Oncologie

810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un lymphome, elles portent toutes un phénotype dommageable, et 290 d'entre elles subissent une prise de sang sur animal vigile, une biopsie d'oreille et une injection intraveineuse sous anesthésie, dont 240 avec cinq injections répétées. Le développement du cancer provoque prostration, poil hérissé, dos voûté, gonflement de l'abdomen et troubles respiratoires liés aux tumeurs du thymus. Le porteur indique que des études in vitro sur cellules humaines ont déjà été menées, puis conclut que le recours aux animaux reste "nécessaire" pour observer le développement d'un cancer.

Objectifs

Au laboratoire, nous travaillons sur les lymphomes, qui sont des cancers qui affectent certains globules blancs (lymphocyte). Nous avons mis au point un modèle de souris qui développent ce type de cancer. Ce modèle nous a permis de trouver un gène dont l'expression est diminuée dans ce type de cancer. L’objectif de ce projet est de continuer à étudier ce modèle pour mieux comprendre comment se développe les lymphomes et étudier le rôle de ce gène dans ce développement. Nous souhaitons donc poursuivre notre étude débutée en 2019.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes du développement d’un certain type de lymphome et ainsi pouvoir améliorer les traitements et la prise en charge thérapeutique des patients car il s’agit encore d’une pathologie dont le taux de survie à 5 ans n’est que de 30%.

Procédures

Les 810 souris générées auront un phénotype dommageable et seront soumises à de la contention. Parmi toutes ces souris, 290 auront une injection par intraveineuse (30 sec) après une anesthésie et un prélèvement de sang sur souris vigile (moins d’1 min) et une biopsie d'oreille (1 mm ; 30 sec). Parmi ces 290 souris, 240 auront 5 injections répétées.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements et biopsie seront sources de stress et de douleur (inflammation/infection sur le site d'injection et de prélèvement). Les effets indésirables liés au développement du cancer seront la prostration, le poil hérissé, le dos vouté, un gonflement exacerbé de l'abdomen et des problèmes respiratoires associés au développement de tumeur au niveau du thymus.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront mises à mort : soit lors d’atteinte de point limite, pour éviter toute souffrance inutile, soit à la fin des procédures, car ces souris génétiquement modifiées ne pourront ni être réutilisées dans un autre projet, ni replacées

Remplacement

Des études in vitro sur des lignées de cellules humaines ont été réalisées et ont permis d'étudier l'impact du gène sur la survie et prolifération de ces cellules. Cependant, ces approches ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire, ni le développement de cancer. C'est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet pour étudier l'impact de ce gène sur le développement de cancer.

Réduction

Dans cette nouvelle DAP nous voulons compléter nos effectifs déjà en expérimentation afin d’obtenir au total 25 souris/groupes expérimentaux . Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=810) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables pour la cinétique de développement de la tumeur. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (incidence des tumeurs, analyse phénotypique des tumeurs, analyse de marqueurs sanguins)

Raffinement

La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux en générant le moins de stress possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur, stress ou souffrance des souris. Les gestes douloureux seront toujours précédés d'une anesthésie gazeuse qui limitera la douleur des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 3 fois par semaine. Au fur et à mesure de l'apparition de cancer et de mises à mort des animaux, des souris se retrouveront isolées dans les cages. Ces animaux recevront un enrichissement supplémentaire (coton et igloo pour la nidification, morceaux de bois et tube plastique pour l'enrichissement ludique). Pour les étapes de reproduction, les souris gestantes seront maintenues avec le mâle géniteur. Les croisements seront contrôlés afin de limiter le risque de développement précoce de cancer chez les animaux reproducteurs.

Choix des espèces

Le développement de modèles animaux est indispensable à l’étude de cancer. Pour l’espèce souris, nous disposons de nombreux outils génétiques nous permettant d’étudier précisément les mécanismes moléculaires qui conduisent au développement de cancers. Ce degré de précision n’est actuellement atteignable dans aucune autre espèce de mammifère. Pour les accouplements, nous utiliserons des souris arrivées à maturité sexuelle c'est à dire 6-10 semaines. Les souris en expérimentation seront âgées de 8 à 12 semaines (âge standard pour l'étude du système immunitaire) et car nous devons utiliser des souris adultes mais jeunes de manière à pouvoir les étudier sur un temps suffisamment long pour que des cancers se développent.

Greffées de fibrosarcomes sous anesthésie générale, 320 souris reçoivent une injection unique d'un anesthésique testé pour ses effets anti-tumoraux, puis leurs tumeurs sont mesurées au pied à coulisse. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour prélever tissus et organes. Le porteur rappelle qu'un travail antérieur a permis de guérir 50 % des souris en associant cet anesthésique à une immunothérapie, et 75 % en injection intratumorale, puis affirme qu'il est "indispensable" d'avoir recours à l'animal de laboratoire. Les points limites qui déclenchent la mise à mort sont annoncés comme définis et strictement appliqués, sans que le résumé indique lesquels ni à quelle taille de tumeur ils s'appliquent.

Objectifs

Notre récent travail a permis de démontrer l'effet anti-tumoral d'un anesthésique. Il permet une réduction significative de la croissance tumorale. Associée à l'immunothérapie, il permet de guérir 50% des souris et de générer une mémoire immunitaire. Injectée directement en intratumoral,il permet de guérir 75% des souris. De très nombreuses études précliniques ont pu observer la présence de récepteurs impliqués à la surface de nombreuses lignées tumorales. Afin de démontrer que l'action anti-tumorale de ce médicament repose sur des récepteurs spécifiques, nous réaliserons des expériences dans lesquelles des souris porteuses de fibrosarcomes ou de fibrosarcomes modifiés dont les cellules seront déficientes pour ces récepteurs seront traitées avec de l'anesthésique étudié.

Bénéfices attendus

Démontrer que l'action antitumorale de l'anesthésique repose sur les récepteurs spécifiques étudiés. Ce résultat pourrait amener à des essais randomisés contrôlés chez l'homme car actuellement ces agents sont utilisés comme complément analgésique per-opératoire et n'ont aucune recommandation spécifique en chirurgie oncologique.

Procédures

Greffe de tumeurs après injection de cellules sous anesthésie générale (1 fois, durée 5 minutes), traitement par injection (1 fois, durée 1 minute), anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections uniques de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress léger et transitoire chez l’animal et les croissances tumorales en sous cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées.

Devenir

Euthanasie des animaux pour études sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les effets des traitements anticancéreux impliquent des processus multiparamétriques impliquant des sécrétions humorales et des répercussions immunitaires non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier. On ne peut donc se contenter de l'étudier uniquement in vitro, il est indispensable d'avoir recours à l'animal de laboratoire. Notre hypothèse est que la dexmedetomidine induit une réponse anti-tumorale médiées par les récepteurs alpha2 adrénergiques présents sur de nombreuses lignées tumorales. L'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour étudier l'immunité et l'efficacité des traitements sur la réponse anti-tumorale. La confirmation de cette activité anti-tumorale in vivo ouvrirait la possibilité d'utiliser systématiquement ces agents au cours des chirurgies oncologiques chez l'homme afin de diminuer le risque de récidives grâce à une destruction des cellules tumorales résiduelles.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes déterminés par calcul statistique pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les résultats seront analysés par des méthodes statistiques. L’étude sera arrêtée si une procédure invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous souhaitons prouver l'efficacité de potentiels nouveaux agents anti-tumoraux afin d'augmenter la réponse anti-tumorale chez l'homme qui est un mammifère. Avant de passer à des études cliniques, il est absolument nécessaire de réaliser des études pré-cliniques sur le modèle mammifère afin de tester notre hypothèse mais également afin de vérifier l'absence de toxicité qui pourrait être majorée par l'association de traitement. Le modèle souris permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, facile à manipuler, et suffisamment grand pour pouvoir avoir des injections de cellules tumorales. Souris adultes de 6-8 semaines. Les tumeurs murines générées sont des tumeurs survenant chez l'adulte, nous réaliserons donc les études sur des adultes.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux injections espacées de 24 heures déclenchent une mutation ciblée, puis une micropompe est implantée sous la peau sous anesthésie pour diffuser en continu une substance qui imite le stress chronique, et quatorze jours plus tard des cellules de cancer de la peau sont injectées dans la veine de la queue. L'objectif est de suivre pendant deux semaines la formation de métastases pulmonaires, la mise à mort de toutes les souris étant imposée par les tumeurs développées. Le porteur écrit que l'implantation de la pompe ne devrait générer aucune souffrance, et affirme que l'étude des phénomènes métastatiques "nécessite" un modèle in vivo.

Objectifs

Le but de ce projet est de découvrir comment les vaisseaux sanguins influent sur la croissance des tumeurs. Nous voulons en particulier comprendre comment le corps réagit au stress constant et comment cela peut affecter la formation de tumeurs secondaires (dans d’autres organes ici les poumons) à distance du site primaire d’une tumeur (dans un organe ici la peau) lors du phénomène de métastase cancéreuse. Des recherches antérieures ont montré qu’une protéine activée lors d’un stress continu induit la production d'une substance chimique dans la paroi interne des vaisseaux sanguins. L’objectif de notre travail est de comprendre comment cette modification influence l’expression des gènes des cellules des vaisseaux sanguins et facilite la dissémination des cellules tumorales sur le site secondaire de la circulation vers l’organe métastasé. Pour mener cette étude, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées qui ne produisent pas la Cxcl12 spécifiquement dans leurs cellules de la paroi interne des vaisseaux sanguins. Nous allons également utiliser une forme de cancer de la peau très vascularisée comme modèle de tumeur primaire. Pour simuler le stress constant, nous allons implanter des mini-pompes dans ces souris, délivrant une substance qui imite le stress. Au cours de nos recherches, nous allons examiner le développement de tumeurs secondaires pulmonaires, ainsi que les changements dans leur vascularisation, sur deux semaines.

Bénéfices attendus

Étant donné la disponibilité d'antagonistes situés sur les parois des vaisseaux qui se comportent déjà bien pour le traitement chez l'homme, les résultats issus de cette étude pourraient être facilement transférés pour des thérapies complémentaires du cancer.

Procédures

Nous soumettrons nos groupes de souris à deux injections d’une substance permettant de générer la mutation specifique espacées de 24h. Ces gestes techniques réalisés par du personnel compétent et expérimenté sont réalisés en quelques secondes. Les souris qui ne produiront pas la substance chimique spécifiquement dans leurs les cellules de la paroi interne des vaisseaux sanguins et les souris contrôles la produisant seront soumises 6 jours plus tard à une implantation d’une micropompe sous la peau réalisée sous anesthésie qui durera au maximum 5 minutes. Quatorze jours après une implantation réussie, les souris recevront en intraveineuse dans la veine caudale des cellules de cancer de la peau ce geste réalisé par du personnel compétant et expérimenté n’excédera pas 1 minute. L’implantation de la micropompe sera accompagnée d’un traitement analgésique préopératoire en sous cutané.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises à des manipulations de courte durée lors du nettoyage des cages et des pesées occasionnelles qui peuvent engendrer un léger stress. Les génotypésdes animaux seront determiner par extraction d'ADN à partir de follicles pileux réalisées sur souriceaux de 21 jours. Ce geste n’engendre aucune douleur à cet âge. L’implantation de la micropompe en sous cutané sera réalisés sous anesthésie et avec un traitement préopératoire d’antalgique et ne devraient générer aucune souffrance chez les souris. Il existe un risque minime de cicatrisation altérée au niveau du site chirurgical d’implantation. La formation de métastases, c’est-à-dire de tumeurs secondaires à distance de la tumeur primaire facilitées par la dissémination dans la circulation sanguine, sera examinée au bout d’un temps court au niveau des poumons. L’expérience accumulée sur ces modèles a montré que vu le temps d’utilisation pour observer des métastases pulmonaires est très inférieur au temps permettant la croissance de tumeurs sous-cutanées, et que la souffrance des animaux est minimisée.

Devenir

Les tumeurs développées chez les souris exigent que toutes les souris soient mis à mort à la fin des expériences.

Remplacement

L’étude de la contribution de la circulation sanguine et de l'extravasation des cellules tumorales depuis les vaisseaux et donc des phénomènes métastatiques à distance de la tumeur primaire, nécessite d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

L’utilisation de micro-pompes micro-osmotiques permet de limiter le stress des animaux et d’éviter des traitements trop invasifs. Cela réduit aussi le risque que certains animaux meurent à cause du stress. Le nombre d’animaux nécessaires pour l’étude a été calculé grâce à un test statistique, afin de garantir des résultats fiables tout en limitant leur utilisation.

Raffinement

Les animaux seront manipulés par du personnel expérimenté. L’implantation sous-cutanée de micro-pompes réduit considérablement le stress lié à la manipulation des animaux (par exemple, aucune injection quotidienne n'est nécessaire). Le stress des animaux est réduit à un niveau minimum. Toutes les mesures seront prises pour minimiser le degré de souffrance des animaux, comme décrit dans la grille de score. L'anesthésie et l'analgésie seront assurées pendant l'implantation de la pompe osmotique en sous cutané. La douleur ou la souffrance des animaux pendant l'induction de la tumeur peut être maintenue à un niveau modéré grâce à des mesures adaptées prises en concertation avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Etre Animal; Conseille le personnel d'institute sur des questions relatives au bien-être des animaux) et le vétérinaire référent. La mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés basés sur une observation quotidienne des animaux (apparence de l’animal, évolution du poids, modifications du comportement, respiration, aspect de la cicatrice au niveau du site d’implantation de la micropompe, mobilité, croissance d’une tumeur cutanée) au cours de la procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. L'utilisation d'analgésiques sera également proposée lors de l’atteinte de certains points limites.

