Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Régulation de l’évitement comportemental par la dopamine
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des chocs électriques "d'intensité modérée" apprennent aux souris à éviter un lieu, et cinq des six procédures comportent une chirurgie stéréotaxique du cerveau, certaines souris passant en outre deux semaines isolées. 646 souris adultes, mâles et femelles, issues de différentes lignées transgéniques, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, puis tuées par une dose létale d'anesthésique suivie d'une perfusion de fixateur par le cœur. Il s'agit de comprendre comment l'aire tegmentale ventrale du cerveau contrôle cet évitement, ce qui "pourrait" selon le porteur aider à identifier des cibles thérapeutiques contre l'évitement persistant du stress post-traumatique. Le porteur range la chirurgie parmi les "procédures douloureuses", sans préciser ce qu'elle implante ou injecte, ni le nombre de chocs, ni les tests réunis sous l'expression "validation comportementale".
Objectifs
Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les neurones de l’aire tegmentale ventrale qui jouent un rôle clef dans le comportement de défense. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’aire tegmentale ventrale contrôle l’évitement de place chez la souris. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ce circuit.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.
Procédures
Ce projet implique 6 procédures expérimentales. La procédure 1 consiste en une série d’expériences de validation comportementale. Les procédures 2-6 comprennent toutes la chirurgie stéréotaxique pour étudier des circuits neuronaux impliqués dans le comportement d’évitement de place. A l’issue de ces expériences, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Le comportement d’évitement de place engendre de l’inconfort pour l’animal puisque des chocs électriques d’intensité modérée sont administrés à l’animal. Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures douloureuses. L’isolement des souris pendant 2 semaines engendre de l’inconfort pour l’animal.
Devenir
Notre étude nécessite de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose létale d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.
Remplacement
Il est impossible de remplacer l’animal vivant pour l’étude du comportement d’évitement. La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 646 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. De plus, ce chiffre comprend le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires (pilotes), afin de 1) déterminer les conditions optimales lors des tâches comportementales de conditionnement et 2) mettre en place de nouvelles techniques, ce qui permettra de diminuer la quantité d’animaux utilisés à long terme. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.
Raffinement
Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont proches les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.
Choix des espèces
L’évitement est un comportement extrêmement important pour la survie et est donc conservé chez les mammifères. Par ailleurs, ce projet requiert l’étude fine de populations de neurones accessibles uniquement via des modèles murins transgéniques. Les souris se reproduisent rapidement (une portée par mois) et leur système nerveux atteint son développement adulte en 12 semaines. Ainsi, la souris adulte représente un modèle de choix pour étudier les mécanismes neuronaux qui contrôlent le comportement d’évitement.
Effets in vivo des inhibiteurs de DYRK1A sur la prolifération des cellules bêta du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
192 rats, dont des rats rendus diabétiques, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent pendant quatre semaines un inhibiteur par injection, voie orale ou patch, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires par section du bout de la queue et des tests métaboliques, avant d'être tués pour analyse du pancréas. Le projet vise une "preuve de concept" pour une molécule candidate contre le diabète. Le porteur n'attend "aucun effet indésirable" hormis la douleur des piqûres et des coupures de queue, et affirme qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement".
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique associée à une diminution de la masse des cellules β du pancréas qui sécrètent l’insuline. La régénération des cellules béta est désormais considérée comme une stratégie thérapeutique de premier plan. Au cours des dernières décennies, des études ont été menée pour identifier les cibles moléculaires pouvant être modulées afin de restaurer la masse β cellulaire et parmi elles l'enzyme DYRK1A. Nous proposons d’étudier, in vivo, un nouvel inhibiteur de DYRK1A, plus puissant et plus spécifique que ceux actuellement disponibles pour la recherche et ayant comme particularité d’être actif sous différentes voies d’administration ( intra-péritonéale, transdermique et orale). Durant 4 semaines nous administrerons, selon ces trois voies, deux doses de cet inhibiteur à deux modèles animaux, le rat Wistar non diabèrique et le rat Goto Kakizaki ( GK) diabétique. Nous analyserons par des tests in vivo l'évolution de la glycémie et de l’Insulinémie. Enfin, à l’issue des traitements, les animaux seront sacrifiés et une étude par des approches d'immunohistochimie sera menée pour analyser les aspects structurels et fonctionnels du pancréas .
Bénéfices attendus
Le bénéfice majeur de cette étude sera la livraison d'une preuve de concept solide indiquant que l’inhibiteur EMD92 est un candidat potentiel pour une pharmacothérapie ciblée sur les patients diabétiques. En plus de construire une meilleure connaissance de l'implication de DYRK1A dans la régulation de la croissance des cellules β au cours du diabète, des résultats positifs sur les rats diabétiques GK nous permettront de proposer une stratégie thérapeutique « curative », capable de prévenir la progression du diabète, grâce à la restauration d'une masse cellulaire β fonctionnelle
Procédures
Dans ce projet des rats mâles Wistar et GK âgés de 8 semaines recevront les molécules d'intérêt selon 3 voies d’administration et durant 4 semaines : -32 rats Wistar et 32 rats GK recevront une injections intrapéritonéales (IP) 1 jour sur 2, -32 rats Wistar et 32 rats GK recevront par voie orale (dans l’eau de boisson) -32 rats wistar et 32 rats GK recevront par diffusion transdermique (par patch). Un prelèvement de sang de 10 microlitres sera réalisé une fois par semaine jusqu'a la fin du traitement. A l'issue du traitement tous les animaux ( 96 rats wistar et 96 rats GK) subiront des tests métaboliques durant lesquels il recevront une injection soit de glucose pour mesurer la tolérance à cette molécule, soit d'insuline pour etudier leur sensiblité à cette hormone. Au cours du test de tolerance au glucose 4 prélèvements de sang seront faient de chacun 10 microlitres.
Impact sur les animaux
Les molécules étudiées ne sont pas censé induire de toxicité, aucun effet indésirable n’est donc attendu sur les animaux. De plus, ces molécules ne pouvant pas traverser la barrière hémato-encéphalique, aucune neurotoxicité ne devrait être observée. Par contre de legers effets indésirables pour l'animal seront liés à la piqure d'aiguille lors de l'injection en intrapéritonéale des molécules, du glucose et de l'insuline pendant les tests in vivo ainsi qu'à la coupure de l'extrémité de la queue lors des prelèvements de sang.
Devenir
Aprés le traitement à l'EMD tous les animaux sont gardés en vie. Aprés les tests métaboliques les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Pour ce projet il n'existe pas de méthode de remplacement à celle faisant appel aux modèles animaux. Ils sont les seuls à nous permettre d'appréhender les paramètres structurels du pancréas, à savoir les interactions entre les cellules bêta et les cellules acinaires/canalaires qui entrent dans la constitution du pancréas. Le choix du rat Wistar et du rat diabétique GK pour cette étude réside dans le fait qu'il présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'Homme
Réduction
Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur. Les résultats seront analysés et validés par des tests statistiques adaptés : Mann-Whitney, Wilcoxon ou Anova (différences significatives P
Raffinement
Pour le traitement nécessitant une injection ainsi que pour les tests in vivo, les animaux sont préparés à la contention par les expérimentateurs. La douleur liée à l'injection est celle du niveau d'une piqure de l'aiguille. Ces méthodes sont en accord avec la classe lègère des procédures.
Choix des espèces
Le choix du rat pour cette étude réside dans le fait que cette espèce présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'Homme. Les rats seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines. A cet âge, les rats GK développent le diabète et les cellules béta du pancréas sont altérées. Le traitement à l’EMD92 a pour but de rétablir cette défection en augmentant la masse béta cellulaire. Pour les rats Wistar, le traitement à l’EMD92 indiquera l’effet de la molécule sur les cellules béta d’un pancréas sain.
Étude des processus biologiques induisant l’aggravation de maladies chroniques du sang et leur transformation en cancer (du sang).
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont irradiées pour détruire leur moelle osseuse puis greffées par injection de cellules malades, avec des biopsies de moelle au fémur, pour reproduire la transformation d'une maladie chronique du sang en leucémie aiguë. Le porteur indique des complications possibles comme des thromboses, des hémorragies, des infections et des diarrhées liées à l'immunodépression. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces interactions et qu'un "organisme entier" est nécessaire pour tester les molécules.
Objectifs
Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) représentent un ensemble de maladies hématologiques (maladies du sang) affectant un des sous-groupes de cellules constituant le sang: le groupe myéloïde. Celui-ci inclut les granulocytes (cellules impliquées dans l’immunité), les thrombocytes (communément appelés « plaquettes », responsables de la coagulation sanguine) et les érythrocytes (couramment appelés « globules rouges » chargés du transport d’oxygène dans le sang). Des études scientifiques basées sur le « séquençage de l’ADN » (une méthode utilisée en laboratoire afin de connaître de manière exacte le type et l’ordre des molécules constituant notre ADN), ont permis de montrer l’existence de modifications génétiques (mutations) à l’origine de cette maladie. Ces mutations perturbent principalement des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire, entraînant ainsi la multiplication anormale et accrue de ces cellules. D’une part, ces mutations semblent également être impliquées dans la transformation de cette maladie vers en un cancer du sang particulier dit «Leucémie Aiguë Myéloïde (LAM) », associé à de très faibles chances de guérison et/ou de survie. D’autre part, cette transformation en LAM serait aussi liée à des modifications touchant à l’environnement dans lequel se trouvent ces cellules : la moelle osseuse. Ainsi, l’objectif de notre projet est d’identifier les processus biologiques propres aux cellules des NMP et propres à leur environnement (moelle osseuse) impliqués dans la transformation de la maladie (NMP) vers un cancer du sang plus grave (LAM). Il permettra alors de déterminer de nouvelles pistes de préventions et de traitements (cibles thérapeutiques), afin d’empêcher la transformation des NMP en cette maladie dévastatrice qu'est la LAM.
