Oncologie

Ouvertes au niveau de l'abdomen sous anesthésie pour recevoir une implantation de cellules tumorales dans la paroi du caecum, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Après l'opération, elles reçoivent des traitements trois fois par semaine pendant trois semaines et passent deux séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie, avec un transfert entre deux établissements à chaque fois. Le projet vise à tester un inhibiteur d'HSP110 sur la formation de métastases hépatiques du cancer colorectal, étape que le porteur présente comme une condition de la validation préclinique avant un essai clinique renvoyé au "long terme". Il reconnaît que la chirurgie et les métastases peuvent provoquer souffrance, perte de poids ou infection, tout en écrivant que le foie est un organe "silencieux" qui ne fait pas mal lorsqu'il est colonisé.

Objectifs

Le cancer colorectal (CCR) est le troisième cancer le plus fréquent et la troisième cause de décès par cancer. Bien que la plupart des patients atteints de CCR survivent à une chirurgie de la tumeur primitive, la principale cause de décès est la dissémination des cellules cancéreuses dans l’organisme. Lorsque le CCR est détecté à un stade précoce et localisé, le taux de survie à cinq ans est d'environ 90 % ; cependant, après l'apparition de métastases, ce taux chute à moins de 12 %. Le principal organe cible est le foie. Environ 20 à 25 % des patients atteints de CCR présentent des métastases hépatiques au moment du diagnostic, et au moment du décès, jusqu'à 70 % des patients atteints de CCR présentaient des métastases hépatiques. L’objectif de notre recherche est de comprendre les mécanismes métastatiques dans le CCR. Nous nous intéressons en particulier au rôle d’une protéine de choc thermique, HSP110. HSP110 possède un rôle essentiel dans la prolifération des cellules cancéreuses de CCR et leur résistance aux agents chimiothérapeutiques, cependant son rôle dans le développement des métastases hépatiques n’est pas connu. Nous utiliserons un composé chimique inhibiteur spécifique de HSP110 ayant déjà montré son efficacité sur le ralentissement de la croissance tumorale de CCR lors de greffes sous-cutanées nonmétastatique. Nous envisageons de tester l’efficacité de ce composé sur l’inhibition de la formation des métastases de CCR, seul et en association avec la chimiothérapie standard et des traitements plus novateurs appelés immunothérapie. Cela constituera une étape préclinique supplémentaire pour ce candidat médicament. En résumé, nous souhaitons explorer dans ce projet le rôle de HSP110 dans la formation des métastases et étudier l’impact de son inhibiteur seul ou associé aux traitements chimiothérapeutiques standards et aux immunothérapies sur ces métastases. Le projet se déroulera entre 2 etablissemnts utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires mis en jeu par la protéine HSP110 dans la croissance tumorale sont maintenant bien connus in vitro. Cependant, il est nécessaire d’étudier le rôle de HSP110 dans un contexte in vivo pour évaluer son impact dans la formation de métastases hépatiques. Ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de l’inhibiteur spécifique de HSP110 in vivo dans la prévention des métastases et d’identifier la meilleure combinaison thérapeutique avec une immunothérapie innovante. A terme, ce projet est une condition de la validation pré-clinique de l’utilisation de cet inhibiteur d’HSP110 dans le cancer colorectal dans une perspective d’essai clinique à long terme

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 (5 minutes de trajet) pour réaliser les traitements (1 minutes par souris) 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semain

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans la paroi du caecum sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. L’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes, principalement en raison de la perturbation de la fonction hépatique. A noter que le foie est un organe « silencieux » qui ne fait pas mal lorsqu’il est colonisé par des métastases.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience.

Remplacement

Nous avons réalisé les expériences possibles in vitro (capacité de migration en présence ou absence de HSP110 et mécanisme d’action de HSP110) et nous devons valider ces fonctions maintenant dans un organisme entier. Nous continuerons à explorer les mécanismes moléculaires dans le modèle in vivo.

Réduction

Nous utiliserons le plus petit nombre d’animaux possibles. Pour chacune des combinaisons thérapeutiques réalisées lors de nos expérimentations in vivo, nous utiliserons des groupes de 5 souris ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à nos tests statistiques. Les expériences seront réalisées 3x pour contrer la variabilité inter-individus et la possible non prise métastatique. De plus, nous étudierons plusieurs éléments sur un même groupe de souris dès que cela est possible (réduction) et nous réaliserons seulement les expériences les plus indispensables sur les modèles murins.

Raffinement

imitation du stress. Pour limiter le stress, les souris sont placées par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en plastique leur permettant de se regrouper (nid). Elles seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée. Les séances d’imagerie seront réalisées sous anesthésie. Les animaux seront transférés rapidement pour éviter un stress de l’EU1 à l’EU2 dans un sac de transport (temps de trajet de 5 minutes). Procédures d’étude non invasives (imagerie) : Le gène de la luciférase exprimée par les cellules tumorales injectées permettra d’évaluer par émission de lumière la présence de métastases sur animaux vivants. Procédure d’injection des cellules tumorales : Les souris seront anesthésiées. Elles recevront du gel ophtalmique (évite le dessèchement des yeux) et injection de burpénorphine et application lidocaine. L’imagerie et la chirurgie abdominale sont réalisées sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse (réduction inconfort pour raffinement de l’étude). Au cours d’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Des tapis chauffants seront utilisés pendant l’expérimentation afin de prévenir l’hypothermie. Un suivi (réveil et post anesthésique) sera mis en place après injection des cellules tumorales pour vérifier le retour à une activité normale (confort, vivacité). Les injections de molécules d’intérêt thérapeutique se feront sur animaux vigiles. Surveillance de l’état général des animaux : Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire et une prise en charge antalgique adaptée en pré- et post-opératoire 2X/jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire et la prise de boisson sera installé (nourriture gélifiée). Nous avons une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine. Au cours des différentes étapes de la procédure et pour chaque animal, la masse pondérale des animaux ne devra pas dépasser ± 20 pour cent de leur poids initial. En cas de dépassement de cette limite de poids, ils seront sacrifiés

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée ou orthotopique de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris femelles de 8-14 semaines car elles sont considérées comme adulte. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel. Les souris seront hébergées en groupe afin de diminuer le stress induit par l’isolement.

90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever la tumeur, les ganglions et la rate. Chacune reçoit une injection de cellules de cancer colorectal dans le flanc droit, puis un transfert de lymphocytes T sept jours plus tard, la tumeur devenant palpable au cinquième jour et l'expérience s'arrêtant entre le dixième et le treizième jour. Le porteur indique que les travaux in vitro sur le rôle de la protéine HELIOS ont déjà été menés et que l'activation des lymphocytes ne peut pas être reproduite hors de l'organisme. Il classe le projet en recherche fondamentale et renvoie au conditionnel les applications en immunothérapie, qui pourraient à terme rendre les traitements existants plus efficaces.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier chez la souris le rôle d’une protéine appelée HELIOS dans le fonctionnement des cellules immunitaires appelées lymphocytes T CD8. Ces cellules sont essentielles pour éliminer les cellules cancéreuses. Nous voulons savoir si la déficience d’HELIOS dans les cellules CD8 rend ces cellules plus actives ou, au contraire, moins efficaces. Pour cela, des lymphocytes T CD8 normaux ou dépourvus de HELIOS seront transférés dans des souris atteintes d’une tumeur appelée MC38, un modèle bien établi du cancer colorectal. Nous observerons ensuite comment les cellules immunitaires (les lymphocytes T CD8) s’activent, se multiplient et se déplacent dans la tumeur afin de comprendre l’influence directe de HELIOS sur leur comportement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire dans le cancer afin d’améliorer la réponse aux traitements d’immunothérapie. Nous avons mis en évidence une combinaison de traitement dans notre équipe qui améliore grandement l’efficacité des immunothérapies. Cette amélioration semble être dépendante de la protéine HELIOS. Notre étude, aidera à déterminer si la protéine HELIOS limite ou favorise l’action des lymphocytes T CD8, qui jouent un rôle majeur dans la lutte antitumorale. Les connaissances acquises pourraient servir de base au développement de nouvelles approches d’immunothérapie, c’est-à-dire des traitements visant à renforcer les défenses immunitaires des patients atteints de cancer. Ces travaux relèvent de la recherche fondamentale, mais ils pourraient à terme contribuer à rendre les thérapies existantes plus efficaces ou à en concevoir de nouvelles, mieux ciblées et moins toxiques. Les résultats permettront d’identifier si HELIOS agit comme un modulateur intrinsèque limitant la prolifération et la persistance des CD8 dans le microenvironnement tumoral. Ces données sont essentielles pour concevoir des stratégies d’immunothérapie plus ciblées, capables d’améliorer la réponse antitumorale sans la suppression de la réponse immunitaire anti-tumorale. En outre, ce modèle expérimental apportera une base de connaissances utile à la recherche translationnelle sur la régulation des réponses immunitaires dans le cancer.

Procédures

Les souris seront soumises à deux types de manipulations principales : Implantation tumorale : Chaque souris recevra, sous anesthésie gazeuse, une injection de cellules tumorales dans le flanc droit. Cette injection de 3 secondes provoque la formation d’une petite tumeur localisée, généralement palpable à partir du 5ᵉ jour. Cette phase dure environ 10 à 13 jours avant l’euthanasie des animaux. Transfert adoptif de lymphocytes T CD8 : Sept jours après l’implantation tumorale, les souris recevront une injection de lymphocytes T CD8 (cellules du système immunitaire), soit normales, soit dépourvues du facteur d’intérêt. Cette injection est rapide (moins de 10 secondes) et réalisée sous anesthésie pour éviter toute douleur.

Impact sur les animaux

La procédure est classée en sévérité modérée. La classification modérée signifie que les animaux peuvent ressentir un inconfort temporaire, mais pas de douleur prolongée ni de souffrance sévère. L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite mais ne semble pas attendue étant donné que l’expérience sera stoppée 10 et 13 jours après injections des cellules tumorales. Les animaux atteignant les points limites seront immédiatement mises à mort selon la note de la grille de score. L’ensemble des procédures sera conduit sous anesthésie gazeuse, et les animaux bénéficieront d’un enrichissement environnemental pour réduire le stress.

Devenir

Les 90 souris seront toutes euthanasiées afin de prélever les organes

Remplacement

Avant de réaliser les expériences sur les animaux, des études en laboratoire (in vitro) ont déjà été menées pour évaluer le rôle de HELIOS dans les lymphocytes CD8. Cependant, les phénomènes d’activation et de migration de ces cellules dépendent de nombreux échanges entre différents types de cellules et ne peuvent pas être reproduits correctement hors de l’organisme. L’expérimentation animale reste donc nécessaire pour répondre à la question scientifique posée.

Réduction

Trois groupes expérimentaux avec des effectifs de n=15 (N=5 x 3 répétitions) à J10 et n=15 à J13 seront utilisés. L’expérience sera donc répétée 3 fois. Le nombre d’animaux a été limité à 90 souris au total (3 groupes de (5 *2 temps *3 répétitions)), soit le minimum permettant une analyse statistique valide. Chaque souris fournira plusieurs échantillons (tumeur, ganglions, rate), maximisant la quantité de données par individu. Les analyses multiparamétriques réduisent le besoin de répétitions supplémentaires. Chaque souris fournira plusieurs types de données (cytométrie, histologie, mesure tumorale), ce qui maximise la quantité d’informations recueillies sans augmenter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis quotidiennement par les personnels animaliers ils seront suivis au min 3 fois par semaine par les techniciens de l’étude et quotidiennement si une des variables mesurées dans la grille des points limites montrent une possible dégradation de l’animal (perde de poids, modification du comportement) Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

Un examen Doppler d'une heure trente sous anesthésie tous les cinq jours, une imagerie de bioluminescence deux fois par semaine, jusqu'à cinq cycles de traitement: sept actes techniques sont prévus par animal. 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau et analyser la tumeur. Un lentivirus leur est injecté par stéréotaxie dans le ventricule latéral pour induire un glioblastome dont le porteur attend une perte de masse musculaire, une gêne de la mobilité et une dégradation de l'état général. Seules des femelles sont utilisées, le porteur indiquant que ces tumeurs se développent de la même façon chez les mâles et que la signature de sénescence étudiée vaut quel que soit le sexe.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'effet de drogues dites sénolytiques (drogues qui éliminent les cellules sénescentes) seules ou en combinaison avec d'autres traitements, dans un nouveau modèle immunocompétent de tumeur cérébrale de type glial appelée glioblastome. Le modèle de glioblastome de type mésenchymateux proposé dans le projet récapitule au mieux les altérations moléculaires identifées chez les patients en utilisant une nouvelle technologie d'invalidation de l'expression de gènes. Une demande de modification est nécessaire afin de passer ce projet en multisites car un équipement spécifique se trouve dans un autre établissement utilisateur. La modification n’engendre pas d’augmentation du nombre d’animaux.

Bénéfices attendus

Le glioblastome est la tumeur cérébrale adulte primaire la plus fréquente et agressive dont les patients ne survivent pas plus de 15 mois en moyenne à ce jour. Ce projet devrait générer un modèle préclinique immunocompétent de glioblastome de type mesenchymateux qui récapitule au plus près les altérations moléculaires des glioblastomes de patients. En effet, afin de traduire de façon efficace nos résultats de recherches fondamentales à la clinique il est indispensable de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine. Nos résultats devraient permettre de proposer des nouvelles aprroches thérapeutiques pour la prise en charge des patients avec un glioblastome.

Procédures

La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 7 actes techniques incluant une injection intra-crâniale de lentivirus nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par utilisation d’imagerie par bioluminescence, une mesure du flux sanguin cérébral par examen Doppler, des traitements, des prélèvements sanguins puis finalement une euthanasie. La chirurgie prendra environ 30-40min sur animal anesthésié et analgésié en pré et post-opératoire (établissement 1). Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs sur animal vigil (établissement 1). La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines sur animal anesthésié. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min (établissements 1 ou 2). Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés sur souris vigiles pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. Les animaux recevront au maximum 5 cycles de traitement (établissement 1). L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines sur souris vigile (établissement 1). Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigil (durée de quelques secondes, 4 fois par animal) (établissement 1). L'examen Doppler d'une durée d'1h30, sera réalisé tous les 5 jours sur des animaux anesthésiés (établissement 2).

Impact sur les animaux

Ce projet comporte deux étapes où des effets indésirables sont attendus sur les animaux, la procédure chirurgicale et la charge tumorale. La procédure chirurgicale est invasive, il s'agit d'une injection stéréotaxique de lentivirus dans le ventricule latéral effectué sous anesthésie/analgésie mais qui entraîne des nuisances (risques anesthésiques, douleur post-opératoire, risque infectieux). Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées). Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et les animaux seront pesés quotidiennement pendant les 5 jours suivant la chirurgie et deux fois par semaine par la suite. De la douleur légère de courte durée pourrait être ressentie lors des prélèvements sanguins. Dans de très rares cas un hématome ou une perte de sang hémorragique pourrait être observée. L’imagerie Doppler mesure la perfusion sanguine cérébrale et tumorale de manière non invasive et nécessite une anesthésie qui peut engendrer une hypothermie et des difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris et d'analyser la tumeur cérébrale induite pendant la procédure, au niveau moléculaire et histologique.

Remplacement

En parallèle de ce projet in vivo, nous caractériserons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patient collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare car la survie des patients après diagnostic est inférieure à 15 mois. Cette étude fondamentale demeurera néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans un modèle animal. Dans un souci de remplacement et réduction, nous projetons de générer des organoides à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle d'organoides conservant le microenvironnement global (notamment, la microglie, les monocytes et les cellules T infiltrants, les cellules endothéliales et les péricytes). Un projet collaboratif visant à générer des organoides de glioblastomes incluant de la microglie et des monocytes infiltrants est en cours. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.

Réduction

Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, nous utiliserons dans ce projet 812 souris. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 18 animaux. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, ganglions, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescence sera localisée dans le cerveau disséqué à la loupe binoculaire et nous réaliserons plusieurs type d'analyses sur chaque tumeur. Immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques. Pour les animaux du lot 2, de l'imagerie permettra de quantifier les flux sanguins cérébral et intratumoral au cours de la croissance tumorale permettant d’accumuler un grand nombre de résultats pertinents par animal.

Raffinement

Pour réduire le stress post-opératoire, les animaux seront logées par groupes de 5 souris par cage pendant une période d'acclimatation de 7 jours minimum avant la procédure chirurgicale. Tous les animaux auront un enrichissement ICM : carré de coton et bâton à ronger. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Le transfert d'un site à l’autre sera réalisé dans une boite de transfert avec litière et enrichissement prélevés dans la cage de stabulation. La cage sera placée dans un sac à l’abris de la lumière du jour et le transfert (d’une durée de 5 minutes) se fera à pied. Pendant la chirurgie et l'examen Doppler, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l'hypothermie, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter leur déshydratation. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. Nous avons établi dans l’équipe une grille de suivi post-opératoire pour les animaux pouvant développer des tumeurs cérébrales. Cette grille sera consultée et une fiche de suivi de l’animal sera remplie à chaque examen, présente au dos de l'étiquette de cage. Nous analyserons la croissance tumorale par imagerie et le poids des animaux deux fois par semaine. En fin de processus d’expérimentation, si une souris est isolée nous regrouperons cet animal avec des animaux sujets au même traitement et lorsque cela ne sera pas possible nous apporterons de l’enrichissement supplémentaire dans la cage sous forme de maisonnette. Lors des prélèvements sanguins, si le saignement ne stoppe pas rapidement, une compression plus longue avec un papier essuie tout propre sera directement effectuée sur le point de prélèvement. En cas d'apparition de prostration et de difficulté à récupérer (anomalie cardiorespiratoire), l'animal sera pris en main pour effectuer des frictions afin de le stimuler. De la nourriture hydratée sera déposé à côté de lui dans la cage. Si cet état perdure plus de quelques minutes, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour induire de novo des glioblastomes. En effet ce type de tumeur est diagnostiqué chez des sujets adultes d'âge médian de 59 ans, cette tumeur se développe donc à l'âge adulte. Notre projet, qui vise à évaluer l'effet de drogues sénolytiques dans un nouveau modèle immunocompétent de glioblastome, utilisera uniquement des souris femelles. En effet, les modèles de glioblastomes murins se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles. De façon plus importante dans une étude récente, nous avons montré que l’enrichissement de la signature murine de sénescence chez les patients avec un glioblastome est un facteur de mauvais pronostique quel que soit le sexe. Ces résultats montrent donc que l’étude de la sénescence dans le contexte des glioblastomes peut être réalisée sur un seul sexe. Nous avons choisi pour ce projet de travailler sur des femelles.

Déjà capturés et manipulés jusqu'à huit fois au cours de leur vie pour certains, les cincles plongeurs de cette population de rivière sont repris chaque année depuis une dizaine d'années. 2 300 oiseaux adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous relâchés sur leur site de capture. Pris au filet, ils attendent jusqu'à deux heures dans un pochon, puis sont bagués, mesurés, soumis à une mesure du rythme cardiaque et d'un comportement de lutte, avant une prise de sang, un prélèvement de plumes et un prélèvement de sécrétions de la glande uropygienne. Le porteur reconnaît que le cumul de ces gestes peut peser sur l'oiseau et que le stress s'accumule sur toute une vie, tout en indiquant qu'aucun effet négatif majeur n'a été mis en évidence jusqu'ici.

Objectifs

En populations naturelles, les individus sont soumis à des variations des conditions environnementales qui peuvent être d'origine naturelle ou anthropique. Parmi ces dernières, la présence de polluants de natures diverses, liée aux activités industrielles, agricoles et/ou à l'urbanisation, peut fortement impacter le fonctionnement des organismes et des populations. Les actions de restauration des milieux au travers de mesures de dépollution restent pourtant souvent d'une efficacité limitée en raison du manque d'informations sur les concentrations de multiples polluants à une échelle spatiale fine ainsi que de leur impact biologique réel sur l'écosystème concerné. Le projet a pour objectif de fournir une cartographie détaillée des concentrations de différents types de polluants (métaux lourds, polluants organiques persistants, microplastiques) et de caractériser leur impact de façon conjointe (« effets cocktail » potentiels) sur une population d'un petit passereau considéré comme un bioindicateur du milieu des rivières courantes de basse et moyenne montagne, le cincle plongeur. Les rivières sont des milieux particulièrement sensibles à la pollution du fait de la concentration des polluants dans l'environnement alentour via le ruissellement. Sur la zone d'étude, des échantillons biologiques (plumes, sang, sécrétions) sont prélevés sur les oiseaux de façon faiblement invasive et compatible avec le suivi à long terme de la population. Ils permettent de mesurer (1) d'une part les concentrations de différents types de polluants très présents dans cette zone fortement exploitée par l'homme et anthropisée depuis des siècles, et (2) d'autre part des paramètres physiologiques, mais aussi comportementaux et d'histoire de vie (reproduction, survie) des individus. L'étude des liens entre ces concentrations mesurées de polluants auxquels les individus sont effectivement exposés (et donc présents dans leur organisme) et du fonctionnement physiologique (marqueurs des processus immunitaires, hormonaux, métaboliques...) permettra de mieux comprendre l'impact biologique réel des polluants au niveau individuel, et les implications au niveau de la population. Cette cartographie et ces résultats seront donc mis à disposition des acteurs locaux de la société civile, permettant de cibler les zones les plus impactées afin d’optimiser les actions de gestion et de restauration de la biodiversité des écosystèmes rivulaires dans la zone d'étude.

Bénéfices attendus

Nos analyses permettront de comprendre de façon fondamentale l'action des polluants sur les organismes en conditions naturelles et qui sont donc soumis à différentes sources de stress en même temps ; elles permettront également de façon plus appliquée. d’établir une cartographie détaillée à l'échelle locale des niveaux d'exposition aux polluants et de leurs effets sur le fonctionnement des organismes, qui sera mise à disposition des acteurs locaux associatifs et institutionnels comme outil de sensibilisation du public et pour cibler les zones les plus impactées afin d’optimiser les actions de gestion, restauration et préservation de la qualité de l'eau des rivières et de leur biodiversité sur ce territoire. Le manque d'informations sur les variations dans l’espace et le temps des concentrations de différents polluants à une échelle spatiale fine et surtout sur leurs effets biologiques conjoints sur les individus et les populations limite en effet souvent fortement la possibilité de mettre en oeuvre des actions efficaces de ce type face à diverses sources de pollution. Dans un contexte de "santé globale", l'enjeu est à la fois environnemental mais aussi sanitaire, car les activités humaines liées à l'eau sont nombreuses dans la zone d'étude (pêche, sports d'eau , baignade...). Pour atteindre ce but, le suivi exhaustif de la population étudiée permet d'accéder à l'ensemble des paramètres biologiques d'intérêt, chez une espèce qui intègre les mesures de polluants et de leurs effets le long de la chaîne trophique. Le transfert des résultats et connaissances concernant la pollution par différentes substances, sa dynamique au cours du temps et ses conséquences sur l'écosystème des rivières vers différents partenaires de la société civile est aussi un objectif du présent projet.

