Oncologie

Trois heures d'imagerie sous anesthésie gazeuse, avec l'hypothermie que cela entraîne : 290 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent d'abord une greffe de cellules de glioblastome sous la peau, dont la croissance dégrade leur état général, puis une injection de radiotraceur par cathéter, geste qui peut laisser un hématome. Le travail vise à repérer par imagerie deux enzymes du métabolisme d'un acide aminé, marqueurs possibles de cancers et de maladies du système nerveux. Le porteur retient des souris immunodéficientes de six à dix semaines, jeunes précisément pour qu'une "légère immunocompétence" ne fasse pas rejeter la greffe.

Objectifs

Nous développons de nouveaux outils d’imagerie médicale appelés traceurs, qui permettront d’observer directement dans le corps deux enzymes importantes liées au métabolisme d'un acide aminé présent dans de nombreux tissus et cellules du corps humain. Quand ce métabolisme est perturbé, cela peut être lié à de nombreuses maladies, allant du cancer à des troubles du système nerveux (comme certaines maladies du cerveau). Ces perturbations entraînent souvent une augmentation de la quantité de ces enzymes. Pouvoir les détecter dans le corps pourrait donc aider à diagnostiquer certaines maladies, notamment les tumeurs, ou même à développer de nouveaux traitements. Il existe déjà des traceurs à base de tryptophane pour ce type d’imagerie, mais ils sont difficiles à fabriquer à cause de la complexité du processus de marquage radioactif. Une autre solution consiste à créer de nouveaux traceurs à partir de petites molécules capables de se fixer directement sur ces enzymes, plutôt que d’utiliser l'acide aminé lui-même.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traceurs d’imagerie capables de se lier spécifiquement à deux enzymes majeures du métabolisme de l'acide aminé. Après une caractérisation plus précise de leurs propriétés, ces traceurs pourraient être proposés pour le diagnostic, le suivi et le traitement de nombreuses affections cancéreuses ou neurologiques.

Procédures

Injection de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse 1 fois pendant 10 min par animal. injection sous anesthésie gazeuse suivi d'une imagerie de 3h, 1 fois par animal pendant 5 min.

Impact sur les animaux

La manipulation avant l’anesthésie entraine un léger stress chez l’animal. L’injection des cellules peut infliger une douleur correspondant à celle d’une piqûre d’aiguille. La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale. Une hypothermie durant l’imagerie induite par l’anesthésie gazeuse. Un hématome peut se former suite à la cathéterisation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des études d’immunohistochimie cérébrales complémentaires aux études d’imagerie.

Remplacement

L’objectif du projet étant de développer un traceur d’imagerie utilisable chez l’humain, aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal entier, étant donnée la complexité des processus mis en jeu telles que les interactions avec le microenvironnement tumoral et ne permet d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution et le développement de nouveaux radiotraceurs d'imagerie.

Réduction

L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. La première étude permet grâce à l’imagerie d’évaluer la cinétique du radiotraceur après une injection intra-veineuse. Les moyennes de captation du traceur dans la tumeur et les différents tissus seront comparés entre les 2 groupes d’animaux par des tests statistiques. Nous prévoyons d’inclure un total de 28 animaux par traceur (2 groupes de 14 animaux) et par lignée cellulaire, toutefois, ce nombre de 14 animaux par groupe représente une valeur maximale car les sessions d’imagerie seront réalisées séquentiellement, à raison de 2 à 3 animaux/groupe. Pour exemple, si un traceur ne se fixe pas du tout dans la tumeur car il ne passe pas la barrière tumorale alors les sessions d’imagerie ne seront pas répétées et le nombre d’animaux utilisé sera moindre. Ces sessions d’imagerie seront répétées si nécessaire, jusqu’à atteindre, le cas échéant, le plafond des 14 animaux/groupe.

Raffinement

Dès leur arrivée, les souris seront hébergées en portoir ventilé afin d’empêcher l'installation du phénotype dommageable lié à l’immunodéficience. Elles seront hébergées en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique) et observées quotidiennement. Lors de l’injection tumorale en sous cutanée, les souris seront anesthésiées en gazeux et placées sur un tapis chauffant et une protection oculaire sera appliquée. Après ces implantations, les animaux seront récompensés (morceau de fruit...) et auront une surveillance accrue jusqu'à l'imagerie. Nous prendrons soin de mesurer tous les jours pendant 5 jours, l’évolution de la tumeur grâce à un pied à coulisse. Avant l'imagerie, les animaux auront une phase d'habituation à l'environnement de la pièce pour éviter le stress lors de l'imagerie. Pour cette dernière (maximum 3h), les animaux seront anesthésiés en gazeux, une protection oculaire sera appliquée, les souris seront maintenues dans un lit thermorégulé (environ 37°C) et la température corporelle sera monitorée. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.