Bénéfices attendus
Les processus responsables de la transformation des NMP en LAM secondaire sont encore mal compris. Ils semblent liés d’une part à des anomalies génétiques au sein des cellules sanguines et d’autre part à des anomalies de leur microenvironnement, au sein de la moelle osseuse, dans lequel évoluent les cellules malades des NMP. Le microenvironnement est constitué d’autres types de cellules (immunitaires, neuronales, ...etc.) baignant dans une matrice (une sorte de gelée chargée de molécules nécessaires à la survie de ces cellules). L’altération de ces cellules et/ou de cette matrice conduit à des anomalies du microenvironnement, ce qui perturberait aussi les cellules sanguines se nichant dans cette moelle osseuse. Ainsi, la compréhension des mécanismes responsables de la transformation des NMP en LAM et le développement de stratégies thérapeutiques permettant de prévenir l’apparition de cette complication, représentent un enjeu important pour les patients atteints de NMP.
Procédures
Afin d'identifier les mécanismes à l'origine de la transformation de la NMP en un cancer du sang plus grave qu’est la LAM, nous mettrons en place un modèle de souris « chimères », c’est-à-dire, ayant reçu des cellules provenant de notre modèle de souris malade afin de suivre leur développement. Pour cela des souris normales seront irradiées (étape durant 15 minutes, non douloureuse permettant d’éliminer les cellules de leur moelle osseuse) avant de recevoir par injection intraveineuse (injection d’une durée d’une minute, sur souris éveillée dans la veine de la queue) des cellules obtenues à partir de la moelle osseuse de nos souris transgéniques en post-mortem. Les souris seront alors maintenues sous antibiotiques durant les deux semaines afin d’éviter tout risque d’infection liée à la perte de leur système immunitaire causée par cette irradiation. Les cellules injectées, correspondant à des cellules malades de NMP, pourront être préalablement modifiées génétiquement afin d'invalider l'expression d'autres gènes et ainsi déterminer comment a lieu la transformation de la NMP en LAM. Pour suivre le développement des cellules malades de NMP et leur éventuelle modification à l'origine d'un cancer du sang, nous réaliserons des biopsies de moelle osseuse au niveau du fémur des souris (geste technique de moins de 5 minutes réalisé sous anesthésie et analgésie, deux fois maximum pour chaque souris). Nous effectuerons également des prélèvements sanguins (au niveau de la joue, geste non douloureux réalisé sur souris éveillées et durant maximum une minute par souris) de manière bimensuelle sur toute la durée (maximum 12 mois) de la procédure expérimentale. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition espacée d’au moins deux semaines. Enfin, nous réaliserons des expériences d'imagerie afin de visualiser les interactions potentielles entre les cellules de la NMP et celles de leur environnement (observation d'une heure au niveau du crâne sur souris anesthésiée après incision de la peau sur 5mm. L'incision sera refermée après l'imagerie par des points de suture). Ensuite nous testerons des traitements sur une durée de 28 jours (injection non douloureuse deux fois par jour dans l'abdomen ou sous la peau ou par gavage avec une sonde spécifique). Chaque injection, réalisée sur souris éveillée, prend moins d'une minute. Le suivi de l'efficacité des traitements sera réalisé par prélèvement de sang ou de moelle osseuse, comme décrit précédemment.
Impact sur les animaux
Les souris génétiquement modifiées exprimant la mutation fréquemment retrouvée chez les patients NMP peuvent présenter des complications thrombotiques et hémorragiques (caillot sanguins et saignements), comme cela est observé chez les patients. Pour prévenir ces complications, plusieurs mesures seront prises, en particulier lors des prélèvements sanguins afin d'éviter la survenue de thrombose. Dans le cas des procédures impliquant une irradiation des animaux préalablement à l’injection de cellules par voie intraveineuse, des événements d’infection et de déshydratation pourraient apparaître. Ceci pourrait potentiellement induire des diarrhées modérées ou aiguës, ce pourquoi les souris seront maintenues sous antibiotiques durant la période de prise de greffe. En outre, l’administration des traitements standards de NMP par voie orale (gavage) constitue un risque d’irritation du tube digestif des animaux. Pour cela, nous prévoyons d’administrer un antidouleur par voie non invasive (sous-cutanée) afin de réduire au minimum leur souffrance. Toutefois, les conditions d’hébergement des souris ainsi que leur suivi quotidien permettront de prévenir le risque de souffrance et d’agir dans un délai très court (compensation de la perte en eau par ajout d’une gélose hydratée notamment). Enfin, et étant donné que nous travaillons sur la transformation des NMP en LAM secondaires, les animaux risquent de développer une leucémie mais seront aussitôt euthanasiés dès l’apparition de la maladie. Lors de la mise en place des essais thérapeutiques, nous veillerons au bien-être des souris, malgré la répétition des administrations (deux fois par jour pendant 28 jours) et nous arrêterons les tests dès que des signes de souffrance apparaîtront chez ces animaux.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Il n'existe actuellement pas de modèle in vitro pertinent pour l'étude de la transformation leucémique des NMP, récapitulant les interactions entre l'environnement (moelle osseuse) et les cellules de NMP. Or la transformation des cellules malades de NMP vers le cancer du sang implique ces interactions. De plus, le test de molécules thérapeutiques nécessite l'utilisation d'un organisme entier afin de miner les conditions de distribution du médicaments comme cela se passera chez l'Homme.
Réduction
Étant donné que nous travaillons depuis plusieurs années sur des modèles animaux, nous avons acquis de l’expérience et une expertise dans ce domaine. Nous avons ainsi mis à profit nos connaissances théoriques et pratiques afin de mettre en place un protocole exprimental incluant le minimum d’animaux. Grâce à des analyses statistiques, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures).
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé, afin de s’assurer du bien-être des animaux, et du bon état de leur environnement de vie (propreté des cages, disponibilité d’eau et de nourriture, enrichissements, ...etc.). De plus, un suivi clinique quotidien des souris sera également entrepris pour détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses. Cela sera réalisé en s'aidant d'une grille d'évaluation du score clinique et des actions seront mises en place de manière graduée en fonction de l'apparition de signes de souffrance. En cas d’irritation du tube digestif, les animaux recevront une dose d’antidouleur afin de réduire leur souffrance au minimum. Les animaux seront euthanasiés si leur état se dégrade soudainement. Enfin, les cages où sont maintenus les animaux feront l’objet d’un change hebdomadaire, et nous nous assurerons d’y apporter le maximum d’enrichissements (Social : les souris seront en groupe de 5 pour favoriser les interactions sociales entre elles. Matériel : bûchettes en bois, papier kraft, tunnels, ...etc.).
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille dont la génétique et le comportement sont parfaitement connus. Cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l’angoisse des animaux et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. De plus, la souris et l’homme partagent 99 % de leurs gènes. Ainsi, les résultats des expériences réalisées chez la souris pourront être facilement transposables à l'être humain et donc améliorer l'étude des pathologies humaines et leurs thérapeutiques. Dans notre cas, nous disposons d'un modèle de souris génétiquement modifiées, exprimant la mutation la plus fréquemment retrouvée chez les patients atteints de la pathologie humaine que notre projet vise à étudier (la NMP). Pour mettre en place ce projet, nous utiliserons des souris âgées de 6 à 12 semaines (jeunes adultes). Notre modèle de souris "chimères" nécessitera des souris receveuses normales, âgées de 6 et 8 semaines au moment de la transplantation de moelle osseuse. Ce âge est celui où la mise en place du modèle de souris "chimère" est le meilleur comme cela est décrit dans de nombreux articles scientifiques du domaine.
Restauration de la sensibilité au glucose au niveau de la veine porte – réduction de la dose efficace
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
6 porcs miniatures vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie puis des séances d'imagerie au fil d'une succession de cinq procédures dont la dernière est terminale, pour tester une substance censée moduler la détection du sucre près du foie. Le porteur présente le diabète de type 2 comme concernant environ 500 millions de personnes et annonce une "solution thérapeutique innovante". Il justifie le recours au porc par sa taille proche de l'humain et l'impossibilité de reproduire in vitro la régulation de la glycémie sur un "animal entier".
Objectifs
Le projet vise à définir la dose minimale d’une substance susceptible de moduler la manière dont le système de détection de l’arrivée de sucre situé à proximité du foie renseigne le cerveau après le repas. L’objectif final est de traiter le diabète de type 2 en limitant les effets secondaires néfastes qui sont malheureusement classiques avec les thérapeutiques actuelles. Le modèle retenu est celui du porc miniature car il développe spontanément un des permisses du diabète de type 2 lorsqu’il est soumis à un régime alimentaire pléthorique. De plus, la taille de l’animal permet un abord chirurgical identique à celui qui sera réalisé à terme chez l’homme. Enfin, sa taille est adaptée à une imagerie du système de détection de l’arrivée du sucre.