Procédures

Les oiseaux sont capturés grâce à des filets spéciaux et soumis à une série de manipulations, mesures et de prélèvements une fois par an (lors de leur première capture uniquement, dans le cas où ils seraient recapturés plus tard la même année). Une fois sortis du filet, ils sont placés en attente dans des pochons dédiés, au calme, le temps de la capture de l'ensemble des individus présents sur la zone (maximum 2h). Au moment des manipulations, réalisées sur site, ils sont d'abord identifiés individuellement par baguage, puis mesurés : masse, longueur du tarse, du crâne et du bec, de l'aile, de la queue. Une série de mesures comportementales et physiologiques est ensuite réalisée : mesure du rythme respiratoire et du rythme cardiaque, comportement de lutte. Différents prélèvements sont alors réalisés : (1) prise de sang ; (2) prélèvement de plumes (plumes de couverture du corps à différents endroits et une plume de la queue) ; (3) sécrétions de la glande uropygienne. Enfin, diverses informations sont notées : le sexe et l'âge des oiseaux, l'état des plumes et la présence de mue, la présence d'une plaque incubatrice (pour les femelles reproductrices), la présence de blessures éventuelles, liées à la capture ou antérieures. L'ensemble de ces opérations de mesures et prélèvements dure environ 20 à 30 minutes. Une fois l'ensemble des manipulations effectuées, l'oiseau est relâché directement sur le site de capture (entre 30 min et 2h30 après la capture selon le temps d'attente au départ).

Impact sur les animaux

Le coeur du projet est de pouvoir explorer les liens entre concentrations de différents polluants et leurs effets biologiques sur les individus à différents niveaux, y compris physiologique. Ceci implique de disposer des mesures des polluants et des mesures physiologiques simultanément, sur les mêmes individus, et donc de récolter l'ensemble des échantillons nécessaires sur chaque oiseau. Au cours d'une capture, chaque oiseau sera donc soumis à l'ensemble des gestes d'échantillonnages : (1) prise de sang, (2) prélèvement de plumes, (3) prélèvement de sécrétions de la glande uropygiale, en plus (4) des opérations d'identification (baguage) et des mesures morphologiques. Les effets individuels de chacun de ces prélèvements ou manipulations restent limités, mais le cumul de ces effets pourrait avoir une résultante impactant l'oiseau, parce qu'ils impliquent un temps de manipulation plus long, et/ou parce qu'ils occasionnent des stress et douleurs prolongés / multiples. Le principal effet indésirable attendu est donc un niveau de stress potentielement élevé de l'oiseau durant la capure et les manipulations. Par ailleurs, afin d'étudier la dynamique éventuelle des effets des polluants au cours de la vie des individus (et en particulier les processus de vieillissement), les oiseaux seront échantillonnés et mesurés chaque année. Ainsi un oiseau sera manipulé à chaque première capture de l'année au cours de sa vie, avec un effet potentiellement cumulatif du stress engendré sur l'ensemble de la vie. Une fraction importante des oiseaux subira donc les prélèvements et manipulations plusieurs fois (entre 2 et 8 fois jusqu'ici, la durée de vie moyenne de cette espèce étant d'environ 2 à 3 ans).

Devenir

L'objectif du projet étant de comprendre les effets à long terme des polluants sur des oiseaux en conditions naturelles, les mesures et échantillonnages réalisés visent à impacter le moins possible le devenir des oiseaux (survie, comportement, reproduction futurs) et donc à être compatibles avec le suivi à long terme de la population. Une fois les manipulations effectuées sur les oiseaux, ils sont donc tous relâchés dans leur milieu naturel, au site de capture.

Remplacement

L'objectif étant de comprendre les effets des polluants sur des animaux en conditions naturelles à long terme, l'utilisation d'expériences in vitro ou in silico n'est pas envisageable et seuls les prélèvements et mesures sur oiseaux vivants en population naturelle est possible.

Réduction

Le nombre d'oiseaux impliqués dans le projet correspond à la taille de la population reproductrice suivie (environ 460 adultes maximum par an), soit 2300 oiseaux adultes manipulés au maximum durant tout le projet) ; ceci permettra d'utiliser les modèles statistiques complexes appropriés pour quantifier l'effet des polluants sur les différents paramètres biologiques tout en tenant compte de nombreux facteurs individuels (sexe, âge, histoire des oiseaux) et environnementaux (date, rivière, altitude...) susceptibles d'affecter l'action des polluants. L'exhaustivité de l'échantillonnage de la population est nécessaire pour étudier les liens avec les différents paramètres et en particulier les paramètres démographiques tels que la survie et le succès reproducteur à l'échelle de la vie, qui ne peuvent être estimés fiablement qu'avec un effort de suivi suffisamment important, mais aussi pour estimer le déterminisme génétique des traits (héritabilité) au travers du pedigree établi via les captures et le suivi de la reproduction.

Raffinement

Le suivi de la population est réalisé depuis une dizaine d'années, et les procédures utilisées lors de la capture et manipulation des oiseaux ont été ajustées au cours de cette période afin de réduire au maximum leur impact sur le devenir des oiseaux et le fonctionnement de la population. L'expérience acquise par les manipulateurs leur permet de réduire au strict minimum le temps nécessaire au démaillage et à la manipulation des oiseaux. Afin de réduire le stress des oiseaux, ceux-ci sont placés dans des pochons spécialement conçus et opaques pendant les temps d'attente, et leur tête est gardée dans le pochon tant que les manipulations le permettent ; cette procédure est reconnue comme limitant le stress des oiseaux. Les manipulations se font en évitant les gestes et buits brusques ou mouvements non nécessaires, qui occasionnent du stress chez les oiseaux. Durant toute la manipulation de l'oiseau, le manipulateur reste vigilant et observe l'oiseau sans interruption afin de détecter les signes de stress intense et peut décider de relâcher l'oiseau immédiatement avant la fin des prélèvements ou mesures si ces signes deviennent trop forts. Ces précautions permettent de réduire quasiment à zéro le risque de mortalité pendant la capture. Les effets à plus long terme du stress de la capture, plus difficiles à évaluer directement, sont régulièrement estimés au travers des données de survie, mouvement et comportement des oiseaux collectées au cours du suivi général, et font l'objet d'une évaluation régulière. Jusqu'ici, aucun effet négatif majeur évident n'a pu être mis en évidence sur la base de ces données.

