Oncologie

3 045 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une protéine contre l'anorexie liée aux chimiothérapies ou au stress. Selon les groupes, elles subissent une microcoupure hebdomadaire de la queue, jusqu'à six injections intraveineuses, une contention de deux heures par jour pendant deux fois quinze jours, un jeûne de 48 heures ou l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique. Le porteur présente la perte de poids comme le principal effet indésirable et qualifie le stress lié à la contention et au jeûne de transitoire. Toutes les souris sont mises à mort pour prélever leurs organes.

Objectifs

Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim, stimulant le comportement alimentaire par des mécanismes périphériques. Cette protéine agit comme un stimulateur lipogénique et un stimulateur de l'appétit efficace chez la souris. De plus, il a été montré que son injection chez la souris entraine une inhibition du processus autophagique. Une étude bio-informatique à montrer l’existence de plusieurs isoformes exprimées de façon différentielle dans l’organisme de la souris. Cette protéine apparaît comme un candidat d'intérêt dans la lutte contre l’anorexie du fait de son expression ubiquitaire, de ses liens avec la régulation centrale de l'appétit et de son rôle dans le métabolisme des lipides. L’objectif de ce projet est donc d’étudier et de déterminer si la présence de cette protéine (en fonction de son mode d’administration) peut empêcher : (i) l’anorexie (perte ou la forte diminution de l'appétit) associée aux traitements avec des agents chimiothérapeutiques ; (ii) ou l’anorexie associée à un stress psychologique/physique important.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à l’anorexie induite par les chimiothérapies ou par un stress mental trop important dans l'espèce humaine. Ceci pourrait avoir des retombées thérapeutiques dans ces cas par la suite.

Procédures

Sur tous les animaux, une microcoupure de 1mm de l’extrémité de la queue sur animal vigile au début de l’expérience sera réalisée pour analyse sur le sang (durée: quelques secondes), puis une fois par semaine pendant 46 jours. Pour certains animaux, au maximum 6 injections i.v. par souris (20 secondes) ou une injection intravasculaire hydrodynamique par souris (6-8 secondes). Pour d'autres animaux : 1 contention de 2h par jour pendant deux fois 15 jours dans un cylindre acrylique permettant la respiration. Pour d'autres animaux: Une période de jeûne de 48h et 1 injection intranpéritonéale (20 secondes). Pour une des procédures, les souris subiront une chirurgie légère par implantation de pompe osmotique sous anesthésie générale avec analgésie (durée 15 minutes).

Impact sur les animaux

L’ effet indésirable principal prévu pour les animaux est la perte de poids. Les animaux seront transitoirement stressés lors des périodes de contentions de 2 heures ou les périodes de jeûne.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Les tests statistiques utilisés seront des tests « LogRank » pour la survie, et des tests « Anova » pour la perte ou la récupération de poids.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie et analgésie des animaux pour toutes les procédures expérimentales (locale ou générale selon les cas), utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...). La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. Du fait du but des recherches prévues, les animaux seront au stade adulte, étant des bons modèles pour les maladies à étudier. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

720 souris et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour élever et infecter des moustiques Anopheles vecteurs du paludisme. Les lapins sont exposés vingt minutes par semaine pendant six mois aux piqûres d'environ 500 moustiques femelles, les souris à quarante piqûres par semaine pendant deux mois, certaines étant en outre infectées par des parasites Plasmodium. Le porteur présente ces piqûres et les prélèvements de sang associés comme les seuls effets indésirables. Il justifie le gorgement sur animaux vivants par la difficulté de certaines lignées à se nourrir sur membrane, et met à mort lapins et souris à l'issue de chaque cycle.

Objectifs

L’objectif du projet est de produire régulièrement des moustiques femelles du genre Anopheles pour l’étude des interactions Plasmodium-Anopheles. Selon les questions scientifiques, il s’agira soit de colonies bien établies, soit de nouvelles lignées récemment établies ou à établir à partir de populations sauvages. Trois programmes scientifiques sont en cours. Programme 1 : Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae (souche Yaoundé) conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants. Programme 2 : Analyse fonctionnelle de gènes d’Anopheles arabiensis dont l’expression est régulée par P. falciparum et Plasmodium vivax. Programme 3 : Infection d’Anopheles darlingi par P. vivax pour le cyclage au laboratoire de ce parasite.

