Oncologie

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).

Procédures

4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle

Raffinement

Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole

80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un régime riche en graisses induisant l'obésité, complété par une supplémentation en poudre de tomate, avec prises de sang par incision de la queue, perçage des oreilles, tests de tolérance au glucose et à l'insuline et isolement pour recueil des fèces. Il indique que l'isolement provoque un stress social et que l'incision et le perçage peuvent être douloureux, avant la mise à mort pour prélever les tissus. Sur le remplacement, il affirme que l'étude d'une supplémentation sur la santé métabolique ne s'envisage qu'in vivo.

Objectifs

La tomate est une des productions agricoles les plus importantes en termes de volume de production et de portée économique. Sa consommation, notamment sous forme de poudre de tomate, est associée à des effets bénéfiques pour la santé métabolique, mais son profil nutritionnel et sa teneur en micronutriments dépend du génotype et des conditions de production. L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact du génotype de tomate et du déficit d’irrigation sur la qualité nutritionnelle des poudres de tomates et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez souris. Pour ce faire, 4 génotypes de tomate ayant subit différents niveaux de stress hydrique et présentant des profils contrastés en phytomicronutriments seront lyophilisés (6 poudres différentes en tout) puis administrés à 80 souris C57Bl/6J males (8 groupes de 10 souris) durant 12 semaines, dans le cadre d'un régime riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux évaluer l’impact du génotype et des conditions de culture de poudres de tomate sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la tomate avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors d'un test de tolérance à l'insuline, d'un test oral de tolérance au glucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors de la distribution des doses de glucose pendant le test oral.

Devenir

Les animaux de cette prcédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet quei seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de tomate.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de tomate sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (10 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Une crème anesthésique sera appliquée localement lors du perçage des oreilles pour identification et avant incision pour les prélèvements de sang à la queue. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Et une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit une injection d'azoxyméthane déclenchant une cancérogenèse du côlon, suivie cent jours plus tard d'un jeûne de seize heures, d'un gavage et d'une prise de sang sous anesthésie, avant la mise à mort et le prélèvement du côlon. Il indique que les interventions peuvent provoquer du stress mais "pas de douleur" et que les lésions précancéreuses restent indolores. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune étude in vitro ne reproduit l'ensemble du développement d'un cancer colique.

Objectifs

Le contrôle de la perméabilité intestinale joue un rôle crucial dans le maintien d’une intégrité fonctionnelle et protectrice de l’intestin, face à de nombreux intrants alimentaires ou toxiques et face au contact permanent entre le microbiome et le tube digestif. De nombreux cas de fragilité ou de pathologies intestinales ont été associés à une augmentation de la perméabilité intestinale qui peut être observée de façon transitoire ou permanente. Cette perméabilité augmentée a été largement observée suite à des situations de stress, d’inflammations ou de cancers colorectaux (CRC) mais sa contribution dans la genèse ou l’entretien de pathologies intestinales reste à préciser. Ce projet étudiera la perméabilité intestinale de façon globale, in vivo mais aussi ex vivo sur des côlons prélevés post mortem, en comparant des rats mâles témoins à des rats dont la cancérogénèse colorectale a été chimio-induite 100 jours plus tôt par une injection d’azoxyméthane. Chez ces animaux traités, des lésions prénéoplasiques indolores se seront développées dans les côlons sans aller jusqu’au stade tumoral et sont de bons marqueurs de cancérogenèse qui sont largement acceptés par la communauté scientifique. Ces lésions seront dénombrées après mise à mort des animaux et la perméabilité intestinale sera détectée in vitro. Nous chercherons notamment à préciser en précisant l’abondance des zones perméables et leur proximité avec des lésions précancéreuses.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de préciser, notamment sur les côlons prélevés post mortem, où se situent les zones perméables du côlon et leur proximité des zones prénéoplasiques afin de mieux comprendre en quoi la perméabilité intestinale peut participer au processus de cancérisation du colon. La comparaison de la structure des côlons sains par rapport à celle des rats chimio-induits nous permettra d’identifier les lésions prénéoplasiques et de potentielles différences de perméabilité intestinale dans les zones saines ou précancéreuses.

