Oncologie
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Evaluation d’une nouvelle stratégie anti-tumorale visant la synthèse des protéines chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
240 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer du sein triple négatif leur sont injectées sous la peau, la tumeur est suivie au pied à coulisse et des composés sont administrés par voie orale ou intrapéritonéale plusieurs fois par semaine. Le porteur indique que la littérature ne prévoit pas d'effet secondaire notable de ces composés et que les animaux ne développant pas de tumeur seront tués huit semaines après la greffe. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire in vitro la distribution du composé et l'organisation d'une tumeur, et conclut à la nécessité d'un recours aux animaux.
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent en France et représente la première cause de décès par cancer chez la femme. (Source : Santé publique France). Il existe plusieurs types de cancer du sein dont un appelé triple négatif. Peu de solutions efficaces sont disponibles pour le traitement du cancer du sein triple négatif, aussi le but de ce projet est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour se développer les cellules cancéreuses ont besoin de ressources importantes et notamment de protéines. Récemment, plusieurs facteurs nécessaires à la synthèse des protéines ont été identifiés, et vis-à-vis desquels les cellules cancéreuses sont dépendantes. L'inactivation de ces facteurs bloque les propriétés tumorales des cellules cancéreuses et induit leur mort. Les cellules saines ne sont pas affectées par l'inhibition de ces facteurs. Ceci a été montré in vitro pour plusieurs cancers dont la prostate, le colon ou le mélanome. Un travail préliminaire a été mené qui étend cette approche au cancer du sein de type triple négatif en utilisant une dizaine de modèles cellulaires, par des approches in vitro de culture de cellules en 2 dimensions et en 3 dimensions. En particulier in vitro deux approches ont été validées, l'une par inhibition de l'expression de ces facteurs par des outils génétiques, l'autre par inactivation de ces facteurs à l'aide de composés chimiques, qui sont des candidat médicaments en cours d'évaluation clinique dans d'autres pathologies. Il est maintenant nécessaire de vérifier si un effet anti-tumoral est obtenu lorsque les cellules sont organisées en tumeur. Le modèle de choix utilisé est la greffe de tumeurs sous-cutanée de cellules tumorales humaines chez la souris immunodéprimée. La croissance des tumeurs sera suivie au cours du temps, puis les tumeurs seront collectées et analysées par histologie afin de déterminer l'impact des composés sur la prolifération et la mort des cellules tumorales.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anticancer en santé humaine. En effet, altérer la synthèse des protéines des cellules cancéreuses est une nouvelle approche thérapeutique anticancer qui semble très prometteuse selon les premiers essais cliniques. Afin d'évaluer le véritable potentiel thérapeutique de cette approche, la communauté scientifique fait face à deux enjeux : premièrement, déterminer les cancers qui bénéficieraient de cette nouvelle approche ; deuxièmement, identifier de nouveaux médicaments. Ainsi les bénéfices de ce projet seront précisément de : 1- Apporter des données in vivo pour finaliser une étude in vitro en cours sur le cancer du sein de sous-type triple négatif. 2- Démontrer que les composés utilisés n'ont pas d'effets secondaires notables chez la souris. 3- Disposer de résultats obtenus dans des modèles animaux qui seront nécessaires avant d'initier des études cliniques chez l'Homme.
Procédures
Des cellules humaines de cancer du sein seront injectées sous la peau des souris. Pour cela l’animal est maintenu environ 15 secondes sans stress. Une seule injection de 0,1 mL est réalisée par animal. Suite à cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée dans les 2 à 3 semaines qui suivent. Le développement tumoral sera suivi par simples mesures au pied à coulisse (3x/semaines), sur animal vigile maintenu immobile environ 20 secondes. Les composés seront administrés soit par voie orale (2x/semaine ; 15 secondes) ou par injection intrapéritonéale (5x/semaines ; 10 secondes).
Impact sur les animaux
Implantation des tumeurs : Les cellules seront injectées sur animal vigile, pour cela l’animal est tenu en contention sans stress. Le volume d’injection est faible (0,1 mL). Une seule injection par animal, durée 15 secondes. Suite à cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée dans un délai de 2 à 3 semaines, sans géner la mobilité des animaux. Suivi des greffes de tumeurs : Le développement tumoral sera suivi par mesures au pied à coulisse, sur animal vigile tenu en contention. Fréquence : 3x/semaine, 20 secondes. Traitements : Les souris seront traitées par voie orale (3x/semaine ; 15 secondes) ou par injection intrapéritonéale (5x/semaine ; 10 secondes). La littérature indique que ces composés n'induisent pas d'effet secondaire chez les souris. Un des objectifs du projet étant de confirmer ces données, les animaux bénéficieront d'une vigilance toute particulière dans la détection de signes de souffrance. Un des traitement sera administré dans l’eau de boisson. Celui-ci a un goût amer, donc pour que les souris s’hydratent correctement, 3% de sucre sont ajoutés dans l’eau de boisson.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de récupérer les tumeurs pour des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques. Si des animaux, ne développent pas de tumeur, ils seront mis à mort 8 semaines post-greffe. Les animaux ont subi une injection de cellules tumorales, ils ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
L'efficacité des composés a été validée in vitro, sur des cellules en culture, par plusieurs approches complémentaires. Néanmoins, l'efficacité d'un composé médicament dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de la tumeur et de son environnement. Aujourd'hui, il n'est pas possible de reproduire in vitro la distribution et l'élimination du composé dans un organisme, ni de reproduire à l'identique l'organisation d'une tumeur (par exemple la vascularisation ou la surveillance anti-tumorale). Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux pour valider l'efficacité in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au minimum requis pour ces expériences. Une étude préliminaire de validation sera effectuée sur un petit nombre d'animaux (40 souris) avant d'engager l'étude principale. Les protocoles utilisés permettent d'effectuer l'ensemble des analyses sur une seule tumeur pour éviter de dupliquer les expériences et donc le nombre d'animaux. La procédure prévoit la collecte post-mortem de l'ensemble des tumeurs et des organes de plusieurs animaux afin qu'ils soient stockés et disponibles pour des analyses complémentaires qui pourraient être nécessaires (par exemple lors de l'expertise externe des résultats), et ce sans l'utilisation d'animaux supplémentaires. Le nombre d'animaux a été fixé à 10 par groupe, en prenant en compte les éléments suivants : - Les contraintes statistiques. - Disposer d'un nombre minimum de 8 animaux par groupe, prenant en compte que la greffe ne prendra pas chez 10% des animaux et le risque qu'un animal meurt dans chaque groupe au cours de l'expérience. - La croissance de tumeur présente une variabilité de 30% - Observer un écart d'au moins 30% de baisse de croissance entre les moyennes des deux groupes
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 5 individus. Les analyses de croissance des tumeurs seront non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requiert pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. Sur la base de données disponibles, deux des trois composés seront administrés par voie orale. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris sera suivi par pesée des animaux et par une analyse histologique de plusieurs organes sur quelques animaux traités. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.
Choix des espèces
La souris immunodéprimée est le modèle de choix pour l'analyse de greffes de tumeurs humaines en oncologie. Les expérimentations seront effectuées sur des femelles immunodéprimées de 6 à 8 semaines, âge où la prise de greffe est la plus efficace et la plus homogène. De plus, les femelles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de la constitution de groupes d'animaux.
Conséquences de micro-biopsies musculaires répétées sur la nage des poissons
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
60 poissons rouges vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Ils subissent deux micro-biopsies musculaires sous anesthésie à quinze jours d'intervalle, alors que le projet vise précisément à valider une méthode d'échantillonnage sans mise à mort. Le porteur décrit des risques d'infection des plaies et de stress, et indique que tous les poissons seront finalement tués pour caractériser les conséquences des biopsies et le fonctionnement mitochondrial. Il présente ce projet comme relevant des 3R et affirme que seule l'expérimentation sur animaux permet une étude intégrative de "l'ensemble de l'organisme".