Bénéfices attendus

Globalement, le projet contribuera à une meilleure compréhension des interactions Anopheles-Plasmodium avec pour objectif principal la recherche de stratégies nouvelles et innovantes pour lutter contre la transmission du paludisme. Spécifiquement le programme 1 (Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants) doit permettre d’identifier des facteurs de type épigénétique impliqués dans la susceptibilité du moustique Anopheles gambiae, vecteur majeur du paludisme en Afrique sub-saharienne, à P. falciparum et guider vers le choix de nouvelles stratégies de contrôle des populations de ce moustique sans avoir recours à des insecticides. Le programme 2 a pour objectif une meilleure connaissance des gènes du moustique spécifiquement régulés par P. vivax, un parasite négligé mais d’importance croissante en Asie et Amériques et ainsi orienter les programmes de stratégie de blocage de la transmission de ce parasite, tel que des vaccins bloquant la transmission. Le succès du programme 3 (cyclage au laboratoire de P. vivax) ouvrira un pan nouveau de recherches, notamment pour agir sur les formes quiescentes du parasite au niveau du foie, sensibles à une seule famille de molécule (primaquine et tafénoquine), qui présente de nombreux effets indésirables chez les patients déficients en G6PD. Sur le plan transmission de P. vivax, ce programme permettra de compléter les études développées dans le programme 2, facilitant et accélérant la validation des gènes d’intérêt du moustique.

Procédures

Dans la procédure 1, les lapins sont exposés pendant 20 minutes à une cage contenant environ 1000 moustiques (donc seulement 500 sont des femelles), une fois par semaine, pendant 6 mois. Dans la procédure 1, les souris sont exposées pendant 20 minutes aux piqures de moustiques, à raison de 40 anophèles femelles par souris, une fois par semaine, pendant 2 mois. Dans la procédure 3, les souris reçoivent une injection intra péritonéale (quelques secondes), puis subissent un prélèvement d’un micro-volume de sang par une micro incision à l’extrémité de la queue de la souris à l’aide de ciseaux stérilisés (quelques secondes par prélèvement), puis sont exposées aux femelles adultes d’Anopheles, pour un repas de sang sous anesthésie générale (injection intrapéritonéale/ quelques secondes par injection ; repas sanguin pendant 30 minutes).

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables sur les animaux peuvent être dus à l’inconfort lié aux piqures par moustiques et la quantité de sang qu’il leur sera prélevé à cette occasion.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure : au bout de 6 mois pour les lapins, au bout de 2 mois pour les souris non infectées par Plasmodium, 3 à 5 jours après l’infection pour les souris infectées par des Plasmodium de rongeurs

Remplacement

Le choix de nourrir les moustiques sur animaux et non par gorgement sur membrane est guidé par la difficulté de lignées à se gorger sur membrane (An. arabiensis, An. darlingi) et l’impact potentiel d’altérer l’effet maternel étudié chez An. gambiae souche yaoundé (programme 1). En effet le comportement et la physiologie du moustique sont très sensibles à l’origine du sang, aux odeurs émises par les animaux et au mode de piqure. Par ailleurs des souris infectées par un Plasmodium de rongeur (P. berghei ou P. yoeli) sont utilisées comme substitut à des infections avec les parasites infectant l’homme (P. falciparum ou P. vivax) difficiles à produire au laboratoire.

Réduction

Le nombre requis d’animaux découle de la longue expérience de l’équipe qui veille à respecter les recommandations 3R. L’utilisation d’un même lapin au-delà de 6 mois résulterait à une production réduite de moustiques incompatible avec les objectifs scientifiques du fait de l’apparition d’un taux trop élevé d’anticorps anti-salive de moustiques ayant pour conséquence une perte de qualité des repas sanguin pour les moustiques et donc une perte en nombre de descendants moustique. Il en va de même pour les souris, auquel s’ajoute l’effet cumulé d’une anesthésie hebdomadaire qui amènerait à avoir recours à des doses d’anesthésiant plus importante et les conséquences possibles sur le bien-être de la souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales d’hébergement répondant aux normes européennes, avec une surveillance de l’état général (observation de la mobilité, du pelage, et de la couleur des oreilles) et du poids. Avant et après chaque repas sanguin des suppléments alimentaires sous forme de gel seront proposés aux animaux.