Bénéfices attendus
Le bénéfice prévu vise à disposer d’une solution thérapeutique innovante pour le traitement du diabète de type 2. Cet objectif est réaliste car nous avons préalablement mis en évidence les mécanismes qui conduisent à la réduction d’efficacité du système de détection de l’arrivée de sucre. Cette réduction est parallèle à la survenue de la réduction de l’efficacité de l’insuline - un phénomène connu comme étant la prémisse de l’établissement du diabète de type 2. Cette cascade survient, en l’absence de prise de charge, chez tous les patients au cours de l’apparition du diabète de type 2, c’est à dire environ 500 millions de personnes dans le monde par an.
Procédures
Pour ce projet, 6 animaux seront utilisés sachant que les données sur des animaux témoins ont déjà été obtenus dans le cadre d’un projet antérieur. Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale dont la durée interventionnelle est de 10 minutes. Les animaux subiront également des imageries (2 imageries par animal) pour évaluer l’efficacité de la thérapeutique. Ces animaux sont produits à cet effet dans une structure agréée qui tient compte de l’éthique animale et assure l’élevage et le suivi quotidien des animaux dans les meilleures conditions de bien-être conformément à la législation et à la règle des 3R.
Impact sur les animaux
Ce projet sera réalisé́ en s’assurant qu’aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie lors de toute intervention sur les animaux. Une observation quotidienne et une interaction positive quotidienne avec les animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. En cas d’effet inattendu, les traitements appropriés seront mis en œuvre en accord avec les responsables du bien-être animal de notre établissement utilisateur.
Devenir
Ce projet correspond à la succession temporelle de 5 procédures - les 4 premières conduisant à la réutilisation de l’animal pour la procédure suivante, la cinquième et dernière étant terminale. A la fin de chaque procédure, les animaux seront suivis par un vétérinaire pour décider d’enclencher la procédure suivante. Trois procédures sont de classe légère, une procédure de classe modérée (chirurgie) et une sans réveil.
Remplacement
Les procédures ne peuvent être faites que sur l’animal entier car la régulation de la glycémie est liée à une série de réponses biologiques non reproductibles intégralement in-vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux est volontairement réduit car les données sur les animaux témoins ont déjà été obtenues dans le cadre d’un projet antérieur. Cette réduction significative du nombre d’animaux n’induit donc pas une réduction de la significativité statistique alors qu’elle divise par deux le nombre d’animaux impliqués.
Raffinement
Des points limites sont fixés au préalable, et un suivi des animaux est effectué́ de façon très régulière. Les procédures chirurgicales et d’imagerie ont été́ conçues et validées par un vétérinaire en incluant une valence analgésique forte. Les méthodes d’imagerie sont les plus sophistiquées possible à ce jour indépendamment de l’espèce utilisée. La méthode chirurgicale est reconnue comme celle produisant les suites post-opératoires néfastes les plus limités possibles.
Choix des espèces
Le porc s’impose comme un modèle privilégié pour les études en nutrition et neurosciences. En contexte nutritionnel délétère, le miniporc adulte développe une obésité similaire à la pathologie humaine. Les animaux seront des jeunes adultes lorsque leur croissance aura atteint un plateau i.e. > 1,5 an. Ceci se justife par le fait que la condition visée par notre solution thérapeutique est celle de l'obésité chez l'adulte
Néphrotoxicité du lithium : rôle de la prolifération des cellules du canal collecteur
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent du lithium et diverses molécules par gavage, injection intrapéritonéale, croquettes enrichies ou minipompe implantée sous la peau, avec passages en cage à métabolisme et injection rétro-orbitaire, avant d'être tuées pour analyse des reins. Le projet cherche à comprendre la toxicité rénale du lithium, que le porteur qualifie de traitement "incontournable" du trouble bipolaire. Les atteintes possibles décrites vont de la soif intense à la douleur liée aux injections et aux implantations chirurgicales.
Objectifs
Le trouble bipolaire est une affection à la fois fréquente, touchant 1 à 4% de la population mondiale, et grave, puisque les accès maniaques et dépressifs engagent le pronostic vital en raison du risque suicidaire. Le traitement le plus efficace à ce jour est le Carbonate de Lithium. Cette efficacité incontestée est contrebalancée par des effets secondaires à long terme, et en particulier rénaux. Ceux-ci se manifestent d’abord par une incapacité à concentrer les urines et donc une soif intense, puis à plus long terme par une insuffisance rénale avec l'apparition de microkystes rénaux, pouvant évoluer vers l’insuffisance rénale terminale. Le mécanisme impliquerait un type de cellules particulières du rein, les cellules principales du canal collecteur responsables de l'équilibre de l'eau et du sel, et donc du milieu intérieur, dans l'organisme. Les données de la littérature ont montré une prolifération de ces cellules suite à une exposition à doses thérapeutiques au lithium. Cette prolifération semble médiée par le GDF15, facteur de croissance précédemment connu du laboratoire pour son effet en situation d’acidose. Notre projet vise à déterminer in vitro (sur des cultures cellulaires, dont sphéroïdes 3D) et in vivo sur un modèle d’exposition à long terme (jusqu’à 6 mois) le rôle et les mécanismes de la prolifération de ces cellules dans la progression vers l’insuffisance rénale. L’objectif de ce projet est ainsi de mieux comprendre la toxicité rénale du lithium et de mettre en évidence des pistes thérapeutiques préventives et curatives sur un modèle expérimental avant le développement d’essais cliniques.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’un projet original de recherche fondamentale dans le domaine de la physiopathologie. Il vise à élucider certains mécanismes qui sous-tendent la toxicité rénale d’un traitement incontournable de la maladie bipolaire et de proposer des traitements préventifs.
Procédures
Un groupe de 80 souris sera soumis à une mise en cage métabolique pendant une durée de 4heures, chez un animal vigile, à 15 jours, 1 mois, 3 mois et 6 mois du début de la procédure : soit 4 fois par souris. Ces mêmes souris seront soumises à une mesure de DFG : injection rétro-orbitaire de FITC-inuline sous anesthésie à l'isoflurane, puis prélèvements microcapillaires à la queue à 3, 7, 10, 15, 20, 40 et 60 minutes, qui seront réalisées à 1 mois, 3 mois et 6 mois, soit 3 fois par souris. Un groupe de 40 souris sera soumis à un gavage gastrique de mubritinib sur animal vigile quotidien pendant 4 semaines. Un groupe de 40 souris sera soumis à une injection intrapéritonéale de canertinib sur animal vigile quotidienne pendant 4 semaines. Enfin, un groupe de 80 souris sera soumis à une intervention chirurgicale consistant à la pose de minipompes osmotiques sous-cutanées sous anesthésie générale (réalisée par injection intrapéritonéale) : une pose par souris. Les minipompes seront laissées pendant une durée de 4 semaines. Enfin, 400 souris seront nourries par des croquettes enrichies en médicaments données au long cours aux humains (amiloride et lithium) sans autre intervention que le prélèvement d'urines par simple contention et la surveillance de la prise de boissons, d'aliments et du poids.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des interventions sont connus car déjà testés chez l'animal et utilisés chez l'homme. Le traitement par carbonate de lithium induit une augmentation de la consommation d'eau et de la diurèse ; le traitement par mubritinib peut être responsable d'un inconfort lié au gavage gastrique, il est par ailleurs bien toléré ; le traitement par canertinib peut entraîner du fait de sa voie d'administration des douleurs liées à l'injection intrapéritonéale, il est bien toléré par ailleurs. Le traitement par tolvaptan peut entraîner des douleurs liées à l'implantation sous-cutanée des minipompes. Il est responsable également d'une augmentation de la diurèse et d'une augmentation de la consommation d'eau. La mise en cages métaboliques peut entrainer un stress chez la souris. La mesure du débit de filtration glomérulaire peut entraîner des douleurs au point d'injection du produit.
Devenir
Les souris sont euthanasiées car les prélèvements et analyses sont nécessaires sur les tissus afin d'évaluer l'efficacité des traitements sur l'architecture des reins, la présence de microkystes et de fibrose, et ceci n'est pas possible avec le maintien en vie.
Remplacement
Le projet vise élucider des mécanismes responsables de l’homéostasie cellulaire du rein en réponse à des stimuli physiopathologiques. Ces stimuli sont transduits au niveau de différents tissus/organes en messages hormonaux, humoraux et/ou physiques qui sont perçus par le rein. La réponse rénale quant à elle intègre plusieurs types cellulaires, avec des interactions para et endocrines entre elles. L’analyse d’une telle complexité nécessite de travailler sur des organismes entiers.
Réduction
Pour toutes les procédures expérimentales qui seront mises en oeuvre, le nombre de souris par groupe sera de 10, avec un nombre total de 640 animaux. Ce chiffre correspond à la taille des effectifs établis grâce au calcul du nombre d'animaux nécessaires pour que les tests statistiques soient interprétables.
Raffinement
Afin de réduire au maximum la souffrance des animaux, nous prévoyons de mettre en place des critères d’interruption des procédures expérimentales basés sur des paramètres non invasifs représentatifs de l’évolution de la pathologie tels que la mesure de la variation du poids corporel (Perte de poids de plus de 10 % par rapport à la dernière pesée), la pression artérielle et la surveillance quotidienne du comportement des animaux (paralysie des membres postérieurs, epistaxis, animal prostré, ne bougeant plus). La procédure en cage métabolique concernant la plus faible proportion de souris possible, et sera réalisée après habituation des souris à la procédure sur une très courte période (6h). Enfin, pour limiter la douleur dans la procédure de mesure du débit de filtration glomérulaire (procédure 6), la sédation à l’isoflurane est privilégiée.