Choix des espèces

Pour obtenir des données sur la fonction et la contribution spécifique du facteur produit par les cellules de la paroi des vaisseaux sanguins dans la progression tumorale (ici la métastase de la tumeur primaire dans des organes secondaires), le modèle murin est particulièrement approprié. En effet les modèles de formation des tumors et de stress chronique utilisés sont bien établis chez la souris. Toutes les lignées de souris étant consanguines sur un fond génétique stable, elles permettent de futurs croisements entre les lignées et des implantations de tumeurs dérivées de souris de même fond génétique que les souris receveuses. Le taux d'échec de l'implantation de tumeurs est dès lors minime. En raison de la comparaison avec l'évolution de la progression tumorale chez l'homme, ce projet sera réalisé sur des souris adultes âgées de 9 à 15 semaines.

Une partie des souris utilisées est immunodéprimée par construction, pour accepter la greffe de tumeurs humaines. 2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, portant chacune une tumeur greffée sur animal vigile. Elles reçoivent jusqu'à trois injections du composé à tester, des mesures de tumeur au moins deux fois par semaine, plusieurs prélèvements sanguins sur animal vigile, puis un prélèvement terminal sous anesthésie sans réveil que le porteur décrit comme pouvant provoquer un arrêt cardiaque. 540 d'entre elles pourront être réutilisées, et les souris jamais entrées en protocole sont utilisées pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de caractériser ensemble ou indépendamment les paramètres de candidats médicaments de type thérapie ciblée anticancéreuse chez la souris porteuse de tumeur au niveau pharmacocinétique (PK) c’est à dire le devenir du candidat médicament dans le sang au cours du temps, pharmacodynamique (PD), son effet sur l’organisme, et de biodistribution (BioD), sa distribution dans l’organisme. Ces composés, développés dans le cadre de thérapies ciblées anticancéreuses pour l’Homme, nécessitent une évaluation complète de leur comportement in vivo afin d’optimiser les futures études d’efficacité et de tolérance. L’étude PK sera réalisée selon une méthode d’échantillonnage conventionnel ou la méthode de micro-échantillonnage, avec des volumes de sang total prélevés concordants avec une limite réglementaire de 7.5 % du volume sanguin total par semaine glissante ou 10% sur deux semaines glissantes. Des prélèvements d’organes et de tumeurs pourront également être effectués à différents temps post-administration afin d’étudier la biodistribution du composé et leur impact sur les tissus (PD). Ces données permettront de déterminer la répartition tissulaire du composé, d’identifier les éventuels organes cibles ou de stockage, et de corréler ces observations avec les effets pharmacodynamiques observés. Afin de maximiser la robustesse des données tout en respectant les principes des 3Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement), la stratégie d’échantillonnage (PK) ainsi que les groupes satellites (groupes supplémentaires pouvant être ajoutés pour divers prélèvements) (PD/BioD) seront optimisés. Cela permettra d’obtenir l’ensemble des points de la courbe cinétique et des données de biodistribution et de pharmacodynamie à partir d’un nombre réduit d’animaux, tout en assurant la qualité scientifique des résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à générer ensemble ou indépendamment des données précliniques de pharmacocinétiques, de biodistribution tissulaire et d’activité pharmacodynamiques de candidats médicaments de type thérapie ciblée anticancéreuse. Les résultats attendus permettront d’identifier les profils d’exposition systémique, la répartition dans les tissus cibles, ainsi que les effets biologiques induits par ces composés dans les organes sains et les tumeurs. L’intégration potentielle de ces trois paramètres dans une même étude permettrait une compréhension globale et rigoureuse du comportement in vivo de ces candidats, permettant (1) de continuer d’en optimiser les propriétés (2) d’orienter la sélection de composés ayant la meilleure fenêtre thérapeutique et (3) d’anticiper/optimiser les schémas posologiques (dose, fréquence, voie d’administration). En intégrant des approches de réduction du nombre d’animaux (via le suivi longitudinal sur un même individu et l’utilisation ciblée de groupes satellites), ce projet s’inscrit pleinement dans une démarche éthique et scientifique rigoureuse. À terme, les données générées contribueront à accélérer le développement de thérapies ciblées innovantes contre le cancer, avec un fort potentiel de transposition vers l’Homme grâce à la pertinence translationnelle du modèle utilisé.