Un morceau d'oreille prélevé sur des nouveau-nés de sept à dix jours, un rein retiré par chirurgie à deux ou trois mois pour accélérer la maladie, puis quinze mois de suivi : 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent six recueils d'urine et quatre prises de sang en tube de contention, sur animal éveillé, avant un jeûne de six heures le dernier jour. Le porteur décrit une maladie rénale qui reste silencieuse jusqu'à un stade très avancé, autour de quinze mois, où les souris commencent à perdre du poids, à se toiletter moins, à se prostrer et à moins se déplacer. Toutes sont tuées pour qu'on prélève leurs reins, leur intestin, leur foie, leur hypophyse, leur hypothalamus et leurs gonades.

Objectifs

La glycogénose de type 1 est une maladie génétique rare caractérisée par une incapacité de l’organisme à produire du sucre en dehors des repas. La maladie se caractérise par des chutes des taux de sucre dans le sang (hypoglycémies) sévères, rapidement entre les repas. A l’âge adulte, la plupart des patients développent une maladie rénale, qui reste longtemps silencieuse mais détectable par mesure de marqueurs urinaires (présence d’albumine dans les urines ; albuminurie). En progressant lentement, elle évolue vers une insuffisance rénale caractérisée par une perte de la fonction du rein et l’accumulation de déchets dans le sang. A ce stade, les patients présentant aussi des kystes (formation d’un « sac » rempli de liquide) sur la surface des reins ou dans les reins. Des études récentes ont montré que dans cette maladie les cellules du rein ont la capacité de se multiplier de façon anormale ce qui favorise le développement de kystes et possiblement de cancers (2 cas décrits chez des patients atteints de glycogénose de type 1. A l’exception d’un contrôle nutritionnel, il n’existe actuellement aucun traitement curatif pour limiter l’avancée de la maladie rénale. La dialyse puis la transplantation rénale sont les seules solutions lorsque l’insuffisance rénale est atteinte. Le développement de cette maladie a été reproduit chez la souris en ciblant la mutation génétique de la glycogénose de type 1 uniquement dans les reins, ce qui permet d’éviter les épisodes d’hypoglycémie car le foie peut produire du sucre dans ce modèle animal. Comme chez l’homme, l’évolution de la maladie rénale est lente et silencieuse mais irréversible et mène à une insuffisance rénale au bout de 15 mois environ, avec l’apparition de kystes. Les premiers signes cliniques (albuminurie) apparaissent entre 6 et 9 mois, et la maladie peut être suivie par le dosage des mêmes marqueurs biologiques que chez les patients. Le but de ce projet est d’identifier les cellules et les mécanismes impliqués dans le développement des kystes, voire des cancers rénaux. Pour accélérer le développement de la maladie rénale, un rein sera enlevé au cours d’une chirurgie peu invasive. Dès les premiers signes d’insuffisance rénale, les reins seront prélevés pour des études moléculaires. Cette étude sera réalisée chez des animaux des deux sexes et devrait également permettre de comprendre les mécanismes à l’origine du retard d’apparition de la maladie chez les femelles par rapport aux mâles.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe pas de traitement curatif qui permette d’endiguer la mise en place de l’insuffisance rénale sévère sur le long-terme. Cette complication est pourtant importante chez les patients atteints de glycogénose de type 1 puisque plus de 70-80% développent une maladie chronique rénale. Du fait du faible nombre de patients, nous n’avons pas le recul nécessaire pour évaluer les risques associés à l’apparition de kystes chez les patients, ni l’incidence de cancers rénaux. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l’évolution de la maladie à long-terme, permettant ainsi une meilleure prise en charge des patients. Plus précisément, identifier d’éventuelles nouvelles cibles thérapeutiques est primordial pour développer des thérapies efficaces

Procédures

Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Les animaux subiront une intervention chirurgicale courte (durée d’environ 15 minutes) à l’âge de 2/3 mois permettant l’ablation d’un des deux reins, sous anesthésie générale (maximum 30 minutes d’anesthésie) et après injection d’analgésiques (2 injections le jour de la chirurgie et 1 injection/jour pendant les 2 jours post-chirurgie, nécessitant quelques secondes/injection). Au cours du temps, les souris vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les 3 mois à partir de 6 mois. L’animal peut subir un léger stress (qui entraine le déclenchement de la production d’urine), même si ce geste ne nécessite pas forcément la contention de l’animal. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 12 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine. La piqûre peut engendrer une faible douleur et un stress lié à l’immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, 6 prélèvements d’urine et 4 prélèvements de sang seront réalisés. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Même si la glycémie reste constante, les animaux peuvent subir un léger stress. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.