Objectifs
Le but de ce projet est d’étudier les conséquences de micro-biopsies musculaires répétées chez le poisson. Le développement de ces méthodes moins invasives pour obtenir des échantillons utilisables à des fins expérimentales apparait comme nécessaire et indispensable. En effet, une fois validées, ces méthodes s’avèreront précieuses dans un contexte éco-physiologique, car elles permettront à terme, de réaliser 1) des protocoles expérimentaux longitudinaux, c’est-à-dire utiliser le même individu pour étudier les conséquences physiologiques de stresseurs environnementaux (par exemple), ayant pour finalité une réduction drastique du nombre d’individus expérimentés et 2)
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but principal de valider la méthode de punch biopsie chez les poissons pour réaliser des protocoles de bioénergétique musculaire, sans mise à mort des individus, ce qui permet de réfléchir à de nouveaux protocoles avec suivis longitudinaux sur les mêmes individus, ou sur de nouveaux modèles moins classiques (espèces sauvages). Les bénéfices attendus à court terme seront donc la validation cette méthode, tant au niveau de la fonctionnalité des échantillons biopsiés, qu’au niveau de la récupération des poissons ayant subi les biopsies. De plus, comme ce projet s’inscrit directement dans le contexte de la règle des 3 R, les bénéfices attendus se trouvent à différents niveaux : - Réduction du nombre d’individus : au niveau statistique, l’analyse par mesures répétées, où l’individu est son propre contrôle, permet d’augmenter la puissance des tests permettant ainsi de diminuer le nombre d’individus expérimentés, et de fait, cette méthodologie est tout à fait en accord avec le « Reduce » des 3 R en éthique animale (Sneddon et al., 2017). - Utilisation d’organismes non modèles : en évitant d’euthanasier les poissons, cela permettrait d’établir des protocoles portant sur la bioénergétique cellulaire sur des espèces sauvages ou avec des restrictions d’utilisation liées à un statut particulier. Cela permettra d’étudier les mécanismes cellulaires chez des organismes non issus d’élevage, et donc parfois plus pertinents pour répondre à des problématiques d’écophysiologie ou de conservation. - Suivi longitudinal des mesures de la bioénergétique cellulaire sur des espèces non-modèles : la combinaison des deux protocoles permettrait d’étudier plus finement la mise en place des variations métaboliques des poissons en réponse à des contraintes environnementales. - Raffinement de la méthode d’anesthésie : en évaluant les effets potentiellement positifs de la lidocaïne couplée à une anesthésie classique au MS222, ce projet pourrait grandement participer à améliorer la récupération post-chirurgie des poissons.
Procédures
Les poissons seront soumis à 2 micro biopsies musculaires sous anesthésie, réalisées à 15 jours d’intervalle.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de ces protocoles pourraient être l’apparition d’infections chez les poissons au niveau des plaies chirurgicales, une augmentation du stress entrainant une atteinte au niveau comportemental (diminution de l’activité, diminution de la prise alimentaire).
Devenir
Tous les poissons seront mis à mort, afin de caractériser les conséquences morphologiques de la biopsie (hématomes ?) et le fonctionnement mitochondrial final.
Remplacement
A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques. Cela permet notamment de caractériser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour étudier de façon complète, les réponses métaboliques de l’animal face à son environnement.
Réduction
Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. Il faut souligner le fait que cette étude a pour but, notamment de diminuer le nombre d’individus expérimentés. En effet, la validation de la méthode des micro-biopsies répétées permettra un suivi temporel du fonctionnement mitochondrial, où chaque individu deviendra son propre témoin et de fait la variation interindividuelle sera directement prise en compte au niveau statistique.
Raffinement
Les différentes phases du protocole (Anesthésies, et biopsies puis métabolisme in-vivo, performances de nage et bioénergétique cellulaire) sont bien établies chez les poissons et maitrisées au laboratoire. Lors des procédures de biopsie, les poissons seront anesthésiés soit au MS222 (selon les recommandations en vigueur), soit au MS222 + Lidocaïne hydrochloride (utilisé ici comme analgésique). Afin de favoriser une récupération rapide de la biopsie, une incision de la peau permettra au punch à biopsie d’attendre le muscle rouge sans enlever de peau au poisson. un pansement en poudre de type Orahésive sera appliqué sur l’incision ce qui favorisera une cicatrisation cutanée. De même, lors des protocoles non invasifs in vivo (mesure de la consommation d’oxygène associée aux performances de nage et tests comportementaux) un des principaux objectifs est de limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux. Chaque geste contraignant (mesure et placement des poissons dans les tunnels de nage) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h. Les poissons seront à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore pendant la récupération et les expériences. Cela permet d’obtenir des mesures physiologiques valides et fiables, qui ne sont pas influencées par un état de souffrance, stress ou agitation de l’animal. Au niveau des expériences de bioénergétique, les individus seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur avant de prélever des échantillons tissulaires. Tout au long de l’étude, les poissons seront surveillés quotidiennement et dès l’apparition de signes de mal-être, les individus seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage.
Choix des espèces
Le poisson rouge est un modèle pertinent pour cette étude expérimentale car il présente des avantages importants : - 1) facilité d’acquisition par un établissement éleveur et de stabulation en animalerie agréée. Cette espèce est déjà communément utilisée au laboratoire - 2) population homogène en termes de taille et d’âge permettant d’avoir des paramètres morphologiques également homogènes. Il permet d’utiliser différents outils expérimentaux, afin de caractériser les paramètres in vivo et d’avoir à disposition suffisamment de matériel biologique pour les études au niveau in vitro. - 3) modèle biologique couramment utilisé en recherche, d’où une ressource bibliographique très bien fournie. Les poissons utilisés seront de jeunes adultes, dont la taille sera adaptée à l’utilisation des tunnels de nage à disposition au laboratoire.
Régulation pharmacologique des canaux ioniques et conséquences sur le métabolisme et le vieillissement
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un phénotype migraineux leur est induit par injections répétées d'un donneur de NO, à 3 puis 12 mois, et le porteur précise que cette douleur ne pourra être soulagée ni par analgésique ni par anesthésique puisque ce sont ses conséquences qui sont étudiées. La sensibilité douloureuse est mesurée par les tests de von Frey et de Hargreaves, complétés de tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Il affirme que le suivi du vieillissement "requiert un système biologique intégré" et ne peut être modélisé in vitro, les bénéfices thérapeutiques restant présentés comme des perspectives.
Objectifs
La migraine est un trouble neurologique invalidant, d'origine génétique, environnementale et/ou hormonale, avec une prévalence estimée à 15% de la population. Elle se caractérise par des maux de tête sévères, généralement unilatéraux et lancinants qui peuvent être accompagnés de nausées, vomissements et de photophobie. Par ailleurs, la douleur chronique représente un stress pour l'organisme dont les conséquences à long terme sont encore peu connues. Des études cliniques ont corrélé une augmentation de l'ncidence des pathologies cardio-vasculaires et des cancers et une diminution de la durée de vie chez des patients qui présentent des niveaux chroniques de douleur. Ce projet vise à étudier les conséquences cellulaires et moléculaires de la douleur migraineuse chronique sur le métabolisme, et en particulier à déterminer si des canaux ioniques potassiques à deux domaines pores (famille des K2P), qui régulent la transmission de la douleur et dont des mutations chez l'homme induisent la migraine, exercent un contrôle sur les paramètres métaboliques impliqués dans le vieillissement. Ce projet nécessitera 480 animaux.
Bénéfices attendus
La migraine est considérée comme l'une des maladies les plus invalidantes au monde, affectant environ 15 % de la population mondiale. Elle se manifeste par une céphalée lancinante unilatérale et s'accompagne de multiples symptômes tels que nausées, vomissements, photophobie, phonophobie ou allodynie cutanée. En parallèle, différentes études cliniques ont permis de corréler une augmentation de l’incidence des pathologies cardio-vasculaires, des cancers et une diminution de la durée de vie, à des niveaux chroniques de douleur chez des patients humains. De plus, les souris déficientes pour TRPV1, un canal ionique impliqué dans la perception de la douleur thermique, sont caractérisées par une meilleure espérance de vie. Enfin, des mutations génétiques chez C. elegans et chez D. melanogaster modifiant la transduction des signaux sensoriels augmentent également la longévité des individus. Il est admis que les crises de migraine commencent par l'activation des neurones sensoriels dans les ganglions trigéminaux (TG). L'hyperexcitabilité des fibres TG innervant les méninges induit la libération de neuropeptides (par exemple la substance P et le peptide CGRP) qui déclenche la vasodilatation des vaisseaux sanguins environnants et une inflammation locale, conduisant à la migraine. De plus, les fibres C exprimant les canaux TREK1, TREK2 et TRESK innervent le le pancréas et leur stimulation induit la sécrétion de CGRP, provoquant l’inflammation et inhibant le relargage d’insuline. Ces données suggèrent fortement que l’activité des canaux ioniques et en particulier de TREK1, TREK2 et TRESK a un impact sur le métabolisme et le niveau général de santé de l’individu. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la migraine et plus généralement de la douleur chronique de manière à limiter son impact sur le métabolisme en collaboration avec la Fédération Hospitalo-Universitaire.
Procédures
Dans chacune des procédures, un phénotype migraineux sera induit chez les animaux à 2 stades de leur vie : à 3 mois et à 12 mois. Ce modèle de migraine classiquement utilisé en études pré-cliniques et cliniques consiste à induire des symptômes chroniques migraineux par injection systémique intra-péritonéale d'un "donneur de NO", l'isosorbide dinitrate (ISDN, Risordan ©, Sanofi) pendant 4 jours, à raison de 1 injection/jour. Chez la souris, une injection quotidienne d'ISDN pendant 4 jours induit une hypersensibilité mécanique douloureuse chronique quantifiée quotidiennement avec un appareil de von Frey dynamique qui consiste à appliquer une rampe croissante de pression sur la paume de la patte arrière avec un filament automatique et à mesurer la pression (en grammes) induisant le retrait volontaire de la patte par la souris qui témoigne d’une douleur mécanique. Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles déterminent un seuil avec possibilité d’échappement. Une allodynie chronique se développe progressivement, mise en évidence par une diminution des valeurs de force nécessaires (seuils) pour induire le retrait réflexe (volontaire) de la patte. L’hypersensibilité douloureuse mécanique (6 tests dans la vie de l'animal) et thermique (6 tests) des souris sera quantifiée par les tests de von Frey et de Hargreaves respectivement sur des groupes de souris indépendants. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront mesurés par prélèvement d'une goutte de sang (6 tests) sur des groupes de souris indépendants. Les mesures d'exercice spontané et de motricité seront réalisés 6 fois dans la vie de l'animal, sur 2 groupes de souris indépendants. Chacun de ces tests dure environ 3h excepté la mesure de l'exercice volontaire qui est évaluée après une semaine.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés 1) à la douleur migraineuse qui sera induite et qui ne pourra être soulagée ni par des analgésiques ni par des anesthésiques puisque ce sont ses conséquences que nous étudierons, 2) par les injections intrapéritonéales des molécules régulatrices des canaux ioniques, du glucose (test GTT) ou de l'insuline (test ITT), et 3) par les tests de comportement (mesure de reflexes volontaires). Pour cette raison, nous évaluons à un niveau sévère la gravité de nos procédures et nous compenserons par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures. La mise à mort sera effectuée pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Nos études préalables menées sur des neurones en culture et chez les rongeurs ont permis de caractériser le phénotype migraineux des animaux mutants pour les K2P d’intérêt et le profil pharmacologique des régulateurs de K2P en termes de spécificité de cible et de concentration active. De plus, les effets métaboliques analysés sur le long terme et le suivi du vieillissement des animaux requièrent un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant. Les pathologies associées au vieillissement (diabète, néoplasmes, etc) sont d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Leur apparition et leur gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro. De plus, nos résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet.
Réduction
Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique permanente) ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique paramétrique (student t-test ou ANOVA si plus de deux groupes) ou non paramétrique afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Pour évaluer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.
Raffinement
Notre expertise dans le domaine de la douleur nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et nous porterons une attention particulière à limiter toute forme de stress de nos animaux (habituation en amont de chaque procédure). Aucun des animaux élevés pour ce projet ne présente de phénotype dommageable (Royal et al, 2019 ; Avalos-Prado et al, 2021). Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur. Dès l'entrée en procédure, les animaux seront soumis à un contrôle quotidien par le principal expérimentateur de façon à relever tout changement d'aspect (dos voûté, poil non entretenu) et de comportement (apathie, souris à l'écart), à mener leur habituation aux différents tests et à réaliser des injections intrapéritonéales si nécessaire. Ce suivi quotidien permettra aussi un contrôle visuel et expérimental (niveau de sensibilité douloureuse) de l'état de l'animal et de ses sites d'injection. Ainsi, tout animal qui présenterait des signes d'infection au site d'injection, de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement basal anormal (prostration, apathie..) ou d‘une pathologie quelconque (plaie...) serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans notre étude des conséquences de la douleur. Un suivi du poids corporel sera également effectué toutes les semaines par pesée. Une perte de poids comprise entre 10 et 15 % du poids de la semaine précédente conduira à une surveillance accrue de l'animal. Celui-ci sera euthanasié si son état ne s'est pas amélioré la semaine suivante. Un suivi tous les 2 jours sera aussi organisé après les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (pendant 6 jours). En plus du suivi par les expérimentateurs, les animaux seront suivis quotidiennement par l’équipe de l’animalerie de l’institut afin de détecter le plus rapidement tout signe de mal-être. Un formulaire permettant l'évaluation de la douleur sera rempli systématiquement. Les animaux seront sacrifiés à un score égal ou supérieur à 3 dans le tableau de l'évaluation de la douleur qui constituera notre base de travail.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle d'étude, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l'humain, et de la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons à notre disposition tous les outils déjà mis au point et validés pour pouvoir étudier les modèles de régulation des canaux ioniques TREK1, TREK2 et TRESK dans la souris. 2 âges: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux. Chaque animal sera utilisé à 3 et 12 mois pour réduire le nombre total d’animaux, et parce que chaque animal sera son propre contrôle interne.
Réponses individuelles de brebis Romane soumises à un challenge nutritionnel sévère après mise bas
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
40 brebis vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes rendues ensuite à la production. Le porteur soumet des brebis venant de mettre bas à deux jours de paille de faible valeur nutritive, puis leur prélève du sang huit fois en dix-neuf jours, pour étudier leur adaptation à un manque alimentaire lié au changement climatique. Il indique qu'une perte de poids et une mobilisation des réserves corporelles sont possibles, sans danger annoncé. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible car l'étude porte sur une race ovine précise.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme européen. Des expérimentations similaires sont en train de se dérouler dans d'autres installations expérimentales, avec d'autres races ovines et une autre espèce, les caprins, dans les pays membres du consortium (Egypte, Espagne et Tunisie). L’objectif global est d’étudier les réponses des petits ruminants face aux effets du changement climatique, plus particulièrement les effets des challenges nutritionnels en faisant varier quantité et qualité de l’offre alimentaire. L'objectif du projet est d'évaluer, d'une part, les capacités adaptatives des brebis de race Romane face à un challenge nutritionnel sévère après la mise bas. D'autre part d'étudier, pour le caractère efficacité alimentaire, les effets de la lignée génétique (une lignée de brebis efficaces et une lignée de brebis inefficaces) sur la réponse au challenge nutritionnel et de décrypter les mécanismes de l'organisme qui sont reponsables de cette réponse. Ainsi une meilleure compréhension de la réponse des animaux aux stress alimentaires nous permettra de proposer aux éleveurs des pratiques de conduites ciblées pour des catégories ou types d’animaux spécifiques et de maintenir la performance productive des brebis dans des situations extrêmes par exemple imposées par le changement climatique où l’offre de ressources est variable ou limitée et/ou la qualité (valeur nutritionnelle des fourrages) est dégradée.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'étudier comment des brebis de race Romane qui appartiennent à une lignées génétique divergente, pour le caractère efficacité alimentaire, font face à un challenge nutritionnel pendant la période critique de la mise-bas. Il permettra également de déterminer la variabilité individuelle des brebis.
Procédures
Prélevements sanguins pour dosage des métabolites et hormones métaboliques. La prise de sang se fera au niveau des jugulaires en alternant gauche/droite. Cela 8 fois durant les 19 jours de mesures.
Impact sur les animaux
Il n’y a pas d'effets indésirables attendus avec le déroulement de ce projet. Néanmoins, un minimum d’effet est prévu concernant l’impact instantanée sur le bilan énergétique des brebis soumises à un challenge nutritionnel pendant deux jours avec de la paille de faible valeur nutritionnelle. Donc des effets « cascade » à court terme sur le métabolisme, avec une perte éventuelle de poids vifs et d'état corporel (mobilisation des réserves corporelles) seront envisageable, sans représenter un danger pour les brebis.
Devenir
Tous les animaux retourneront en production dans leur environnement naturel.
Remplacement
Il s'agit d'un projet qui cherche à développer de la connaissance fondamentale pour l'espèce ovine, plus particulièrement, pour la race Romane (ancien INRA401) et les deux lignées divergentes développées pour l'éfficacité alimentaire. Donc, pas de remplacement possible avec d'autres animaux ou méthodes alternatives.
Réduction
Le nombre d'animaux prévus a été calculé avec la formule statistique : n=(2SD/p)² avec N = nombre d’animaux, SD=écart type, P=la précision souhaitée pour l’analyse. Au final, nous avons 10 brebis par lignée, par parité, il s'agit du minimum d'observations possibles pour arriver à une puissance statistique minimale pour les interprétations à prévoir dans ce projet.
Raffinement
Les animaux sont en groupe sur aire paillée. Pendant toute la durée de l'expérimentation, le personnel qualifié observera quotidiennement les brebis et leurs agneaux lors des 2 distributions de l'alimentation ainsi que lors de son passage dans la matinée et l'après-midi. Les brebis seront dressées au fonctionnement des portillons électroniques pendant quelques jours au milieu de la gestation, pour éviter la phase critique de la fin de gestation. Le milieu sera enrichi, pour les brebis, par des objets (chaine ou disque) accrochés qui seront alternés au cours de la semaine . Lors du paillage la paille sera mise en tas et ce sont les brebis qui l'étaleront. Pour les agneaux une table, de petite taille dont les pieds ont été ajustés à leur hauteur, sera mise à disposition. Le matériel de contention pour les prélèvements est adapté aux ovins et les animaux y sont habitués.
Choix des espèces
Il s'agit d'un projet destiné à la filière des petits ruminants, notamment les ovins. Les brebis seront utilisées après la mise bas et au début de la lactation. A ce stade physiologique la brebis démarre sa lactation qui permettra d'assurer la croissance des agneaux. En élevage selon les périodes d'agnelage des déficits nutritionnels (quantité et/ou qualité) peuvent avoir lieu pendant cette période. L'objectif est d'évaluer les capacités adaptatives des petits brebis.
Etude du rôle d’une nouvelle protéine impliquée dans la sénescence et l’inhibition de l’initiation tumorale pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur les irradie à faible dose et suit le développement d'adénomes pulmonaires par scanner sous anesthésie, pour tester le rôle protecteur d'une protéine contre le cancer du poumon. Il indique que des difficultés respiratoires sont possibles mais prévoit la mise à mort avant que les lésions ne soient trop importantes. Il affirme qu'il est "nécessaire" de démontrer l'effet à l'échelle d'un "organisme entier" et développe en parallèle des organoïdes de poumon.
Objectifs
Le patrimoine génétique de nos cellules est constamment soumis à des stress qui induisent des anomalies. Les cellules se sont dotées d’un arsenal de molécules permettant de réparer ces anomalies. Ces molécules agissent en tant que barrière anti-tumorale. Au cours du processus par lequel une cellule devient tumorale, il est fréquent que plusieurs de ces molécules soient inactivées, et ceci permet l’émergence de mutations. Le but du projet proposé ici est de démontrer qu’un nouvel acteur de ces voies de réparation agit comme une barrière anti-tumorale pour protéger le tissu pulmonaire in vivo. Les résultats obtenus pourraient ouvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le cancer du poumon non à petites cellules reste un cancer fatal et la résistance aux traitements est fréquente. Découvrir de nouveaux acteurs impliqués dans les mécanismes de protection du patrimoine génétique des cellules et de nouveaux gènes suppresseurs de tumeur est donc primordial pour accroitre les connaissances et ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du cancer du poumon
Procédures
Les animaux seront imagés avec un scanner sous anesthésie gazeuse. La durée de l’acquisition au scanner est de 2 min et l’anesthésie de 5 min.
Impact sur les animaux
Les souris seront irradiées à des doses faibles ce qui réduira le risque d’affecter les épithéliums à fort taux de renouvellement tels que la muqueuse intestinale. Des difficultés respiratoires seront possibles du fait du développement d’adénomes dans le tissu pulmonaire mais le protocole prévoit une mise à mort pour analyse des tissus avant que les lésions ne soient trop importantes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyse des tissus pulmonaires.
Remplacement
Jusqu’à présent ce projet a été mené sur des lignées de cellules humaines in vitro. Afin de démontrer le rôle anti-tumoral du gène d’intérêt dans l’objectif de publier ces résultats, il est nécessaire de démontrer l’effet à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l’expérience sera suffisant pour permettre une interprétation statistique des résultats. L’utilisation d’un appareil d'imagerie de type scanner permettra de suivre l’évolution des lésions de manière longitudinale sur les mêmes groupes d’animaux et d’éviter le maintien inutile d’animaux en souffrance respiratoire. La mise en place de procédures pilotes contribuera à réduire le nombre d’animaux utilisés pour la phase expérimentale.
Raffinement
Une définition précise des points limites et une surveillance adaptée des souris permettra d'éviter toute souffrance, en particulier l'aspect des poils, la prostration, des difficultés respiratoires et l’isolement social seront les paramètres majeurs pris en compte. L’analyse par imagerie ainsi que les procédures d’inhalation seront réalisées sous anesthésie. De la nourriture hydratée sera fournie aux groupes de souris irradiées. Les expériences de détermination de la dose des irradiations à utiliser seront menées de façon séquentielle. Si la première dose donne des résultats satisfaisants, nous ne procéderons pas avec le 2ème test. En parallèle nous établissons des cultures organoïdes de poumon. Il s’agit de cellules primaires dérivées des animaux, maintenues et propagées en culture tridimensionnelle. Nous testerons si les réponses sont similaires in vivo et ex vivo. Le cas échéant, nos futures expériences pourraient être réalisées sur organoïdes.
Choix des espèces
La souris est le modèle mammifère comportant le plus grand nombre d'outils génétiques développés (technologie de transgénèse . Les modèles tumoraux pré́-cliniques sont bien établis. Les expériences seront réalisés sur des animaux adultes
Etude de l’origine des cancers pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur déclenche chez elles un cancer du poumon par instillation dans la trachée, pour étudier l'origine et la progression des tumeurs selon le rôle d'une protéine. Il indique que les souris développent une maladie pulmonaire avec des difficultés respiratoires en stade avancé, et fixe des points limites sur le rythme respiratoire. Il affirme que les cultures cellulaires ne récapitulent pas la complexité de l'organe et qu'il faut "valider in vivo".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer les facteurs modulant l’initiation et la progression tumorale en fonction de l’origine des tumeurs (alvéolaire ou broncho-alvéolaire) en utilisant des modèles murins exprimant la mutation KRAS caractérisés dans la littérature. Notre hypothèse de travail étayée par de nombreux résultats obtenus au laboratoire est que CD98hc module l’initiation et la progression tumorale en fonction de l’origine alvéolaire ou broncho-alvéolaire des tumeurs. Ce projet a été évalué de manière positive par plusieurs comités d'experts, des financements ont déjà été obtenus. Des demandes d'autorisation expérimentale sur l'animal ont été préalablement accordées pour caractériser le rôle de CD98hc dans l’apparition et la progression des cancers pulmonaires. Les résultats obtenus suite à cette étude ont permis de mettre en évidence une expression différentielle de CD98hc dans les cellules broncho-alvéolaires ou alvéolaires.
Bénéfices attendus
L’adénocarcinome pulmonaire est un cancer très agressif, dont l’espérance de vie à 5 ans est d’environ 5%. De plus, les cancers exprimant une mutation KRAS sont réfractaires aux traitements anti-cancéreux actuels. Ainsi, trouver un traitement est primordial pour soigner ces cancers. CD98hc a été décrit comme étant impliqué dans l’initiation et le maintien des leucémies. De plus, nos résultats préliminaires suggèrent un rôle de CD98hc dans l’initiation et la progression des adénocarcinomes pulmonaires dépendants de KRAS et la survie des cellules cancéreuses. Cette étude in vivo va nous permettre de mieux comprendre le rôle de CD98hc en fonction non seulement de l’origine des tumeurs mais également du génotype tumoral. De plus, comme CD98hc est une protéine transmembranaire pouvant être inhibée in vivo par l’utilisation d’anticorps anti-CD98hc, cela pourrait représenter une cible de choix dans le traitement des cancers pulmonaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - anesthésie (procédure 1) 20 min - instillation intratrachéale (procédure 1 ), 1x 1 minute environ - injection intrapéritonéale (procédure 2/3) , procédure 2: 5x 1min. procédure 3: 1x 1min - prélèvement sanguin (procédure 1 et 2), pour le modele KRAS/P53 uniquement, tout les 15 jours, 200ul de sang, temps d'intervention: 5min.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer un cancer pulmonaire avec les nuisances liées a cette pathologie comme une difficulté respiratoire en stade avancé. Cette difficulté respiratoire s'observe par un ralentissement et un changement de la respiration (accélération ou ralentissement). Au moindre signe de détresse respiratoire et/ou de douleurs associées (prostration), les animaux seront euthanasiés.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés en fonction des cinétiques de chaque procédure.
Remplacement
Les lignées cellulaires humaines et murines seront utilisées dès que possible. Quelques publications décrivent les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude de l'initiation tumorale. Elles sont actuellement mises en place et seront envisagées aussi souvent que possible. Cependant, ces cultures sont encore très expérimentales et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe, c’est pourquoi nous avons besoin maintenant de valider nos résultats in vivo en ayant recours à des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum en utilisant la méthode statistique prédictive de Monte Carlo. Nos groupes expérimentaux sont composés de 20 animaux (10 animaux pour l’étude statique (les resultats seront analysés avec un t test corrigé (logiciel Prism)) et 10 animaux pour les analyses de cytométrie, d’extraction d’ARN et d’extraction protéique) en accord avec la pénétrance de la procédure et aucune distinction de sexe n’est nécessaire. Néanmoins, si après l'analyse de la première expérience nous constatons une différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons alors que l'un ou l'autre des sexes en fonctions des résultats obtenus.
Raffinement
Ces expériences ont été pensées en tenant compte du bien-être animal. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect de la réglementation européenne en cours afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront également suivis quotidiennement . Les points limites ont été définis comme suit : -Respiration rapide > 250 bpm (compter pendant 1 minute les mouvements de la cage thoracique). -Respiration lente < 80 bpm -Suffocation : la souris ne peut plus respirer, les mouvements de la cage thoracique sont amples. -Halètement (à confirmer 20 minutes plus tard) : La respiration est forte et saccadée.
Choix des espèces
La mutation KRAS représente environ 25% des adénocarcinomes pulmonaires, la mutation p53 représente 50 à 70% de ces cancers. Ainsi, l'utilisation de ces modèles murins (KRAS G12Dflox/+ et KRAS G12Dflox/+; p53flox/flox) permet une bonne représentation génétique des cancers pulmonaires humains. Une comparaison pourra être établie entre nos travaux et la littérature abondante dans ce domaine. Ces modèles permettent une très bonne approche des processus impliqués dans l’initiation et la progression tumorale. L'inhibition de CD98hc dans ces modèles se fera soit par adénovirus soit en croisant ces modèles avec les souris K14 et K19 et injection de Tamoxifen 4OHT. Nous utiliserons des souris adultes âgées d’au moins 8 semaines (souris adultes).
Programmation de bactéries comme agents thérapeutiques contre le cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur greffe des tumeurs sous la peau, dans le côlon ou dans la rate, puis les infecte par des bactéries modifiées censées libérer des molécules anticancéreuses au contact de la tumeur. Il indique que la greffe et la croissance tumorale peuvent provoquer perte de poids, prostration et perte de poils en fin d'étude. Il affirme qu'aucune alternative en laboratoire ne permet de faire croître une tumeur tout en conservant la diversité de ses cellules.
Objectifs
Le projet consiste en une étude chez la souris, d’utilisation de bactéries non pathogènes issues de la flore intestinale, comme agents thérapeutiques anti-cancéreux. Dans ce but, les bactéries sont modifiées afin de libérer au niveau de la tumeur des molécules chimiques anti-cancéreuses. Ce projet sera réalisé dans deux modèles tumoraux : cancer colorectal et le fibrosarcome. Dans le cadre de nos recherches, nous avons travaillé sur la modification de lactobacilles qui, par leurs caractéristiques, se présentent comme une thérapie prometteuse. Notre objectif est de réaliser une étude d’infection par ces modèles bactériens afin de démontrer que leur utilisation est possible pour atteindre différents types de tumeurs et développer des molécules thérapeutiques innovantes.
Bénéfices attendus
La biologie permet aujourd’hui de concevoir et construire de nouveaux outils qui peuvent être utilisés afin de produire des composés d’intérêt ou de détecter des molécules (marqueurs ou contaminants environnementaux), d’assainir l’environnement et de créer de nouvelles thérapies. Notre projet s’inscrit dans ce dernier domaine et a pour objectif de développer de nouveaux modes de thérapie anti-tumorale. Les résultats attendus sont : (i) la validation de bactéries non pathogènes en tant qu’agent thérapeutique, (ii) la démonstration de l’efficacité anti-cancéreuse des molécules libérées par les bactéries au site tumoral et (iii) l’absence d’effets secondaires tels que ceux observés lors de chimiothérapies ou immunothérapies.
Procédures
Les animaux vigiles pourront être soumis à 3 types de procédures : - Greffe sous-cutanée, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 1) ou - Greffe intra caecale, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 2) ou Greffe intra splénique, infection bactérienne et induction puis suivi de la croissance tumorale (Procédure 3).
Impact sur les animaux
La procédure de greffe, le développement tumoral ou encore l’induction de molécules anti-tumorales peuvent entraîner : une perte de poids ou des effets indésirables chez les animaux tels que : prostration, dos courbé, ou perte des poils. Ces signes ne devraient apparaitre qu’en fin d’étude. Les animaux faisant l’objet d’un dépassement des points limites ou présentant des signes de souffrance clinique irréversibles seront systématiquement euthanasiés et sortis de l’étude.
Devenir
Tous les animaux ayant fait l’objet d’une des procédures seront euthanasiés par inhalation progressive de CO2 ou par dislocation cervicale, réalisée par du personnel formé et compétent.
Remplacement
- « Remplacer » les modèles animaux : pour ce projet, l'utilisation d'animaux à des fins expérimentales est indispensable. Il n'existe en effet pas d'alternative en laboratoire permettant de faire croître une tumeur isolée à partir d’une lignée cellulaire tout en maintenant la diversité des cellules qui composent cette tumeur.
Réduction
« Réduire » le nombre d'animaux en expérimentation. Nous avons prévu prévu de réaliser une étude pilote puis d'utiliser un nombre minimum mais suffisant d’animaux pour garantir l’obtention de résultats pertinents et utilisables pour la génération de nouvelles thérapies bactériennes anti-cancer.
Raffinement
« Raffiner » la méthodologie utilisée, ce qui implique les notions d’élevage en milieu enrichi et de points limites (critères d'interruption de l’expérience). Afin d’améliorer la qualité de vie des souris, elles seront hébergées dans des cages d’une superficie de 500cm2. La litière sera enrichie avec des frisottis ou des carrés de cellulose. Nous porterons une attention particulière au bien-être de nos animaux qui feront l’objet d’un suivi quotidien. Pour les greffes de lignées de cellules cancéreuses, toutes les mesures d’asepsie, d’anesthésie, d’analgésie et de confort lors du réveil des souris, seront prises. Les souris seront ensuite traitées par les bactéries qui seront injectées par voie intra-tumorale, intraveineuse ou orale. L’évolution des traitements sera suivie par imagerie. .
Choix des espèces
L’étude de l’effet des thérapies bactériennes y compris sur le système immunitaire se fera sur des souris immunocompétentes C57Bl/6 greffées avec différents modèles tumoraux (colon et fibrosarcome). Les souris seront réceptionnées à l’âge de 4 semaines puis greffées 1 semaine plus tard (temps d’acclimatation minimum après réception).
Conséquences de la salinisation des zones humides côtières sur la reproduction des amphibiens
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
320 crapauds épineux vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous relâchés sur leur lieu de capture. Le porteur maintient 80 adultes en captivité brève et 240 têtards environ trois mois, en les exposant à des niveaux de salinité proches de ceux du milieu naturel, pour étudier les effets sur la reproduction et le développement. Il indique s'attendre à une éclosion et à une croissance altérées, sans effet attendu sur la survie. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal et qu'il est "indispensable" d'obtenir les pontes au laboratoire.
Objectifs
La salinisation de l’environnement a été identifiée comme une menace globale pour les systèmes océaniques, dulçaquicoles et terrestres. Plus d’un quart des zones humides de la planète ont déjà été touchées par la salinisation, d’autres sont en voie d’être affectées par ce processus, notamment les zones côtières menacées par la montée des niveaux marins et l'augmentation de la fréquence d'évènements extrêmes (submersions marines). A l’échelle globale, l’impact de la salinisation sur la biodiversité est en voie de devenir un problème de conservation majeur. Il est connu que la salinisation du milieu peut avoir des conséquences importantes sur l’utilisation de l’habitat, les budgets énergétiques ou la reproduction chez de nombreux taxons. Certains de ces groupes taxonomiques possèdent des capacités de dispersion élevés qui leur permettent d’échapper à ces conditions négatives et de se reporter sur des habitats encore favorables (par exemple les oiseaux). D’autres groupes sont beaucoup moins mobiles et sont particulièrement soumis à ce type de perturbation. C’est typiquement le cas des amphibiens qui sont caractérisés par de faibles capacités locomotrices. Ils sont également caractérisés par une peau très perméable qui facilite les échanges avec le milieu ce qui peut poser des problèmes de maintien de l’équilibre osmotique. D’autre part, le développement des œufs et des têtards dans l’environnement aquatique (mares) les rend particulièrement susceptible à la salinisation des sites de reproduction, particulièrement en zones côtières. Toutes ces caractéristiques font des amphibiens des espèces particulièrement adaptés pour examiner l’impact de la salinisation de leur environnement sur la reproduction. Le projet consiste à évaluer l’impact de la salinité environnementale (évaluée par des mesures in situ) sur le développement embryonnaire et larvaire d’un amphibien répandu, le crapaud épineux (Bufo spinosus). Afin d’évaluer les capacités d’adaptation de ce taxon à la salinisation de l’environnement, nous comparerons les réponses d'individus capturés en zones côtières (présumés habitués à ces conditions) et de zones continentales (non soumis à cette contrainte environnementale) afin d’identifier si des mécanismes spécifiques permettent aux populations côtières de faire face à cette contrainte environnementale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de répondre à deux questions cruciales. Tout d'abord, ce projet permettra d'évaluer si la salinité environnementale affecte négativement les capacités de reproduction des amphibiens côtiers. D'autre part, ce projet permettra d'élucider les capacités d'adaptation des populations cotières a ce paramètre environnemental en comparant les réponses de populations soumises ou non à la salinité environnementale. Les données récoltées seront utilisables dans un objectif de conservation (protection contre les intrusions marines des sites de reproduction côtiers, aménagement de zones refuge ou tampon).
