Oncologie
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Impact du stress in utero dans le désordre métabolique
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
884 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées d'une étape à l'autre puis mises à mort pour prélever leurs organes. 52 femelles gestantes sont immobilisées dans un tube de contention sous lumière vive trente minutes, trois fois par jour pendant six jours, pour induire un stress prénatal, et leur descendance subit des tests de tolérance au glucose avec gavage et prises de sang à la queue. Le porteur décrit ce protocole comme un modèle de stress psychologique humain transposé à la souris. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes alternatives sont peu représentatives des pathologies humaines et rend le recours à l'animal "incontournable", le stress et les désordres métaboliques étant des réactions de l'"organisme entier".
Objectifs
La prévalence mondiale du développement de maladies métaboliques est en perpétuelle augmentation à travers le monde. L’objectif de notre projet est d'étudier les mécanismes du stress sur le développement de ces pathologies dans la descendance.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact d'un stress prénatal se rapprochant d'un modèle de stress psychologique chez l'humain, chez la souris. Ce projet apportera des connaissances sur la physiopathologie des désordres métaboliques altérés par le stress au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Pour générer des souris F1 issues de mères stressées, 52 femelles seront placées dans un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour, pendant 6 jours, du 13ème jour au 18ème jour de gestation. L'ensemble des souris F1, soit 624 sera soumis à un test de tolérance oral au glucose avec gavage sur animaux vigiles et avec prélèvement de sang à la queue. Parmi ces animaux, la moitié, soit 312 animaux seront soumis à deux tests de tolérance oral au glucose avec prélèvement de sang à la queue 3 mois après. Ces expériences seront réalisées sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Ce modèle n'induit pas de douleur spontanée chez la souris. Nous attendons le premier jour de la procédure de stress une stabilisation du poids ou une perte de moins de 3.5% du poids des mères gestantes en comparaison avec les mères gestantes non stréssées. Dès le deuxième jour de la procédure de stress les mères gestantes doivent reprendre du poids. Le stress réalisé sur les mères gestantes ne comporte pas d'effet visible comportemental. Nous attendons un stress léger sur la génération F1 qui pourrait se manifester sur les différents paramètres mesurés, notamment une augmentation de la glycémie à jeun ou en réponse à l'administration de glucose.
Devenir
Les animaux ayant servi à générer la descendance F1 seront mis à mort et des prelèvements d'organes seront réalisés. Les souris F1 sous régime normal ou sous régime particulier seront euthanasiées à différents âges : adulte jeune ou adulte mature après la procédure du test de tolérance oral au glucose. Différentes expériences seront réalisées ex-vivo et des prélèvements tissulaires seront collectés pour différentes études au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut métabolique au cours du temps de la descendance suite à un stress gestationnel sont peu représentatives des pathologies humaines. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin d'étudier les mécanismes engagés entre l'effet du stress in utéro et les désordres métaboliques observés chez la descendance. De plus, le stress et les désordres métaboliques sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.
Réduction
Le nombre de 8 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées. L'ensemble des procédures seront réalisé lors de 3 expériences indépendantes.
Raffinement
Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives : suivi du poids, observation du bien etre animal. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.
Choix des espèces
La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine.
Identification de nouveaux mécanismes de réabsorption hydro-sodée dépendants de l’aldostérone dans le rein chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation des deux glandes surrénales et la pose d'une mini-pompe, puis une injection d'aldostérone et une perfusion du rein sous anesthésie avant d'être tué par dislocation cervicale pour prélever les tubules rénaux. Le porteur indique que l'ablation surrénalienne peut provoquer léthargie, perte de poids et déshydratation, et que la ligature de l'aorte peut être douloureuse, avec des points limites prévus. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne reproduit in vitro la complexité cellulaire du rein et juge le modèle animal "indispensable".
Objectifs
L’hypertension artérielle est un facteur de risque cardiovasculaire qui affecte entre 10 et 40% de la population en fonction de l’âge. Les reins sont indispensables pour la régulation de la pression artérielle. L'acteur majeur de cette régulation est l’hormone aldostérone, qui agit au niveau d'une portion spécifique du rein appelée tubule distal. Des dysfonctionnements de la production ou de l’action de l’aldostérone sont responsables de maladies entrainant une hypertension artérielle ou une perte rénale de sel associée avec une baisse de la pression artérielle. L’objectif du projet consiste à mieux comprendre les mécanismes d’action de l'aldostérone sur le tubule distal. Nous allons prélever les tubules distaux des reins de souris traitées ou non avec de l’aldostérone afin de réaliser une « carte d’identité cellulaire » de ces cellules et ainsi comprendre les effets de l’aldostérone sur ces cellules. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes de l’action de l’aldostérone sur la régulation du sodium et du potassium par les reins et sur le contrôle de la pression artérielle. Ils seront également utiles pour le développement de nouvelles options thérapeutiques pour le traitement de l’hypertension artérielle et des maladies héréditaires touchant les tubules rénaux.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet devraient permettre d'établir une cartographie moléculaire du néphron distal et de définir de nouvelles cibles cellulaires et fonctionnelles du MR impliquées dans la réponse à l'aldostérone. L’identification de nouveaux mécanismes moléculaires de régulation de la balance hydro-sodée dépendante de l’aldostérone pourrait ouvrir des perspectives nouvelles dans la compréhension de la régulation de la pression artérielle et le développement d’hypertension dans la population générale, mais aussi une meilleure compréhension des bases mécanistiques de certaines pathologies touchant le néphron distal.
Procédures
Afin d’évaluer la réponse aigüe des cellules du néphron distal à l’aldostérone, nous devons nous affranchir de la production endogène de cette hormone par les glandes surrénales. Pour cela nous allons procéder à une surrénalectomie bilatérale ; il est cependant nécessaire de compenser la perte en glucocorticoïdes produits par cette glande par un apport exogène en glucocorticoïdes. L’établissement de ce modèle se décompose en trois étapes principales : 1) La surrénalectomie bilatérale qui permet l’arrêt de la production endogène d’aldostérone et la pose de mini-pompes osmotiques ALZET délivrant de la dexaméthasone (1ug/100g de poids corporel/jour) pour prévenir la chute du débit de filtration glomérulaire et assurer la survie des souris Durée de l'intervention 30 minutes. 2) Après 7 jours, une injection unique d’aldostérone (0,002 mg/kg de poids corporel) ou l’équivalent en volume de serum physiologique 0,9% est réalisée par la veine caudale pour évaluer les mécanismes moléculaires de la réponse aigue à l’aldostérone dans les cellules individuelles du néphron distal. 3) Une heure après l’administration d’aldostérone, les souris sont anesthésiées et le rein gauche est perfusé avec une solution contenant de la libérase afin de permettre une digestion partielle du rein et permettre la microdissection des tubules d’intérêt. Le rein est ensuite aussitôt prélevé. Durée de l'intervention 45 minutes. Les animaux sont ensuite mis à mort par dislocation cervicale. Dans la même procédure, le rein droit, le cœur, l’aorte abdominale, du tissu adipeux viscéral et le cerveau seront prélevés et stockés à -80oC pour des possibles études futures sur l’action de l’aldostérone sur autres tissus cibles.
Impact sur les animaux
Les manques en aldostérone ou en corticostérone endogènes suivant la surrénalectomie bilatérale peuvent être responsables d’une léthargie importante des souris, d’une perte de poids et d’une déshydratation. Ces effets indésirables sont prévenus par la supplémentation en dexaméthasone. La ligature de l’aorte avant la perfusion du rein avec la solution de libérase peut entrainer de la douleur aux souris. La procédure ne commence que lorsque l’animal est profondément anesthésié (immobilité, rythme cardio respiratoire lent, pas de réaction à la stimulation interdigitale). Une dose d'analgésie (Metacam 5 mg/Kg, soit 10 ml/KG SC) juste avant l’intervention est également administrée, si besoin une demi-dose supplémentaire de Kétamine seule à 10mg/kg (0,02 ml/kg) sera réinjectée. Des points limites en rapport avec ces nuisances éventuelles sont prévus.
Devenir
Il s’agit d’une procédure sans réveil qui concerne tous les animaux.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire in vitro la complexité de la composition cellulaire du rein en vue d’une analyse de l’impact de l’action de l’aldostérone sur cellule unique. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable à la réalisation de ce projet. Une approche in vitro sera ensuite développée pour étudier l’impact des gènes et voies de signalisation identifiés dans les tubules distaux de ces animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et nous avons établi des points-limites bien défini à chaque étape des procédures entrainant la mise à mort des animaux si nécessaire. Nous réduirons au maximum la souffrance animale, notamment en utilisant de l’analgésie et de l’anesthésie adaptée dès que cela sera nécessaire.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus Musculus) comme le modèle de choix, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques proches de l’homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Ce raisonnement s’applique tout particulièrement à l’étude de l’hyperaldostéronisme primaire, maladie complexe et impossible à analyser in vitro mais aussi aux syndromes de perte de sel. Tous les animaux utilisés seront âgés de 12 à 14 semaines au début de la procédure. Nous avons choisi d’étudier des souris adultes post pubères afin de nous affranchir de possibles différences (souris âgées) ou d’absences (souris non matures) de réponse de la fonction rénale.