Impact sur les animaux

A l’âge de 7-10 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie au bord de l’oreille afin d’analyser leurs gènes. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. À l’âge de 2 ou 3 mois, les souris subiront l’ablation d’un rein sous anesthésie générale. Après l’opération, elles peuvent ressentir un peu de douleur et d’inflammation. Dès 6 mois, les souris peuvent développer une maladie rénale sans impact sur le bien-être animal jusqu’au stade très avancé de la maladie caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois). A ce stade, les animaux commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Pour suivre le développement de la maladie, des prélèvements urinaires spontanés seront effectués, ce qui peut provoquer un très léger stress. Les animaux subiront aussi des prises de sang après leur immobilisation dans un tube de contention. Ces gestes peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. Enfin, en fin de protocole, les animaux sont mis à jeun pendant 6h ce qui peut entrainer un léger stress. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. La piqure entraine une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin, du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et des testicules ou ovaires afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires

Remplacement

Aujourd’hui, il est possible de fabriquer en laboratoire de petits modèles de reins (appelés organoïdes) qui reproduisent les différents types de cellules présentes dans cet organe. Mais ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution de la maladie rénale ni le développement de tumeurs sur une longue période. Pour cela, il est indispensable d’avoir recours à des études chez l’animal, sur plusieurs mois. Le modèle de souris utilisé dans ce projet est le seul à reproduire fidèlement tous les problèmes rénaux observés dans la glycogénose de type 1. Ce modèle a été créé grâce à une méthode spécifique à la souris. De plus, le métabolisme de la souris est très proche de celui de l’être humain. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale été faite chez la souris. Il existe donc beaucoup de données scientifiques et d’outils disponibles pour poursuivre ces recherches dans ce modèle. Enfin, il est très difficile de mener ce type d’étude chez l’humain, car la glycogénose de type 1 est une maladie très rare (environ 1 naissance sur 100 000), ce qui rend les recherches sur des patients très limitées.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 24 souris, permettront de réaliser à la fois les études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, les souris « contrôles » qui ne présenteront pas la perte du gène ciblé dans les reins seront issues des mêmes reproductions. Les expériences que nous prévoyons exigent de petites quantités de tissu rénal pour différentes analyses en laboratoire. Comme les échantillons disponibles sont très limités, nous devons organiser les prélèvements de manière à pouvoir réaliser toutes les analyses prévues sans gaspillage. Le protocole durera 15 mois, donc nous devons aussi anticiper la possibilité que certaines souris ne puissent aller jusqu’au bout de l’étude, en prévoyant une marge de sécurité (une souris en plus par groupe). En tout, nous aurons 4 groupes expérimentaux, chacun composé de 6 souris, soit 24 souris par série d’expérience. L’étude sera réalisée sur des souris des 2 sexes car des résultats précédents suggèrent une progression plus lente de la maladie rénale chez les femelles ; nous doublerons ces groupes, ce qui portera le nombre total de souris à 96 : 48 souris malades et 48 souris saines servant de témoins. Enfin, nous veillerons à limiter la production d’animaux en n’utilisant que les souris nécessaires, et en utilisant les animaux surnuméraires uniquement pour maintenir nos lignées. Une fois le nombre requis atteint, les reproductions seront arrêtées. Nos lignées de souris sont d’ailleurs conservées à long terme par congélation, ce qui nous évite d’avoir à produire des animaux en continu. Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera au maximum 96 souris, incluant l’obtention de 48 souris transgéniques atteintes de la maladie rénale de la glycogénose de type 1 et de 48 souris contrôles, sans signes de maladie.