Procédures

Sur une durée d’expérience de 100 jours, les rats vigiles seront soumis à J0 à une injection intrapéritonéale d’AOM, à J90 à une mise à jeun, avec accès libre à l'eau de boisson, puis gavage au FD4 et prélèvement de sang à la queue sous anesthésie à l'isoflurane, à J100 mise à mort sous anesthésie, par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Seules quelques interventions sur les animaux seront effectuées pouvant provoquer un peu de stress mais pas de douleur. A J0, 12 rats recevront une injection intrapéritonéale d’azoxyméthane (AOM) dilué dans du sérum physiologique sera effectué par une personne qualifiée, afin de réduire la douleur et le stress de l’animal. A J90, le gavage de FD4 sera effectué par un utilisateur expérimenté ainsi que la prise de sang qui sera effectuée sur animaux anesthésiés à l'isoflurane. Le jeûne de 16h, avant l’administration orale est long mais nécessaire pour vider le côlon de ses fèces et le rendre ainsi accessible au FD4. Avant cette expérience les animaux auront été habitués à la contention et au gavage pendant quelques jours pour diminuer leur ressenti de stress.

Devenir

Tous les animaux seront anesthésiés et mis à mort à la fin de l’expérimentation (J100 après injection d’azoxyméthane) et leur côlon sera prélevé.

Remplacement

Aucune étude in vitro ne permet d’évaluer l’ensemble des étapes de développement des cancers, au niveau de l’écosystème colique. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité physiologique du côlon, dans les différentes étapes de son fonctionnement et du développement de foyers cancéreux qui sont influencés par la consommation alimentaire, la formation de composés toxiques, le microbiote et qui sont en permanence régulés par les systèmes immunitaires, sanguins et nerveux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum (12 rats témoins et 12 rats traités à l’AOM) pour obtenir des résultats statistiquement solides et fiables dans l’appréciation de la relation entre l’installation de foyer prénéoplasiques dans le côlon et des modifications potentielles de la perméabilité intestinale.

Raffinement

Les rats seront maintenus à 2 par cage qui sera transparente pour ne pas souffrir d’isolement et dans laquelle un tunnel pour s'abriter sera ajouté pour raffinement. La température et l’hygrométrie seront maintenues constantes avec un cycle constant de lumière et obscurité de 12h chacune, un accès illimité à la nourriture et à l’eau et un change de litière hebdomadaire, pour leur confort. Les interventions sur les animaux (contention, injection d’AOM et gavage au FD4) seront réalisées par des techniciens expérimentés et après une habituation des rats, afin de limiter leur stress. La prise de sang sera effectuée sous anesthésie brève à l’isoflurane.

Choix des espèces

Le traitement de rats de la souche F344 à l’AOM induit dans leur côlon des carcinomes qui sont similaires aux carcinomes coliques humains sur de nombreux aspects comme la formation de foyers de cryptes aberrantes (ACF pour aberrant crypt foci) qui sont des lésions prénéoplasiques. Ces lésions sont précurseurs des adénomes ou carcinomes coliques chez l’homme et, chez le rat, permettent d’étudier la raison de la genèse des cancers colorectaux et de développer des thérapies préventives ou curatives. Rats adultes L'ensemble des études précédentes du laboratoire ont été menées sur des rats adultes. Ce projet vise à compléter les études précédentes des stratégies préventives sur le rôle du fer héminique dans l’effet promoteur de la cancérogenèse colorectale, il est important de rester au même stade de développement.

608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe une tumeur, puis elles reçoivent des médicaments par injection intraveineuse et intra-tumorale, avec des séances d'imagerie sous anesthésie et des prélèvements sanguins. Le projet teste des nanoparticules activées par ultrasons pour concentrer les médicaments anticancéreux au niveau de la tumeur. Le porteur affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour évaluer la biodistribution in vivo.