Développement de vaccins thérapeutiques HLA universels contre les cancers
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 132 souris transgéniques humanisées pour des molécules HLA vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales sous-cutanées répétées et des prélèvements de sang à la veine sous-maxillaire, avant d'être tuées pour prélever la rate et d'autres organes. Le porteur vise un vaccin peptidique dit universel censé couvrir plus de 80 % de la population mondiale, un bénéfice renvoyé au développement futur. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire après vaccination ne peut être reconstituée hors d'un "organisme entier" et juge "indispensable" le recours aux souris transgéniques.
Objectifs
Une avancée majeure dans le traitement des cancers a été réalisée au cours de ces dernières années grâce à l’utilisation de l’immunothérapie. L’immunothérapie consiste à réactiver les cellules du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Bien que très efficace chez certains patients, une large proportion de personnes atteintes par le cancer ne répond pas à ces nouvelles thérapies (environ 80% des patients). De nombreuses études montrent à présent, que chez les patients traités par certaines immunothérapies, l’ajout d’une vaccination dirigée contre des cibles appelées «antigènes» présentes à la surface des cellules tumorales peut améliorer la destruction de la tumeur et induire une rémission ou une stabilisation des patients. Dans ce cas, l’efficacité de la réponse vaccinale dépend directement de la nature des antigènes sélectionnés pour cibler les tumeurs et de la capacité du système immunitaire à reconnaitre efficacement ces cibles tumorales. On appelle antigène toute substance capable de déclencher une réponse immunitaire visant à l'éliminer. Dans le cas des cancers, il s'agit le plus souvent de peptides (fragments de protéines) qui sont reconnus de manière spécifique par certains globules blancs, les lymphocytes T CD8 (étudiés dans le cadre de ce projet). Nous avons développé une méthode pour identifier des cibles tumorales très efficace pour détruire les tumeurs, consistant à activer le système immunitaire avec des antigènes bactériens très semblables à certains antigènes tumoraux. L’utilisation d’antigènes bactériens permet de réactiver une réponse immune similaire à celle pouvant exister lors d’une infection bactérienne et d’induire une réponse contre les tumeurs similaires à celle observée contre un pathogène étranger. Utilisés pour la vaccination des patients, ces antigènes bactériens semblables aux antigènes tumoraux pourraient devenir un nouvel outil pour le traitement des cancers. L’objectif de notre projet est de développer un vaccin thérapeutique efficace qui ciblerait la grande majorité de la population mondiale.
Bénéfices attendus
Les objectifs pour ce projet sont d'étendre nos connaissances scientifiques sur le mimétisme moléculaire peptidique à d'autres HLA et de développer un vaccin peptidique universel (pour tous).
Procédures
Les interventions auxquelles les souris seront soumises sont les suivantes pour la 1e procédure expérimentale (Immunisation par méthode prime-boost): • Vaccination par injection sous-cutanée : 2 injections à 14 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 3 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10 et 17 jours après la vaccination). Pour la procédure expérimentale n°2 (Cinétique de vaccination) : • Vaccination par injection sous-cutanée : 5 injections à 7 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 4 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10, 17 et 31 jours après vaccination)
Impact sur les animaux
Lors de l’immunisation des animaux et du suivi des cinétiques de vaccination, douleurs légères associées à une injection sous-cutanée et à des prélèvements de sang par voie sous-maxillaire (plaie réduite au point d’injection ou de prélèvement, œdème).
Devenir
Tous les animaux de cette procédure seront euthanasiés en fin d'expérience afin de pouvoir prélever leur rate et autres organes pour effectuer les analyses in vitro.
Remplacement
La mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination est un phénomène complexe. Cela implique la reconnaissance des antigènes par des cellules spécifiques et la collaboration de différents types cellulaires (lymphocytes T, B et cellules présentatrices d’antigène). L’efficacité de la réponse immunitaire est favorisée par de nombreux facteurs solubles provenant du microenvironnement dans lequel l’antigène est présenté. Ces particularités (collaboration de différents types cellulaires et microenvironnement) ne peuvent pas actuellement être reconstituées en dehors d’un organisme vivant. L’étude d’une réponse immunitaire après vaccination sur organisme entier ne peut donc être remplacée et n’a pas d’équivalent expérimental n’utilisant pas d’animaux. Il est donc indispensable d’avoir recours aux modèles animaux transgéniques pour le HLA humain pour récapituler ces interactions complexes antre cellules et microenvironnement afin de démontrer la mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination. Ce projet ne vise pas à l’évaluation directe d’une réponse anti-tumorale chez l’animal. La vaccination sera réalisée chez des animaux non porteurs de tumeur.
Réduction
En amont, 2 étapes ont permis de réduire le nombre de peptide et d’animaux qui seront utilisés : 1/ Une analyse in silico et la réalisation de tests in vitro ont permis de sélectionner un nombre restreint de peptides vaccinaux immunogènes et de forte affinité pour les HLA ciblés. 2/ L’analyse in silico via l’outil en ligne tools.iedb.org/population/ a permis de déterminer que le ciblage de 3 HLA-A (parmi les 68 possibles) et 2 HLA-B (parmi les 125 possibles) permet une couverture de 80% de la population mondiale. La réduction du nombre d’animaux a été réalisée pour permettre d’obtenir un nombre suffisant de données pour répondre à la problématique. L’utilisation d’outils statistiques du calcul de puissance de test et de taille d’échantillons (https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#), permet de définir un nombre minimal d’animaux de 12 par groupe, en considérant un seuil de significativité à p
Raffinement
Le bien-être des animaux étant primordial, les souris sont acclimatées au moins 7 jours avant le début de la procédure expérimentale. A réception, les souris sont hébergées par 7 maximum par cage pour les femelles et 6 maximum par cage pour les mâles. Les animaux seront maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (température, humidité, cycle jour/nuit), dans un espace suffisant, en groupe pour maintenir les interactions sociales, et avec un enrichissement environnemental permettant de répondre aux besoins physiologiques et comportementaux des souris (présence de petite maison permettant aux animaux de se cacher). Toutes les manipulations seront réalisées dans le respect de l’animal. Le temps de manipulation des animaux sera de plus réduit au maximum afin de réduire le stress des animaux et l’impact possible sur la réponse immunitaire. La procédure expérimentale (vaccination) est de classe de gravité légère et ne nécessite pas d’y associer un protocole d’anesthésie. Les prises de sang régulières seront effectuées afin de suivre l’évolution dans la circulation sanguine la reponse immunitaire, ce qui élève le niveau de la procédure à une classe modérée. Ces prélèvements de sang seront effectués à la veine sous-maxillaire, 1 fois par semaine (ou tous les 15jours), selon le chronogramme prédéfini (cf annexe). Un volume total prélevé inférieur à 10% du volume sanguin de l’animal (soit au total environ 100µL/semaine ou 200µL/15jours, pour une souris de 25g) sera effectué afin de ne pas causer de dommage aux animaux. Toujours pour le bien-être de l’animal, le prélèvement sera effectué par alternance sur les 2 côtés.
Choix des espèces
Le principe de la vaccination repose sur la présentation des antigènes par le système HLA chez l’Homme. Le système de présentation antigénique est différent d’une espèce à l’autre. Ainsi les antigènes reconnus chez la souris peuvent être très différents de ceux reconnus chez l’homme car présentés par des molécules CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) différents. Le vaccin final développé dans le cadre de ce projet représente un mélange de plusieurs peptides restreints par le HLA. Ce vaccin sera un vaccin HLA universel qui traitera une grande majorité des patients cancéreux (prédiction >80%) car ciblant les HLA du locus A et B les plus représentés chez l’homme (HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B35 et HLA-A2). Ce projet nécessite donc l’utilisation de souris dites humanisées transgéniques pour les différents HLA humains et parfaitement caractérisées pour leurs réponses aux vaccins peptidiques humains (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7 ou HLA-B35 restreint). Le modèle de souris transgéniques humanisées pour les différents HLA-A et HLA-B sont des modèles existants et relevant pour étudier l’immunogénicité de ces vaccins destinés à l’homme. Les études pourront être réalisées sur des souris adultes âgées au début de l’expérimentation de 7 jusqu’à 15 semaines, âge où le système immunitaire est mature et donc à partir duquel une réponse immunitaire peut être correctement évaluable. Pour chaque étude, des souris d’âges similaires seront utilisées (plus ou moins une semaine). En cas de variation de plus d’une semaine, les animaux seront répartis de façon équilibrée dans chacun des groupes afin d’assurer l’homogénéité des groupes.