Raffinement

Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10 jours après la naissance, un âge où les nerfs ne sont pas encore complètement développés. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et au contact avant le début des procédures. Un petit tunnel sera aussi utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. La glycogénose de type 1 sera déclenchée uniquement dans les reins, ce qui permet aux souris de continuer de produire du sucre normalement grâce au foie, et ainsi d’éviter de baisses de sucre dans le sang. Lors du retrait d’un rein, les souris recevront un médicament contre la douleur avant et après l’opération. Une crème analgésiante sera aussi appliquée sur la peau, et la température corporelle sera maintenue pendant la chirurgie grâce à une plaque chauffante. Les interventions se feront dans des conditions stériles pour éviter les infections. Après l’opération, les souris seront isolées au chaud et surveillées pour s’assurer qu’elles se réveillent bien et sans souffrance. Elles retrouveront leur groupe au réveil. Pour les prises de sang, la veine sera dilatée par le chaud pour faciliter le prélèvement. Le volume de sang prélevé sera très limité selon les recommandations. Les souris seront habituées aux tubes dans lesquels elles seront placées pendant ces prélèvements, pour réduire leur stress. Les analyses d’urine se feront sans manipulation forcée : nous attendrons que les souris urinent spontanément, ce qui évite de les isoler dans des cages spéciales. Concernant la maladie elle-même : Les premiers signes ne provoquent pas de souffrance visible (c’est une maladie dite « silencieuse »). Les symptômes graves, comme une forte perte de poids ou une dégradation de l’état général, apparaissent tardivement, et indiquent la fin du protocole. La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet. Les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude, ou plus tôt si leur état de santé se détériore, afin de prélever les différents organes dont les reins.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans le corps. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, ce modèle de souris est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatale. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement puisque la perte de la fonction rénale qui est progressive. Voici comment se dérouleront les principales étapes du suivi : • Un prélèvement de tissu sera réalisé entre 7 et 10 jours après la naissance pour sélectionner les souris porteuses de la maladie. • À l’âge de 2 à 3 mois, une intervention chirurgicale peu invasive (le retrait d’un rein) sera réalisée. • Ensuite, nous effectuerons des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole.

Pour savoir si les lipides de la salive de moustique facilitent l'infection par les flavivirus, 397 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent en intradermique, sous anesthésie, des produits que le porteur décrit lui-même comme pouvant être irritants, puis une partie est tuée dans la foulée pour biopsie cutanée. Les autres sont infectées et suivies quinze jours, avec une prise de sang à la veine mandibulaire tous les trois jours, l'infection pouvant provoquer perte de poids, immobilité, troubles neurologiques et convulsions. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou montrent des signes de souffrance sont tuées par dislocation cervicale sous anesthésie.

Objectifs

L'objectif du projet est de déterminer le rôle des lipides de la salive de moustique dans les infections par les flavivirus pour développer une nouvelle méthode de lutte ciblant les lipides de la salive.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) Identifier une cible pour bloquer la transmission de tous les flavivirus au niveau de la peau, ii) Comprendre l’effet des lipides de la salive de moustique sur l'infection. A long terme, les résultats permettront le développement d’un médicament préventif ou curatif contre tous les flavivirus, lesquels infectent un demi-milliard de personnes et en tuent 250 000 par an.

Procédures

Dans toutes procédures, nous injecterons les souris avec des produits qui peuvent être irritants, mais cela se fait sous anesthésie. L'injection intradermique se fait en 2- 3 min. Nous collecterons, sur une partie des souris dans toutes les procédures, des biopsies de peau sur des animaux anesthésiés qui seront euthanasiés juste après. L‘autre partie des souris seront suivies pendant 15 jours pour la survie et les signes cliniques suite aux infections et nous réaliserons des prélèvements sanguins tous les 3 jours. Les biopsies et l'examen clinique prennenent environ 3- 5 min/ animal, le prélèvement sanguin prend 2- 3 min. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Impact sur les animaux

-Douleur passagère dans le site de l’injection lors de l’inoculation des virus avec les lipides. Nuisances suite aux prélèvements sanguins sur la veine mandibulaire qui se traduisent par une lésion et douleur passagères après la ponction. -Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, stress, comportement anormal, troubles neurologiques (dépression, excitation ou convulsions), liés à l’infection par les virus.

Devenir

Dans toutes les procédures, les souris seront euthanasiées sous anesthésie : après la réalisation des biopsies cutanées, si elles développent des signes de souffrance et à la fin des expériences.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet des lipides de la salive de moustique sur la transmission des flavivirus. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro. Nous identifierons les lipides impliqués dans l'augmentation de l'infection virale sur des modèles in vitro en utilisant des cellules humaines avant de confirmer l’effet avec le modèle animal.

Réduction

Pour réduire le nombre des souris à utiliser, nous faisons toutes les optimisations sur les modèles in vitro. Nous avons étudié l'effet des lipides sur les différents flavivirus in vitro, et sur les souris nous validerons l’effet observé pour seulement deux espèces de flavivirus pour limiter l'utilisation des souris. De plus, nous testerons différentes doses sur des souris males et puis nous validerons la dose ayant un effet sur des souris femelles. Dans nos expériences, nous utiliserons dans chaque condition le minimum des souris nécessaire pour avoir des données statistiquement analysables (10 souris/ condition dont 3 seront utilisées pour la collecte de la peau à 24h post infection pour étudier la transmission, et le reste des souris seront suivies pour la survie, les signes cliniques et la virémie).