Procédures
Les interventions sont limités à de la captivité transitoire (adultes : 48h, têtards : ~90 jours) et à des mesures morphométriques (quelques minutes).
Impact sur les animaux
Concernant les adultes, les effets indésirables potentiels sont limités à ceux induit par la captivité transitoire. Néanmoins, nos travaux précédents ont montré que les niveaux d'hormones de stress des individus reproducteurs adultes ne sont pas modifiées par la capture et la captivité ce qui semble suggérer des effets faibles de nos procédures. Les niveaux sublétaux de salinité testés dans ce projet sont similaires à ceux auxquels les individus font face dans l'environnement naturel (zones côtières). Les effets indésirable potentiels seront donc similaires à ceux auxquels les individus font face sur le terrain. Parmi les effets potentiels, nous nous attendons à des succès d'éclosion et des patrons de croissance altérés au traitements de salinité faible et modérée. Néanmoins, à la vue des niveaux de salinité testés, nous n'attendons pas d'effets sur la survie des individus. Tout sera mis en oeuvre pour limiter au maximum le stress et/ou la douleur possiblement induits par nos procédures. La durée de captivité des adultes sera réduite au minimum (la ponte ayant lieu en général dans les 24h qui suivent la capture). Les individus adultes seront relâchés sur leur lieu de capture dès que la ponte aura eu lieu. Les têtards seront maintenus dans des conditions optimales (nourriture ad libitum, pas de risque de prédation et de compétition, régime thermique stable). L'avis du vétérinaire référent sera sollicité tout au long de ces procédures (capture, captivité pour les adultes; captivité pour les têtards) en cas d'anomalie observée.
Devenir
Les niveaux sublétaux de salinité testés dans ce projet sont similaires à celux auxquels les individus font face dans l'environnement naturel (zones côtières). Les effets indésirable potentiels seront donc similaires à ceux auxquels les individus font face sur le terrain. Tous les individus seront donc maintenus en vie et relâchés sur leur site de capture.
Remplacement
L'étude de l'influence de la salinité environnementale sur les performances de reproduction a des implications importantes à la fois pour la recherche fondamentale en écologie et la recherche appliquée en conservation. Ce projet porte spécifiquement sur le crapaud épineux (Bufo spinosus) en conditions contrôlées. Il n'existe pas d'alternative à l'utilisation d'un modèle animal pour cette étude.
Réduction
Le nombre d'individus sera réduit au minimum (20 couples par sites soit 40 couples au total, soit 80 individus adultes). Seule une fraction des têtards issus de chaque ponte sera conservée pour monitorer le développement larvaire (6 individus par ponte, soit un total de 240 têtards). Les oeufs et les têtards qui ne sont pas impliqués dans ces suivis seront relâchés sur le lieu de capture des adultes dès la ponte ou l'éclosion. Les 240 têtards gardés au laboratoire seront relâchés sur le lieu de capture des adultes dès la métamorphose. L'étude concerne donc 80 individus adultes et 240 têtards (soit un total de 320 animaux). Un test de puissance (1-β) ainsi que nos travaux précédent valident que ces tailles d'échantillon sont suffisantes pour détecter des différences significatives. Les données obtenues seront analysées grâce aux techniques statistiques classiques : des modèles linéaires généralisés qui permettent de comparer des variables entre plusieurs groupes. Lorsque les analyses requièrent l'utilisation de plusieurs données par individus (parents), des modèles mixtes seront utilisés pour tenir compte de la non-indépendance des données (identité parentale en facteur aléatoire).
Raffinement
Tout au long des procédures, les adultes, les oeufs et les têtards disposeront de conditions de maintien en captivité optimisées. Les conditions d'hébergement sont adaptés aux différents stades. Le choix des dimensions des différentes boites sont tirées de la réglementation en vigueur ou de notre expertise et/ou celle de collègues quand ces informations ne sont pas disponibles. Les boites de transports permettent de limiter l’amplitude des déplacements (et donc le stress) pendant le transport. Les bacs de ponte dépassent la taille requise pour le 1/3 d’habitat aquatique requis pour les amphibiens terrestres de cette taille. Les têtards seront maintenus dans des aquariums dédiés, dans des conditions thermiques optimales (régime stable à 17°C), l'eau sera changée de façon hebdomadaire et les individus auront un accès à la nourriture ad libitum, sans compétition, sans prédation. Un suivi journalier de l'état de chaque individu et de son aquarium sera effectué. L'avis du vétérinaire référent sera sollicité le cas échéant.
Choix des espèces
L'étude de l'influence de la salinité environnementale sur les performances de reproduction a des implications importantes à la fois pour la recherche fondamentale en écologie et la recherche appliquée. Ce projet porte spécifiquement sur le crapaud épineux (Bufo spinosus), une espèce largement répandue à la fois en zones cotières et en zones continentales, ce qui en fait un modèle particulièrement bien adapté à nos investigations. Il n'existe pas d'alternative à l'utilisation d'un modèle animal pour cette étude. Il est nécessaire d'obtenir les oeufs dès la ponte pour éviter qu'une fraction significative du développement embryonnaire n'ait lieu dans des conditons non-maitrisées (i.e., sur le terrain) et pour évaluer de manière robuste les effets des traitements expérimentaux de salinité dès le début du développement embryonnaire. Dans ce cadre, il est indispensable d'obtenir les pontes au laboratoire. En outre, cela permet d'inclure des variables parentales (taille, masse corporelle) dans nos investigations. la salinité des milieux côtiers s'exprime en particulier sur les mares dans lesqeulles les amphibiens se reproduisent. Il est donc indispensable d'intégrer les effets de cette salinité environnementale sur le développement larvaire de ce groupe.
Etude du microenvironement dans les cancer pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur induit chez elles un cancer du poumon par instillation dans la trachée, puis administre des injections répétées pendant deux mois pour étudier si la rigidité de la tumeur modifie la réponse à l'immunothérapie. Il reconnaît que sa manipulation peut augmenter la dissémination des métastases et fixe un point limite à 10 % de perte de poids. Il affirme que les cultures cellulaires ne récapitulent pas la complexité de l'organe et qu'il faut "valider in vivo".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de déterminer si la modulation de la rigidité matricielle impacte la réponse des cancers pulmonaires aux immunothérapies et ce de plusieurs façons : 1)Soit en inhibant notre protéine d'interet (impliquée dans le remodelage de la matrice extracellulaire) au niveau des cellules tumorales à l’aide des modèles KRASG12Dfl/+ et KRASG12Dfl/+, p53fl/fl. Ces modèles sont très bien documentés et bien caractérisés. 2)Soit en inhibant cette protéine au niveau des fibroblastes pulmonaires à l’aide du modèle FSP1Cre. Ce modèle a été très bien décrit. Notre hypothèse de travail étayée par de nombreux résultats obtenus au laboratoire est que la modulation du microenvironement matriciel pourrait impacter la réponse de ces cancers à l’immunothérapie. Ce projet a été évalué de manière positive par plusieurs comités d'experts, des financements ont déjà été obtenus.
Bénéfices attendus
L'immunothérapie est une arme thérapeutique actuellement en plein essor dans le cancer du poumon. Néanmoins, bien que prometteuse pour certains patients, une grande majorité de patients ne répondent pas ou peu à l'immunothérapie. Notre projet, base sur des résultats préliminaires solides permettrait de mettre en évidence un levier thérapeutique potentiel. Non seulement CD98hc pourrait être un marqueur de résistance mais aussi une cible thérapeutique potentielle.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions : - instillation intratrachéale (1x au début de l'expérience - durée de l'intervention: 2 minutes) - injection intrapéritonéale (2x par semaine pendant 2 mois- duréee de l'intervention 1minute) - prélèvement sanguin (toutes les deux semaines pendant 2 mois - durée de l'intervention: 10 min) - injéction sous-cutanée (1x au début de l'expérience- durée de l'intervention: 10 min) Pour chaque intervention les animaux seront anesthésiés afin de diminuer le stress.
Impact sur les animaux
Il a été démontré que le "softening de tumeur" pourrait augmenter les metastases. En modulant l'expression de la protéine d'interet dans le compartiment tumoral ou dans le microenvironnement, le risque est une augmentation de la dissemination tumorale dans le groupe controle. C'est pourquoi nous allons suivre les cellules tumorales circulantes régulierement et analyser les differents organes en coupe histologique. Le marque mTmG pourrait également etre utile dans la détection des métastases.