Etude de l’effet d’expositions aux radiofréquences du téléphone portable sur la neurogenèse par la technique 5- bromo-2’-deoxyuridine
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
98 rats, dont 14 femelles gestantes et 84 ratons, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes sont exposées aux radiofréquences du téléphone portable de la gestation au sevrage, puis mères et descendants reçoivent une injection de BrdU et sont mis à mort deux heures après pour prélever le cerveau et mesurer la neurogenèse. Le porteur nomme les tests comportementaux imposés, réflexes néonataux, activité exploratoire en open-field et test de retournement, pour évaluer l'effet de l'exposition sur la maturation cérébrale. Sur le remplacement, il affirme que les approches in vitro et in silico ne peuvent pas répondre à la question sur un organisme en interaction avec son environnement et conclut à la nécessité du recours au rat.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de préciser l’impact d’expositions aux champs électromagnétiques (CEM) des télécommunications (comme le téléphone portable) sur la neurogenèse. Ce projet sera réalisé sur 98 rats Sprague-Dawley (14 femelles gestantes et 84 ratons, en considérant que 6 ratons/portée seront obtenus) répartis en deux groupes expérimentaux, exposés ou non aux CEM (cf. ANNEXE 1). Une procédure est considérée dans le cadre de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des réponses aux questions scientifiques et aux préoccupations sociétales concernant les possibles effets neurobiologiques des expositions développementales aux champs électromagnétiques avec le minimum de rats pour le projet.
Procédures
Aucune intervention de type prélèvement sur animal vigile ou chirurgie n'est prévue. Deux heures avant leur mise à mort, les rats recevront une seule injection intrapéritonéale de BrdU (150 mg/kg pour les mères et 50 mg/kg pour les descendants à PND9, 21 et 44 dans un volume maximum injecté de 6 ml/kg pour les animaux traités à PND9 et de 10 ml/kg aux autres âges). Préalablement à leur sacrifice, le cas échéant (en cas d'atteinte de point limite nécessitant la mise à mort après l’âge de PND15), les animaux recevront une seule injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital (EXAGON, 400 mg/kg, ou traitement équivalent recommandé par le vétérinaire référent). Préalablement à leur mise à mort, les rats seront sédatés par inhalation d’isoflurane. Au bout de quelques minutes, l'anesthésie profonde sera vérifiée et les rats seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Nous n'attendons pas de nuisance ou d'effet indésirable sur les animaux suite à la réalisation de la procédure n°1 de ce projet. Néanmoins, des signes critiques et les actions correctives qui seront menées en conséquence sont envisagés afin d’être en mesure de pallier toute manifestation inopinée de souffrance des animaux hébergés dans notre animalerie même si sa cause n’est pas prévisible et est indépendante des actions de la procédure n°1.
Devenir
Tous les rats seront mis à mort aux temps de sacrifices définis pour effectuer des prélèvements biologiques post-mortem qui permettront de réaliser des analyses biochimiques et de biomarqueurs cérébraux.
Remplacement
Pour ce qui est du remplacement, les approches cliniques, in vitro et in silico, par leurs limitations éthiques et techniques, ne peuvent pas répondre au questionnement concernant l’impact des expositions aux CEM-RF sur le positionnement et la morphologie des nouveaux neurones sur un organisme en interaction sensorielle avec son environnement et doué de thermorégulation, nécessitant de fait le recours aux études in vivo.
Réduction
Au plan de la réduction, plusieurs paramètres biologiques seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés. Les coupes de cerveau qui seront réalisées ex vivo seront exploitées pour l’analyse de plusieurs marqueurs (marquage du BrdU, marqueurs neurotrophiques, de l’inflammation et du stress oxydant) fortement questionnés dans les effets in vivo des CEM. Les variables quantitatives (marqueurs ex vivo, poids, …), seront analysées par 4-ways ANOVA ou 3-ways ANOVA suivi d’un test post-hoc avec la correction de Bonferroni, en fonction de paramètres inter-sujet (sexe, niveau de champs électromagnétique, âge) et intra-sujet (le temps pour les variables mesurées plusieurs fois chez un même rat (poids, tranches de 5 minutes pour l’activité locomotrice,…)). Les variables de rang (mesure du délai de retournement dans le « surface righting » sur un maximum de 60 secondes, …) seront analysées par le test du log Rank.
Raffinement
Concernant le raffinement, chaque animal sera observé quotidiennement et pesé tous les 2 jours. Des feuilles d’observation permettront de consigner les signes anormaux concernant l’apparence, le comportement, les signes cliniques, etc. En période périnatale, une attention particulière sera portée au bien-être des mères et de leur portée et à la nidification. L’état de santé des animaux sera suivi à l’aide d’une grille de scores (cf. ANNEXE 2) qui indiquera l’action à mener de prise en charge de la douleur. De plus, les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être. Pendant la période périnatale, les rates seront hébergées seules puis avec leur portée. A partir du sevrage, tous les rats seront hébergés par sexe par groupe à plusieurs par cage pour leur socialisation. Un fond sonore musical sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, et éventuellement des bâtons en bois à ronger, seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Une sédation par inhalation d’isoflurane sera pratiquée préalablement à la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
Le rat est un animal de référence pour les études de toxicologie. En particulier, ses systèmes neurobiologiques et physiologiques ont été largement étudiés en laboratoire. Il existe une documentation très complète dans le domaine, dans la littérature et les ouvrages spécialisés. L’UMR PériTox possède une expertise en recherche en toxicologie expérimentale. Ces recherches ont été effectuées majoritairement chez le rat. Dans un souci de comparer nos résultats avec les résultats obtenus précédemment concernant les effets des CEM sur les fonctions cérébrales, nous avons choisi la même espèce. De plus, le personnel qui sera en charge des expérimentations est formé et possède une expérience reconnue pour l’entretien et l’observation des rats. Les femelles gestantes arriveront à l’animalerie au jour gestationnel (G) 3 et seront exposées à partir de G8 aux CEM-RF jusqu’au sevrage de la descendance, au jour postnatal (PND) 21, soit approximativement durant 35 jours. Elles seront sacrifiées à PND21 pour évaluer les effets de l’exposition sur leur neurogenèse. Les effets de l’exposition sur la mise en place de la fonction cérébrale seront évalués sur la descendance au stade néonatal (réflexes néonataux évalués de PND3 à 10), au stade juvénile et à l’adolescence (activité exploratoire évaluée dans l’open-field respectivement entre PND17 et 19, et entre PND41 et 43). Les femelles gestantes recevront une injection de BrdU à PND21 et la descendance aux stades néonatal (PND9), juvénile (PND21) et adolescent (PND44), et seront mis à mort 2h après pour examiner la neurogenèse. Cette analyse permettra d’identifier le stade développemental le plus sensible aux expositions aux CEM-RF et les effets à court/long terme et transitoire/permanent sur la neurogenèse et la fonction cérébrale tout au long de la maturation cérébrale.
1/2: Impact de la neuro-inflammation dans les déclins cognitifs et comportementaux liés à l’âge et aux diabètes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 160 et sévère pour 160. Soumises à un régime gras pendant 14 semaines puis à des injections de streptozotocine pour induire un diabète, y compris des animaux âgés de 18 à 24 mois, elles passent des tests de champ ouvert, de reconnaissance d'objet et de labyrinthe surélevé. Le porteur fixe des points limites, dont la mise à mort en cas de perte de poids supérieure à 20 % ou de glycémie effondrée. Il affirme que les tests de comportement et de métabolisme rendent le modèle in vivo "indispensable".
Objectifs
On sait que le vieillisement est associé à un déclin des fonctions cognitives. Il a été montré que le diabète était lui aussi associé à un déclin cognitif accéléré. A titre d'exemple, 19 à 25% des diabétiques de types 2 souffrent d'un déclin cognitif avant l'âge de 60 ans. De la même façon, les patients avec un diabète de type 1 peuvent présenter des dysfonctions cognitives assez précocement. Le diabète de type 2 est en effet reconnu pour être un facteur de risque du déclin cognitif. De plus le défaut et la résistance à l'insuline observés dans les diabètes sont associés à des altérations de la mémoire hippocampo-dépendante. L'augmentation de la prévalence du diabète ainsi que le vieillissement général de la population font du déclin cognitif un enjeu majeur de santé. Les mécanismes communs au vieillissement et aux diabètes sont : une perte de la tolérance immunitaire, une baisse dans la capacité de réguler son métabolisme ainsi qu'une inflammation centrale (neuro-inflammation) et systémique induisant des changements de comportement, d'habitudes alimentaires, d'activité, ainsi que des troubles cognitifs (perte de mémoire, anxiété). La neuro-inflammation est souvent associée aux maladies neuro-dégénératives. Cette neuro-inflammation présente dans les diabètes est suspectée d'être à l'origine de l'aggravation du déclin cognitif lié à l'âge. Au niveau cellulaire, la neuro-inflammation est un processus résultant de la présence de cellules gliales activées (astrocytes/microglies) dans le cerveau. Cibler la neuro-inflammation dans le but de traiter les maladies neuro-dégénératives pourrait donc être une porte d'entrée dans le ralentissement de l'apparition du déclin cognitif voire sa résolution.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier le rôle de la neuro-inflammation, dépendante du facteur de transcription étudié, dans l'accélération du déclin cognitif lié à l'âge, dans un contexte diabétogène (diabète de type 1 ou 2) ou non-diabétogène. Ce facteur de transcription pourrait donc être une cible thérapeutique intéressante permettant de ralentir le déclin cognitif. Celui-ci étant considéré, avec le vieillissement de la population et l'augmentation de la prévalence des diabètes comme un enjeu majeur de santé pour les années à venir. A terme, le projet permettra de déchiffrer les mécanismes inflammatoires qui contrôlent le déclin cognitif lié à l'homéostasie glycémique du patient. Ces études permettront d'associer l'inflammation locale du système nerveux central à l'inflammation systémique dépendante du facteur de transcription en question, qui était mis en évidence dans des études précédentes. Cette inflammation systémique pourrait être un bio-marqueur du déclin cognitif précoce dans le diabète.