Raffinement

-Les souris seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées avec le mélange kétamine/xylazine avant l’inoculation intradermique des produits et les biopsies cutanées. Nous utiliserons des coussins chauffants et une lampe chauffante pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à l'anesthésie : suivi des grandes fonctions et desséchement de la cornée. -Nous ajouterons un gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée. En dehors des expériences, le suivi des souris s’effectuera chaque jour. -Les souris infectées seront euthanasiées après la collecte des biopsies cutanées par dislocation cervicale sous anesthésie. -Les souris seront aussi euthanasiées si elles développent des signes de souffrance ou perdent >20% de poids corporel et à la fin des expériences, par dislocation cervicale sous anesthésie.-Les souris seront maintenues par 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance. Nous changerons la litière tous les 3 jours.

Choix des espèces

Nous allons utiliser dans ce projet des souris immunocompétentes, contrairement aux autres modèles d’infection pour les flavivirus, qui utilisent généralement des souris transgéniques avec une immunité innée déficiente. Notre projet vise à étudier l'effet des lipides salivaires sur la transmission des flavivirus et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. De plus, nous avons déjà validé et établie les conditions sur les souris. Par ailleurs, les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler. Les constantes physiologiques seront facilement mesurables avec des outils adaptés. Nous allons utiliser des sujets adultes de 5 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate nécessaire pour l'étude de la transmission, l'inoculation en intradermique, et leur manipulation.

Greffées d'une tumeur sous la peau sous anesthésie gazeuse, puis piquées jusqu'à quatorze fois par des micro-aiguilles chargées d'immunothérapie, 3 974 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs tissus. Le porteur signale une gêne au site d'implantation de la tumeur, avec difficulté à se déplacer dans la cage. L'objet est de produire les données précliniques d'un essai clinique sur le mélanome localisé de stade IIB et IIC, dont la prise en charge actuelle laisse un fort risque de rechute. Le RNT annonce des lignées "génétiquement modifiées et immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale", puis affirme que ces mêmes modèles permettront de valider les observations "dans un système immunocompétent".

Objectifs

En 2020, 1,5 million de cancers de la peau ont été diagnostiqués dans le monde, dont environ 325 000 mélanomes. En France, on dénombre 18 000 nouveaux cas par an, avec un pic d’incidence entre autour de 50 ans, avec 2 000 décès enregistrés en 2018. Les stades localisés IIB et IIC, caractérisés par un mélanome épais et/ou ulcéré sans métastase, affichent des taux de survie à 10 ans de 82% et 75%, mais présentent un risque de rechute élevé, comparable à celui des stades IIIB avec métastases ganglionnaires. Le traitement repose sur la chirurgie, complétée par des thérapies adjuvantes. L'immunothérapie néo-adjuvante (donnée avant la chirurgie) est maintenant couramment utilisée chez les patients ayant des métastases régionales (ganglions envahis) macroscopiques car elle a démontré une efficacité supérieure aux thérapies adjuvantes (mêmes traitements mais données en post-opératoire avec un nombre de récidive significativement diminué versus les traitements adjuvants). Un essai clinique évalue actuellement l'efficacité d'une immunothérapie systémique en néo-adjuvant pour les stades IIB/IIC. Une technologie innovante et prometteuse, non encore utilisée en clinique consisterait à utiliser des micro-aiguilles pour administrer localement des anticorps bloquant les points de contrôle immunitaires, stimulant une réponse immunitaire dirigée contre les antigènes tumoraux sein des ganglions de drainage du mélanome, tout en limitant les effets indésirables systémiques. Ce projet vise à produire des données précliniques pour un essai clinique sur l’utilisation des micro-aiguilles comme traitement local pour les mélanomes de stades IIB/IIC. La recherche fondamentale (in vitro) et préclinique (modèles animaux) évaluera l’efficacité de cette stratégie sur les réponses immunitaires et biologiques. Les résultats attendus incluent une réduction de la masse tumorale, une meilleure stimulation des lymphocytes infiltrant les tumeurs et au sein des ganglions de drainage, une rétention prolongée des anticorps au site tumoral et une diminution des effets indésirables systémiques par rapport aux traitements conventionnels, administrés par voie systémique. Les modèles souris recevront une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, permettant d’obtenir un modèle rapide et reproductible, avec une mesure de la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, les mélanomes de stades IIB/IIC sont pris en charge par la chirurgie (exérèse large) puis par un traitement adjuvant par immunothérapie et biopsie des ganglions sentinelles. Cette prise en charge entraine de nombreuses récidives à plus ou moins long terme ainsi que des effets indésirables parfois irréversibles. L’un des objectifs de ce projet serait d’ajouter une immunothérapie néo-adjuvante à la prise en charge de ce type de mélanomes localisés en identifiant dans un même temps les réponses immunitaire et biologique secondaires à l’administration par micro-aiguilles (en péri- ou intra-tumoral). Les objectifs secondaires sont multiples et impliquent la caractérisation du microenvironnement tumoral, le profil de toxicité (local et systémique) et la distribution tissulaire/ganglionnaire des administrations péri- et intra-tumorales par rapport à l’administration conventionnelle en IP chez le modèle animal. A plus long terme, ces travaux pourront servir de base à une nouvelle approche thérapeutique chez l’Homme, dans la prise en charge du mélanome localisé et améliorer ainsi leur espérance de vie.

