nous inclurons une resection de la tumeur c'est à dire nous opérerons à nouveau les souris portant une tumeur afin de retirer cette tumeur. La resection tumorale combinée à la radio et chimio thérapie sont le traitement standard des tumeurs chez les patients correspondant au protocole de Stupp. Après ce traitement la majorité des tumeurs ont une récurrence. La proposition de recherche fournira une compréhension plus globale de PRL-2 dans le développement agressif du glioblastome primaire et récurrent.
Bénéfices attendus
Ce projet est en complément d'un précédent projet visant à étudier le role de PRL2 dans le développement de tumeur cérébrale. Ici, nous élargirons nos résultats à des conditions plus proches de ce qui est observé en clinique chez les patient, ce qui constitue un bénéfice pour l'étude du role de PRL2 dans la récurrence des tumeurs cérébrales. Pour cela, nous allons appliquer le protocole thérapeutique des patients, le protocole de Stupp, aux modèles murins. Ce protocole consiste en la resection de la tumeur primaire puis traitement par radio et chimiothérapie. Grace à cette étude, on pourra valider PRL2 comme une nouvelle cible thérapeutique afin d'améliorer le traitement des patients.
Procédures
Injections de tamoxifène en intrapéritonéale pendant 8 jours (moins d'une minute par souris). Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales: une implantation de tumeur (10 min), une resection tumorale (10 min). Irradiation (10min). Injection de temozolomide (2 par jour pendant 8 jours non consecutifs). Suivi par bioluminescence: 6-25 min, une à deux fois per semaine.
Impact sur les animaux
Douleur légère mais répétée d’injections intrapéritonéales avec plusieurs molécules sans effet secondaire pour le tamoxifène. L'irradiation et le témozolomide peuvent induire des symptomes ressemblant à l'anxiété, des troubles de la mémoire spatiale et d'apprentissage chez la souris. Les souris seront exposées à des douleurs post chirurgies à l’issue des 2 stéréotaxies. Le développement de tumeurs cérébrales peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes neurologiques invalidants (désorientation, désequilibre). De manière générale, chaque manipulation est génératrice de stress.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale car tous les animaux sont utilisés pour l'impantation tumorale qui conduit aux points limites décrits précédemment.
Remplacement
Nous avons déjà mis en évidence par des tests fonctionnels in vitro que PRL2 est impliquée dans les caractéristiques oncogéniques de cellules de glioblastome humaines. Or, nous savons que le microenvironnement tumoral est une composante essentielle à la régulation de la tumeur. Bien que des tests in vitro existent pour mimer ce microenvironnement, aucun n'est capable de récapituler précisément ce qu'il se passe in vivo. L'implantation de tumeur chez la souris est donc indispensable pour tenir compte de la structure 3D, de la composition chimique, de l'interaction avec d'autres types cellulaires, avec la matrice extracellulaire, avec le flaux sanguin.
Réduction
Les études statistiques seront réalisées grâce au test Anova car nous comparons en général plus de 2 groupes, c'est donc le test statistique adapté à ce type d'expérience. Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons calculé sur le logiciel R le nombre minimal de souris par groupe pour atteindre de bons résultats statistiques, et c'est 8 souris pour le Kaplan-Meyer (atteinte de points limites). Nous prevoyons donc 10 souris par groupe pour éviter de finir une expériences avec moins de 8 souris par groupe en cas de problème pendant la procédure. Enfin, femelles et mâles seront utilisés. Par ailleurs, nos modèles murins de tumeurs se développent de manière très reproductible, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences.
Raffinement
Durant les expériences, nous assurons un confort des animaux (gel sur les yex pour éviter de désèchelent durant l'anesthésie, tapis chauffant pour réguler la température corporelle). Des enrichissements (cocons et maisons rouges) sont placés dans les cages en tout temps et les hébergements sont collectifs. Nous assurons un suivi des animaux tout au long du projet, quotidiennement. Ceci nous permet de prendre en charge toutes les douleurs par une médication adaptée. Pour cela, nous utilisons des points limites spécifiques et adaptés à notre modèle (tumeur cérébrale). Nous procédons selon un arbre décisionnel évitant des souffrances inutiles grâce à des critères d’arrêt de l'expérimentation suffisamment précoces.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle Rag gamma2C-/- car il permet d'implanter des tumeurs humaines sans que le système immunitaire ne rejette la greffe. La greffe récapitule la tumeur observée chez des patients. Les deux autres lignées murines sont immunocompétentes, elles possèdent toutes les cellules immunitaires. Elles permettent d'etudier le role du microenvironemment dans le développement tumoral. Dans tous les cas, nous utilisons des souris de 7 à 9 semaines (adultes). Les expériences peuvent durer longtemps et nous voulons que le vieillissement n'intervienne pas dans le développement de la tumeur et le maintien en forme des souris.
Programme d’immunisation de souris en vue du développement d’anticorps monoclonaux.
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.
Objectifs
Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.
Bénéfices attendus
Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).
Procédures
4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle
Raffinement
Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.
Choix des espèces
La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole