Oncologie

Une tonte, une injection de cellules tumorales tuées dans le flanc gauche sous anesthésie, puis huit jours plus tard une injection de cellules cancéreuses vivantes dans le flanc droit sur animal vigile, 70 souris subissent cette séquence, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs tumeurs. Les cellules viennent d'un adénocarcinome du pancréas de souris, modifié pour qu'on puisse en déclencher la mort à volonté. L'hypothèse testée est qu'une mort cellulaire inflammatoire vaccine l'organisme contre la tumeur qui suit. La croissance tumorale est mesurée au pied à coulisse pendant 28 jours, et le porteur annonce des points limites établis sans indiquer à quelle taille de tumeur ils se déclenchent.

Objectifs

Afin de tester l’effet vaccinal d'une mort inflammatoire des cellules issues d'adénocarcinomes du pancréas (PDAC) murines, sur l’induction d’une immunitée anti-tumorale, nous avons introduit dans une lignée de PDAC ( isolées de tumeurs d’animaux mutants portant les mutations sur l'oncogène K-ras et le gène suppresseur de tumeur TP53) une construction permettant d'actionner la mort des cellules sur commande. Sept jours après leur acclimatation, les souris sauvages seront injectées en sous-cutanée avec ces cellules qui auront été préalablement stimulées à mourir puis 8 jours plus tard les cellules PDAC vivantes seront injectées dans le flanc droit des souris. La croissance tumorale sera suivie sur 28 jours avec un pied à coulisse en mesurant la longueur et la largeur de la masse tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si la mort inflammatoire des cellules de PDAC active une réponse immunitaire contre la tumeur en fournissant à la fois les signaux inflammatoires et l’antigène tumoral. Si cette hypothèse est validée par ce test, elle ouvrira la voie d’une étude plus complète sur la séquence de recrutement et d’activation des cellules immunitaires dans ce contexte précis, mais également au développement d’approche thérapeutique basée sur l'outil que nous avons déveoloppé et qui permettra de tuer les cellules cancéreuses de patients de façon ciblée.

Procédures

Les animaux recevront une ou deux injections en sous-cutanée précédées d'une tonte à une semaine d’intervalle l'injection flanc gauche aura lieu sous anesthésiant l'injection flanc droit aura lieu sur animal vigile.Le geste dure moins d’une minute

Impact sur les animaux

Différentes nuisances peuvent être attendues : Stress liés à la contention des animaux et l’injection, et une douleur est éventuellement possible liée à l’injection des cellules mortes et à la pousse tumorale

Devenir

Les animaux entrés dans la procédure développeront des tumeurs. Ils ne pourront pas être ré-utilisés, ils seront mis à mort, et les tumeurs seront collectés pour une analyse anatomopathologique.

Remplacement

Nous avons généré des données solides in vitro en démontrant l’activation des cellules immunitaires humaines qui nécessitent une validation in vivo. A ce jour, pas de méthode alternative possible que le modèle animal car nous avons besoin de tous les acteurs de la réponse immunitaire pour évaluer la réponse anti-tumorale. Néanmoins nous travaillons en parallèle à mettre au point des modèles cellulaires 3D humains dans le but de remplacement futur.

Réduction

L'effet minimal souhaité de l’approche vaccinale serait une réduction de 50% de la pousse tumorale. Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l’expérience a été calculé sur la base d’un test statisitqie non paramétrique, non pairé avec un risque de 5% ainsi qu'une puissance de 80%. La simulation projette 20 animaux par groupe. Pour la procédure n°1 qui prépare la procédure N°2, le nombre d’animaux est réduit de moitié car il s’agit d’estimer le comportement de différentes conditions de culture cellulaire afin de déterminer la condition la plus appropriée pour la procédure N°2. Il s’agira de 3 groupes avec 10 animaux par groupes.

Raffinement

Les tumeurs PDAC injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases. Les animaux sont hébergés en groupe, dans un milieu enrichi pour limiter le stress. En cas d’agressivité, surtout des mâles, des bâtonnets de bois seront mis dans les cages. Si l’agressivité persistait le mâle agresseur sera hébergé individuellement de façon temporaire. Des points limites ont été établis entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si necessaire Les souris seront suivies quotidiennement, en cas de douleur de la buprenorphine sera administrée par injection sous-cutanéee. Si une alteration de l’état general de l’animal est observée des aliments gélifiés ou de l’eau gélifié sera utilisé.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux pré́-cliniques sont bien établis chez la souris. De nombreuses lignées cancéreuses syngéniques sont disponibles comme celles du PDAC. Des animaux adultesmâles et femelles âgés de 8-10 semaines seront utilisés. Pour ces expériences de vaccination des animaux adultes avec un système immunitaire mature sont requis

Tuées en fin d'étude ou dès qu'elles atteignent les points limites, et pour 928 d'entre elles réutilisées ailleurs, 4 644 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Celles qui n'entrent pas dans le protocole sont reversées à l'entraînement du personnel aux gestes techniques, puis mises à mort. Une tumeur est greffée à chaque animal vigile, mesurée deux fois par semaine puis tous les jours à l'approche des points limites, avec jusqu'à trois injections de composés et deux prélèvements sanguins dont le dernier est terminal. Le porteur signale que les nids et les rouleaux de carton sont retirés des cages pour éviter que les tumeurs ne s'ouvrent, et conclut qu'aucune alternative ne peut remplacer la souris pour ce criblage de candidats médicaments.

Objectifs

Ce projet dans son ensemble consiste à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine. Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représente ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet s’effectuera en 3 temps : # une étude de tumorogénicité permettra de mettre au point différents modèles tumoraux d’intérêt (tumeur/ souris) et d’effectuer un premier tri parmi ceux-ci. # Une étude Pilote d’efficacité antitumorale permettra de tester un/des médicament/s contrôle/s de référence sur les meilleurs modèles précédemment validés. #Une étude d’efficacité permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les meilleurs modèles sélectionnés précédemment.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble consiste à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine. Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représente ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité (combinées avec les données de tolérance), permettent de choisir les candidat médicaments ayant la meilleure fenêtre thérapeutique chez les patients (c'est à dire la meilleure efficacité pour le moins d'effets indésirables). Ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. Une partie du projet permettra ainsi de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux alors que l’autre partie permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés précédemment.

Procédures

# Greffe tumorale sur souris vigile (2-3 minutes_1 fois), # Prise de mesure des tumeurs sur souris vigiles minimum deux fois par semaine et quotidiennement en cas d’approche des points limites (2-3 minutes), # Injection des composés sur souris vigile (2-3 minutes_maximum 3 fois) # Un prélèvement sanguin intermédiaire sur souris vigile (2-3 minutes_1 fois), # Un prélèvement de sang terminal sur souris sous anesthésie et analgésie générale sans réveil (2-5 minutes_ 1 fois).

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions, (4) mesures tumorales et (5) anesthésie fixe ou gazeuse. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (a) de la greffe tumorale sur animal vigile, (b) de l’injection des composés sur souris vigiles et (c) de prélèvements sanguins intermédiaires. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue. En fonction des besoins de l’étude, un prélèvement terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, pourra être effectué.

Devenir

Pour chacune des trois procédures : Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. De même, les souris non entrées en protocole seront utilisées pour l’entraînement aux gestes techniques (DAP_FormationHabilitation#50826) avant d’être mises à mort. La Structure Bien Etre Animal (SBEA), assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in- vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en termes de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant majoritairement cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle Souris.

Réduction

Les études de tumorogénicité et de preuve de concept permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés dans l’étude d’efficacité. Selon les modèles, une implantation ectopique dans le tissu adipeux mammaire latéral plutôt que sous-cutanée peut permettre de réduire le nombre d’animaux nécessaires grâce à une croissance des tumeurs plus homogène, mieux vascularisée et de limiter les nécroses tumorales. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des études de tumorogénicité et de preuve de concept seront utilisés pour l’étude d’efficacité avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs, le fait de tester dans les 2 premières études une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés. Des tests statistiques adaptés à un petit nombre d’animaux permettront de suivre au cours du temps le volume tumorale, le poids corporel et la survie des souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, tunnels, bâtons à ronger). Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscrit afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de celluloses et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’environ une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive, avec des points limites définis et qui seront appliqués, permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure seront effectuées au moins deux fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel, du volume tumoral et de la qualité de la tumeur. Cette surveillance sera renforcée à l’approche des points limites. Selon les modèles, une implantation ectopique dans le tissu adipeux mammaire latéral plutôt que sous-cutanée peut permettre de réduire le nombre d’animaux nécessaires grâce à une croissance des tumeurs plus homogène, mieux vascularisée et de limiter les nécroses tumorales. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le weekend et les jours fériés. Ainsi les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos conditions d’hébergement et d’expérimentation (statut sanitaire sans pathogènes ni opportunistes et expérimentation en condition stérile).