Procédures
Les souris suivront un régime commercial contenant 60% de lipides pendant 14 semaines. Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Les souris seront observées et pesées une fois par semaine. Classiquement les souris atteignent un poids situé entre 35 et 45 grammes à la fin du régime. A la 12e semaine du régime, les animaux recevront des évaluations comportementales sur 2 semaines. Le protocole d'injection stréptozotocine consiste en l'injection quotidienne de faibles doses de streptozotocine (40mg/Kg, diluée dans du tampon citrate à 50mM; pH 4.5) en intrapéritonéal pendant 5 jours à l'aide de seringues de 1mL et d'aiguilles de 25G. Les souris sont ensuite remises dans leur cage d'origine avec de la nourriture et boisson ad Libitum. La glycémie des animaux sera mesurée quotidiennement durant cette période. En cas de glycémie trop basse malgré la supplémentation en sucrose de l'eau, un bolus de sucrose (20%) sera administré en intra-péritonéal. Environ 9 jours après la dernière injection de streptozotocyne, la glycémie des animaux sera mesurée à jeun (6h de jeûne). Tests comportementaux: Pour évaluer les capacités cognitives, nous allons utiliser 3 tests de comportement: le test de l'espace ouvert (Open Field; OF), le test de la reconnaissance d'un nouvel objet (NOR) et le test du labyrinthe surélevé (Elevated + maze). Les souris recevront ces tests avec un délai de 7 jours entre chaque. Le OF et l'elevated +maze sont des tests qui mesurent le comportement exploratoire du rongeur. Pour les 2 tests, les souris seront transportées vers la salle d'expérimentation dans leurs cages d'hébergement contenant une partie de leur litière d'origine. Elles seront laissées au repos durant 1 heure avant le test. Pour le test de l'OF, les souris seront placées à l'intérieur d'une enceinte de dimension 43X43 cm pendant 30 min. Le système est automatisé et permet la mesure de plusieurs paramètres comme la distance parcourue au centre, en periphérie, le temps et la vitesse. D'une façon similaire, pour l'elevated plus maze les souris sont observées par un système automatisé durant le test pour 15-20 min. Pour le NOR la souris sera placée dans la boite de comportement de dimension 60 x40 x 32 cm, qu’elle pourra explorer librement durant 5 min. 24 h plus tard, la souris sera placée dans le même environnement pendant 10 minutes avec 2 objets identiques, le lendemain un de ces objets est ramplacé par un nouveau, le comportement exploratoire est observé.
Impact sur les animaux
Les animaux sous régime gras auront une prise de poids plus importante que ceux sous régime normal. Ceux chez qui un diabète (de type 1 ou 2) sera induit présenteront une hyperglycémie. Les seules nuisances pouvant apparaitre concernent les injections de streptozotocine, qui est un composé toxique, il faudra alors veiller à ce que les souris ne perdent pas trop de poids (
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure afin d'effectuer des analyses de biologie moléculaire et cellulaire ainsi que d'histologie.
Remplacement
Pour réaliser les tests de comportement et de métabolisme, les modèles in vivo sont indispensables. La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car se rapprochant physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de cognitives et de comportement. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des publications précédentes. Pour finir les études de comportement et de cognition ne permettent pas l'utilisation de modèle in vitro en remplacement des modèles in vivo.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. Chaque souris est réutilisée pour chaque test comportemental. De plus de nombreux tissus (tissus adipeux, foie, rate, cerveau...) seront collectés après mis à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et transcriptomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. De plus nous avons choisi et déterminé un nombre de 20 souris par groupe en fonction de données de la littérature (Etudes de comportement suite à un régime riche en graisse, Ogrodnik et al., 2019) et grâce à l'utilisation d'un outil statistique "sample size calculation" (http://www.lasec.cuhk.edu.hk/sample-size-calculation.html). En se basant sur les résultats de tests comportementaux de l'article ci-dessus, nous avons calculé que pour obtenir une puissance de 90% avec une valeur alpha de 0.05, la taille de l'échantillon doit être de n=8 individus par groupe. En tenant compte des 10% de mortalité intrinsèque de cette lignée (C57Bl6/J) ainsi qu'à la mortalité dû au traitement (streptozotocine) et au vieillissement des souris, le nombre de 20 individus par groupe a été arrêté. Concernant les résultats, une analyse statistique (test de Wilcolxon) sera réalisée en tenant compte de la variabilité intra-groupe (T test (2 conditions), Test anova (plus de 2 conditions)), ainsi qu'un test ANOVA sur mesures répétées pour les mesures de glycémie et les poids des souris.
Raffinement
Dans cette étude aucun test douloureux n'est effectué. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les animaux seront nourris avec un régime enrichi en lipides pour induire une obésité et une insulino-résistance nutritionnelle, ou avec un régime normal (chow diet). Le change de la litière est réalisé une fois par semaine. Ce rythme pourra être réajusté si besoin pour les souris diabétiques grâce à une surveillance bihebdomadaire. Concernant les tests comportementaux les points limites suivants ont été établis: Grille d'évaluation pour les procédures comportementales: tout score ≥ 3 entrainera le retrait de l’animal et donc sa mise à mort. a) Variation du poids corporel (mesuré 2 fois par semaine). Le poids de référence sera celui de l'animal à l'arrivée. 0) Normal 1) Perte de poids 20% b) Apparence physique0) Normal 1) Manque de toilettage 2) Poil ébouriffé, yeux plissés ou bridés 3) Pelage ébouriffé, posture anormale (dos voûté) c) Changements comportementaux 0) Normal 1) Changements mineurs : démarche boîtante 2) Anormal : mobilité réduite, inactif, peu réactif aux stimulations 3) Très agité ou immobile, auto mutilation, agressif, prostré ou immobile. Pour les animaux traités avec la streptozotocine, une glycémie inférieure à 30mg/dL, suite aux injections, entrainera la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont adaptés à ce projet. De plus le laboratoire dispose déjà des souris transgéniques nécessaires pour l'étude, desquelles proviennent nos résultats précédents. Les animaux seront utilisés à environ 6 à 8 semaines pour certains afin d'étudier les effets du diabète à un stade précoce. Et à un stade adulte très avancé (18 - 24 mois) pour d'autres cohortes afin d'étudier le vieillissement.
Effets de composés chimiques inhibiteurs des voies d’entrée du calcium sur la croissance de tumeurs mammaires murines
- Recherche fondamentale
- Oncologie
207 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures légères pour 167 et modérées pour 40, dont 181 servant seulement à entretenir la lignée génétiquement modifiée. Les 40 femelles porteuses du transgène PyMT développent des tumeurs mammaires spontanées et reçoivent des injections trois fois par semaine pendant huit semaines de composés inhibant l'entrée du calcium. Le porteur prévoit l'euthanasie si la tumeur dépasse 1 000 mm³, s'ulcère, ou si apparaissent des signes de métastases pulmonaires ou hépatiques. Il affirme que le développement des métastases ne peut pas s'étudier in vitro.
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer féminin le plus fréquent qui représente la première cause de mortalité des femmes par cancer de par le monde. La forte mortalité associée au cancer du sein est essentiellement liée au développement des métastases qui ne peut pas s’étudier in vitro et nécessite le développement et l’utilisation de modèles animaux. L’évaluation in vitro de nouvelles molécules analogues du tamoxifène, utilisé comme traitement adjuvant (associé aux médicaments de référence pour renforcer leur action) de cancers hormono-dépendants, en particulier les cancers du sein, a permis d’isoler 2 composés d'intérêt de par leur action inhibitrice des voies d'entrées du calcium Ca2+ et de la prolifération de cellules cancéreuses. Ce projet multidisciplinaire pourrait permettre d'identifier des inhibiteurs des voies calciques pour lesquelles nous avons montré un rôle important dans le développement de métastases osseuses. Il s'agit d'un champ précis, concernant des molécules cibles de protéines originales (canaux ioniques membranaires), pour une problématique dans un domaine de la santé pour lequel il n'existe actuellement aucune thérapie efficace. Objectif : Il s'agit d'évaluer le rôle anti-métastatique et/ou anti-prolifératif des 2 composés dans le modèle murin PyMT (présence d'un antigène pro-tumoral du polyomavirus) du cancer du sein, qui est un modèle de progression tumorale spontanée. Ce projet nécessitera 40 souris pour les expériences et 181 souris pour l'entretien de la lignée et suivra la règle des 3R.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’apporter des éléments de preuve concernant l’efficacité de ce nouveau type de traitement.
Procédures
Les injections des molécules chimiques ou de véhicule seront réalisées sur animaux vigiles (100 µl de volume par injection intra-péritonéale). Cela concerne les 40 femelles hétérozygotes pour l'allèle PyMT avec 3 injections par semaine sur 8 semaines. Tous les prélèvements seront effectués après euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Les molécules chimiques à tester ne présentent pas de toxicité particulière aux doses testées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales
Remplacement
Nous avons tenté d'identifier des méthodes alternatives pour le développement du cancer de sein. Pour identifier le rôle des molécules anti-tumorales, nous avons besoin d'utiliser des systèmes complexes dans lesquels l’ensemble des paramètres physiologiques (ex: présence de vaisseaux sanguins, apport de métabolites sanguins vers la tumeur) qui sont modifiés lors du développement du cancer sont présents. En outre, le développement du cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur dissémination dans l’organisme. Ces systèmes doivent également refléter au mieux la complexité de la pathologie humaine. Cela nécessite l’utilisation de modèles de souris qui développent l’ensemble des propriétés observées dans le cas du cancer du sein chez la femme, ce qui est le cas du modèle PyMT.
Réduction
Les effectifs sont optimisés avec l'utilisation d'un seul groupe contrôle sans traitement et d'un seul groupe traité avec la molécule de référence. Les observations nécessitent une taille d’effectifs de 10 animaux par groupe afin d'obtenir une différence statistique de l'ordre de 25%, pour avoir 80% de chances de détecter une différence dans la taille des tumeurs ou le nombre de métastases (si elle existe) à l'aide d'un test T avec un risque d'erreur alpha de 5% .
Raffinement
Le développement des tumeurs sera limité et les animaux portant des tumeurs seront particulièrement suivis afin d'éviter toute souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages dont l’environnement sera enrichi (4 animaux par cage). Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement des cages d'hébergement systématique (cabanes, tubes, boîtes à oeuf et smarthomes®). Les souris seront suivies quotidiennement afin de vérifier leur état de santé et leur bien-être. Si la tumeur est ulcérée, nécrosée ou atteint plus de 1000 mm3 de diamètre, l'animal sera euthanasié. Si les tumeurs interfèrent avec le mouvement, nous fournirons de la nourriture sur le sol de la cage, ou de l'eau par l'intermédiaire d'agarose. L’observation de dyspnée démontrerait l’existence de métastases pulmonaires. Une distension abdominale serait une preuve de la propagation métastatique vers le foie ou le péritoine. Si une dyspnée ou une distension abdominale est observée, la souris sera euthanasiée. Les animaux qui sont moribonds (par exemple poil hérissé, apathique) ou avec une perte de poids corporel > 20% seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la moins complexe du point de vue phylogénétique qui permet tout de même de décrypter les mécanismes impliqués dans la carcinogenèse mammaire et d'évaluer les effets des traitements. Ce modèle murin est particulièrement adapté pour notre étude dans la mesure où les souris hétérozygotes pour le transgène PyMT développent des tumeurs mammaires au cours du temps et aussi des microtumeurs pulmonaires. Le développement du cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur dissémination dans l’organisme. Ces systèmes doivent également refléter au mieux la complexité de la pathologie humaine. Cela nécessite l’utilisation de modèles de souris qui développent l’ensemble des propriétés observées dans le cas du cancer du sein chez la femme, ce qui est le cas du modèle PyMT. Le projet sera réalisé sur des femelles adultes, les souris hétérozygotes pour l'allèle PyMT développent des tumeurs de la glande mammaire à partir de la 5ème semaine, identifiables à partir de j53.
Effet de la spiruline sur la dégradation des processus cognitifs liés à un régime hypercalorique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures classées légères. Soumis à un régime hypercalorique de type "cafétéria" pendant plusieurs mois, ils reçoivent chaque jour de la spiruline par gavage, puis passent des tests de reconnaissance d'objets et de mémoire spatiale. Le porteur teste l'hypothèse que la spiruline limiterait les déficits cognitifs liés à l'obésité et annonce comme bénéfice l'ouverture de pistes cliniques. Il affirme que l'évaluation des capacités cognitives ne peut se faire que sur l'animal entier.
Objectifs
L'obésité est une maladie complexe, multifactorielle, qui affecte plus d'un tiers de la population mondiale. Elle est devenue la première maladie « inflammatoire » non infectieuse et concerne aussi bien l'enfant et l'adolescent que l'adulte dans les pays industrialisés et les pays en voie de développement. L'Organisation Mondiale de la Santé définit l'obésité comme une surcharge pondérale par excès de masse grasse qui a des conséquences néfastes pour la santé, dans ses trois dimensions, somatique, psychique et sociale. Selon les dernières estimations de l'OMS, 1,6 milliards d'adultes de plus de 15 ans seraient en surpoids, et 400 millions seraient obèses. En France, selon la dernière enquête épidémiologique on estime que 31,9% des français de plus de 18 ans sont en surpoids, et 14,5% sont obèses. Outre les conséquences sociales et psychologiques qu'engendre cette pathologie, elle représente un risque majeur de développement des maladies cardiovasculaires et d’altération des fonctions cognitives. Au cours des dernières décennies, de nombreux efforts ont été consacrés à l'étude de différentes espèces végétales en raison de leurs activités pharmacologiques puissantes, de leurs effets secondaires moindres et de leur coût relativement faible. En particulier, la spiruline (Spirulina platensis) une algue microscopique suscite un intérêt important et un certain nombre de travaux indique qu’elle pourrait avoir un effet anti-obésogène. Le projet a pour objectif d’étudier l'impact de la spiruline à la fois sur l'installation de l'obésité induite par un régime hypercalorique et sur les perturbations cognitives de cette obésité. En effet, de nombreuses études montrent que l’obésité affecte les capacités d’apprentissage et de mémoire dépendantes de l’hippocampe chez les animaux et l’homme. Plus spécifiquement nous étudierons les effets de l’obésité induite par un régime « cafétéria » sur la reconnaissance d’objets et la mémoire spatiale dans une tâche d’exploration d’objets, ainsi que les effets de la prise de spiruline pendant le régime cafétéria sur ces mêmes processus mnésiques. L'hypothèse du projet est que la prise de spiruline empêche également l’installation des déficits cognitifs induits par l’obésité.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont d’apporter des connaissances fondamentales sur les effets de la spiruline sur l’obésité, et d’ouvrir des pistes cliniques de traitement préventif de l’obésité. En effet, les hypothèses du projet sont que la spiruline empêche l’installation des mécanismes physiologiques de l’obésité (prise de poids) et contrecarre les effets délétères de l’obésité sur la cognition et la mémoire.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure de gavage pour administrer la spiruline. L'intervention pour le gavage dure de 5 à 7 s. Le gavage aura lieu une fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (2 mois + la durée des tests comportementaux c'est -à-dire au total 3 mois environ).
Impact sur les animaux
L'effet indésirable principal est lié à la réalisation du gavage pour l'administration de la spiruline. L’expérimentateur maitrise la technique de gavage chez les rats car elle la pratique depuis plusieurs années. Si des difficultés surviennent dans la mise en œuvre de cette technique, ce qui peut se manifester par une résistance à l’insertion de la canule d’administration, des traces de sang sur la canule, un comportement anormal (halètement), l’opération de gavage sera suspendue pendant plusieurs jours. Un autre effet indésirable potentiel sur la physiologie est la prise de poids liée au régime hypercalorique. Cependant, il est à noter que bien que le régime cafétéria induise une hyperphagie et aboutit à une prise de poids plus rapide que les animaux contrôles, le poids des animaux en surpoids reste dans une gamme de poids "normale" pour ces animaux. La courbe de poids provenant d'études réalisées par l’expérimentateur et d’autres études (en annexe 3) montre qu'après 3 mois de régime cafétéria, les animaux pèsent aux alentours de 350-400 g. Ainsi cette prise de poids, si elle est rapide ne sera pas, dans l’absolu, d'une ampleur telle qu’elle aurait un effet délétère sur la motricité par exemple. Cependant, l’expérimentateur sera vigilant sur l’état général de l’animal qui sera vérifié quotidiennement selon la grille de score approuvée par la SBEA.
Devenir
A l'issue les animaux seront mis-à-mort afin de prélever le cerveau pour mesurer les marqueurs du stress oxydant et des défenses anti-oxydantes.
Remplacement
Ce projet repose sur un modèle rongeur de l’obésité qui permet une induction rapide de l’obésité et qui permet de tester les effets de traitements potentiellement efficaces contre l’obésité. L’évaluation des capacités cognitives et mnésiques ne peut se faire que chez l’animal entier, et non avec des études in vitro ou de la modélisation.
Réduction
Le régime cafétéria induit une obésité chez tous les animaux. Le nombre d’animaux minimum nécessaires pour les tâches de reconnaissance est de 8 par groupe. Ce nombre permet d’obtenir des données qui peuvent être analysées statistiquement soit par des test paramétriques (dans le cas d’une distribution normale des données) ou non paramétriques.
Raffinement
Les régimes alimentaires seront contrôlés mais la nourriture sera fournie ad libitum. Dès leur arrivée, chaque animal sera quotidiennement manipulé par l’expérimentateur afin de diminuer leur stress pendant toute la durée de l’étude. Les tests comportementaux impliquent une exploration libre de l’environnement et reposent sur l’attrait de la nouveauté et la réaction naturelle et spontanée de l’animal à la détection de la nouveauté. Il n’y a donc pas de contrainte pouvant induire un mal être. L’état général des animaux sera observé. Il est par exemple possible que, dans une cage, les animaux dominants blessent les animaux dominés. Ces critères seront évalués selon une grille de score, adaptée de Morton et Griffiths 1985, approuvée par la SBEA, ce qui permet de s’assurer du bien-être animal pendant et en dehors des temps d’expérience. Cette grille repose sur des critères liés à l’apparence des animaux, à leur prise alimentaire/poids corporel, à certains signes cliniques (fréquence respiratoire) ainsi qu’à leur comportement général (activité, vocalisation) et permet d’évaluer si l’animal est dans un état normal ou en souffrance. Le score obtenu dicte les dispositions éventuelles à considérer pour l’animal : De 0 à 4 : Etat normal ; De 4 à 9 : observation quotidienne, analgésie envisagée (buprénorphine 0,05 mg/kg ; s.c. 0,1 ml/10g) ; ≥ 10 : souffrance sévère avérée, arrêt de l'expérimentation par mise à mort de l'animal. Les animaux seront observés à chaque pesée bi-hebdomadaire. Les méthodes d’arrêt des souffrances se font de concert avec les zootechniciens de l’animalerie et sont reportées pour chaque animale sur une feuille de soins disponibles à l’animalerie.
Choix des espèces
Du fait de l'existence de modèles bien connu d'obésité innée ou acquise par l'exposition à des régimes hypercaloriques, le rat est une espèce particulièrement pertinente pour la réalisation du projet. En particuler le modèle d'obésité induite par un régime cafétéria est un modèle pertinent de l'obésité chez l'homme. Ce seront des rats adultes. L'étude considère l'obésité induite par un régime hypercalorique chez l'adulte.
Mesure de la pharmacocinétique de produits pharmacologiques perfusés chez le rat par prélèvements répétés
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Maintenus sous anesthésie gazeuse jusqu'à deux heures et demie, ils reçoivent un candidat-médicament par cathéter dans la veine caudale et subissent jusqu'à dix micro-prélèvements de sang sur 24 heures avant d'être tués pour récolter les échantillons. Le porteur décrit ces micro-prélèvements comme indolores mais reconnaît un stress possible, et signale un risque d'hypothermie ou d'arythmie en cas de défaillance du matériel. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit l'ensemble des phénomènes d'absorption et d'élimination et juge l'approche animale "indispensable".
Objectifs
Le développement de nouveaux médicaments requiert d'étudier le devenir de la substance active dans l’organisme afin de déterminer sa distribution, son métabolisme et son élimination. Ces propriétés influencent la posologie du médicament : dose et fréquence d'administration. L’objectif de ce projet est de mesurer la concentration sanguine de candidats-médicaments en fonction du temps afin de déterminer le volume de distribution, la concentration maximale observée, le temps de demi-vie, la clairance et la valeur d’exposition des candidats-médicaments chez le rat.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de sélectionner les candidats présentant une concentration élevée et durable dans le sang, alliée à un métabolisme lent et une faible élimination. Ces caractéristiques sont indispensables pour garantir la distribution du candidat-médicament à sa cible et une bonne efficacité. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Cela permettra de réduire drastiquement le nombre d'études nécessaires pour ne mesurer ensuite que l’activité des candidats-médicaments les plus prometteurs et épargnera la vie de centaine d'animaux, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament efficace pour le traitement des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse durant plusieurs dizaines de minutes (maximum de 2h30), l'insertion d'un cathéter avec aiguille dans la veine caudale (sous anesthésie, l’aiguille est ensuite éliminée) et des micro-prélèvements de sang répétés à l'extrémité de la queue (maximum 10 prélèvements). La procédure durera un maximum de 24h puis les animaux seront mis à mort afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
Les animaux seront maintenus sous anesthésie gazeuse durant la perfusion intraveineuse des candidats-médicaments dans la veine caudale et les premiers prélèvements de sang (maximum de 2h30). En cas de défaillance du matériel, une hypothermie ou une arythmie pourrait survenir si elles ne sont pas détectées à temps. Les derniers micro-prélèvements de sang sont réalisés dans la veine caudale, à l’extrémité de la queue, sur les animaux vigiles et non contraints. Ces micro-prélèvements, d’une durée de 1 à 2min, sont indolores mais peuvent être stressant pour quelques animaux qui peuvent manifester leur impatience ou inconfort. Un maximum de 10 micro-prélèvements de sang seront réalisés sur une durée maximum de 24h. D’autre part, une toxicité imprévue d’un candidat-médicament pourrait être mise en évidence et entrainer l’arrêt immédiat de la procédure.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses.
Remplacement
Les candidats médicaments auront été sélectionnés préalablement lors des tests in vitro pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un médicament car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animal reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la concentration sanguine en fonction du temps sera réalisée chez le rat, car c’est l’espèce la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.
Réduction
La procédure développée et validée permet la réalisation de micro-prélèvements de sang répétés chez un même animal. Cela permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour la détermination de la pharmacocinétique. Elle est effectuée par un technicien rompu à ces manipulations, ce qui garantit une excellente reproductibilité et de limiter encore le nombre d’animaux engager dans les études. Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace de la pharmacocinétique d’un candidat-médicament à l’aide de trois animaux pour un candidat médicament.
Raffinement
La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Le rat étant un animal social, les rats seront maintenues par groupes sociaux dans des cages enrichies de tubes en carton et de bâtonnets à ronger. Une période d'aclimatation et d'habituation d'une semaine sera respéctée. Les rats seront anesthésiés le temps de la perfusion pour éviter tous risque de blessure et assurer une perfusion efficace et parfaitement repoductible. Le rat sera placée sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. Les micro-prélèvements de sang sont indolores et réalisés sur les animaux vigiles et non contraints a même de signifier librement tout manquement à leur bien-être. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments pour visualiser tous signes de toxicité imprévue qui seraient immédiatement suivi de l’arrêt de la procédure.
Choix des espèces
Les rats permettent l’étude des cibles thérapeutiques et des candidats-médicaments et sont suffisamment gros pour qu'une perfusion soit réalisée avec des volumes et des débits comparables à ceux utilisés chez les patients en clinique (0,25 à 2ml/kg/h). Les rats auront minimum 6 semaines, stade adulte, pour débuter les protocoles, car les systèmes immunitaires, nerveux et circulatoires sont matures.
Evaluation de l’entrée dans le cerveau de protéines et de nanobodies d’intérêt thérapeutique délivrés par un nanobody cargo par imagerie PET
- Recherche fondamentale
- Oncologie
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères, dont 240 génétiquement modifiées pour être dépourvues d'un récepteur du cerveau. Chaque animal reçoit une injection dans le ventre puis passe une imagerie PET/CT sous anesthésie, pour évaluer l'entrée dans le cerveau de petits anticorps issus de lama. Elles sont ensuite tuées par dislocation cervicale ou au dioxyde de carbone. Le porteur affirme, en s'appuyant sur des travaux de collaborateurs, une douleur "non supérieure à celle produite par l'introduction d'une aiguille", et conclut que le recours à l'animal est "inévitable".
Objectifs
Les anticorps constituent des outils thérapeutiques à fort potentiel. Dans le cas des maladies du cerveau, leur développement est malheureusement limité du fait des barrières physiologiques qui protègent l'organe. Ces barrières, notamment la barrière hémato-encéphalique, limitent le passage de molécules du sang vers les tissus cérébraux, et inversement. Franchir ces obstacles permettrait aux biomolécules d'intérêt thérapeutique (protéines tels que des anticorps ou peptides (d'atteindre leurs cibles et d'offrir aux patients de nouvelles approches thérapeutiques. Des anticorps de lama, qui ont la caractéristique d'^tre de petite taille (appelés nanobodies) et spécifiques des récepteurs de messagers chimiques dans le cerveau (le glutamate et l'acide gamma-aminobutyrique, dit GABA) ont été produits au laboratoire. Ils reconnaissent différentes cibles potentielles dans le cadre de plusieurs maladies du cerveau. Nous avons observé que certains de ces petits anticorps sont capables d'entrer dans le cerveau et donc de franchir ces barrières physiologiques. Toutefois, la majorité de ces nanobodies n'a pas été testée in vivo. De ce fait, nous ne savons pas si cette capacité à pénétrer le tissu cérébral est propre à ces quelques nanobodies, ou commune à nombre d'entre eux. Les objectifs de ce projet sont 1) de comprendre leur mécanisme d'entrée dans le cerveau et 2) d'utiliser un des ces petits anticorps comme transporteur pour apporter au niveau cérébral d'autres nanobodies thérapeutiques. Ce projet sera mené conformément à l'application de la règle des 3R.
Bénéfices attendus
Ce projet enrichira nos connaissances sur l'entrée des petits anticorps (nanobodies) dans le cerveau. Il nous permettra également d'évaluer leur utilisation pour administrer des nanobodies thérapeutiques dans cet organe. En perspective, notre nanobody vecteur pourrait servir d'outil pour administrer différentes protéines thérapeutiques ou diagnostiques dans le cerveau.