Devenir
A la fin de l'étude, nous devons analyser la taille, le nombre et le grade des tumeurs pulmonaires. Les animaux seront tous euthanasiés en fonction des cinétiques de chaque procédure.
Remplacement
L’utilisation de lignées cellulaires humaines et murines seront utilisées dès que possible. Quelques publications décrivent les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude de l'initiation tumorale. Elles sont actuellement mises en place et seront envisagées aussi souvent que possible. Cependant, ces cultures sont encore très expérimentales et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe, c’est pourquoi nous avons besoin maintenant de valider nos résultats in vivo en ayant recours à des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum (analyse statistique prédictive selon la méthode de Monte-Carlo). Nos groupes expérimentaux sont composés de 20 animaux (12 animaux pour l’étude statique et 8 animaux pour les analyses de cytométrie, d’extraction d’ARN et d’extraction protéique) en accord avec la pénétrance de la procédure et aucune distinction de sexe n’est nécessaire. Néanmoins, si après l'analyse de la première expérience nous constatons une différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons alors que l'un ou l'autre des sexes en fonctions des résultats obtenus.
Raffinement
Ces expériences ont été pensées en tenant compte du bien-être animal. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect de la réglementation européenne en cours afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront également suivis périodiquement à l’aide d’une fiche de score. Toute alteration de la respiration (plus rapide, plus lente), ainsi qu'une perte de plus de 10% du poids de la souris sont considérés point limite entrainant la mise a mort de l'animal.
Choix des espèces
La mutation KRAS représente environ 25% des adénocarcinomes pulmonaires, la mutation p53 représente 50 à 70% de ces cancers. Ainsi, l'utilisation de ces modèles murins (KRAS G12Dflox/+ et KRAS G12Dflox/+; p53flox/flox) permet une bonne représentation génétique des cancers pulmonaires humains. Une comparaison pourra être établie entre nos travaux et la littérature abondante dans ce domaine. Ce modèle permet une très bonne approche des processus impliqués dans la l’initiation et la progression tumorale. Dans cette étude, nous utiliserons des souris agées d'au moins 3 semaines.
Création d’une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 700 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, destinées à d'autres protocoles selon leur phénotype, celles n'ayant pas le profil recherché étant tuées. Le porteur croise deux lignées génétiquement modifiées pour obtenir des souris exprimant une molécule d'étude sur leurs lymphocytes T. Chaque petit est identifié par une boucle d'oreille sous anesthésie, puis phénotypé par prise de sang à la mâchoire ou au sinus rétro-orbitaire. Il affirme que ce passage in vivo est une étape "indispensable" avant le recours aux gros animaux puis à l'homme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer le rôle d'une molécule spécifique sur la biologie des Lymphocytes T in vivo. CEtte molécule n’est pas exprimée chez les rongeurs, nous avons donc fait modifier génétiquement des souris de fond C56BL/6 afin que l’expression son expression soit sous le control du promoteur du CD3e, ainsi tous les Lymphocytes T exprimeront la molécule d'étude. Son ligand, est une molécule ubiquitaire, présent chez la souris mais la protéine étant légèrement différente, nous avons choisi de faire développer des souris hybrides exprimant la portion extracellulaire de la version humain du ligand tout en gardant la portion intracellulaire de la version murine de cette molécule. Cette souris « hybride » a également été créée sur un fond C56BL/6. Nous souhaitons désormais croiser ces 2 lignées pour obtenir des souris Hybrid pour le ligand exprimant également la molécule d'étude.
Bénéfices attendus
Une fois obtenues, ces souris seront incluses dans des projets ou le système immunitaire sera chalengé et le rôle de notre molécule d'intérêt sera évalué grâce au développement d’Ac bloquant spécifiquement l’interaction de la molécule à son ligand (version extra cellulaire humaine et intracellulaire murine) et déjà validés in vitro.
Procédures
Lors du sevrage, les souriceaux seront identifiés par la mise en place d'une boucle d'oreille numérotée. Pour cette mise en place l'animal reçoit une dose de charge d’Isoflurane. En fonction du caractère récessif ou dominant des modifications génétiques, et du génotype des parents les petits seront ou non phénotypés par analyse des cellules sanguine. Cette prise de sang sera réalisée soit, sur des animaux vigiles au niveau mandibulaire ou sur des animaux anesthésiés au niveau du sinus rétro-orbitaire sur animal anesthésié et ayant reçu une goutte de Tétracaine 1% .
Impact sur les animaux
Ce nouveau phénotype ne devrait pas engendrer d’effet nuisible pour les souris
Devenir
Les souris issues de l’élevage seront incluses dans des expériences en fonction de leur phénotype ou bien sacrifiées si le phénotype escompté n’est pas obtenu.
Remplacement
Des données préliminaires in vitro ont été obtenues mais le rôle exact de la molécule que nous étudions n’a pas encore été totalement clarifié. Un passage à l’in vivo dans des souris génétiquement modifiées pour exprimer les molécules d’intérêts permettra de mieux comprendre le rôle de ces molécules et les conséquences de leur blocage spécifique. Il s’agit d’une étape indispensable avant le passage aux gros animaux puis à l’homme.
Réduction
L’élevage sera dimensionné en fonction des expérimentations prévues.
Raffinement
Les couples seront hébergés dans des cages contenant des frisottis papiers et du coton leur permettant la nidification. Une fois sevrées, les souris seront hébergées dans des cages contenant des frisottis papiers. Une surveillance journalière par les animaliers nous permettra de surveiller que les souris n’ont pas de phénotype dommageable. La prise de sang pour phénotyper les souris sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 4%/air comprimé) en ayant préalablement déposé une goutte de Tétracaïne 1% collyre.
Choix des espèces
Les souris issues de cette nouvelle lignée seront ensuite incluses dans des protocoles que nous maitrisons pour questionner le système immunitaire. La molécule d’intérêt pourra ou non être bloquée à l’aide d’Ac spécifiques pour questionner son rôle dans différentes situations expérimentales mettant en jeux le système immunitaire. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5-6 semaines pour maintenir l’élevage
Conception de modèles d’hémopathies malignes chez la souris immunodéprimée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur greffe à des souris immunodéprimées des cellules humaines rendues cancéreuses, puis suit la prise de greffe par des ponctions dans le fémur sous anesthésie chaque mois, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Il indique surveiller la perte de poids, une croissance tumorale pouvant s'accompagner de nécrose ou d'ulcère cutané. Il affirme avoir "besoin" d'un "organisme entier" pour étudier le développement des tumeurs et conclut que la souris n'est remplaçable par aucune autre méthode.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la conception de deux modèles de cancer du sang, associés a des altérations chromosomiques, chez des souris immunodéprimées. Pour cela les souris recevront des cellules humaines exprimant, après manipulation, des acteurs clés de la transformation d'une cellule normale en cellule cancéreuse. Ce projet se déroulera uniquement après validation in vitro du caractère cancéreux des cellules générées afin de limiter le nombre d'animaux nécessaires à ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra pour la première fois le développement de deux modèles de cancer du sang associés à des altérations chromosomiques. En mettant à jour le rôle clé de certaines molécules, iIl pourrait mettre en évidence de nouvelles combinaisons thérapeutiques. pour ces deux cancers.
Procédures
La greffe chez les souris recevant une injection par voie retro-orbitale sera suivie par ponction médullaire tous les mois. En pratique les souris sont anesthésiées sous anesthésie gazeuse, après désinfection à l'alcool de la patte, un trou est effectué dans le fémur, la ponction s'effectue par aspiration dans ce trou à l'aide de seringue . Au moment opportun les souris seront sacrifiées par dislocation cervicale pour être disséquées
Impact sur les animaux
La prise de greffe devra etre surveillée car elle peut engendrer une perte de poids importante et rapide et une modification du comportement des animaux. Une croissance tumorale en sous-cutanée peut etre également associée à une nécrose/ulcère de la peau. Ainsi, après toute application d'une procédure, les critères de surveillance généraux seront appliqués : une perte de poids atteignant les 20%, un comportement anormal grave, un arrêt d’alimentation, une baisse de la température corporelle ou un mutisme de plus de 24 h conduiront à un arrêt de l’expérimentation. Dans ce cas, l’animal sera immédiatement euthanasié.
Devenir
A la fin de l'expérimentation, euthanasie par dislocation cervicale.
Remplacement
La souris est le modèle expérimental le plus utilisé dans la littérature pour l’étude de la tumorigenèse et pour évaluer les effets de molécules anti-cancéreuses. En effet l'expérimentation in vivo est non substituable à aucune autre méthode car nous avons besoin d'un organisme complet pour étudier le développement des tumeurs. Les expériences sur les souris ne sont faites que après avoir testé in vitro les differents ARN non codants et la translocation NPM_ALK. Seuls les « acteurs » ayant un intérêt biologique seront testés sur l'animal. Cette étape est nécessaire en cancérologie car il est crucial de connaitre le devenir des cellules cancéreuses dans un organisme entier afin d'étudier les risques de genèse, de metastases ou de rechutes après traitement.