Choix des espèces

# S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Pour les modèles de tumeurs humaines, des animaux immunodéprimés sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. Dans le cas des tumeurs de souris, l’utilisation de la souche consanguine dont sont issues les cellules cancéreuses est indispensable. # La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacologie seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. # Les animaux seront livrés à partir de 7 semaines de développement et inclus en expérience à partir de 8 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’établissement utilisateur). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant leur comparaison avec les patients humains. Pour les animaux non-immunodéprimés, leur système immunitaire sera complètement mature et adulte.

2 580 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à seize injections en vigile, deux injections sous anesthésie, cinq gavages et dix séances d'imagerie de vingt minutes. Des tumeurs leur sont greffées dans un flanc ou dans les deux, puis mesurées tous les deux ou trois jours. Le projet teste si neutraliser une protéine restaure la réponse immunitaire antitumorale chez des patients sous corticothérapie, un bénéfice que le porteur place au conditionnel et à long terme. Il écrit par ailleurs que les chimiothérapies employées, dont l'oxaliplatine et la mitoxantrone, "n'entraînent pas de nuisances chez la souris aux doses utilisées".

Objectifs

Le système immunitaire est fortement influencé par des facteurs tels que les glucocorticoïdes, dont les taux augmentent notamment en situation de stress psychologique. Ces interactions jouent un rôle déterminant dans la réponse immunitaire, y compris dans le contexte oncologique. Le succès des traitements anticancéreux, qu’il s’agisse de chimiothérapie, de thérapies ciblées ou d’immunothérapie, repose en grande partie sur leur capacité à induire une réponse immunitaire antitumorale efficace. Certaines chimiothérapies, comme la mitoxantrone et l’oxaliplatine, induisent une mort cellulaire immunogène, capable de stimuler puissamment le système immunitaire contre les cellules tumorales. Cependant, l’utilisation des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (ICIs) est souvent associée à des effets secondaires inflammatoires ou auto-immuns nécessitant une corticothérapie. Par ailleurs, les glucocorticoïdes sont également largement prescrits en oncologie pour contrôler des symptômes tels que la douleur, la dyspnée ou les œdèmes associés aux traitements comme la radiothérapie et la chimiothérapie. Leur action immunosuppressive peut compromettre les effets bénéfiques des traitements anticancéreux en inhibant l’immunité antitumorale. Dans des expériences in vitro récentes, nous avons observé que les glucocorticoïdes induisent la sécrétion et l’expression d’une petite molécule spécifique et que la neutralisation extracellulaire de celle-ci inhibait les effets secondaires induits par les glucocorticoïdes. Le présent projet vise à tester l’hypothèse selon laquelle la neutralisation de notre protéine pourrait non seulement restaurer ou renforcer la réponse immunitaire antitumorale induite par la chimiothérapie et l’immunothérapie, mais aussi contrecarrer les effets immunosuppresseurs des glucocorticoïdes administrés en parallèle des traitements antinéoplasiques.

Bénéfices attendus

Si nos hypothèses se vérifient, ce projet permettra de valider dans des modèles précliniques une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace contre plusieurs types de cancer en monothérapie et/ou en association avec d'autres thérapeutiques et immunothérapies. À long terme, ce projet pourrait ouvrir la voie au développement de combinaisons thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées, en particulier chez les patients nécessitant une corticothérapie pour le contrôle des effets secondaires des traitements anticancéreux.