Procédures
Au cours de la procédure expérimentale, les animaux seront soumis à : - Une injection unique de nanobody par voie intrapéritonéale (durée 2-3 secondes, injection sur la droite de l’abdomen afin d’éviter une injection dans le caecum) à la concentration de 10 mg/kg, soit de 100 à 300µl en fonction de la concentration des nanobodies. Ces injections seront réalisées par du personnel compétent et qualifié. - Une analyse par imagerie PET/CT (30 minutes maximum) sera réalisée à l’aide de nanobodies radiomarqués. De très nombreuses expériences permettent de démontrer que ces radio-traceurs n’influent aucunement sur le bien-être des souris. - L’analyse sera réalisée sous anesthésie gazeuse de la souris (4% isoflurane) avant installation dans le lit de l’imageur PET/CT. La souris sera maintenue endormie avec 2% d’isoflurane pendant le temps de l’imagerie, qui n’excède pas 30 minutes. Le lit de l’imageur est chauffé à 37°C et les yeux de la souris sont protégés avec de l’Ocrygel. - Durant la phase de réveil, la souris sera transférée dans une cage placée sous une lampe chauffante où elle sera surveillée jusqu’à son complet réveil. La souris sera ensuite replacée dans sa cage initiale. - Plusieurs temps d’analyses seront étudiés pour suivre le passage de barrière hémato-encéphalique par les nanobodies : ainsi chaque souris du projet sera analysée par PET/CT à 1h, 4h, 24h, 72h. Toutefois, ces temps pourront être modifiés en fonction des premiers tests. Les animaux seront sacrifiés à la fin de l’expérimentation.
Impact sur les animaux
De précédentes données obtenues via des études sur des souris par des collaborateurs ont montré qu’un traitement aigu avec les nanobodies dirigés contre le récepteur mGluX n’engendrait pas de signe de toxicité ni de souffrance chez l’animal*. *Douleur non supérieure à celle produite par l’introduction d’ une aiguille.
Devenir
Mise à mort par dislocation cervicale ou insufflation progressive de CO2.
Remplacement
Remplacement : Le remplacement de l’animal n’est pas possible pour cette étude. Des données préliminaires montrent une importante accumulation des petits anticorps dans une région où la barrière physiologique cérébrale (barrière hémato-encéphalique), qui est la principale barrière s’opposant à la pénétration des molécules dans le cerveau, est modifiée. Nos données in vitro suggèrent que les anticorps de petite taille (nanobodies) déclenchent un mécanisme particulier faisant intervenir de manière indispensable leur cible mGluX pour passer la barrière physiologique. Un modèle isolé de barrière hémato-encéphalique ne permet pas de représenter exhaustivement les potentielles voies d’entrée dans le cerveau et toute la complexité de cet organe. De plus, il n’existe aucun modèle de la région particulière qui semble impliquée dans le passage des nanobodies. Ainsi, étudier le passage de ces nanobodies in vitro ne pourrait apporter de preuves irréfutables confirmant ou infirmant leur propriété de pénétration dans le cerveau. Le recours à l’animal est donc inévitable.
Réduction
Réduction : l’étude sera réalisée sur un total de 480 souris (240 souris sauvages et 240 souris déficientes en récepteur mGluX ( appelées mGluX KO)). Nos résultats préliminaires ne permettent pas de prédire leur efficacité d’entrée. Le nombre d’animaux utilisés pour pouvoir tester l’ensemble des petits anticorps thérapeutiques que nous voulons tester a été réduit au minimum pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue statistique.
Raffinement
Raffinement : cette étude impliquera l’utilisation d’une lignée de souris génétiquement modifiées, déficientes en récepteur mGluX, dont le phénotype n’est pas dommageable. Tous les animaux de cette étude seront placés dans un milieu enrichi, avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté, sous surveillance quotidienne. Les données obtenues par nos précédents collaborateurs suite à un traitement aigu avec les petites molécules dirigées contre mGluX ne montrent pas de signe de souffrance supérieure à celle engendrée par l’introduction d’une aiguille. L’observation d’anomalies chez les animaux dans le cadre de leur suivi quotidien sera reportée sur une fiche de suivi clinique (Annexe I), mise en place par la SBEA. Cette grille de scoring ne nécessite pas de personnalisation particulière car elle tient compte de tous les éventuels points critiques de notre expérience. Les points limites retenus seront donc : - Une perte de poids > 20% du poids initial ; - L’infection au site d’injection ; - L’état général des souris à leur réveil après l’anesthésie à l’isoflurane. Nous surveillerons plus précisément leurs comportements tels que l’hypo ou hyperactivité ; le mode de déplacement ou leur respiration (annexe 1).
Choix des espèces
Les anticorps de petite taille (nanobodies) utilisés dans le cadre de ce projet reconnaissent des cibles (récepteurs) murines. Le choix de l'espèce Mus musculus et du caractère sauvage de la souche de souris utilisée nommée mGluX WT permettra d'évaluer le passage des molécules via une barrière hémato-encéphalique intègre. Les souris mGluX KO seront elles, utiles pour évaluer le rôle crucial que jouerait le récepteur mGluX dans ce transport. Les souris seront traitées à partir de 5 semaines d'âge correspondant à l'âge adulte auquel la formation de la barrière hémato-encéphalique est complètement achevée. Les souris seront acceuillies à l'âge de 4 semaines et seront hébergées pendant une semaine avant le début de l'étude, pour permettre leur bonne acclimation.
Délivrance d’une chimiothérapie par sonoporation dans un modèle murin de cancer colorectal sous-cutané et métastasique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer colorectal, sous la peau ou par injection dans la rate pour induire des métastases, puis des injections de microbulles et des ultrasons deux fois par semaine jusqu'à l'atteinte des points limites. Le porteur cite parmi les atteintes la douleur de la chirurgie du ventre et la dégradation de l'état général liée à la croissance de la tumeur. Il affirme qu'à cette étape le modèle animal ne peut être remplacé par un modèle in vitro ou in silico.
Objectifs
Evaluer différents types de microbulles pour la délivrance d’un protocole de chimiothérapie, l’irinotécan (libre et encapsulé) par action combinée de microbulles et d’ultrasons (appelé également sonoporation).
Bénéfices attendus
Optimiser le modèle murin de métastases hépatiques de cancer colorectal Optimiser la procédure d’imagerie CT des métastases hépatiques de cancer colorectal Améliorer l’efficacité thérapeutique de l’irinotécan libre et encapsulé pour le traitement du cancer colorectal
Procédures
Procédure 1 Evaluation de microbulles de gaz pour la délivrance d'une chimiothérapie par sonoporation dans un modèle murin de cancer colorectal sous-cutané chez la souris 1- identification par puce – insertion sous cutanée du trocart –anesthésie gazeuse– 480 animaux- pour chaque animal 1 seule fois 2- injection sous cutanée de cellules tumorales – anesthésie gazeuse - 480 animaux- pour chaque animal 1 seule fois 3- i.v. microbulles gaz et/ou chimiothérapeutiques et/ou ultrasons (
Impact sur les animaux
- Le stress lié à la manipulation des animaux - L’hypothermie induite par l’anesthésie générale - La douleur induite par la chirurgie abdominale - La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale
Devenir
Procédure 1 : A la fin de l'étude, une euthanasie par dislocation cervicale de l'animal après anesthésie gazeuse (Vetflurane 5%) sera réalisée par un des responsables de l’étude. Procédure 2 : A la fin de l'étude, une euthanasie par dislocation cervicale de l'animal après anesthésie gazeuse (Vetflurane 5%) sera réalisée par un des responsables de l’étude.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons réalisé des expériences sur des cellules cellulaires dont les résultats sont particulièrement encourageants et nécessitent d'être validés avec un modèle préclinique. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in silico.
Réduction
Grâce à un plan d’expérience, les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 20 souris (10 mâles et 10 femelles). Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si ces différentes thérapies permettent une diminution significative de la croissance, du métabolisme et de la perfusion tumorale (Puissance de test: 80%, Seuil de risque: 0.05).
Raffinement
Les nuisances ou effets indésirables des procédures 1 et 2 seront évalués par le personnel de zootechnie et par les responsables de l’étude. Les animaux seront observés une fois par jour afin d’évaluer leur stress/leur douleur après les différentes procédures réalisées sous anesthésie gazeuse (Vetflurane). - Le stress lié à la manipulation des animaux : Les souris seront hébergées en présence d'un objet d'enrichissement (morceaux de carton et/ou tube plastique) en groupe. Le stress est minimisé par l'implication d'un personnel qualifié à l'expérimentation animale. Les souris sont facilement stressées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. - L’hypothermie induite par l’anesthésie générale : L’animal est réchauffé par une couverture chauffante. - La douleur induite par la chirurgie abdominale : La douleur sera prise en charge par une analgésie adaptée (Buprénorphine 0.05 mg/kg et lidocaïne) en pré- et post-opératoire. - La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale : Le poids sera mesuré tous les deux jours et les animaux seront observés tous les jours selon les critères ci-dessous : (1) Détérioration générale de l'état sanitaire, altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir et de boire, locomotion réduite, dos vouté et yeux enfoncés). (2) Cachexie associée à une perte de poids de 17% du poids total de l'animal. (3) Symptomologie évocatrice : Saignements, urines ictériques, dyspnées ou sibilances… La manifestation d'un seul de ces signes cliniques conduira à une euthanasie par dislocation cervical après anesthésie au vetflurane (5%) par une des personnes en charge de l'étude. Une analgésie ne pourra pas être administrée aux animaux pendant la croissance tumorale car cette première influence cette dernière.