Choix des espèces

Le choix des lapins et souris pour maintenir ou produire des lignées de moustiques anophèles est guidé par la qualité du sang fourni par les animaux vivants et le fait que certaines lignées ne se gorgent que très faiblement à travers une membrane produisant des progénitures dont la taille est incompatible avec les programmes scientifiques. Le programme 1 interroge une composante épigénétique pour laquelle une modification du mode de gorgement des moustiques (Lapin versus poche de sang) pourrait être dommageable sachant que de nombreux paramètres peuvent être impliqués dans l’expression de signatures épigénétiques. Stade de développement des animaux : souris et lapins adultes jeunes car les animaux vieux sont difficiles à « piquer » et leur poids est trop important et pour les souris hôtes de Plasmodium, pour leur sensibilité aux parasites.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie locale, avec des prélèvements de sang, pour tester des molécules censées déclencher une mort des cellules cancéreuses reconnue par le système immunitaire. Le porteur décrit une croissance tumorale sous-cutanée dont il qualifie les nuisances de limitées. Il affirme que des tests in vitro existent mais n'évaluent pas la réponse immunitaire mémoire, juge l'animal vivant entier "indispensable", puis met à mort les souris pour prélever rate, ganglions et tumeur.

Objectifs

Le développement des tumeurs dépend fortement de l’interaction entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement, particulièrement avec les cellules immunitaires présentes comme les lymphocytes cytotoxiques. Ces dernières reconnaissent spécifiquement la tumeur via la présentation d’antigènes, qui sont de petites protéines spécifiques à la tumeur. Après avoir été activatés, les lymphocytes cytotoxiques peuvent détecter et détruire la tumeur. Le profil antigénique de la tumeur est donc un point déterminant dans la réponse anti-cancéreuse. Cependant, la présentation antigénique n’est pas suffisante pour produire une réponse immunitaire efficace ; d’autres paramètres sont requis. Les lymphocytes cytoxiques sont activés les cellules dendritiques, or lors de cet échange, des signaux co-stimulateurs sont requis pour finaliser l'activation. Ce paramètre est décrit comme l’adjuvanticité, et l'absence de ces signaux se traduit par l’échappement de la tumeur au près système immunitaire. Dans un contexte tumoral, l’adjuvanticité est décrite, entre autre, par l’émission de motifs moléculaires associés au danger (DAMPs). Ces DAMPs sont des biomolécules sécrétées lors de mort des cellules cancéreuses et causent une réponse inflammatoire locale. La mort cellulaire immunogène (ICD) est définie par l'induction d'un stress aux cellules cancéreuses, et aboutit à la mort de celles-ci, accompagnée de la libération de nombreux DAMPs. Ces DAMPs sont reconnus par les cellules dendritiques et initient une cascade cellulaire aboutissant à l'activation de réponse immunitaire anti-cancéreuse . Plusieurs études ont décrit certaines chimiothérapies et radiothérapies comme inductrices de mort cellulaire immunogène, ce qui renforce leurs effets thérapeutiques. Jusqu'à présent, peu de molécules ont été caractérisées comme inductrices de l’ICD. Or ces agents pourraient être pertinemment utilisés en thérapie combinatoire en oncologie, avec des immunothérapies par exemple, afin de renforcer la réponse immunitaire anti-cancéreuse, et à terme d’améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer la capacité de molécules à induire une vaccination contre 3 modèles tumoraux différents via une induction de la mort cellulaire immunologique. Cette mort cellulaire permet d’engendrer des populations de lymphocytes T spécifiques contre la tumeur. Ainsi les souris seraient vaccinées contre la tumeur étudiée, ce qui serait un bon modèle préclinique en vue de développer des stratégies identiques ou similaires dans l'espèce humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections durant toute la durée de l’expérience. Ces injections se feront après anesthésie locale sur l’un des deux flancs de l’animal, durée 5-10 minute. Du sang pourra être prélevé au niveau sub-mandibulaire après anesthésie sous anesthésie gazeuse (1 fois par semaine pendant la période entre la 1ère et la 2nde injection de cellules), durée: 2-3 minutes.

Impact sur les animaux

Croissance tumorale sur le flanc des souris, en sous-cutanée. Nuisances limitées liées à la présence de cette tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes (rate, ganglions drainants et tumeur) et d'étudier au mieux la réponse immunitaire mémoire mise en place.

Remplacement

Concernant cette étude, il existe des alternatives non-animales comme des tests elternatifs in vitro. Cependant ces alternatives nous permettent seulement de décrire la capacité de nos molécules à induire la mort cellulaire, or il nous est impossible d’évaluer leur capacité à engendrer une population celulaire spécifique. L'utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier la réponse immunitaire mémoire, et une potentielle vaccination complète contre les tumeurs étudiées. En effet, les relations entre les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires s’effectuent via différents organes, nécessitant toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Les traitements et procédures seront faits après tirage au sort et en aveugle. Afin réduire le nombre d’animaux, seules deux concentrations par molécule seront testées afin d’observer une vaccination in vivo. Ces deux concentrations seront déterminées au préalable via des tests de toxicité in vitro. Les témoins seront regroupés pour éviter la multiplication des groupes témoins lors du test in vivo en faisant toutes ces procédures en parallèle pour chaque modèle tumoral. Les résultats seront analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de réduire la douleur chez l’animal : - Les injections seront effectuées après anesthésie locale - Le milieu est enrichi afin de réduire le stress des animaux. - Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie gazeuse . - Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. De plus, le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. - Des points limite ont été définis a priori et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme - Les modèles de tumeurs existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implatation chez la souris est indispensable pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale dans sa globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines (travaux sur les cancers de l'adulte).

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une xénogreffe de tumeur dans le pancréas par chirurgie, parfois une seconde chirurgie d'exérèse, puis des injections de nanoparticules magnétiques, une exposition à des champs magnétiques et une irradiation, pour tester une destruction locale des tumeurs. Le porteur renvoie les retombées cliniques annoncées, sensibiliser des cancers résistants et abaisser les doses de chimiothérapie, au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme que la validation in vitro déjà obtenue doit maintenant passer par la souris, sans détailler d'alternative.

Objectifs

Les objectifs de cette étude consistent à analyser l’effet anti-tumoral de nanothérapies par ablation mécanique ou hyperthermie magnétique locales, consistant en l’injection de nanoparticules magnétiques suivie d’une application de champ magnétique alternatif à basse fréquence [amplitude 1 à 380 mT / Fréquence 0 à 20 Hz] ou haute fréquence [amplitude 1-50 mT, fréquence 100 à 350 kHz] en association ou non avec des agents chimiothérapeutiques, pharmacologiques ou un traitement radiothérapeutique.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur les nanothérapies pour des cancers incurables pour lesquels la clinique ne dispose pas ou peu de solutions thérapeutiques, tels que le cancer du pancréas. Ces stratégies nano-thérapeutiques pourront être associées aux traitements conventionnels (chimiothérapeutiques et radiothérapeutiques) et devraient sensibiliser ces tumeurs très résistantes à ces traitements. Les stratégies nanothérapeutiques pourraient également permettre d’abaisser la dose des traitements conventionnels (chimiothérapie, radiothérapie), réduisant ainsi leurs effets indésirables.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à une procédure chirurgicale permettant de réaliser des xénogreffes orthotopiques (intra-pancréatiques principalement, durée 15 minutes). Une seconde procédure chirurgicale sera éventuellement envisagée, consistant à l’exérèse de la tumeur principale (durée 30 minutes), antérieurement aux traitements nanothérapeutiques an association ou non avec un traitement chimiothérapeutique, pharmacologique ou radiothérapeutique, afin de mimer les conditions retrouvées en clinique humaine proposant les traitements anti-cancéreux après chirurgie. Les autres interventions consisteront en : 1) l’injection de nanoparticules, d’agents chimiothérapeutiques ou pharmacologiques (durée :

Impact sur les animaux

De nombreuses études in vivo utilisant des nanoparticules d’oxyde de fer ont été menées et permettront l’utilisation de ces nanoparticules (concentration, mode d’injection…) sont induire de nuisances sur les animaux. Il existe aussi des données sur l’utilisation des champs magnétiques. Ceux-ci peuvent induire quelques effets indésirables (notamment les champs à haute fréquence). Nous prévoyons de limiter les expositions en s’appuyant sur les données de la littérature pour ne pas induire de nuisances ou limiter les effets indésirables : les temps et séquences d’exposition ainsi que les paramètres de champs seront scrupuleusement choisis pour obtenir le meilleur rapport bénéfice/risque. L’implantation de xénogreffes peut engendrer des effets indésirables sur les animaux, ainsi que la chirurgie d’exérèse de ces tumeurs. Les souris ayant subi ces procédures (xénogreffes, chirurgie d’exérèse) sont suivies quotidiennement, pesées au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance, pendant toute la durée de l’étude. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …§points limites) les animaux seraient placés en cage individuelle dans un milieu enrichi et suivis attentivement. Si leur état ne s’améliorait pas, les animaux seraient euthanasiés.