Procédures

Les animaux seront soumis à : Soit 1 injection sous anesthésie générale (2min), 15 injections sur animaux vigiles (

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention peuvent stresser transitoirement et légèrement les animaux, au cours des injections, gavages et avant les séances d'imagerie. Il peut apparaitre une irritation au niveau du point d’injection induisant un prurit léger. La croissance des tumeurs peut provoquer une gêne mécanique et induire une perte de poids modérées.Les chimiothérapies n'entraînent pas de nuisances chez la souris aux doses utilisées.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de collecter divers organes pour des analyses immunologiques.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est indispensable car ce projet vise à tester l'efficacité des traitements anticancéreux et à confirmer l'activation du système immunitaire. Actuellement, il est, en effet, impossible de reconstruire un système immunitaire fonctionnel et mature in vitro/ex vivo ou in silico (modélisation mathématique et informatique).

Réduction

Une analyse statistique a été effectuée afin de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie générale (isoflurane). Une analgésie sera mise en place si nécessaire. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout changement.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. En effet, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Ensuite, notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Et pour finir, la souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques en oncologie. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

5 000 poissons de douze espèces, du goujon au silure, subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré avant d'être remis dans le fleuve. Chacun est pêché, anesthésié trois à cinq minutes, mesuré, pesé, ouvert sur trois à cinq millimètres du ventre pour y glisser une puce, et maintenu hors de l'eau jusqu'à une minute. La moitié des individus capturés en amont est transportée en aval de la passe avant d'être marquée, pour ne suivre que des poissons enclins à remonter. Le porteur reconnaît que certains perdront leur puce et que des femelles peuvent l'expulser en se reproduisant, et écrit qu'il est "indispensable" de réaliser ce suivi pour savoir s'il faut améliorer l'ouvrage.

Objectifs

Suite à différents aménagements au niveau des fleuves ou de cours d'eau plus petits, la migration des poissons n'est plus possible. Ainsi des "passes à poissons" sont mises en place pour aider le passage des poissons au niveau de ces ouvrages et ainsi permettre notamment leur reproduction. L'objectif de ce projet est de vérifier l'efficacité d'une "passe à poisson" nouvellement installée en suivant le passage des individus au travers de celle-ci. Pour ce faire, un éventail des poissons représentatifs du cours d'eau correspondant est pêché par différentes techniques. Les caractéristiques des poissons sont rapportées (taille, poids, sexe) sous-anesthésie générale et une puce, dont la taille est adaptée aux mensurations du poisson est implantée dans la cavité abdominale par chirurgie. Le poisson est ensuite remis en eau sous surveillance avant d'être relâché. Le poisson portant la puce pourra être détecté s’il passe au travers de la passe à poissons, ce qui permettra de vérifier que l'aménagement réalisé est bien efficace pour permettre le passage des individus au travers de l'ouvrage.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de vérifier l’efficacité de la passe à poissons pour les espèces présentes. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour vérifier s’il est nécessaire de réaliser des travaux d’amélioration de la passe à poissons, pour que les poissons puissent librement circuler.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et une puce électronique sera implantée manuellement sur 5000 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, le transport, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress modéré sur les animaux. Il existe également un risque de douleur légère post-anesthésie suite à l’incision.

Devenir

Tous les individus seront replacés dans leur habitat naturel

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici une passe à poissons) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.

Réduction

L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements des poissons par espèce et par stade, et évaluer la franchissabilité de la passe à poissons. Il est adapté au gabarit du milieu (grand fleuve) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des puces ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur puce dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser la puce lors de la reproduction. Tous les individus d'une même espèce ne vont pas forcément migrer. Les individus pêchés en amont de la passe à poissons (50%), seront transportés en aval de la passe, où ils seront pucés puis relâchés, de manière à privilégier l'étude sur des individus enclins à migrer et in fine réduire le nombre d'individus marqués. Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale menée en milieu naturel, en-dehors des statistiques descriptives (taux de franchissement, durée moyenne de franchissement).

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée toutes les 30 minutes, pour éviter que la température du bain n’augmente et soit toujours suffisamment fraiche pour éviter le stress des poissons et l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière. L’application de points limites stricts et spécifiques du projet limitera les risques de douleur tout au long de la procédure.