Choix des espèces

Le cincle plongeur a été choisi comme espèce d'étude en raison de : (1) sa situation élevée dans la chaîne trophique des rivières (c'est un prédateur d'invertébrés aquatiques), entraînant des niveaux de bioconcentration de polluants importants, et donc la possibilité de les quantifier et de détecter leurs effets biologiques mêmes faibles; (2) une variation importante des niveaux et type de pollution entre rivières étudiées, permettant de quantifier les effets de ces polluants ; et (3) la possibilité de suivre individuellement un grand nombre d'oiseaux et leur reproduction au cours de leur vie, grâce à une forte densité locale, assurant des tailles d'échantillons importantes et donc une puissance statistique satisfaisante, en particulier par rapport aux processus populationnels (survie, dispersion). Le cincle plongeur est une espèce protégée, dont le statut de conservation actuel est "préoccupation mineure" sur la liste rouge de l'UICN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature, qui fait référence pour l'établissement du statut de conservation des espèces), reflétant une absence de vulnérabilité spécifique (effectifs stables en France). Il est considéré comme un bioindicateur des écosystèmes rivulaires. Les prélèvements seront réalisés sur les oiseaux adultes, qui sont installés sur leurs territoires au moment de la capture et ont donc pu bioconcentrer les polluants présents dans l'environnement pendant une durée suffisante pour permettre leur détection et l'exploration de leurs effets biologiques.

Homozygotes pour une mutation qui provoque des dépôts de calcium dans les artères, ces souris meurent d'une rupture de l'aorte entre 42 et 56 jours de vie. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans autre intervention que le développement de ce phénotype. Les prélèvements d'organes sont échelonnés à 7, 14, 21, 28, 35 et 42 jours, l'âge de 42 jours servant de plafond au-delà duquel aucun animal n'est maintenu en vie. Le porteur indique qu'aucune de ces souris ne peut être réutilisée ni adoptée parce qu'elles sont génétiquement modifiées, et présente leur mise à mort avant l'apparition des signes cliniques comme une gestion "éthique et réglementaire" du phénotype.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’assurer la gestion éthique et réglementaire d’un phénotype dommageable associé à une mutation génétique entraînant des dépôts anormaux de calcium dans plusieurs organes chez la souris. Les animaux présentant ce phénotype (souris homozygotes pour la mutation) développent un problème grave caractérisé par des accumulations importantes de calcium dans leurs artères, pouvant entraîner une mort précoce entre 42 et 56 jours de vie ; pour éviter toute souffrance, elles seront euthanasiées avant ou au début de l’apparition des signes cliniques. Les souris hétérozygotes et sauvages serviront respectivement à la reproduction pour maintenir la lignée et comme témoins pour les expériences. Ce projet permettra d’identifier les mécanismes biologiques responsables des dépôts anormaux de calcium liés à la déficience de la protéine d’intérêt. Les connaissances acquises pourront être transposées à l’homme, en particulier pour mieux comprendre les calcifications liées au vieillissement ainsi que celles observées dans des maladies rares comme le syndrome de Keutel, associé à une déficience de cette protéine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des dépôts anormaux de calcium dans les tissus liées à la déficience d’une protéine empechant ce phénomène et que l’on peut retrouver dans des maladies rares comme le syndrome de Keutel, mais également dans des pathologies chroniques fréquentes telles que l’athérosclérose, le diabète ou l’insuffisance rénale.

Procédures

L’intervention prise en compte dans ce projet correspond au développement spontané d’un phénotype dommageable d’origine génétique, caractérisé par l’apparition progressive de dépôts anormaux de calcium dans plusieurs organes. Ce phénotype qui peut entrainer la mort par rupture de l'aorte entre 1.5 et 2 mois de vie constitue la nuisance à laquelle les animaux peuvent être exposés . Aucune autre intervention n’est réalisée sur les animaux vivants. Les prélèvements d’organes sont effectués exclusivement après euthanasie (hors DAP)

Impact sur les animaux

Le problème qui apparait chez ces souris entraîne une mortalité par rupture de l'aorte entre 1.5 et 2 mois de vie. Ce décès est précédé par des signes cliniques tels qu’un aspect chétif et une posture prostrée, indiquant un risque accru de mortalité dès le stade le plus précoce d’apparition du problème qui se situe autour du jour 42 (J42) après la naissance. La majorité des expériences prévues seront réalisées entre J7 et J30, avant l’apparition de ce problème. Pour les rares souris devant être sacrifiées à J42, c'est-à-dire au moment où problème peut apparaitre, seules celles ne présentant jusqu'à ce stade aucun signe de fragilité ou d’attitude prostrée seront conservées pour prélévements d'organes. En cas d’apparition de tels symptômes ou de tout autre critère de points limites, les animaux seront immédiatement pris en charge par les zootechniciens et/ou les chercheurs qui assureront un suivi quotidien.

Devenir

Tous les animaux devront être euthanasiés à la fin de la procédure pour prélévements d'organes aux différents stades J7, J14, J21, J28, J35 et J42. Comme il s'agit d'animaux génétiquement modifiés, il n’est pas possible de les réutiliser dans d’autres projets ni de les placer en adoption.

Remplacement

Les dépôts anormaux de calcium apparaissent dans de nombreux organes et tissus et peuvent être influencées par de nombreux paramètres spécifiques à ces organes. Les cultures cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions à l’origine de la mise en place de ces phénomènes. A ce jour, il n’existe pas d’alternative de remplacement et seule l’utilisation d’un modèle animal est possible pour l’étude de ces calcifications

Réduction

La reproduction des souris est réalisée de façon à obtenir uniquement le nombre d’animaux nécessaire pour nos recherches. Nous prenons en compte les particularités de la lignée, dont les portées comptent généralement entre 4 et 8 petits. En moyenne, 25 % de ces souris seront des témoins, 25 % des souris présentant la mutation étudiée (toutes deux utilisées pour les expériences), et les 50 % restants (souris porteuses d’une seule copie de la mutation) permettront d’entretenir la lignée et de produire de nouveaux animaux pour les futures études. De plus, nous prévoyons de prélever plusieurs organes sur chaque souris afin de maximiser les données recueillies et ainsi limiter le nombre total d’animaux nécessaires. Enfin, comme les effets de la mutation ne dépendent pas du sexe, nous incluons à la fois des souris mâles et femelles dans nos analyses.