Objectifs

Aujourd'hui, de nombreux médicaments en oncologie souffrent d'une faible efficacité. Seul un pourcentage très faible de la dose atteint la cible à traiter lorsqu'ils sont administrés par voie orale ou intraveineuse, tandis que la majorité de la dose surcharge inutilement et dangereusement le corps du patient. En cancérologie, les traitements entrainent des effets indésirables difficiles à supporter pour les patients nécessitant de diminuer les doses et d’espacer les traitements. L’effet thérapeutique est alors fortement diminué. De nombreuses thérapies innovantes telles que l’ajout de transporteurs actifs tentent d’apporter une réponse à ce problème mais sont le plus souvent actives sur un nombre restreint de patients et ont un coût très élevé. Nous avons mis au point une nouvelle approche utilisant des nanoparticules pouvant être administrées chez les patients pour délivrer tout type de médicaments de façon ciblée au niveau de la tumeur. Cette délivrance peut être contrôlée par l’action d’ondes sonores (ultrasons) appliquées au niveau de la zone à traiter. Cette approche permettrait de traiter la zone cancéreuse chez un patient avec une plus grande efficacité thérapeutique tout en minimisant les effets indésirables au niveau des tissus sains. Elle permettrait ainsi d’éliminer les effets indésirables du médicament administré qui serait, de fait, mieux toléré et dont l’efficacité thérapeutique serait conservée. De nombreux médicaments utilisés aujourd’hui dans le traitement des cancers, peu tolérés en administration seule ou présentant certaines toxicités, pourraient être combinés à nos nanoparticules afin de limiter leurs effets indésirables et augmenter leur efficacité thérapeutique. Cette approche permet, en plus, d’exploiter des agents déjà développés ou en cours de développement et ayant fait leur preuve in vitro contre divers cancers avec des résultats mitigés in vivo. Nous avons montré en laboratoire (in vitro) que des ultrasons à des ondes bien précises entrainent la délivrance contrôlée de médicaments utilisés dans le traitement des cancers. Ces études en « tube à essai » sont une étape initiale importante mais doivent être validées dans un organisme vivant pour se rapprocher de la complexité rencontrée chez les patients. .

Bénéfices attendus

Ce projet avec un fort potentiel clinique doit permettre de tester cette nouvelle stratégie thérapeutique qui couple délivrance par ultrasons et médicaments anti cancéreux dans un modèle préclinique. Le recours à l’animal est indispensable pour l’évaluation in vivo sur la biodistribution et l’efficacité. Ces études auront pour but de vérifier et d’optimiser le ciblage de médicaments anti-cancéreux au niveau de la tumeur et d’étudier comment le médicament se distribue dans le reste du corps. Ces études sont une étape clé pour continuer le développement de cette technologie chez l’humain.

Procédures

Les effets interventions prévues sur les animaux sont listés ci dessous : o L’injection des médicaments en intra veineux et intra tumorale (2 fois par semaine maximum) peut induire une courte douleur (moins de 5min) qui sera réduite via l’utilisation d’anesthésiant local (Xylocaïne, gel 2%). Les injections de médicaments ne seront réalisées que sur une durée de moins de 3 semaines. o Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (1h30 maximum) par voie gazeuse (isoflurane 1.5% à 2.5%). Lors du réveil, les souris peuvent être désorientées et stressées. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière sera prévu dans la cage propre. o Des prélèvements sanguins seront réalisés pendant les différentes procédures. Un volume maximal de 50-100µL, lors de séance d’imagerie, soit une heure et 48h après l’injection des médicaments seront réalisés (durée totale : 5minutes). L’application de gel de Xylocaine (2%), sera effectué pour atténuer la douleur. o Les tumeurs peuvent impacter la mobilité de la souris. Suite à l’injection des xénogreffes, les souris seront examinées tous les deux jours afin de vérifier que le volume tumorale n’impacte pas la mobilité de la souris. Dès l’observation de cette mobilité réduite (dans les 24h), les souris seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

La mise en place de modèles tumoraux peut induire une gêne au niveau du site d’implantation de la tumeur lors de l’injection de cellules pendant quelques heures. Une analgésie adaptée est mise en place (Xylocaine en gel) ainsi qu’un suivi régulier des animaliers. L’injection d’agents d’imagerie, toujours réalisée sous anesthésiant local (imagerie par tomographie par émission de positon, imagerie optique et /ou échographie) n’induit pas d’effets indésirables, étant donné que le traceur est à très faible dose. Le prélèvement sanguin n’est réalisé qu’une ou deux fois par semaine avec des volumes très faibles, ne perturbant pas le bien-être animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser des corrélations entre des analyses ex vivo et l’imagerie. L’analyse ex vivo est un point crucial afin de réduire dans les prochains projets le nombre d’animaux en validant la méthodologie appliquée. De plus, le volume tumoral à chaque fin de procédure serait trop important pour garantir les points limites sur le volume tumoral.