Choix des espèces

12 espèces de poissons sont ciblées et sont représentatives du fleuve et de la zone concernée : - Poissons d’eau courante : barbeau fluviatile, hotu, chevaine, goujon, spirlin, chabot - Cyprinidés d’eau calme : brème, gardon, ablette - Carnassiers : Brochet, silure, perche 2 stades de développement sont retenus : juvéniles et subadultes-adultes. Les juvéniles peuvent migrer à la recherche d’habitats plus favorables ; les adultes migrent avant et/ou après leur reproduction. Au total, les juvéniles représentent environ 17% de l’effectif marqué, le reste étant des subadultes et adultes, qui sont les stades préférentiellement ciblés. Les plus petits individus seront relâchés sans être marqués.

Anesthésiées, saignées jusqu'à cinq fois, opérées pendant une heure pour interrompre puis rétablir la circulation sanguine dans un rein, 360 des 480 souris de ce projet subissent une ischémie-reperfusion rénale. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les douleurs postopératoires peuvent se manifester pendant environ 72 heures et annonce des antalgiques. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever des organes, ensuite placés dans une banque mutualisée avec d'autres projets.

Objectifs

La transplantation est aujourd’hui une solution reconnue pour soigner des patients dont un organe ne fonctionne plus. Mais il y a un vrai problème : le manque d'organes de qualité à greffer. Les médecins doivent donc parfois utiliser des organes dits "marginaux", provenant de personnes âgées ou ayant eu certains problèmes de santé. Ces organes sont plus fragiles et réagissent mal à un phénomène appelé ischémie-reperfusion. Ce phénomène se produit inévitablement lors d’une transplantation. Il correspond à l’arrêt temporaire de la circulation du sang dans l’organe, puis à son retour. Cela provoque un manque d'oxygénation et des lésions qui abîment fortement l’organe et peuvent compromettre la réussite de la transplantation. Il est donc primordial de développer des stratégies thérapeutiques afin de limiter ces lésions. Des travaux précédents ont montré que la régulation de certaines molécules énergétiques appelées métabolites permettrait de limiter les lésions d’ischémie-reperfusion et ainsi améliorer la qualité du greffon rénal. Ce projet cherche à mieux comprendre comment certains métabolites et les transporteurs qui les font circuler, protègent les reins de souris contre les dommages causés par un manque temporaire de circulation sanguine et donc d’oxygènation.

Bénéfices attendus

A court et moyen termes, ce projet permettra d’identifier les mécanismes cellulaires et tissulaires mis en jeu par les transporteurs de métabolites afin de définir une cible thérapeutique protectrice des lésions induites par l’ischémie-reperfusion rénales. A long terme, ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le foie, le coeur, le pancréas. Ce projet vise à améliorer la qualité, la fonction et la survie des greffons après transplantation chez l’humain.

Procédures

Tous les actes décrits se feront sous anesthésie. Tous les animaux (480) subiront au maximum 5 prélèvements de sang (durée de moins de 1 minute) et 1 injection (durée de moins de 1 minute) ou 1 chirurgie (durée de moins de 15 minutes) pour administrer des molécules d'études des récepteur aux métabolites. Les prélèvements de sang (durée de moins de 2 minutes) seront espacés d'au moins 2 jours. Une partie des animaux (360) aura en plus une chirurgie d'une durée de 1 heure pour provoquer une ischémie-reperfusion et auront un maximum de 2 injections (durée de moins de 1 minute) pour administrer des molécules d'études des récepteur aux métabolites.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un stress transitoire peu intense et un léger inconfort au réveil d'une quinzaine de minutes. Suite au prélèvement sanguin sous anesthésie, un stress de moins de 5 minutes peut être observé chez l'animal. Suite à la chirurgie sous anesthésie générale, les douleurs, qui peuvent se manifester pendant environ 72 heures, seront minorées par l'utilisation d'antalgiques. De plus, après chirurgie, peuvent être observées une légère perte de poids, une fatigue et une légère perte d'activité qui disparaissent sous 72 heures. Les prises de sang répétées sous anesthésie (acte de moins de 2 minutes) peuvent induire des douleurs qui peuvent se manifester pendant moins de 4 heures, ces douleurs seront minorées par l'utilisation d'antalgiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédures. Des prélèvements d’organes et tissus, incompatibles avec le maintien en vie des animaux, seront réalisés afin d’effectuer des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques.