Procédures

Greffes de tumeurs en sous-cutanée sous anesthésie générale gazeuse (durée de 15 minutes, n=1). Injections directes (2 minutes) ou via les micro-aiguilles (5 minutes) de molécules d’immunothérapie (n maximal=14). Prélèvement de sang sous anesthésie générale (n=1 ou 2 pour certains animaux, durée de 10 minutes).

Impact sur les animaux

La mise en place de modèles tumoraux peut induire une gêne modérée au niveau du site d’implantation de la tumeur (difficulté à se déplacer dans la cage, douleur à l’injection) ; les greffes sous-cutanées et les injections peuvent induire une douleur localisée légère de courte durée ; la contention lors des mesures des tumeurs peuvent induire du stress léger et transitoire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro modélisant de manière suffisamment robuste pour analyser les effets de ces traitements par différentes voies d’administration ainsi que sur le devenir de molécules au sein du modèle rongeur. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendant l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostic et thérapeutiques. L’utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. Ce projet nécessite également de travailler sur un modèle animal qui permet de maintenir les interactions immunitaires entre les différents organes.

Réduction

Les études préliminaires vont permettre d’identifier les toxicités ou résistances éventuelles, ce qui permettra de tester nos hypothèses dans les meilleures conditions en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les techniques d’imagerie utilisée dans ce projet vont permettre un suivi longitudinal sur le même individu, sans passer par l’autopsie de l’animal et permettant donc une réduction du nombre d’animaux utilisé. Pour les procédures expérimentales, le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence une différence significative sur les paramètres étudiés. Le nombre d’animaux à utiliser dans chaque procédure dépendra des résultats d’expériences précédentes sur les mêmes immunothérapies.

Raffinement

Les animaux seront surveillés tous les jours. Les injections de cellules tumorales se feront sous anesthésie générale tandis que les injections d’immunothérapie se feront à l’aide d’un anesthésique locaLes souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus précocement possible l’apparition de problèmes de santé. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées. Des points limites stricts et suffisamment précoces seront appliqués. Les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasie seront réalisées dans une troisième pièce. Les souris sont hébergées en groupes sociaux pour respecter leur caractère grégaire et réduire leur angoisse.

Choix des espèces

Bien que pertinentes, nos approches in-vitro, à savoir les cellules en cultures, sont le fruit d’un système « isolé ». Ils ne sont, de ce fait, pas extrapolables à la réalité de la clinique et nécessitent pour cela d’être confirmés in-vivo sur le modèle animal le plus adapté. En effet, il est nécessaire de vérifier cet effet dans un organisme entier incluant les interactions avec le microenvironnement tumoral et le devenir des molécules à l’intérieur d’un organisme vivant. La souris représente l’animal classiquement décrit dans la littérature, pour ce type d’expérimentation. Nous utiliserons des lignées génétiquement modifiées et immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale. L’utilisation de ces modèles nous permettra de valider nos observations dans un système immunocompétent, ce qui est essentiel pour envisager un développement chez l’Homme par la suite. Comme ce qui est classiquement décrit dans la littérature pour ce type d’expérimentations, les animaux utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines, âge auquel apparait cette maladie.

Greffées de cellules leucémiques puis traitées par des chimiothérapies choisies pour leur toxicité cardiaque, 392 souris reçoivent jusqu'à huit injections par semaine et une échographie sous anesthésie chaque semaine, pendant quatre semaines. Toutes sont déclarées en souffrance modérée et toutes sont tuées, un prélèvement sanguin terminal précédant le prélèvement de leurs organes. Le porteur écrit que les souris ne subiront de leur vivant que des "interventions d'intensité légère à modérée", puis signale, en majuscules, que la greffe de cellules leucémiques peut provoquer paralysie de l'arrière-train, fatigue sévère et amaigrissement. Le projet vise à décrire le métabolisme du cœur soumis à ces traitements, une étape de connaissance dont les patients ne verraient le bénéfice qu'à long terme.