Remplacement

L’efficacité de la délivrance des médicaments augmentée par ultrasons sera dans un premier temps évalué in vitro afin de définir aux préalables les paramètres ultrasonores. La toxicité des nanoparticules et des médicaments associés seront évaluées in vitro également. Ces études sont essentielles afin de remplacer l’utilisation des animaux par des essais in vitro. De plus ces études permettent de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons pour l’évaluation sur le modèle murins.

Réduction

L’imagerie permet des études longitudinales en pharmacocinétique et par conséquent ne nécessite pas l’utilisation d’animaux à chaque temps, réduisant drastiquement le nombre de groupe d’animaux nécessaires pour des études classiques en pharmacologie. Chaque donnée d’imagerie, individuellement ou globalement, permettront après analyses de définir la distribution des agents thérapeutiques de manière longitudinale en gardant la puissance statistique de l’étude.

Raffinement

Toutes les interventions invasives, à savoir, les injections systémiques ou intra-tumorales seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse, complétées par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liés aux interventions. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Ce projet a comme objectif de suivre et d’évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique sur la délivrance de médicaments anti-tumoraux associés à des nanoparticules augmentée par ultrasons. La souris est l’animal de choix pour la mise en place de modèle tumoraux, ayant une taille adaptée pour la manipulation. Les modèles sous-cutanés sont largement utilisés pour examiner rapidement de larges cohortes de tumeurs relativement homogènes dont la croissance et la réponse aux médicaments délivrés de façon standard ont déjà été évaluées.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises seize semaines à un régime gras jusqu'à devenir obèses, avec pesées, mesures de composition corporelle et tests de tolérance au glucose sur animaux vigiles. Un prélèvement sanguin rétro-orbital sous anesthésie précède la mise à mort et le prélèvement d'organes. Le porteur affirme que la dysfonction métabolique de l'obésité ne peut être étudiée que sur des animaux entiers.

Objectifs

Le but est d'evaluer la reponse metabolique des animaux porteurs d'anomalies de l'expression de certaines proteines a un regime obesogene , et d'evaluer l'importance des changements metaboliques par rapport a un groupe controle .Il s'agit de de tester la pertinence des cibles proteiques etudiées du point de vue physiopathologique/et/ou thérapeutique. Il s'agit d'un protocole de suivi metabolique standard, avec de légeres modifications qui ont pour seules consequences d'ameliorer le confort des animaux (elevage en thermoneutralité).

Bénéfices attendus

ce projet s'inscrit dans le contexte de l'etude de modeles de souris comme outil de comprehension des mecanismes physiopathologiques de l'obesité, qui necessite des etudes sur animaux vivants ne pouvant etre subsitues. Il permettra de demontrer l'importance de l'espression des proteines ciblées dans la dysregulation metabolique mise en jeu dans l'obesité, etape necessaire a la poursuite vers des essais therapeutiques.

Procédures

pendant l'etape 1 pendant 16 semaines: Changement de régime alimentaire et mise sous régime enrichi en graisse. Maintient a thermoneutralité (30°C) pendant l'etape 2: Pesée hebdomadaire. Mesure non invasive de la composition corporelle par RMN. Procedure realisée 2 fois a S0 et S15 sur animaux vigiles. Test de tolerance au glucose et a l'insuline comportant la mise a jeun pendant 4h suivie de prelevements de gouttes de sang a la queue (1 goutte x 6 pendant 180 minutes) sur animaux vigiles. Procedure realisée 2 fois a S0 et S15. pendant l'etape 3: (a S16) Anesthesie gazeuse pour prelevement sanguin retroorbital. Euthanasie pour prelevement d'organes post mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux de ce protocole seront soumis a un regime alimentaire obesogene (riche en graisse) consommé avec grande appétence, qui conduit au développement d'une obésité expérimentale, ce qui peut etre considéré comme une nuisance a la santé. Egalement nous proposons dans ce protocole de maintenir les animaux a thermoneutralité (30°C) et non pas a temperature ambiante comme c'est generalement le cas dans la plupart des animaleries. Cette procedure peut constituer une nuisance dans le sens ou elle necessite l'utilisation d'une enceinte climatique pour la stabulation des animaux, cependant le confort thermique est amélioré, et plus proche des conditions de vie des humains qui vivent la quasi totalité dans des conditions de thermoneutralité.