Remplacement

A ce jour, il existe des modèles in silico et in vitro permettant de recréer un rein, cependant ces modèles sont très limités et ne permettent pas de reproduire la physiologie rénale. Il est donc nécessaire d’évaluer sur un organisme entier, en utilisant un modèle animal, l'impact d'une réponse systémique suite à une séquence d’ischémie-reperfusion.

Réduction

Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape. Les prélèvements sanguins et injections seront réalisés sous anesthésie en asepsie stricte. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie stricte, sous anesthésie générale, et les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire.

Choix des espèces

Le choix de la souris repose sur les critères principaux suivants : 1) Le modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris reflète les lésions physiopathologiques observées chez l’homme. Ce modèle est utilisé dans la littérature pour répondre à des questions pathologiques humaines. 2) La disponibilité dans cette espèce de l’ensemble des outils d’études biologiques. Des souris adultes seront utilisées ; ce stade de développement est approprié pour ce type d'étude nécessitant des reins matures notamment au niveau du réseau de vaisseaux sanguins.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue de leur procédure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à neuf injections à l'état vigile de molécules toxiques pour les reins, subissent des recueils d'urine avec pression manuelle sur la vessie, deux anesthésies gazeuses à deux heures d'intervalle pour poser puis retirer un capteur de fluorescence sur le dos, une chirurgie avec pose de clamps pour certaines, et un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que l'insuffisance rénale induite entraîne une altération de l'état général, une prostration liée à une fatigue importante et une perte de poids, et qu'une lignée génétiquement modifiée plus sensible aux infections est employée. Il justifie le projet par le coût des maladies rénales, "approchant les 4 milliards par an", et par l'absence de thérapie ciblée, quand la molécule testée est déjà disponible dans le commerce et déjà utilisée en essais cliniques.

Objectifs

Les traitements actuels de l'insuffisance rénale aigue et chronique sont limités et non spécifiques. En effet, la plupart d'entre eux ne ciblent pas directement les cellules rénales lésées. Nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler spécifiquement ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui visent le système immunitaire dans sa globalité. Des récents travaux ont montré qu’une interleukine (substance sécrétée par le système immunitaire) ainsi que sa voie de signalisation, favorisaient l'intégrité et la survie des cellules rénales, limitant ainsi l'issue de l'agression initiale. Par conséquent, nous pensons qu’un agent qui va activer cette voie de signalisation (nouvelle molécule testée dans ce projet) pourrait être bénéfique pour limiter l’impact des maladies rénales. L’interleukine ciblée et la nouvelle molécule sont disponibles dans le commerce et déjà utilisés dans des essais cliniques. Ces molécules ont déjà été testées dans deux types murins de maladies rénales qui ciblent les mêmes cellules (glomérules) mais elles n’ont pas eu le même effet bénéfique dans les deux modèles, pour des raisons encore inconnues. Les trois objectifs de ce projet sont : (1) Comprendre pourquoi la molécule à tester est protectrice dans un type de maladie glomérulaire chez la souris, mais pas dans un autre ? (2) Caractériser les effets de la molécule dans des modèles murins ciblant d’autres cellules rénales que les glomérules. (3) Optimiser l'administration de la molécule dans des modèles expérimentaux murins qui ciblent différents types de cellules rénales.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et scientifique. Les maladies rénales sont un problème de santé publique et le développement de thérapies ciblées est nécessaire dans ce domaine. L'insuffisance rénale terminale est associée à un taux de mortalité élevé et à des coûts très élevés, en particulier associés aux thérapies de remplacement telles que l'hémodialyse ou la transplantation rénale. L'étude des mécanismes de survie glomérulaire conduira au développement de thérapies ciblées limitant la progression de la maladie glomérulaire vers l'insuffisance rénale terminale. Le coût extrêmement élevé du traitement des maladies rénales, approchant les 4 milliards par an, et l'absence de thérapies ciblées dans les maladies glomérulaires rendent nécessaire le développement de la recherche sur les mécanismes des lésions et de la survie des cellules rénales. Par conséquent, nous visons à développer des stratégies thérapeutiques pour cibler ces cellules, au lieu des thérapies actuellement utilisées qui ciblent principalement le système immunitaire. Notre approche, qui vise à développer de nouvelles cibles thérapeutiques, peut avoir un grand impact dans la compréhension des mécanismes menant aux lésions rénales.