Choix des espèces
L’intérêt d’utiliser des souris pour cette procédure est que nous maîtrisons la transgénèse chez ces animaux, et que les modèles transgéniques sont déjà disponibles, sans nécessité de nouveaux élevages et croisement dans une autre espèce. Les expériences sont réalisées chez des souris adultes de 8 semaines pesant 25-30g au début de l’expérimentation. L’âge adulte est nécessaire pour que la néphrogénèse soit totalement terminée. Les animaux sont étudiés jeunes car une exposition longue (6 mois) est prévue dans un groupe d’étude.
Fourniture d’individus et de tissus de Xenopus laevis et Xenopus tropicalis
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
2 300 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un centre de ressources les produit et les élève pour approvisionner des laboratoires, injectant des hormones à 1 900 femelles pour stimuler la ponte et pratiquant sur 400 autres jusqu'à quatre laparotomies pour prélever des fragments d'ovaire. Les femelles hormonées peuvent être réutilisées, celles opérées à répétition étant ensuite réutilisées pour l'enseignement ou tuées. Le porteur revendique le xénope comme "organisme modèle de choix" et met en avant sa longévité, jusqu'à trente ans, comme argument de réutilisation.
Objectifs
La plateforme est au service de la communauté scientifique travaillant avec le modèle xénope. Elle reprend les activités du Centre de Ressources Biologiques Xénopes qui servait près de 60 équipes de recherche en France depuis 20 ans. Notre unité d’appui à la recherche a pour mission de fournir des animaux à différents stades de développement (œufs, têtards, juvéniles ou adultes) à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes. Pour cela, le centre devra produire, maintenir et élever des animaux propres à la vente. Aucun apport extérieur ne sera réalisé, nous maintiendrons le cheptel minimum nécessaire aux besoins de la communauté. Les animaux pourront être produits par reproduction semi-naturelle ou par fécondation in vitro, pour lesquelles des injections d'hormones chez la femelle sont nécessaires. Ces hormones stimulent la ponte et permettent d'obtenir un grand nombre d'oeufs. Par ailleurs, pour répondre aux besoins de certains laboratoires utilisateurs concernant les fragments d'ovaires, il est nécessaire de pratiquer sur les femelles une laparotomie (ouverture de l'abdomen par une incision) sous anesthésie générale. Une fois suturée, les femelles feront l'objet d'une surveillance post-opératoire afin de détecter un éventuel signe de souffance.
Bénéfices attendus
Notre unité d’appui à la recherche a pour mission de fournir des animaux à différents stades de développement (œufs, têtards, juvéniles ou adultes) à la communauté de chercheurs utilisant les modèles xénopes.
Procédures
Puçage (tous) Injection d'hormones (1900) ou prélèvement de fragment d'ovaire par laparotomie (ouverture de l'abdomen par une incision) (400)
Impact sur les animaux
La présence d’un stress est tout de suite visible par l’émission de venin par les glandes épithéliales. Dans ce cas l’expérience est arrêtée immédiatement et l’animal est mis en observation. Après manipulation, les femelles retournent en stabulation dans les animaleries. Le personnel animalier s’assure que l’animal a pleinement recouvré son état de santé et de bien-être général. En cas de comportement anormal (perte de poids rapide ou progressive de au moins 20%, état de choc associé à de la prostration, nage anormale, lésions ou changement de couleur de la peau entraine la mise à mort de l'animal), le responsable du bien-être des animaux fait intervenir le vétérinaire référent pour décider de la marche à suivre (administration d’analgésiques pour soulager la douleur, ou décision d’euthanasie si l’état ne s’améliore pas au bout de 4 jours).
Devenir
Les femelles xénopes issues de la procédure 1 pourront être réutilisées dans un autre projet ou à des fins d'enseignement : en effet, la durée de vie de ces animaux est très longue (jusqu'à 30 ans) Les femelles issues de la procédure pourront, après avoir subi 4 laparotomies, être réutilisées à des fins d'enseignement ou seront euthanasiées.
Remplacement
les applications des recherches réalisées sur les xénopes nécessitent des observations sur un tissu ou individu entier. Il n’existe pas de modèle mathématique ou in vitro et pour certaines investigations, le xénope s’avère être le modèle le plus adapté (biotechnologies spécifiques disponibles uniquement chez ce modèle).
Réduction
Pour réduire le cheptel nécessaire aux différents besoins de nos utilisateurs, nous pourrons : 1) mutualiser les commandes pour que cela ne nécessite qu’une seule manipulation 2) opérer 3 à 4 fois maximum un seul individu (opérations espacées de quelques mois) et ensuite le destiner à des fins d’enseignement. 3) faire correspondre les pontes demandées par nos utilisateurs au renouvellement des stocks d’individus dans l’animalerie.
Raffinement
Les animaux seront hébergés et élevés dans une animalerie agréée et les procédures seront optimisées. Tout est mis en œuvre pour enrichir le milieu et améliorer le bien-être animal (ne pas isoler longtemps un animal, cacher des aliments “bonus” pour satisfaire leur instinct de recherche de nourriture, installation de cachette). Lors des chirurgies, la douleur sera prise en charge par l'utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques appropriés.
Choix des espèces
Le xénope est un organisme modèle de choix pour l’étude des processus biologiques. Il a par exemple contribué de manière déterminante à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent le développement embryonnaire. Il fait partie d’une sélection de modèles pour lesquels les approches de génomique fonctionnelle sont réalisables. Par ailleurs, pour l’étude fonctionnelle de canaux ioniques, de récepteurs ou transporteurs, le modèle xénope est très intéressant car les ovocytes sont capables d’exprimer de nombreuses protéines qu’il est ensuite aisé de caractériser grâce, entre autre, à des méthodes d’électrophysiologie. Outre ces caractéristiques, il est facile à élever et à maintenir en laboratoire et des pontes peuvent être obtenues à demande. Les embryons sont nombreux et robustes. Le développement externe permet des analyses non invasives dès la fécondation et à tous les stades. Pour pouvoir obtenir des pontes les animaux utilisés sont des animaux matures sexuellement âgés de 2 ans environ pour X. laevis et 6 mois pour X. tropicalis (le temps de développement de cette espèce est plus rapide).
Induction de tumeurs pulmonaires dans un modèle de souris mutantes K-rasG12D et implication de la protéine Atad2 (Partie 2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Après avoir reçu sous anesthésie, dans une première partie du projet décrite dans une autre demande, des particules virales instillées dans la trachée pour déclencher des tumeurs du poumon, les souris passent un scanner sous anesthésie gazeuse à 4, 6, 8, 10 et 12 semaines. 60 souris vont être utilisées dans cette seconde partie, dont 40 génétiquement modifiées pour le gène étudié, Atad2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger alors que des tumeurs se développent dans leurs poumons. Le porteur renvoie les effets indésirables à des "points limites" qu'il ne détaille nulle part. Au terme de ce suivi, toutes les souris sont tuées et leurs poumons prélevés.
Objectifs
La transformation maligne des cellules pourrait être considérée comme une série d'événements de reprogrammation cellulaire conduite par des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation en amont. La plasticité et la dynamique de la chromatine sont des déterminants critiques dans le contrôle de la reprogrammation cellulaire. Une augmentation de la dynamique de la chromatine pourrait donc constituer une étape essentielle dans la conduite de l'oncogenèse et dans la génération de l'hétérogénéité des cellules tumorales, ce qui est indispensable pour la sélection des propriétés agressives, y compris la capacité des cellules à se disséminer et à acquérir une résistance aux traitements. L'apport et le dosage d'histones sont les régulateurs les plus connus de la dynamique de la chromatine. En facilitant la reprogrammation cellulaire, le sous-dosage des histones devrait également être crucial dans la transformation cellulaire et les métastases tumorales. L'objectif de ce projet est d'évaluer le rôle d'un facteur à bromodomaine, dans la transformation tumorale et plus particulièrement dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC).
Bénéfices attendus
Notre gène d'intérêt est situé sur le chromosome 8q23 chez l'homme, dans une région instable proche de la région de l'oncogène Myc. Cette proximité avec Myc entraîne souvent son amplification dans différents types de cancer. Presque la totalité des études sur notre géne d'intérêt ont été réalisées in vitro avec des modèles de lignées cellulaires de différents cancers ou in vivo en utilisant des modèles de xénogreffes. Ceci rend difficile de conclure sur son degré d’implication dans l’initiation et la progression tumorales in vivo d’où la nécessité de développer des modèle (s) animaux de cancer. Les expériences entreprises dans ce projet devraient nous permettre de démontrer si l’activité d’Atad2 est nécessaire pour la réponse du génome à des facteurs oncogéniques. Ce travail devrait permettre non seulement de découvrir un mécanisme moléculaire de base essentiel mais constitue aussi une étape commune critique dans la transformation maligne.
Procédures
Durant toute la période de cette procédure, l'observation de développement des tumeurs pulmonaires chez les animaux sera réalisée par imagerie microCT sous anesthésie gazeuse. Cette procédure d’imagerie sera répétée à 4, 6, 8, 10 et 12 semaines post-induction. La durée d'un scan est d'environ 15 minutes, soit environ 20 minutes d'anesthésie au total.
Impact sur les animaux
Dans cette partie du projet, les souris qui ont préalablement reçu les particules d'adéno-Cre par voie intratrachéale (voir DAP Partie 1) seront suivies à l'animalerie de l'IAB et observées pour le développement tumoral. Les effets indésirables, décrits dans les points limites, seront surveillés.