Devenir

A la fin du protocole, tous les animaux sont euthanasiés en vue de prelever et d'etudier differents organes (tissu adipeux, foie, muscle etc). Les différents prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem et que cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux

Remplacement

La dysfonction metabolique induite par l'obésité chronique est une situation impliquant de nombreux acteurs cellulaires, qui ne peuvent être étudiées dans leur intégralité que sur des animaux. L’évaluation de candidats therapeutiques potentiels nécessite l’utilisation des modèles murins génétiquement modifiés. Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet et permet d'explorer les males et les femelles.

Réduction

Pour chaque groupe experimental correpondant a un regime (standard ou enrichi en graisse) et un genotype (ko ou control), 12 animaux (6males et 6 femelles) seront utilisés. Au total par lignée transgenique 48 animaux seront nécessaires, soit 240 au totalpour les 5 lignées a étudier. C'est le nombre minimal pour prendre en compte la variabilité experimentale de la reponse au regime riche en graisse, qui permet d'obtenir des differences statistiquement significatives apres 16 semaines de regime. . La durée du regime (16 semaines) correspond au temps necessaire pour obtenir non seulement une augmentation du poids corporel mais aussi des effets metaboliques associées a l'obesité chronique. De plus il est necessaire d'evaluer a la fois des males et des femelles car il est connu que les risques metaboliques consecutifs a l'obesité sont differents selon le sexe.

Raffinement

Pour l’étape 1 : Le maintien es animaux a thermoneutraliré réduit le stress thermique par rapport a un élevage a température ambiante. Il est réalisé dans une enceinte a climat constant a 30°C avec éclairage led entre 6.00AM et 18.00PM, l'humidité est maintenue constante a 40-70%, les cages standard utilisées pour la stabulation a température ambiante avec l'enrichissement habituel (lanières de papier) ont utilisées avec des biberons pour l'accès a l'eau de boisson. 6 animaux par cage au maximum. Le type d'enrichissement (lanières de papier a disposition dans les cages tapissées de sciure) est identique pour tous les groupes. Les point limites de l'expérience sont définis sur les critère habituels de bien être des animaux (posture, état du pelage) mais aussi sur l'évolution du poids corporel et de la prise de poids induite par le regime enrichi en graisse. Toute perte de poids de plus de 10% constatée sur 2 pesées hebdomadaires consécutives entrainera le retrait de l'expérience. Pour l’étape 2 : La pesée hebdomadaire et la mesure non invasive de la composition corporelle sont réalisées dans un environnement calme pour minimiser le stress lié a la manipulation. Pour l’évaluation metabolique par le test de tolerance au glucose, la mise a jeun temporaire (4h) est réalisée en laissant les animaux dans leur cage habituelle. Après chaque prélèvement d’une goutte de sang a la queue, les animaux vigiles sont immédiatement remis dans leur cage habituelle avec leurs congénères. Pour l’étape 3 nécessitant un prélèvement sanguin retro orbital et le prélèvement d’organe post mortem, une anesthésie gazeuse sans réveil est réalisée immédiatement suivie de dislocation cervicale.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. Les souris sont faciles à manipuler et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site nous permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Stade adulte (soit age de 6 semaines) pour induction d'une obésité nutritionnelle. Le suivi pondéral des animaux permet de détecter le phénotype obèse qui se traduit par une prise de poids superieure à celle des animaux en régime standard. Les modeles commerciaux sont elevés comme reproducteurs pour generer les groupes experimentaux, ils ne sont pas utilisés dans le protocole. Les animaux sont identifiés par un marquage aux oreilles. Le genotypage est effectué par PCR sur de l'ADN genomique extrait de fragments de queue prelevés par les personnels de l'animalerie avent le sevrage.