Raffinement

Les souris seront surveillées chaque jour par les soigneurs et/ou les chercheurs pour s’assurer qu’elles ne présentent aucun signe de souffrance. Si un animal montre des signes d’inconfort ou de mal-être, des mesures seront prises rapidement pour le soulager. À la naissance des petits, leur nid sera rendu plus confortable avec l’ajout de coton, en complément des éléments déjà présents dans les cages, comme des tunnels, pour favoriser leur bien-être. Le raffinement spécifique des souris mutées repose sur une anticipation stricte de l’évolution du phénotype dommageable. Aucun animal n’est maintenu au-delà de l’âge auquel des complications graves peuvent survenir (J42=âge plafond). La surveillance est renforcée avec des critères cliniques précoces déclenchant une euthanasie immédiate, garantissant l’absence de souffrance prolongée.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé dans ce projet est une référence reconnue par la communauté scientifique internationale spécialisée dans l’étude des calcifications anormales dans des tissus qui normalement ne sont soumis à ces phénomènes. Actuellement, c’est le seul modèle animal génétiquement modifié qui présente des caractéristiques similaires à celles observées chez les personnes atteintes du syndrome de Keutel. Chez ces souris, les calcifications apparaissent très tôt et évoluent différemment selon les organes. Par exemple, elles commencent dès la première semaine de vie dans les artères et dès la deuxième semaine dans le système respiratoire. Pour bien comprendre comment ces calcifications se développent, l’étude doit débuter avant leur apparition (vers 7 jours de vie) et se poursuivre jusqu’à ce qu’elles soient complètement installées (vers 42 jours). Afin de suivre précisément cette évolution, nous réaliserons des observations quotidiennes tout au long de cette période.

Un gavage par jour pendant trente jours, et deux prises de sang sur animal vigile pour une partie d'entre elles: 664 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées d'une tumeur sous anesthésie gazeuse, elles sont toutes mises à mort à l'issue pour analyser les tumeurs et les organes. Le porteur attend des pertes de poids, des diarrhées, une déshydratation et de la fatigue liées aux anticancéreux testés. Le traitement évalué est déjà en essai clinique chez l'humain pour un type de cancer du pancréas, et ce que le projet promet pour la thyroïde et la peau reste des données précliniques destinées à argumenter la faisabilité d'essais, à moyen terme.

Objectifs

Certains types de cancer de la thyroïde, du pancréas et de mélanome ont des similitudes dans leur développement et manquent actuellement de traitements efficaces. Un nouveau traitement a montré son efficacité seul dans ce type de cancer du pancréas. L'objectif est de démontrer l'efficacité de ce traitement en association (bithérapie) avec le traitement conventionnel dans ces types de cancers du pancréas, de la thyroïde et de mélanomes. L'approche expérimentale consiste à administrer ces traitements à des souris développant ces cancers.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent l'amélioration de la santé humaine et sont d'établir des données précliniques robustes d'efficacité pour argumenter la faisabilité d'essais chez l'humain. Les retombés sont attendus à moyen terme. Alors que ce nouveau traitement est en cours d’évaluation clinique en monothérapie dans un certain type de cancer du pancréas, ce projet permettrait d’élargir l’évaluation aux cancers de type similaire mais se développant à partir de la thyroïde et de la peau et d’explorer des schémas thérapeutiques en association.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une seule injection de cellules tumorales sous anesthésie générale gazeuse. Ce geste dure 3 minutes. Les souris pour lesquelles la greffe de cellules tumorales a prise seront soumises vigiles à un gavage pour administrer les traitements anticancéreux une fois par jour pendant 30 jours. Le gavage dure 10 secondes. Une partie des souris du projet (11%) sera soumise à 2 prélèvements sanguins de manière vigile à 1 semaine d'intervalle. La durée du prélèvement sanguin est de 30 secondes, comprenant 1 seconde de ponction, 10 secondes de recueil et 20 secondes d'hémostase par compression.

Impact sur les animaux

-La contention, manipulation et anesthésie gazeuse peuvent induire un stress. -L'injection des cellules tumorales et l'administration des traitements par gavage peuvent engendrer un stress et une douleur légère de courte durée. -Les traitements médicamenteux anticancéreux peuvent induire une perte de poids, une déshydratation, des diarrhées et une fatigue.-Les prélèvements de sang répétés toutes les semaines peuvent occasionner un léger stress et des douleurs légères de quelques secondes.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue du projet car il est nécessaire d'analyser les tumeurs dans leur totalité et les organes pour évaluer l'efficacité et la tolérance du traitement.

Remplacement

Les cultures cellulaires en 2 ou 3 dimensions, les organoïdes et la modélisation in silico (modélisation par calculs informatisés) sont mobilisés en amont pour réduire le nombre d’animaux, mais ils ne permettent pas d’évaluer de façon fiable les réponses antitumorales, la tolérance systémique ou l’optimisation des schémas d’exposition (dose, séquence, intermittence). Dans ce contexte, le modèle in vivo demeure la référence pour obtenir des données prédictives et cliniquement pertinentes sur l’efficacité et la sécurité des traitements testés.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les effectifs seront ajustés à la baisse au mieux pour les procédures principales grâce à des procédures pilotes utilisant un petit nombre de souris. Enfin, la chronologie en cascade des procédures permet de n'en faire certaines que sous condition des résultats trouvés aux premières.

Raffinement

Les souris seront anesthésiées et sur tapis chauffant pour l'injection des cellules ainsi que pour le réveil. Les points limites sont déterminés de manière stricte et selon les recommandations en vigueur. Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour l'étude du développement tumoral. Le modèle utilisé est immunodéprimé ce qui permet d'étudier des lignées cancéreuses humaines. Les souris seront réceptionnées à l'animalerie à 6 semaines pour pouvoir être greffées à 7 semaines. Cet âge est choisi car il reflète la physiologie “adulte jeune” avec un poids et métabolisme déjà stabilisés.