Réduction
Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée afin d'optimiser nos protocoles pour réduire au maximum le nombre d'animaux. Des études statistiques nous permettent également de déterminer le nombre minimum de souris nécessaires afin que l'expérience ait une valeur scientifique et n'est pas besoin d'être reproduite.
Raffinement
L'évaluation quotidienne de la souffrance nous permet de déterminer si l'expérience doit être arrêtée. Pour cela des points limites et une methode d'évaluation pour la prise en charge des animaux sont identifiés. Les experimentations seront réalisées sous anesthésie et avec utilisation d'analgésie.
Choix des espèces
La souris est le modèle expérimental le plus utilisé dans la littérature pour l’étude de la tumorigenèse et pour évaluer les effets de molécules anti-cancéreuses. En effet l'expérimentation in vivo est non substituable par aucune autre méthode car nous avons besoin d'un organisme complet pour étudier le développement des tumeurs. Ce modèle expérimental nécessite l’utilisation d’animaux immuno-déprimés (pour permettre la croissance des cellules humaines). La souches murine de référence pour l’implantation des cellules primaires humaine et les cancers hémathologiques est la souris NSG. Animaux adultes à partir de 6 semaines. L’utilisation d’animaux adultes est justifiée par le fait que les deux hémopathies malignes que nous étudions sont des cancers de l'adulte.
Analyse de l’activité et la physiologie de l’aorte descendante chez le rat chez la descendance suite à un régime hypercalorique maternelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
277 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie réutilisée pour d'autres projets et le reste tué pour prélèvements. Des rates sont soumises à un régime gras avant et pendant la gestation, puis leur descendance est suivie de la naissance au sevrage pour étudier les effets sur l'aorte et le métabolisme. Le porteur décrit des prélèvements de sang répétés à la queue et des mesures de pression artérielle, et fixe un point limite à 20 % de perte de poids chez les adultes. Il affirme qu'une culture cellulaire ne reproduirait pas la complexité de ce tissu et juge certaines expérimentations "absolument indispensables".
Objectifs
La programmation foetale est un concept qui montre la relation entre le faible poids de naissance et le développement de maladies métaboliques à l'âge adulte telles que les maladies cardiovasculaires, le diabète, le syndrome métabolique, l'obésité et l'hypertension. Les individus qui avaient un faible poids de naissance et qui sont restés petits au début de l'enfance ont rapidement développé une hypertension. Le rebond précoce de l'adiposité est fortement lié à un indice de masse corporelle élevé au cours de l'enfance qui s'est avéré être le facteur de risque du diabète de type 2. Bien que ces maladies ont une part génétique, il y a également une part environnementale. Un régime maternelle hypercalorique (enrichi en graisse) pendant la grossesse va avoir des conséquences sur la descendance. Ce régime aura des impacts directs sur l'ensemble des gènes de la descendance mais également lors de son développement par sa nutrition via le placenta en favorisant l'hyperméthylation du génôme. En effet, l’état nutritionnel de la mère pendant la gestation et/ou la lactation, sont des déterminants clés du développement foetal et postnatal. Dans notre étude nous allons utiliser un modèle de rates Wistar nourries en régime gras pendant 2 mois qui nous permettra d'étudier les conséquences fonctionnelles et métaboliques au niveau des vaisseaux sanguin pendant des périodes spécifiques de développement embryo-foetal. Le projet vise à répondre aux questions: un régime précoce en régime gras entraîne-t-il des modifications de la structure et de la physiologie de l’aorte ? Quels seraient les mécanismes moléculaires et tissulaires responsables de ces éventuelles modifications ? Existe-t-il des fenêtres d'exposition critique pour expliquer l'apparition des altérations moléculaires? L’objectif du projet est d’évaluer l’intégrité des fibres élastiques (élastogenèse et élastolyse) en tant que facteur déterminant des fonctions vasculaires chez la progéniture issue de mère nourie avec un régime riche en gras.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de la mise en place de la matrice extracellulaire vasculaire chez le rat et par extension à l'Homme. Ces connaissances fondamentales permettront d'appréhender de façon plus précoce les maladies cardiovasculaires d'un point de vue vétérinaire et humaine mais aussi d’identifier les phases d’exposition critique pour la descendance.
Procédures
Pour la procédure 1: dans la cadre d'une prévention la glycémie sera mesurée tous les 7 jours en prélevant 10 μl de sang par incision (< 2 mm) d’une veine de la queue. La glycémie devra être située entre 50 et 400 mg/dl. Les rats n'étant pas à jeun les valeurs sont plus élevées. Pour la procédure 2: la pression artérielle sera mesuré de manière non invasive sur animal vigile pour les ratons de 21jours. Cette mesure ne provoque aucune douleur ni prélévement.
Impact sur les animaux
L’objectif est d’obtenir un déséquilibre métabolique dont les conséquences chez les ratons nés de mères surnutri nous sont déjà connues : hypertrophie myocardique, stéatose hépatique, troubles du développement du système nerveux central, diabète... Pour les femelles surnutrie nous obtiendrons un surpoids et pas d’IRES (insulino-résistance) pour un régime de 2 mois.
Devenir
Pour les animaux sous régime HFD, Un retour a un état physiologique d'origine étant trop compliqué après un HFD. Les femelles progénitrices HFD (16 femelles/phase => 4 phases 21jours, 14jours, 7 jours et 24H => 64 femelles HFD) seront euthanasié et les organes seront prélévés. Les animaux sous régime normal (les males progéniteurs 13, 3-4/phase et les femmes progénitrice 40, 10femelles/phase) seront réutilisé pour d'autre projet de recherche ou enseignement. Les ratons témoin et HFD seront euthanasié pour prélèvements. Les ratons surnuméraires obtenus seront réutilisés pour d'autre projet de recherche ou enseignement.
Remplacement
Nous souhaitons étudier les conséquences d’une sur-nutritionnelle maternelle (régime riche en graisse HFD) sur le développement et la fonction de l’aorte descendante chez la descandance. Un modèle de cultures cellulaires ne permet pas d’étudier la complexité et la dynamique de ce tissu.
Réduction
Les procédures ont été réalisées afin de se limiter aux expérimentations jugées absolument indispensables pour cette étude. Une réflexion biostastistique (G-power) a été intégrée à la création de ce projet afin de réduire le nombre d’animaux tout en assurant la fiabilité scientifique. En raison de la petitesse des animaux et des approches biochimiques, moléculaires ou d'imagerie envisagées nécessitant une quantité certaine de matériels, nous constituerons des groupes d’étude à raison de 20 individus. De plus, entre chaque procédure, un système GO/NOGO sera mis en place afin d’utiliser le nombre d’animaux strictement nécessaire. Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un test Mann-Whitney.
Raffinement
En amont des procédures, les animaux seront hébergés dans des cages de dimensions réglementaires avec un enrichissement adapté. L’eau et la nourriture seront données de façon ad libitum. Les cycles de jour de 12h seront réalisés. Chaque protocole expérimental débutera par une période d'acclimatation de 2 semaines à nos locaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une procédure d’estimation de la douleur est mise en place (grille de score RAT GRIMACE SCALE). Le point limite est fixé à 20% de perte/prise du poids corporel (chez les adultes). En fin de protocole les animaux seront mis à mort et des prélèvements (sang aortes) seront effectués. D'autres tissus seront également prélevés et congelés pour d'autres projets scientifiques et pour l'enseignement. Les mâles reproducteurs et les femelles sous régime normal, seront replacés pour d'autres protocoles expérimentaux.
Choix des espèces
Le projet de recherche fait appel à des analyses physiologiques, biochimiques et moléculaires en lien avec des régimes nutritionnels spécifiques. Les rats Wistar sont classiquement utilisés dans la littérature scientifique pour ce type d’étude. Le projet se concentre sur les effets transgénérationnels dans les stades précoces de la vie du régime HFD responsable d'une hyperméthylation du génome de la descendance et vise en particulier à étudier les effets de cette hyperméthylation dans l'élastolyse, l'insuffisance cardiaque et le diabète. Nous regarderons donc les conséquences sur la descendance à 24h, 7J, 14J et 21J moment du sevrage. Les stades de développement utilisés sont: • Rats adultes pour le reproduction (13 males et 104 femelles) • Ratons nouveau nés maintenus à 21 jours, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle) • Ratons nouveau nés maintenus à 14 jours, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle) • Ratons nouveau nés maintenus à 7 jours, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle) • Ratons nouveau nés de moins de 24 heures, mise à mort de 20 ratons par groupe (HFD vs controle)