Devenir
A l'issue de cette procédure, toutes les souris seront sacrifées et les poumons prélevés pour analyse histologique et biochimique.
Remplacement
Bien que les propriétés fonctionnelles du facteur que nous investigons dans cette étude aient été initialement abordées par des tests in vitro et dans des modèles de cultures cellulaires, ces derniers présentent néanmoins des limites considérables. Il n’est pas possible d’appréhender l’ensemble des mécanismes que nous étudions sans l’apport du modèle animal. A ce jour et à notre connaissance il n’existe pas de modèle animal qui permet de déterminer le rôle de notre protéine dans l’initiation et la progression tumorales. Nous avons développé des modèles alternatifs en invalidant des gènes d’intérêt dans des cellules souches de souris ou dans des lignées humaines ou encore l’utilisation de modèles de xénogreffes, mais ces systèmes basés sur la culture cellulaire in vitro présente plusieurs limites. Ce modèle de culture cellulaires est en effet très loin de la physiologie animale et ne reflète pas les évènements de dynamique de la chromatine qui ont lieu in vivo.
Réduction
Dans ce projet nous allons utiliser 40 souris modifiées génétiquement pour notre gène d'intérêt. Ce nombre maximal fera l'objet de tests statistiques.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 5 dans des cages à 22°C avec une alternance jour/nuit de 12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Du coton et des tubes en carton seront disposés dans toutes les cages. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. 4 à 5 jours d’acclimatation seront laissés avant le début des expérimentations. Les souris seront observées quotidiennement.
Choix des espèces
Afin de mieux comprendre les mécanismes de développement et d'aggessivité tumorales et pour découvrir de nouveaux moyens plus efficaces pour diagnostiquer et traiter le cancer, il est nécessaire de mener des recherches sur les animaux vivants plus particulièrement la souris. Les études sur les souris sont essentielles pour comprendre la complexité des processus fondamentaux qui sous-tendent le cancer dans les organismes vivants. Dans notre étude, nous pensons que le meilleur moyen d'évaluer le rôle de la protéine Atad2 dans le développement du cancer du poumon non à petites cellules est d'utiliser des souris invalidées génétiquement pour Atad2 ainsi que des souris sauvages avec lee même fond génétique. Ce modèle murin est très puissant et devrait nous aider à mieux comprendre la liaison Les souris utilisées dans cette étude viennent d'un laboratoire de recherche américain. Le modèle a été validé sur des souris agées de 6 à12 semaines afin d'induire les tumeurs. Les souris de cet âge sont suffisement adultes pour se rétablir assez rapidement des effets de l'anesthésie, du volume des particules virales utilisé anisi que les effets de l'intubation intratrachéale.
Mécanismes immuno-régulateurs des pathologies cardiométaboliques et de leurs comorbidités: récepteurs nucléaires et membranaires (1/2 ET 2/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système respiratoire
25 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Elles servent à reproduire une dizaine de pathologies comme l'anaphylaxie, l'asthme, le psoriasis, la septicémie ou le diabète de type 2, au moyen d'injections répétées, de gavages, de nébulisations et de prélèvements sanguins. Le porteur indique que la douleur, inhérente à certains de ces modèles inflammatoires, ne peut pas être prise en charge dans certaines procédures sans interférer avec les résultats. Il affirme que la complexité des interactions entre organes rend l'expérimentation in vivo "indispensable", les retombées thérapeutiques restant formulées comme de simples perspectives.
Objectifs
But : Ce projet a donc pour but d’étudier la contribution des cellules immunes dans les pathologies immuno-inflammatoires et métaboliques et dans l’aggravation des unes par les autres. Il s’agira notamment de déterminer comment certains facteurs régulent le développement et la fonction des cellules immunes dans le contexte des maladies métaboliques. Ces facteurs sont d’une part, certains récepteurs nucléaires, activateurs ou répresseurs transcriptionnels activés par un ligand (un lipide ou un dérivé d’acide gras) ou des récepteurs membranaires.
Bénéfices attendus
Sur le plan fondamental: meilleure connaissance du rôle des récepteurs nucléaires dans les processus pathophysiologiques impliquant le système immuno-inflammatoire Sur le plan appliqué: les mécanismes mis en évidence pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. En effet, les récepteurs nucélaires peuvent être ciblés pharmatologiquement par de petites molécules
Procédures
P1 Anaphylaxie. 1. Injection intraveineuse, intrapéritonéale et intradermique. 2. Prélèvement sanguin. 3. Injection intraveneuse ou intradermique. 4. Gavage. 5. Injection intraveineuse. 6 Prise de témpérature (2h). 7 Prélèvement sanguin. P2 Athme. 1. Prélèvement sanguin. 2. Sensibilisation (3-5 nébulisation, injection intransale, intrapéritonéale, ou intratrachélae). 3. Nébulisation (20min). 4. Pléthysmographie (30 min). 5. Prélèvement sanguin. P3 Dermatite atopique. 1. Prélèvment sanguin. 2. Rasage. 3. Application topique. 4. Pose de "" (5X 3-4 jours). 5. Nébulisation (20min) ou injection intranasale. 6. Pléthysmographie. 7. Prélèvement sanguin. P4 Psoriasis. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Rasage. 4. Application topique (5). 6 Prélvement sanguin. P5 Hypersensibilité. 1. Prélèvmeent sanguin. 2. Application topique (3). 4. Rasage. 5. Application topique (2). 6 Prélèvement sanguin. P6 Septicémie et P7 Endotoxémie. 1. Prélèvement sanguin. 2. Gavage. 3. Injection intrapéritonéale ou sous cutanée. 4. Prélèvement sanguin. P8 Inflammation stérile. 1.Prélèvement sanguin. 2. Injection intrrapéritonéale. 3. Gavage (3). 4. Injection sous-cutanée. 5. Prélèvement sanguin. P9 Athérosclérose et P10-13 Diabète de type 2 (DT2). 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Prélèvement sanguin (6). P10-11 DT2. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Gavage. 4. Gavage ou injection intrapéritonéale. 5 Prélèvement sanguin (9). P10-12 DT2. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie. 3. Cathétérisation (30 min). 4. Clamp (2h). 5. Prélèvement sanguin. P14 Exercice. 1. Exercice sur tapis de course (4X1h) 2. Prélèvement sanguin. 3. Exercice sur tapis de course (80X1h) 4. Prélèvement sanguin. P15-11-18 NASH. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie ou carencée. 3. Gavage (16). 4. Gavage ou injection intrapéritonéale 5. Prélèvement sanguin (8). 6 Canulation biliaire (1h). 15-11-19 NASH. 1. Prélèvement sanguin. 2. Alimentation enrichie ou carencée. 3. Gavage (16). 4. Gavage ou injection intrapéritonéale 5. Prélèvement sanguin (8). 6 Canulation canal thoracique (1h). P16 Colite. 1. Prélèvement sanguin. 2. Injection Intrapéritonéale ou intrarectale. 3. Prélèvement sanguin. P17 Immunisation. 1. Prélevement sanguin. 2. Injection intrapéritonéale (3). 3. Gavage (8). 4. Prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
La douleur faisant partie de certains processus patholgiques, notamment pour l'inflammation intestinale et les processus allergiques, celle-ci ne peut être prise en charge dans certaines procédures sauf à interférer avec les résultats
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la suite des procédures ou enchaînement de procédures
Remplacement
Les pathologies métaboliques et/ou immunes impliquent de nombreux organes du corps et de nombreux types cellulaires circulant entre ces organes. Comme il est impossible de reproduire la complexité de ces interactions in vitro, l’expérimentation animale in vivo est indispensable pour reproduire de manière aussi réaliste que possible ces pathologies.
Réduction
L’utilisation de conditions les plus standardisées possibles (conditions d’hébergement, âge et sexe des animaux, groupes contrôles appariés, horaires de réalisation des expériences…) et l’entraînement et la dextérité du personnel impliqué dans l’expérimentation permettent de diminuer la variabilité individuelle des réponses des animaux et par voie de conséquence le nombre d’animaux nécessaires par groupe pour obtenir des résultats significatifs. De
Raffinement
L’hébergement dans des conditions sanitaires optimales (exemptes d’organismes -opportunistes etpathogènes spécifiques), l’enrichissement de l’environnement dans les cages (abris et « jeux »), le maintien des interactions sociales, l’utilisation de techniques non invasives, des produits anesthésiques et analgésiques optimaux, et la dextérité du personnel contribuent à réduire le stress durant toute la vie des animaux y compris durant l’expérimentation. Une surveillance quotidienne est également pratiquée.
Choix des espèces
En raison du grand nombre de lignées génétiquement modifiées disponibles et de la facilité relative avec laquelle il est possible d’en créer de nouvelles, la souris a été choisie comme modèle d’étude. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 6 semaines), âge à partir duquel le système immunitaire est mature. De plus les pathologies cardiométaboliques sont des pathologies de l'adulte.