Procédures

(1) Injections : Une grande partie des animaux recevra de 1 à 3 injections de la molécule à tester. Cette injection est réalisée à l’état vigile et dure 10 secondes. L’induction des modèles expérimentaux nécessite, soit des injections sous anesthésie gazeuse (de 1 à 3 injections, durée 30 secondes), soit des injections à l’état vigile (maximum 9 injections, durée 10 secondes). (2) Prélèvements : Une partie des animaux sera soumise à un recueil d’urine : en première intention, dans une boite propre pendant une durée d'au moins 30 secondes, puis si besoin, contention avec la main avec un léger frottement sur la vessie pour la vider le cas échéant. Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux , sous anesthésie, sur un plateau chauffant : durée 5 à 10 minutes. (3) Contentions particulières : Tous les animaux du projet seront pesés régulièrement tout au long des procédures. (Durée 2 secondes par pesée) (4) Mesure de la fonction rénale : une grande partie des animaux sera soumise à la mesure de leur fonction rénale par une technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (5) Chirurgie : Une petite partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. Ce protocole a une durée de 40 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent être générées par : (1) L’utilisation d’un modèle de souris génétiquement modifiée plus sensible aux infections. (2) Les manipulations régulières pour les injections, les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent développer un stress lors de la contention. (3) Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et plus rarement une infection. Certaines injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. (4) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins : Prise de poids en raison de présence d’ascite ou au contraire dénutrition. L'induction d'une insuffisance rénale liée à ces molécules entraine une altération de l'état général, une prostration liée à une importante fatigue et une perte de poids. (5) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs malgré une prise en charge optimale de l'analgésie : ouverture des plans cutanés et musculaires, pose des clamps et sutures. (6) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure transcutanée de la fonction rénale et le prélèvement de sang terminal (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique).

Devenir

Tous les animaux (520) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Les différents prélèvements nécessaires pour les analyses sont réalisés après constatation de l’absence de battements cardio respiratoires.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de la molécule étudiée dans ce projet sur le rein est l'amélioration de la fonction rénale.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité interindividuelle du phénotype étudié dans nos deux modèles expérimentaux. Des lots de dix animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 520 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

(1) Raffinement de l'hébergement et surveillance : les animaux sont acclimatés dans l'animalerie 1 à 2 semaines avant la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que par une pesée quotidienne pendant toute la durée des protocoles. Des points limites ont été définis pour chaque procédure. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme en cellulose dans toutes les cages. En dehors d'une courte période d'isolement limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le personnel impliqué dans le projet est qualifié conformément à la règlementation en vigueur. (2) Raffinement pour la lignée de souris plus sensibles aux infections : les équipements de protection individuelle sont changés plus fréquemment et tout le matériel d’élevage est stérilisé. (3) Raffinement pour les injections : toutes les injections sont réalisées avec une aiguille très fine , ce qui limite les risques hémorragiques. Le volume d'injection est règlementaire. En cas d’injections répétées, les sites sont alternés. Lors de certaines injections, les souris sont sous anesthésie gazeuse et placées sur un plateau thermostaté. Un collyre anesthésiant est appliqué une minute avant l’injection et un gel ophtalmique est appliqué après pour limiter l’irritation oculaire. Les injections sont réalisées par du personnel très expérimenté. (4) Raffinement anesthésie : pour limiter les complications liées à l’anesthésie (détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique), les souris sont placées sur un plateau chauffant. (5) Raffinement Chirurgie (Clampage du rein) : pour assurer le bien-être pendant et après la chirurgie, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une analgésie et d’une anesthésie appropriée. Les souris seront placées dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. Durant toute la procédure, de la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux dans la cage. Pour éviter tout risque de surinfection liée à la chirurgie, les instruments sont stérilisés.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce : Les modèles expérimentaux du projet sont bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire et sont bien documentés dans la littérature scientifique. Concernant le stade de développement : Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre huit et dix semaines. À cet âge, ils possèdent un système glomérulaire mature, tout en ne présentant pas encore de lésions dues au vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.