Objectifs

Un grand nombre de traitements utilisés en oncologie sont cardiotoxiques et peuvent aboutir à l’émergence de maladies cardiovasculaires (MCV). Celles-ci peuvent contraindre le corps médical à diminuer voire arrêter le traitement de patients et sont à l’origine de nombreux décès à court et moyen termes. L’amélioration remarquable de la prise en charge thérapeutique de certains cancers a permis une augmentation significative des chances de survie de ces patients. Cela a conduit, pour certains cancers, à ce que les décès liés à la maladie soient dépassés par les décès causés par la cardiotoxicité des traitements. Pour ce projet, nous nous intéresserons à différentes chimiothérapies particulièrement cardiotoxiques utilisées dans de nombreux cancers (leucémies aigues myéloïdes (LAM), pancréas, sein et mélanome). Depuis quelques années, de nombreuses combinaisons thérapeutiques à base de chimiothérapies et d’inhibiteurs métaboliques ont passés le cap des essais cliniques, en particulier dans le cadre des LAM. Ces combinaisons prometteuses semblent permettre une sensibilisation des cellules cancéreuses aux traitements antitumoraux. En parallèle, la recherche sur l’insuffisance cardiaque et les MCV à aussi progressé dans la caractérisation des dépendances métaboliques liés à ces pathologies. Dernièrement, des approches d’inhibition de certaines enzymes du métabolisme ont permis d’obtenir une amélioration des capacités cardiaques dans plusieurs modèles de pathologies aigues ou chroniques. Ce projet a aussi pour objectif de dresser une carte métabolique de la réponse du tissu cardiaque aux traitements antitumoraux afin d’en détailler les dépendances précises. L’objectif final de ce projet est de déceler les dépendances métaboliques communes des cellules cancéreuses et cardiaques afin de sensibiliser les premières au traitement et de protéger les secondes. Pour cela, il est important de comprendre et d’identifier les mécanismes mis en jeux afin de rendre plus favorables la balance bénéfices/risques des traitements antitumoraux. NOUS PRÉCISONS QUE L'AJOUT DE LA SECONDE PROCÉDURE NÉCESSITE LA MISE À JOUR D'UN PROJET DÉJÀ AUTORISÉ AINSI QUE LA MODIFICATION DU NOMBRE TOTAL DE SOURIS QUI PASSE À 392.

Bénéfices attendus

Ce projet mêlant la cardiologie à la cancérologie aura plusieurs objectifs susceptibles de bénéficier à long terme aux patients atteints par ces maladies. Dans un premier temps, ce projet a un intérêt fondamental de par la description et la compréhension du métabolisme cardiaque dans le cadre de l’utilisation de ces thérapies cardiotoxiques. Ces traitements entrainent des mécanismes de toxicité pour les cellules cardiaques connues mais dont on ne sait quasiment rien en termes de perturbation du métabolisme. En décrivant les modulations et régulations du métabolisme des cellules cardiaques nous pourrons aussi mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’émergence de stress (induit ou non par une chimiothérapie) pouvant aboutir à une insuffisance cardiaque. Deuxièmement, nous étudierons les effets bénéfiques potentiels des combinaisons thérapeutiques associant chimiothérapies et inhibiteur métabolique. Ces nouvelles associations de molécules thérapeutiques sont actuellement très étudiées et pourraient fortement modifier les schémas thérapeutiques utilisés en oncologie. Si à travers ce projet nous pourrions montrer un potentiel bénéfice de cardioprotection, nous appuierions alors l’utilisation de ces combinaisons et accélèrerions possiblement leur utilisation en routine. En effet, la validation in vivo de nos hypothèses pourrait bénéficier à de nombreux domaines de la recherche médicale comme en cancérologie ou en cardiologie.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront manipulées de la même manière et uniquement pour des interventions d'intensité légère à modérée de leurs vivant. Un prélèvement de sang sera effectué en terminal (1 minute), directement suivi par la mise à mort des souris. Toutes les interventions que subiront les souris de leur vivant seront des interventions courtes de types injections (8 par semaine maximum, durée quelques secondes) sauf pour l'échographie sous anesthésie (1 par semaine, 10 min). Au total les souris seront manipulées de 1 a 5 fois par semaine pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