Validation de l’efficacité antitumorale du ZZW-115 et ses dérivées dans des modelés du cancer pancréatique spontané
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
96 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer du pancréas vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant huit semaines pour tester une molécule anti-tumorale, la ZZW-115, et ses dérivés. Le porteur décrit des signes possibles de cyphose, de prostration, de poil hirsute et de perte de poids, et prévoit la mise à mort avant l'apparition d'un phénotype trop dommageable. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle proche de l'humain est indispensable et qu'il ne peut se passer de l'animal vivant.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer très meurtrier. Asymptomatique et métastatique, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement efficace. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer de nouveaux agents efficaces basés sur la nanotechnologie pour combattre ces cancers. Dans ce contexte, un analogue de la trifluopérazine (ZZW-115) et des dérivées sont été développé et s'ont avéré très efficace sur plusieurs lignées cellulaires dérives des patients. Des résultats prometteurs ont été obtenu in vitro qui montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire de plus de 50 lignées cellulaires différentes. De plus, nous avons obtenu des résultats prometteurs in vivo qui montrent une réduction significative de la croissance tumorale de xénogreffes obtenues après implantation de cellules tumorales humaines (MIAPaCa2 ou Hep3B) sur des souris NUDE. L'efficacité de cette famille des molécules est justifiée par son affinité pour une protéine clef dans le processus de carcinogenèse pancréatique, NUPR1. Cependant, nos résultats ont été basés sur des modèles de xénogreffes et jamais sur des modèles spontanés, qui se rapprocheraient davantage de la réalité du patient. En ce sens, nous avons deux objectifs avec ce projet, d'une part évaluer le pouvoir de cette famille de molécules comme agent préventif, pour cela nous utiliserons des souris avec la mutation Pdx1-Cre;KrasG12D/+, qui développent des lésions précancéreuses : les PanINs. Notre objectif est d'évaluer si le traitement à partir de l'âge de 5 semaines réduit l'apparition de ces lésions chez les souris traitées avec le ZZW-115 ou ses dérivés. D'autre part, notre objectif est d'évaluer si ce groupe de molécules a un effet curatif dans des modèles d'adénocarcinome pancréatique spontané. À cette fin, nous utiliserons le modèle KPC (LSL-KrasG12D/+ ; LSL-Trp53R172H/+ ; Pdx1-Cre), l'un des modèles les plus précis qui récapitule le plus fidèlement la carcinogenèse telle qu'elle se produit chez les patients. Dans ce cas, nous allons évaluer si le ZZW-115 et ses dérivés ont un effet curatif et sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, notre objectif est de déterminer si le ZZW-115 (et deux de ses dérivés) est efficace dans le traitement de l'hypertension artérielle. 1) prévenir l'apparition de lésions prénéoplasiques. Par le passé, notre groupe de recherche a démontré que l'apparition des PanINs était liée à la présence de NUPR1, c'est-à-dire que chez les souris KO de NUPR1, même en présence de l'oncogène Kras, les lésions précancéreuses n'apparaissaient pas. En ce sens, notre objectif est de démontrer qu'avec des inhibiteurs pharmacologiques, nous pourrions prévenir l'apparition de lésions prénéoplasiques. 2) étudier l'effet du ZZW-115 et de ses deux dérivés (ZZW-145 et ZZW-143) dans des modèles animaux de cancer pancréatique spontané. Dans le passé, nos études ont toujours été réalisées dans des modèles animaux avec des xénogreffes, cependant, ce modèle, bien qu'il présente de nombreux avantages, est insuffisant à plusieurs égards. Avec le modèle animal KPC (LSL-KrasG12D/+ ; LSL-Trp53R172H/+ ; Pdx1-Cre), un modèle qui récapitule plus fidèlement la carcinogenèse pancréatique chez les patients, nous pourrons déterminer si l'inhibition de NUPR1 par des inhibiteurs pharmacologiques a un effet anti-tumoral dans un modèle spontané et immunocompétent. 3) d'évaluer quel traitement, le ZZW-115 ou l'un de ses deux dérivés (ZZW-145 et ZZW-143) a un plus grand pouvoir antitumoral. Notre objectif est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre nos essais précliniques.
Procédures
Les animaux seront traités quotidiennement par une injection d’une solution (véhicule ou traitement, 60 microlitres) par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 0.5 mL, aiguille de 27G pendant 8 semaines (chaque jour). L’intervention dure 15-20 secondes.
Impact sur les animaux
Les premiers signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, poil hirsute, diminution du poids de l’animal. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris NUDE dues à cette procédure, les injections répétées quotidiennenment pourraient générer des lésions cutanées. Nous tenons à souligner que le ZZW-115 n'a montré aucune toxicité lors d'expériences précédentes aux doses qui seront utilisées dans ce projet, en traitements quotidiens pendant un mois.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse (4% isoflurane, 3 - 5 minutes). Le sang, les tumeurs et les organes seront ensuite prélevés en vue des analyses biochimiques et histologiques pour l’évaluation de l’effet anti-cancer et la toxicité éventuelle. Les cadavres seront stockés dans un congélateur à -20°C en attendant leur évacuation par la société spécialisée dans le traitement des déchets biologiques.
Remplacement
Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que le ZZW-115 et ses dérivés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 96 individus (4 groupes de 12 souris KIC et 4 groupes de 12 souris KC) conformément à la règle de réduction.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage de 530cm 2 ) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection, la solution contenant le ZZW-115 sera chauffée avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (tableau de score fourni en annexe). Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort. Le nombre de souris de chaque groupe a ete calculé avec Biosta TGV, avec un risque alpha de 5 % (valeur normale pour un paramètre) et une force statistique de 85%. Aucun animal ne faisant pas partie de l'étude n'est maintenu avec un phénotype dommageable. Les souris sont sacrifiées avant l’apparition de ce phénotype dommageable
Choix des espèces
Les souris sont des modèles très répandus dans la littérature et établis depuis longtemps. Leur utilisation est simple, peu coûteuse, rapide et permet de s’affranchir d’autorisations plus complexes et restrictives concernant des espèces animales plus évoluées. Les animaux KC seront utilisés à 6 semaines, juste avant l'apparition des lésions précancéreuses, pour évaluer l'effet protecteur du ZZW-115 et de ses analogues. Les animaux KPC seront utilisés à partir de 10 semaines, lorsque des lésions précancéreuses se seront développées, pour évaluer si le ZZW-115 et ses analogues sont efficaces pour inhiber la progression des tumeurs.
Evaluation du potentiel thérapeutique d’un nanomédicament enzymatique pour un traitement anti-tumoral.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, des injections du composé et des prélèvements sanguins, la tumeur étant tolérée jusqu'à un volume de 1 500 mm3, pour tester un nanomédicament censé affamer les cancers. Le porteur précise qu'aucun traitement antidouleur n'est prévu pour ne pas fausser les résultats de l'expérimentation. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de système alternatif et que ces expériences ont une valeur prédictive supérieure aux tests de laboratoire.
Objectifs
Il s’agit d’un projet visant à évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement contre le cancer. Les cellules cancéreuses ont besoin d’un apport continu en nutriments pour leur croissance rapide. Les acides aminés sont essentiels à la survie des cellules cancéreuses. Le traitement que nous développons exploite cette vulnérabilité et a pour but d’affamer les tumeurs en les privant de ces ressources essentielles. En effet, la molécule active de notre médicament est une enzyme, une molécule qui détruit les nutriments en les découpant. Le développement de ces nouveaux médicaments s’appuie sur une technologie novatrice qui permet 1) d’améliorer le temps d’action de l’enzyme (pour affamer la tumeur) et 2) d’être invisible par le système immunitaire, dont le rôle est de préserver l’organisme en détruisant les corps étrangers (pour éviter le rejet du traitement par l’organisme). Des tests réalisés en laboratoire sur des cellules cancéreuses ont montré que notre médicament peut les affamer et donc les éliminer. Cependant une caractérisation plus approfondie de l’efficacité de notre médicament est nécessaire afin de développer un traitement sûr et efficace. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Dans ce cadre, les objectifs de ce projet sont : 1) De confirmer l’efficacité anti-tumorale du médicament chez des souris porteuses de tumeur. 2) D’évaluer la capacité du médicament à se localiser dans la tumeur (à trouver son site d’action). 3) De démontrer la capacité de notre médicament à échapper à sa destruction par le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le processus de développement de nouveaux médicaments. Les études précliniques (tests en laboratoire et sur animaux) sont des étapes fondamentales avant de pouvoir administrer un nouveau médicament à l’Homme. Les résultats attendus lors de ces expériences devraient confirmer l’efficacité anti-tumorale de nos nouveaux médicaments et nous permettre de sélectionner le type de cancer pour lequel le traitement sera le plus efficace. De plus, en démontrant que nos médicaments sont efficaces et échappent à la surveillance du système immunitaire, nous validerons notre procédé de production de nouveaux médicaments. Cette validation permettra d’ouvrir de nombreuses possibilités quant au développement de futures thérapies utilisant cette stratégie.