Devenir

Les animaux utlisés dans les procédures 1 à 7 et 10 sont gardés en vie pour réaliser les procédures suivantes. Les animaux utilisés dans les procédures 8 et 9 sont maintenus en vie jsuquà la fin de l'expériences consistant à analyser l'efficacité des traitements sur la croissances tumorales. Les souris seront quotidiennement observées afin d’évaluer le bien-être ou la douleur. Les points limites sont définis ci-dessous : #1 : Perte de poids de 20% par rapport au poids initial #2 : Nécrose ou ulcération des tumeurs cutanées macroscopiquement visible Tumeur cutanée atteignant 2 cm³ #3 : Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après la chirurgie En cas de dépassement des points limites, les animaux seront suivis attentivement pendant quelques jours et, si leur état ne s’améliorent pas, les animaux seront euthanasiés selon la méthode prévue décrite au paragraphe 3.3.3.

Remplacement

Nous avons validé in vitro l’efficacité de stratégies de ciblage des cellules cancéreuses, du microenvironnement ou de la matrice extracellulaire à l’aide de nanoparticules vectorisées. Nous devons maintenant valider l’efficacité de ce ciblage in vivo, afin d’optimiser ces stratégies qui feront l’objet de tests précliniques, notamment pour le dépistage et la thérapie des tumeurs. Nous avons validé que ces nanoparticules constituent in vitro un agent anti-cancéreux efficace : ciblage efficace des cellules d’intérêt, induction de mortalité et arrêt de prolifération des cellules après application d’un champ magnétique... Nous devons maintenant valider que cette efficacité thérapeutique est réelle in vivo, sur des modèles murins de cancer. Cette validation permettra d’optimiser ces stratégies (améliorer la conception de nanoparticules magnétiques, les paramètres de champs magnétiques…) qui pourront faire l’objet de tests précliniques.

Réduction

Les études in vitro ont été menées précédemment de façon approfondie afin d’anticiper au maximum les futurs résultats in vivo, de privilégier les orientations scientifiques prometteuses, et limiter le nombre d’animaux qui seront utilisées pour valider les stratégies thérapeutiques proposées dans le projet. Nous devons maintenant valider que cette efficacité thérapeutique est réelle in vivo, sur des modèles murins de cancer. Cette validation permettra d’optimiser ces stratégies (améliorer la conception de nanoparticules magnétiques, les paramètres de champs magnétiques…). Le retour aux validations in vitro, à chaque étapes-clefs (validation d’une nouvelle association de traitements nanothérapie + nouvel agent chimiothérapeutique, par exemple), seront toujours privilégiées afin de limiter les études in vivo.

Raffinement

Des tests sur un faible nombre d’animaux seront toujours envisagés, autant de fois que nécessaire, afin de définir et d’optimiser les conditions (concentrations en agents thérapeutiques, en nanoparticules, temps et séquences d’exposition aux champs magnétiques…) afin de garantir l’obtention de résultats concluants dans les études pré-cliniques menées.

Choix des espèces

Des données dans la littérature montrent une bonne tolérance des souris au protocole envisagé et la biocompatibilité des nanoparticules utilisées a été validée dans cette espèce. D’autre part, nous avons antérieurement validé que les modèles cellulaires utilisés (lignées tumorales pancréatiques humaines et murines – i.e. MiaPaca2, BxPc3, Panc1, R211…- et lignées de CAFS ou Cancer-associated fibroblasts humains et murins) permettent de réaliser des xénogreffes chez la souris nude ou C57/BL6 dans de bonnes conditions, sans souffrance de l’animal. Jeunes adultes pour les souris xénogréffées : Ce choix se justifie par la réalisation plus facile de la chirurgie chez de jeunes adultes. Jeunes adultes ou adultes pour les souris transgéniques par la nécessité d’attendre le développement d’une tumeur.

Privées d'une partie de leur système immunitaire pour ne pas rejeter la greffe, 135 souris nude femelles reçoivent dans le cerveau des cellules de glioblastome humain, une tumeur cérébrale agressive. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après six mois de suivi au plus, ou dès qu'un point limite est atteint, pour prélever leur cerveau. Lors de la greffe, sous anesthésie générale, une partie de leur crâne est remplacée par une lamelle de verre de 5 mm, puis elles passent en imagerie sous anesthésie une à deux fois par semaine, seules en cage pour éviter qu'elles rongent la fenêtre. Les nanoparticules et la radiothérapie testées sont appliquées aux cellules. Le porteur écrit pourtant que cette procédure "ne menace pas leur intégrité physique".