Choix des espèces
Dans la littérature et pour la lignée cellulaire CCR choisie pour notre étude, l'implantation se fait généralement dans des souris nudes. Dans la littérature et pour les lignées cellulaires CCR choisies pour notre étude, l'implantation se fait généralement dans des souris nudes de 6 semaines environ pour un poids de 20 g.
Biodistributions nouveaux de vecteurs radiomarqués sur des modèles tumoraux de souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et une injection intraveineuse de produits radiomarqués, puis une imagerie sous anesthésie et un prélèvement sanguin terminal, pour étudier la distribution de nouveaux radiopharmaceutiques anticancéreux. Le porteur décrit l'arme du projet comme le radioélément destiné à détruire la cellule tumorale et affirme n'attendre aucune douleur. Il indique qu'aucune méthode alternative n'existe à ce jour pour cette pathologie complexe.
Objectifs
L’objectif de notre projet est de développer de nouveaux traitements contre le cancer. Divers radiopharmaceutiques élaborés par notre équipe serons testés : nous disposons de différents vecteurs et de différents radioéléments. La cible à détruire est la cellule tumorale, l’arme est le radioélément qui va émettre un rayon «toxique» pour cette cellule. Le radioélément est lié à un vecteur spécifique de la tumeur afin de former un radiopharmaceutique, qui doit cibler et détruire la tumeur, tout en minimisant l’impact sur les tissus sains. L’objectif de l’étude de la biodistribution de nos radiopharmaceutiques est d’appréhender leur distribution dans l’organisme au cours du temps.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre le développement de nouveaux radiopharmaceutiques ciblant les tumeurs, utilisables soit en thérapie soit en imagerie.
Procédures
810 souris vigiles reçoivent une injection sc de cellules tumorales (100µl) : douleur légère Ces mêmes souris vigiles reçoivent une injection iv de radiopharmaceutique dans la veine latérale de la queue : douleur légère. Puis elles sont anesthésiées sous isoflurane pour 10 minutes d’imagerie (dans cellule d’imagerie chauffante avec du gel de protection occulaire), sans douleur. A la fin de la cession d’imagerie les souris endormies subissent un prélèvement sanguin (200µl) dans le sinus orbital puis sont mises à mort. L'ensemble de la procédure durera 2 semaines à 3 semaines et demi. (pousse tumorale 2 à 3 semaines, biodistribution du traceur 72h maximum, imagerie 10 minutes).
Impact sur les animaux
Ce projet ne devrait pas engendrer de douleur. La procédure 1 : greffe de tumeur en sous cutané n’entraine pas de douleur. On ne laisse pousser la tumeur que jusqu’à 100mm 3 (équivalent d’un petit kyste sur le flanc qui n’entraîne pas de gène ni de douleur). La procédure 2 d’injection du radiopharmaceutique en iv pour la biodistribution n’est pas douloureuse. Enfin la procédure 3 d’imagerie TEP/CT sous anesthésie gazeuse et lit chauffant est sans douleur. Le prélèvement sanguin terminal est fait sur souris endormies et analgésiées avant leur mise à mort.
Devenir
Les 810 souris de la procédure 1 (greffe de cellules tumorales) sont toutes gardées en vie pour la procédure 2 (injection du radiopharmaceutique) et la procédure 3 (imagerie de la biodistribution du radiopharmaceutique injecté). Il s’agit des 3 étapes nécessaires pour quantifier la distribution du radiopharmaceutique dans la tumeur et les différents organes des souris.
Remplacement
Remplacer : la pathologie cancéreuse étant une pathologie complexe, il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives à l’expérimentation animale
Réduction
Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. L’apport de l’imagerie permet de réduire le nombre de souris utilisées. Pour l'analyse des résultats, tous les tests statistiques seront réalisés sous Prism.
Raffinement
L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par trois, avec des frisotis pour pouvoir faire un nid. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne selon une grille de score et de points limites qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé. Par ailleurs, les animaux seront anesthésiés pendant la procédure 3.
Choix des espèces
Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. De plus, de nombreux modèles de tumeurs syngéniques ont été développés chez la souris. Par ailleurs, l’existence de souches de souris immunodéprimées permet de développer des modèles de tumeurs à partir de cellules humaines. Les souris sont utilisées à 7 semaines, au stade jeune adultes.
Evaluation de l’impact de la dépletion de la microglie durant le développement sur les fonctions cognitives à l’age adulte
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après déplétion de la microglie par gavage des mères gestantes, elles subissent à l'âge adulte des sons intenses provoquant des sursauts, des chocs électriques plantaires pour un conditionnement pavlovien et un test de sensibilité à l'épilepsie pouvant déclencher des convulsions. Le porteur qualifie ces périodes de stress de courtes et indique faire enchaîner toute la batterie de tests aux mêmes animaux pour en réduire le nombre. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ou in silico n'existe pour étudier ce rôle développemental.
Objectifs
Le développement des cellules de la microglie (une population spécifique du cerveau) durant le développement embryonnaire constitue une étape clé dans la mise en place des réseaux neuronaux mais aussi dans l'équilibre entre les différents types cellulaires qui semble prépondérant dans de nombreuses pathologies neurodégénératives chez l'Homme. Nous souhaitons dans le cadre de cette étude mettre en évidence les troubles comportementaux qui seraient susceptibles d'apparaitre chez des animaux ayant subi une déplétion de cette microglie durant leur développement. On constate en effet que la microglie se régénère lors du développement post-natal, mais que son absence durant le stade embryonnaire entraîne un impact durable au niveau cognitif. Pour cela, des Souris seront exposées durant leur développement (par gavage des souris gestantes), à un agent pharmacologique entrainant une disparition de la microglie durant une période définie du développement. Par la suite, ces Souris poursuivront leur développement et nous analyserons leurs réponses comportementales dans de multiples tests visant à déterminer les capacités cognitives.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mettre en évidence le rôle critique joué par la microglie durant le développement embryonnaire, sur les fonctions cognitives à l'âge adulte. De plus, nous obtiendrons des informations imporantes sur la chronologie des évenénements ayant lieu au cours de la mise en place de cette population durant le développement de l'embryon.
Procédures
Les animaux effectueront plusieurs procédures impliquant des sons d'intensité élevée mais d'une durée inférieure à 40 ms, afin de déterminer leurs réaction face à des stimulus acoustiques, un choc électrique plantaire d'intensité modérée et d'une durée inférieure à 50ms (afin de mettre en place un conditionnement de type pavlovien) ainsi qu'une évaluation de leur sensibilité à l'épilepsie pouvant mener à des convulsions musculaires. Aucun prélevement sanguin ne sera réalisé.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront durant ce projet de courtes périodes de stress (30 minutes environ) liées à l'exposition à des bruits entrainant des sursauts, ainsi qu'à un choc électrique plantaire visant à mettre en place un apprentissage de type pavlovien. En fin de protocole, lors de l'évaluation de la susceptibilité à l'épilepsie, il pourraient subir des contractions musculaires d'intensité modérée à forte durant une période de deux heures, sous surveillance d'un expérimentateur entrainé.
Devenir
Les animaux ayant suvi l'ensemble du protocole ne pourront pas être réutilisés pour d'autres projets.
Remplacement
Etant donné que ce protocole vise à déterminer le rôle d'une population de cellules durant le développement d'une organisme complexe sur le comportement adulte, aucune alternative (in vitro ou in silico) n'est actuellement possible
Réduction
Nos effectifs expérimentaux sont réduits à 10 animaux par groupe, ce nombre est suffisant pour obtenir une puissance statistique acceptable dans les procédures que nous allons utiliser, au regard des données précédemment générées. Par ailleurs, le même lot d'animaux effectuera l'ensemble de la batterie de tests afin de minimiser le nombre d'animaux employés tout en disposant de temps de récupération pour éviter un effet cumulatif du stress et une interaction des procédures entre elles.
Raffinement
Toutes les mesures possibles ont été mises en place pour améliorer les conditions de vie ainsi que réduire le stress occasionné par les procédures expérimentales. Ainsi, les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à disposition, lors des protocoles expérimentaux, les animaux sont placés 30 minutes avant le test dans la pièce expérimentale pour réduire le stress occasionné par le changement d'environnement de leur cage. Durant les procédures impliquant une anésthésie, un gel oculaire sera utilisé pour éviter le déssechement de la cornée. Les animaux seront maintenus en groupe sociaux durant l'ensemble du projet.
Choix des espèces
Nous disposons de bons modèles de déplétion de la microglie durant le développement embryonnaire dans ce modèle . Les animaux seront agés de 8 semaines lors de l'implantation de la puce et de 10 semaines au premier tests comportemental, cela constitue l'âge idéal pour étudire le comportement des animaux déjà suffisamment développés.