Procédures
Ce projet requiert l’utilisation de deux modèles murins : des souris sans système immunitaire (1-3, 5) et des souris avec système immunitaire (4-7). Les gestes réalisés seront les suivant : 1) Greffe sous-cutanée de cellules tumorales (10-15 secondes / souris). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles, 1 seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 672 et 1104 (min-max). 2) Injection intra-tumoral d’un agent antinéoplasique (5-10 secondes / souris). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles lorsque le volume tumoral aura atteint la taille souhaitée. Ce geste sera réalisé une seule fois durant le temps de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 480 et 768 (min-max). 3) Mesure de la taille des tumeurs (20 - 30 secondes). La croissance des tumeurs sera suivie par mesure au pied à coulisse sur les animaux vigiles. Ces mesures seront réalisées 2 fois par semaines pendant la durée de l’étude. Le nombre d’animaux concernés est entre 672 et 1104 (min-max). 4) Injection intra-péritonéale de l’enzyme (3 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Deux injections seront réalisées par souris, espacées de 14 jours. . Le nombre d’animaux concernés est entre 120 et 264 (min-max). 5) Injection intraveineuse d’un agent anti-tumoral (20-30 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Une seule injection par souris sera réalisée sur la durée de l’étude. Les deux modèles murins utilisés dans notre étude sont concernés. Le nombre de souris sans système immunitaire nécessaire est entre 96 et 240 (min-Max), et celui avec système immunitaire entre 120 et 264 (min-max). 6) Prélèvements sanguins dans la veine caudale (30 secondes). Ce geste sera réalisé sur des animaux vigiles. Un maximum de trois prélèvements par souris sera effectué sur l’ensemble de la durée de l’étude. Les volume et fréquence de prélèvements sanguins ont été établis de manière à ne pas prélever plus de 20% du volume sanguin total de la souris sur une durée de 2 semaines. Le nombre d’animaux concernés est entre 128 et 272(min-max). 7) Imagerie par SPECT/CT (20 minutes). Ce geste sera réalisé sur des animaux préalablement anesthésiées par inhalation de 4% d’isoflurane dans une boite à induction puis de 2,5% au masque. L’acquisition des images sera réalisée à différents temps après injection du nanomédicaments : 4h, 24h, 3 jours, 7 jours, 10 jours et 15 jours. Le nombre d’animaux concernés est entre 96 et 240 (min-max).
Impact sur les animaux
Tout au long du déroulement des expériences précédemment décrites, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée par les animaliers ou l’expérimentateur. L’évolution de la taille des tumeurs sera notamment suivie. Le volume tumoral maximal toléré de 1500 mm3 n’induit pas de problèmes de locomotion ou de contrainte mécanique chez la souris. La tumeur est située en sous-cutanée sur le flanc de l’animal. La manipulation de l’animal n’implique pas de palpation de la tumeur mais simplement une mesure au pied à coulisse, minimisant ainsi la douleur. On détermine la longueur (L, en mm) puis la largeur de la tumeur (l, en mm), le volume tumoral et alors calculé selon la formule suivante : volume en mm3 = Lx(lxl)x0,52. Au-delà d'un volume tumoral de 1500 mm3, l’expérience sera arrêtée. Il n'y a pas de douleur prévisible associée à ce protocole expérimental d'injection de lignées cellulaires en sous-cutanée. Concernant les études d’immunisation des souris, nous appliquerons des protocoles établis et décrit dans la littérature. Il n’y a pas de douleur prévisible associée à cette procédure expérimentale d’immunisation.
Devenir
Lorsque les expériences seront terminées, les animaux ne pourront pas être gardés. Dans le respect de la réglementation, la fin de vie des animaux sera induite de manière réglementaire par insufflation progressive de CO2 ou par dislocation cervicale à la suite d’une anesthésie/analgésie chimique.
Remplacement
Dans les processus de développement des médicaments, les études de validation d’un nouveau composé jouent un rôle fondamental. Elles font généralement appel à des expérimentations animales. C’est un pré requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences sur les animaux ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées en laboratoire. Les processus de développement des cancers ainsi que les interactions du système immunitaire avec les médicaments sont des processus complexes qui résultent de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires. De fait, ceux-ci sont difficilement modélisables en laboratoire. Ainsi, même si des expériences préliminaires ont été réalisées au laboratoire les réponses obtenues ne sont qu’indicatives. Il n’existe pas à l’heure actuelle de systèmes alternatifs de remplacement.
Réduction
Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Dans ce but, le nombre de souris à inclure par groupe est limité 8. La significativité statistique de ces différences sera déterminée. Au-delà d’une différence significative entre les différents groupes de souris au sein d’une même expérience, ce qui est important c’est la reproductibilité de l’expérience. Donc on prévoit de reproduire une fois chaque étape. S’il n’y a pas trop d’hétérogénéité au sein des groupes lors de la première expérience on réduira le nombre de souris par groupe de 8 à 6. S’il y contradiction entre la première et la seconde expérience on prévoit une troisième expérience avec 6 souris par groupe.
Raffinement
Une fois les animaux réceptionnés, un délai de 7 jours sera respecté avant le début du protocole expérimental. Les souris seront hébergées au maximum par 5 dans des cages d’une superficie de 500cm2 à 20-24°C et 30- 50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu sera enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux (sciure de peuplier, copeaux, briques de peuplier). Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long des expériences. En cas de signes comportementaux, physiologiques, d’une perte de poids de 20% du poids total de l'animal (critère non applicable pour les souris porteuses de tumeurs), d'une difficulté à se mouvoir ou d’une détérioration générale de l'état sanitaire de l'animal reflétant une douleur associée à l'expérimentation, celle-ci sera terminée prématurément et les animaux seront euthanasiés. Il n’y a pas de traitement antidouleur prévu pour ne pas biaiser les résultats de l'expérimentation en cours.
Choix des espèces
Notre projet nécessite l’utilisation de deux modèles murins : - Modèle de souris dépourvue de système immunitaire : ces souris sont les modèles animaux les plus utilisés pour les études concernant le développement tumoral car le taux de prise de greffe est le plus élevé. Ces souris sont couramment utilisées puisque l’absence de système immunitaire empêche le rejet des cellules humaines et favorise leur développement de la tumeur. - Modèle de souris avec système immunitaire : ces souris sont des modèles animaux qui ont la capacité de développer une réponse immunitaire rapide et efficace 14 à 21 jours après immunisation. Dans le cas de notre étude, des travaux ont été publiés utilisant ce modèle de souris avec une immunisation avec notre enzyme d’intérêt . Les souris utilisées seront des souris adultes de 6 à 8 semaines. Ce choix est motivé par les nombreuses études utilisant des modèles murins semblables à ceux utilisés dans notre étude.
Biodistribution et validation pharmacologique de vecteurs médicaments in vivo
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
7 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit des injections de vecteurs-médicaments et des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tué par une dose létale d'anesthésique pour prélever sang et organes et mesurer la distribution des composés. Le projet, mené par une société, prévoit d'utiliser environ 1 200 souris par an pour valider ses candidats-médicaments. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune modélisation prédictive ne remplace le modèle murin et le présente comme "l'idéal" et le plus facile à mettre en place.
Objectifs
Plusieurs stratégies sont en cours d’exploration pour faciliter le passage et l'adressage de biomolécules vers les tissus et organes cibles. Parmi ces stratégies, on trouve le développement de molécules-vecteurs qui améliorent la biodisponibilité et le passage d’agents thérapeutiques, notamment à travers la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) du cerveau. Ainsi, grâce à la reconnaissance spécifique d’un partenaire ou d’un récepteur (protéine), le complexe vecteur-médicament pourra reconnaître sa cible et franchir cette barrière pour agir dans le parenchyme nerveux. Le réseau sanguin irrigant étroitement la totalité de l’organisme, ce principe de délivrance pharmacologique peut s’appliquer à tout type de tissu ou organe périphérique. Notre société développe de peptides vecteurs (peptides, fragments d’anticorps), conjugués avec différentes classes de molécules (agents d'imagerie, drogues thérapeutiques, siRNA) et proposés comme potentiels candidat-médicaments VHH. Dans notre cas, des peptides, drogues, ou dernièrement de petits ARN interférents (siRNA), dont la finalité sera de bloquer en amont les ARN messagers responsables de l’expression de certaines protéines impliquées dans l’apparition symptomatique de certaines pathologies. Les études sur sujets sains permettent notamment de mieux comprendre et appréhender leurs disfonctionnements, sans que pour autant elles n’aient à court termes d’effets sur la santé et le bien-être animal. Dans ce projet (procédure 1) nous proposons d’étudier à différents temps d’incubation, la biodistribution de nos vecteurs conjugués (VHH) et/ou leurs efficacités, par mesure des quantités d’ANRm rémanentes dans les organes ou tissus d’intérêts. L'assurance de l'innocuité de nos conjugués VHH par des études d'immunogénicité, nous amène à doser certaines protéines plasmatiques et, rapporté à une gamme de référence (procédure 2), à quantifier et identifier toute apparition d'une inflammation.
Bénéfices attendus
Parmi les avantages de nos procédures, on retrouve la sensibilité d’action de nos VHH et les faibles quantités administrées (posologies), qui seront de fait dans ce projet, revues à la baisse par rapport aux autres thérapies plus lourdes, actuellement utilisées (3R : raffinement). Egalement, qui dit doses moindres, dit, risques de toxicités moindres pour les animaux. Le potentiel de ciblage thérapeutique et l'innocuité de nos Vecteurs médicaments constituent en soit les principaux objectifs de nos recherches, dont les conséquences, par le bénéfice thérapeutique, peuvent jouer un rôle considérable dans le milieu médical et surtout, à terme, sur le quotidien des patients.