L’objectif même du projet est de travailler sur la toxicité des chimiothérapies et de leurs combinaisons sur le cœur dans des modèles murins porteur de tumeurs. Il y aura donc des évènements indésirables, que nous chercherons à réduire à travers l’utilisation des inhibiteurs métaboliques. Ces évènements indésirables, suivis grâce à un scoring rigoureux des souris, peuvent prendre la forme de douleur, de perte de poids, d’inactivité, de stress à la suite des traitement chimiothérapeutiques. LA GREFFE DE CELLULES LEUCÉMIQUES PEUT ENTRAINER DES ÉVÈNEMENTS INDÉSIRABLES SUR LES DERNIÈRES ÉTAPES DE LA MALADIE ; À SAVOIR PARALYSIE DE L'ARRIÈRE TRAIN, FATIGUE SÉVÈRE ET AMAIGRISSEMENT.

Devenir

La mise à mort des souris est nécessaire pour obtenir les résultats voulu pour ce projet. Un grand nombre d'organe seront prélevés à la suite de l'euthanasie pour étudier les mécanismes déclanchés par les traitements anticancéreux toxiques.

Remplacement

Une phase in vitro d’expérimentation a eu lieu avant d’envisager les expériences in vivo. Ces expériences, même si partielles, sont prometteuses et nous motivent à poursuivre nos hypothèses grâce à l’utilisation de modèle murin de cardiopathie induite par des chimiothérapies. Les modèles murins permettent d’avoir un niveau de preuve supérieur de par la complexité d’un organisme vivant en comparaison d’une culture cellulaire maintenue en vie en flasque plastique. Les données que nous mesurerons par échocardiographie sur les souris ne sont pas remplaçables et nécessaires pour démontrer une amélioration des fonctions contractiles du cœur après traitements. De plus, notre projet s'intéressant à l'interraction entre coeur et cancer, cela nous oblige à procéder à des expériences in vivo.

Réduction

Pour chaque combinaison, nous utiliserons un nombre limité de souris (392 au total). Ce nombre reste pourtant élevé de part le domaine de recherche auquel nous appartenons, la cardiologie. En effet, les mesures fonctionnelles faites en échocardiographie nécessitent un nombre assez élevé de souris pour obtenir des résultats robustes et significatifs (8 souris par groupe). En effet, les variations fonctionnelles des paramètres cardiaques mesurés en échocardiographie sont légères (+/-10% parfois) mais ont des conséquences fortes sur l’organisme et peuvent entrainer la mort. Ce nombre de souris necessaire au bon déroulement du projet à été calculé avec l'utilisation d'un logiciel de calcul de cohorte et en utilisant des paramètres rigoureux et des tests statistiques utilisés aussi en clinique. Notre projet vise à étudier l’ajout d’inhibiteurs métaboliques à des traitement chimiothérapeutiques cardiotoxiques. Ces combinaisons sont utilisées dans différents projets d’autres équipes avec qui nous sommes en collaboration. Nous chercherons à mettre en commun certaines expériences pour réduire le nombre de souris engagées dans ce projet. Nous utiliserons au maximum chaque souris et réduirons le nombre de manipulation au strict nécessaire. Chaque souris apportera des données d’échocardiographie, d’histologie mais aussi une analyse complète du sérum et une extraction des cardiomyocytes après traitements. Pour les souris xénogreffées avec des cellules cancéreuses, nous récupérerons aussi les organes touchés par la maladie. Ces analyses s’ajouterons aux expériences initialement prévues par nos équipes collaboratives, permettant d’extraire le plus de données possibles à partir d’un nombre limité de souris.

Raffinement

L’environnement des animaux assurera des conditions d’hygrométrie et de température constantes. Les souris sont hébergées dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Des lanières de papier cartonné sont ajoutées pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les cages possèdent des dômes transparents dans lesquelles les animaux peuvent se cacher et exprimer un comportement propre à leur espèce. Les cages sont teintées en rouge de manière à apaiser les animaux. La surveillance quotidienne permettra de s'assurer que les animaux ne présentent pas des douleurs ou détresses dépassant les points limites ou nécessitant le recours à un traitement antalgique. L'hydratation et l'alimentation seront disponibles ad libitum. Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris (392), d'une souche très étudiée en cardiologie et idéale pour l’étude du cancer de par l’existence de modèles in vivo utilisés couramment à l'internationnal. Nous utiliserons uniquement des souris adultes de 8 à 10 semaines. Ces souris présentent toutes les caractéristiques nécéssaires à l'étude des fonction cardiaque chez l'adulte et ne necessitent pas d'hébergement longue durée que l'on pourrait avoir pour l'étude de souris agées.