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie grâce à l’utilisation de nanoparticules. Dans ce projet nous chercherons à évaluer le potentiel thérapeutique de deux nanoparticules innovante (en cours de développement clinique), en association avec la radiothérapie, sur un modèle de tumeur cérébrale humaine. L’objectif du projet étant d'optimiser les modalités de traitement dans le traitement de tumeurs cérébrales. Nous utiliserons des techniques d’imagerie non invasive permettant notamment de réduire les souffrances de l’animal et de réitérer nos observations dans le temps sur un même animal.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

-Procédure 1: Sous anesthésie générale, greffe cérébrale de cellules tumorales humaines avec pose de fenêtre crânienne (un lame de verre de 5 mm de diametre vient remplacer une partie du crane) : réalisée une fois au début de l'étude (durée de 30 min) - Procédure 2 : Observation de la croissance/régression tumorale sous anesthésie générale par des techniques d’imageries : réalisée 1 à 2 fois par semaine (durée 10 min) sur maximum 6 mois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire, de plus nous utilisons des analgésiques pour limiter la souffrance des animaux et le traitement NPs + la radiothérapie n’est pas réalisée sur la souris mais effectuée sur cellules. Nous mettons en place des soins post-opératoire rigoureux. L’hébergement en cage individuelle après la chirurgie et durant tout le suivi par microscopie pour éviter que les animaux ne rongent la fenêtre crânienne ; ceci pouvant conduire à un stress des animaux par limitation des interactions sociales directes pour limiter cet effet indésirable nous accolerons les cages transparentes les unes aux autres ce qui permettra une communication visuelle entre les animaux. Suivi par imagerie classée légère : utilisation d'analgésiques pour limiter le stress de l’animal qui doit être maintenu immobile pour ne pas altérer la qualité des images.

Devenir

Procédure 1: Greffe cérébrale de cellules tumorales humaines avec pose de fenêtre crânienne : animaux gardé en vie. En effet, cette procédure ne menace pas leur intégrité physique et constitue le point de départ de notre étude. Procédure 2 : Observation de la croissance/régression tumorale par imagerie : animaux mis a mort à la fin de la période maximal de suivi soit 6 mois ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau sera prélévé pour analyse macroscopique et histologique (mise en évidence des cellules tumorales en surface ou en profondeur).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque l’implantation de tumeurs cérébrales, la croissance ou la régression tumorale post-traitement dépend de phénomènes biologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. Les différents travaux déjà mener in vitro (sur cellules) et le désire d’évoluer vers la clinique implique une étude préclinique in vivo (sur un modèle animal) du protocole, ainsi que de disposer de tumeurs intracérébrales issues de cellules tumorales humaines pour se rapprocher au mieux de l’histologie tumorale retrouvée en clinique.

Réduction

L’utilisation du modèle de fenêtre intracrânienne permet le suivi sur plusieurs semaines sur un même animal de l’efficacité du traitement permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance, la migration et la régression tumorale. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d’une part lors de la procédure chirurgicale (analgésie avec réitération, opération sur tapis chauffant pour le maintien de la température corporelle, protection de la déshydratation oculaire par du gel ophtalmique, injection d’anti-inflammatoire pour éviter l’œdème cérébral, surveillance au réveil (vérification de l’alimentation et de l’hydratation)) ; Et d’autre part les jours suivant la chirurgie et jusqu’au sacrifice de l’animal (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de papier absorbant et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris nude (dépourvue d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des souris femelles plus sociables, pour faciliter l'hébergement collectif. Des souris âgées de 7 à 9 semaines au moment de la chirurgie sont utilisées, à un stade où leur poids est suffisant compatible avec l'intervention

Huit heures par jour pendant seize semaines, 160 souris sont placées en hypoxie intermittente, une privation d'oxygène répétée censée reproduire l'apnée du sommeil. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois séries d'injections d'insuline, de glucagon, d'adrénaline ou de dexaméthasone, des gouttes de sang prélevées à la queue et trois ECG et échographies cardiaques sous anesthésie générale. Le porteur décrit des effets "sans conséquence majeure", une ventilation et un hématocrite en hausse, alors que le projet doit établir si ce stress hypoxique dérègle le système sympathique et le métabolisme du foie. Toutes sont tuées au bout des seize semaines pour prélever leurs organes, que d'autres chercheurs du laboratoire pourront se partager.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -L’hypoxie intermittente (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système sympathique ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ?

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans la pathologie de l'AOS commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'HI avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au SAOS.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagon devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose à 10% (2mg/kg). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augementer légèrement la fréquence cardiaque.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système sympathique .

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal graçe a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice teminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.