Procédures
Au cours des 2 procédures, nous allons manipuler les animaux en vigile, au cours des administrations (administration i.v. 5.5ml/kg ; i.p. ou s.c.10ml/kg) et des prélèvements de sang intermédiaires (Prélèvement codal ≤50 µl). Puis, dans un deuxième temps; en post-mortem, pour l’exsanguination et les prélèvements de tissus/organes. -Les administrations, rapides (quelques secondes) et précises, se feront sous forme de bolus ou bolus répétés. L’expertise des expérimentateurs garantit la rapidité du geste et de la manipulation sans stress. -De même, le prélèvement intermédiaire, en caudal (PI) (≤ 50 microlitres) sera réalisé en 1 seule fois, sur un temps intermédiare : L'animal sera placé et immobilisé en contention spécialisée, puis, par une légère et micro-incision cutanée de l’extrémité de la queue (idem biopsie génotypage), le sang sera collecté sur tube hépariné (10UI/ml) ou EDTA, à raison de 2-3 gouttes 20 microlitres de sang. Nb : Seuls les temps longs nécessitent un prélèvement intermédiaire. Par la suite, les prélèvements (exsanguination, prélèvements tissulaires) se feront sur animal euthanasié en post-mortem : anesthésié/analgésié à dose létale (Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg); Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm) environ 10 minutes avant la fin de la cinétique. Donc ici, pas de procédures chirurgicales avec réveil, seulement une euthanasie et prélèvements sur du post-mortem.
Impact sur les animaux
Les composé VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité avérée. En cas de souffrances, choc, ou effets indésirables en cours de cinétique (les animaux sont quotidiennement suivits et annotés), une procédure spéciale d'euthanasie à forte dose d'anesthésiques est prévue (cf. 5.6.1). Pour notre 2ème procédure, les quantités de LPS administrées sont largement inférieures au quantitiés rapportées comme toxiques voire létales dans la bibliographie et ces tests communs et standardisés restent significativements en dessous de la DL50, de 10mg/kg.
Devenir
A l'issue de la procédure (fin cinétique d'incubation des vecteurs médicaments ou de cinétique d'endotoxémie) les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements de sang et tissus (Dose létale d'anesthésique en intrapéritonéal; Kétamine 150 mg/kg ; Xylazine 15 mg/kg); Aiguilles 25G (‘5/8’’ ; 0.5*16 mm)
Remplacement
Pour mener à bien notre modèle préclinique, nous envisageons après validation in vitro de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, indispensable pour l’étude de ces mécanismes (3R : remplacement). Actuellement, le modèle murin ne peut pas encore être remplacé par des modélisations prédictives ou autres alternatives de remplacement. Seul le modèle animal mammalien et proche de l'homme permets de prendre en compte les mécanismes physiologiques pour prédire du comportement d'un médicament, d'un modèle thérapeutique et de son efficacité. Dans ce contexte, le modèle murin, ici la souris, reste l'idéal et surtout, le plus facile à mettre en pace pour ce genre de procédures.
Réduction
Procédure : Le nombre d’animaux ou groupe expérimental nécessaire à l’obtention d’une significativité statistique (Réduction, règle des 3Rs) se fera sur de petits groupes (n=4 à raison de 1200 souris/an en procédure 1 et 240 souris/an en procédure 2), suffisant pour appréhender un effet des conjugués sur les souris. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus) nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes, un test de Kolmogorov-Smirnov ou encore une analyse de variance (N.S one-way ANOVA). En cas d’analyse dite qualitative, on parlera de succès ou d’échec.
Raffinement
Comme cité dans cette même partie de la procédure, nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Au minimum la veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclisée (12h/12h), insonorisée, ventilée, sous température et hygrométrie contrôlée, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage, litières et raffinements (dômes, tunels). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires.
Choix des espèces
Toutes études de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos VHH ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des conjugués développés. L'utilisation de rongeurs (ici, n= 1200 souris/an) impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations (Article R. 214-105, code rural et pêche maritime) et cahier des charges.
Evaluation du comportement et de la tolérance hémato-biochimique chez le chien Beagle suite à l’administration orale d’un extrait végétal standardisé
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
20 chiens Beagle vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés vivants et réutilisés à l'issue. Ils reçoivent chaque jour pendant trois mois un extrait végétal par voie orale et subissent des prélèvements de sang à la veine jugulaire à cinq reprises, pour en tester la tolérance et l'effet sur le comportement. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance et prévoit de replacer les chiens dans leur environnement d'étude à la fin. Sur le remplacement, il indique que le chien est l'espèce visée par le produit et qu'il n'existe donc pas d'alternative.
Objectifs
La plante constitue une solution de santé curative et/ou préventive pour les maladies multi-factorielles en raison de la nature multimoléculaire des bioactifs dont elle est composée. Parmi les plantes d’intérêt, une est traditionnellement utilisée pour ses propriétés sédative ou antispasmodique. Bien que des recherches récentes aient étudié les effets bénéfiques d'un des composants majeurs de cette plante, peu ou pas d’études ont exploré directement le potentiel anti-antioxydant et anxiolytique de l’extrait standardisé de la feuille de cette plante chez le chien. Cet extrait contient les principaux constituants biochimiques de cette plante (acides phénoliques incluant l’ensemble des dérivés cinnamiques, flavonoïdes, triterpènes) dont l’action combinée et/ou synergique pourrait lui conférer des effets bénéfiques supérieurs à ceux susceptibles d’être exercés par le composant actif majeur. Ces effets restent globalement, jusqu’à présent, inconnus et peu ou pas explorés notamment chez les carnivores domestiques. Les données relatives à l’action calmante ou anxiolytique de l’extrait standardisé chez le chien restent limitées à ce jour. L'objectif de ce projet sera d'abord d’évaluer la tolérance hémato-biochimique de notre extrait botanique standardisé et de son traceur chez le Chien Beagle sain. Seront également étudiés les effets de cet extrait et de son traceur sur le comportement (à l’aide de grille de scoring) et le statut oxydant. Notre principale hypothèse est que la richesse et la diversité moléculaire de l'extrait botanique étudié (flavonoïdes, acides phénols, dérivés cinnamiques, etc.) et surtout la potentielle action synergique et/ou additive de ses molécules bioactives pourrait lui conférer une action comportementale plus marquée, en impliquant certains mécanismes, comme une action inhibitrice de l’activité de la GABA-T plaquettaire (reflet de la GABA-T centrale, augmentation de la concentration sanguine du GABA). Le traceur testé correspond à un des constituants actifs majeurs de l'extrait végétal étudié. Il appartient au groupe chimique des acides phénols ; il possède des propriétés anti-oxydante, anti-inflammatoire, sédative et organo-protectrice (hépatique et rénal). Dans ce projet, il sera incorporé dans l’aliment à une dose 300 fois inférieure à la dose maximale de sécurité recommandée par l’EFSA.
Bénéfices attendus
Les travaux conduits dans le cadre de ce projet devraient permettre de mettre en évidence d'abord l'acceptabilité de l'extrait botanique étudié et ses effets sur le comportement et le statut oxydant chez le Chien Beagle sain. Le design adopté permettrait de déterminer si l’extrait botanique testé exerce une action supérieure à celle conférée par son traceur. L’hypothèse testée est basée sur la potentielle nécessaire synergie d’action des principes actifs présents dans le totum de l’extrait végéal. La validation des effets de l'extrait botanique étudié permettrait d'envisager son utilisation comme alternative aux traitements chimiques allopathiques dans le cas d'altération du bien-être et/ou du comportement.
Procédures
Aucune nuisance n'est attendue de l'extrait standardisé testé, les données concernant les doses maximales à ne pas dépasser chez le Chien sont disponibles et publiées par l'EFSA. Dans tous les cas, toute souffrance ou toute altération de l'état général, l’animal sera mis en observation pour lui apporter d'éventuels soins. Si la souffrance, pour des raisons inconnues, persiste, il sera exclu de l'étude. Les chiens seront exposés à trois types d'intervention nutritionnelle pendant une durée de 3 mois : un lot de 5 chiens recevant le régime standard et une administration orale quotidienne de l'extrait végétal étudié ; un lot de 5 chiens recevant le régime standard et une administration orale quotidienne du traceur actif de l'extrait végétal étudié; et un lot de 5 chiens recevant le régime standard et une administration orale quotidienne d'un aliment complémentaire à visée comportementale. Un prélèvement sanguin de 8 ml au niveau de la veine jugulaire sera réalisé par une personne expérimentée sur tous le chiens pendant la durée du protocole (J0; J15 ; J30 ; J60 ; J90). L'acte de prélèvement dure 2 minutes environ (contention par un tiers, rasage et désinfection du site de prélèvement).
Impact sur les animaux
Aucune nuisance n'est attendue de l'extrait standardisé testé, les données concernant les doses maximales à ne pas dépasser chez le Chien sont disponibles et publiées par l'EFSA. Il n' y a pas risque de douleur ou de souffrance associé à l'acte de prélèvement sanguin. Cet acte dure 2 minutes environ (contention par un tiers, rasage et désinfection du site de prélèvement).
Devenir
Les animaux sont replacés dans leur environnement d'étude après chaque procédure. Le comportement des animaux est surveillé (par la SBEA) à la fin du projet pour s'assurer de leur bonne santé.
Remplacement
Le Chien est l'espèce cible des résultats du projet. Il n'y a donc pas d'alternative qui permettrait son remplacement.
Réduction
Nous utilisons 5 chiens par groupe afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélévement étant répété sur chaque chien, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.
Raffinement
L'hébergement respecte les recommandations en vigueur chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (balade et moments en liberté , jeux...). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.
Choix des espèces
Les chiens sont des adultes de 2 ans, en bonne sant et n'ayant pas reçu de traitement antibiotique ou tout autre traitement pouvant modifier le comportement, depuis au moins 3 mois. Le Chien est l'espèce cible des résultats du projet. Il n'y a donc pas d'alternative qui permettrait son remplacement.