330 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tumeurs. Elles reçoivent une injection de cellules de neuroblastome humain dans le flanc, un traitement dilué dans l'eau de boisson, puis sont manipulées trois fois par semaine pendant 90 jours ou jusqu'à ce que la tumeur atteigne 1 500 mm3. Les cages sont privées de tunnels pour éviter que les tumeurs se blessent contre l'enrichissement, et du glucose est ajouté à l'eau parce que le traitement lui donne un goût désagréable. Les effets de la transformation des cellules cancéreuses en neurones ayant déjà été étudiés en culture, le porteur affirme que l'animal est "absolument nécessaire" et que la pousse tumorale ne peut s'étudier que dans un "organisme complet".

Objectifs

Le neuroblastome est un cancer pédiatrique responsable de 15% de la mortalité infantile liée aux cancers. Diagnostiqué le plus souvent pendant la première année de vie, c’est le premier cancer extra-crânien chez l’enfant. Pour les patients présentant un neuroblastome à haut risque, le taux de survie à 5 ans reste en-dessous de 50%. La compréhension de cette pathologie et le développement de nouvelles thérapies représentent ainsi un enjeu majeur en santé pédiatrique. Des thérapies permettant d’induire la transformation des cellules cancéreuses en neurones fonctionnels et l’arrêt de la multiplication des cellules de neuroblastome, sont employées mais ont une efficacité limitée. Le but du projet est de déterminer les effets d’une différenciation neuronale forcée, c’est-à-dire une transformation des cellules cancéreuses en neurones fonctionnels, dans trois lignées cellulaires humaines de neuroblastome. Ces lignées cellulaires seront implantées dans des souris nous permettant de travailler avec un modèle d’étude complexe et physiologiquement représentatif des différentes situations pathologiques rencontrées chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les effets de la transformation de cellules de neuroblastome (cancéreuses) en neurones fonctionnels ayant déjà été étudiés in vitro, cette nouvelle étude nous permettra d’identifier les effets de la transformation cellulaire dans un contexte/environnement physiologique complet. Il sera ici possible d’étudier les impacts de l’organisme sur le développement des tumeurs, notamment les effets de la vascularisation sur la pousse tumorale. Ce projet nous permettra également de mieux comprendre au niveau moléculaire les mécanismes permettant de transformer une cellule cancéreuse de neuroblastome en neurone fonctionnel qui arrête de se multiplier. Ainsi, ce projet permettra potentiellement de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques en cancérologie pédiatrique.

Procédures

Les animaux seront soumis chacun à une unique injection sous-cutanée de cellules tumorales dans le flanc. Cette intervention se fera sur animaux vigiles, et durera 10 secondes. Les animaux recevront un traitement dilué dans l'eau de boisson pendant toute la durée de l'expérimentation ou bien 4 jours par semaine pour l'une des procédures. Les animaux seront manipulés 3 fois par semaine pour être pesés et pour que la taille des tumeurs soit mesurée (30 secondes par acte) pendant 90 jours ou jusqu’à ce que les tumeurs atteignent 1500 mm3. Les tumeurs seront prélevées en fin d'expérimentation après mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront chacun une unique injection sous-cutanée de cellules tumorales dans le flanc. Cette procédure, bien que très rapide, peut induire du stress à l’animal ainsi qu’une douleur légère. Puisqu’il est attendu que des tumeurs se développent, ces dernières pourraient gêner les animaux dans leurs déplacements. Aussi, les cages ne seront pas enrichies en tunnels afin d’éviter toute blessure au niveau des tumeurs contre l’enrichissement. De plus, la doxycycline acidifie l’eau et apporte un gout désagréable à l’eau de boisson. Selon des tests préliminaires, du glucose est donc ajouté à l’eau de boisson afin d’éviter que les animaux ne cessent de s’hydrater. Pour s’assurer de la consommation d’eau, les biberons seront pesés pendant les phases de traitement. Pour finir, le neuroblastome est une pathologie connue pour son fort potentiel métastatique chez les patients, en particulier dans la moelle osseuse et le foie. Dans nos conditions d’expérimentation, nous ne savons pas si des greffes auront ce potentiel métastatique et nous serons donc particulièrement attentifs à l’état général des animaux (respiration normale, posture, comportement, yeux plissés).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs pour des analyses au laboratoire.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la capacité à former des tumeurs et d’étudier la prolifération dans un contexte de transdifférenciation. Ces travaux ayant déjà été menés en in vitro sur des cultures monocouches, il est maintenant nécessaire de travailler avec un modèle intégré représentatif du contexte pathologique observé chez les patients humains. L’animal est absolument nécessaire pour son côté physiologique intégratif et l’étude de pousse tumorale ne peut s’effectuer que dans un organisme complet, prenant en compte l’influence de la physiologie de l’animal et du microenvironnement.

Réduction

Les expérimentations de greffes de ces lignées cellulaires étant peu décrites dans la littérature, nous devons tester plusieurs souches murines immunodéficientes pour rechercher le modèle présentant la meilleure efficacité de prise en greffe. Nous grefferons les 3 lignées cellulaires dans 3 modèles murins et nous choisirons le modèle murin qui montre la meilleure efficacité de prise en greffe pour chaque lignée cellulaire. Le nombre d’animaux requis a été calculé grâce à un logiciel de tests statistiques, permettant de déterminer le nombre d’animaux suffisant afin d ‘obtenir des résultats statistiques significatifs.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, ceux-ci seront habitués à être manipulé (contention) pendant une semaine entre la semaine d’acclimatation à l’animalerie et le début de la procédure expérimentale. L‘implantation des cellules de lignées cancéreuses impliquant le développement tumoral, un suivi de poids des souris ainsi que de volume des tumeurs sera réalisé trois fois par semaine. Des points limites qui auront pour effet l’arrêt de la procédure ont été déterminés. Pour faciliter et uniformiser le suivi des animaux, une grille de calcul des points limites sera utilisée.

Choix des espèces

Les modèles de greffes de cellules humaines cancéreuses sur souris sont déjà bien établis et caractérisés et dans le cadre de nos travaux, nous avons besoin de souris immunodéficientes afin de permettre la prise en greffes de cellules humaines dans la souris. L’immunodéficience des animaux permet d’éviter le rejet des greffes. Les lignées cellulaires humaines seront greffées dans trois souches de souris arborant des systèmes immunitaires plus ou moins affaiblis voir absent.