Procédures

# Greffe tumorale sur souris vigile (2-3 minutes_1 fois), # Prise de mesure des tumeurs sur souris vigiles minimum deux fois par semaine et quotidiennement en cas d’approche des points limites (2-3 minutes), # Injection des composés sur souris vigile (1-3 minutes_maximum 3 fois) # Un prélèvement sanguin intermédiaire sur souris vigile (2-3 minutes_plusieurs fois), # Un prélèvement de sang terminal sur souris sous anesthésie et analgésie générale sans réveil (2-5 minutes_ 1 fois).

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie fixe ou gazeuse. # Les animaux vigiles subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la greffe tumorale, (2) de l’injection des composés et (3) de prélèvements sanguins intermédiaires. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs minutes lors d’un prélèvement de sang terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, sous anesthésie et analgésie générale sans réveil. »

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront euthanasiés en fin de procédure. Un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie pourra être réalisée. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entraînement aux gestes techniques (DAP_FormationHabilitation#50826 avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, pharmacodynamiques et de distribution, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant majoritairement cross-réactif entre la souris et l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle de souris.

Réduction

Le projet a été conçu dans une logique de réduction rigoureuse du nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des 3Rs. Cette réduction repose sur une approche expérimentale optimisée, combinant une planification statistique préalable, une connaissance approfondie des composés testés, et une stratégie d’échantillonnage raisonnée. Avant toute mise en œuvre, chaque candidat médicament fera l’objet d’une caractérisation approfondie permettant de définir avec précision les points de cinétique les plus informatifs. Cette sélection ciblée des temps de prélèvement permet de réduire le nombre de points nécessaires à la modélisation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de biodistribution, tout en conservant la robustesse des paramètres estimés. Le nombre d’animaux par groupe (4 à 5) a été défini sur la base d’une analyse de puissance statistique, garantissant une significativité suffisante tout en évitant la surutilisation d’animaux. Lorsque cela est possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur les mêmes individus à plusieurs temps, grâce à l’utilisation de volumes adaptés ce qui permet d’éviter la constitution de groupes satellites pour chaque point de temps. Dans les cas où des prélèvements tissulaires seront nécessaires pour les analyses de biodistribution et de pharmacodynamie, des groupes satellites pourront être utilisés de manière ciblée, uniquement aux temps les plus pertinents, et en nombre restreint. Cette approche permettra de limiter les duplications inutiles tout en assurant la qualité des données biologiques collectées. L’ensemble de ces mesures vise à maximiser l’information obtenue par animal, tout en respectant les contraintes éthiques et réglementaires liées à l’expérimentation animale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, bâtons à ronger…). Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscrits afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de celluloses et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’environ une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure seront effectuées au moins deux fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel, du volume tumoral et de la qualité de la tumeur. Cette surveillance sera renforcée à l’approche des points limites. Selon les modèles, une implantation ectopique dans le tissu adipeux mammaire latéral plutôt que sous-cutanée peut permettre de réduire le nombre d’animaux nécessaires grâce à une croissance des tumeurs plus homogènes, mieux vascularisées et de limiter les nécroses tumorales. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le weekend et les jours fériés. Ainsi les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Il est à noter que le phénotype «immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos conditions d’hébergement et d’expérimentation (statut sanitaire sans pathogènes ni opportunistes et expérimentation en condition stérile).

Choix des espèces

#Les études pharmacocinétiques, pharmacodynamiques et de distribution nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). De plus, les souris immunocompétentes ou immunodéprimées sont des espèces pertinentes pour la greffe de tumeurs murines ou humaines. Enfin, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. #Les animaux seront livrés à partir de 7 semaines de développement et inclus en expérience à partir de 8 semaines (après un minimum de 5 jours d’acclimatation dans l’Etablissement Utilisateur). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant leur comparaison avec les patients humains. Pour les animaux non immunodéprimés, leur système immunitaire sera complètement mature et adulte.

Capturés, anesthésiés, mesurés, raclés au grattoir de silicone pour prélever leur mucus, puis opérés cinq minutes pour recevoir un émetteur acoustique et une puce d'identification : 165 silures, carpes et brochets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont ensuite exposés à des sons attractifs couplés à un stimulus électrique dissuasif, pour tester si le silure glane peut être conditionné à fuir les passes à poissons où il prédate les migrateurs. Le porteur reconnaît que le champ électrique stresse tous les individus présents dans son champ d'action, silures ou non, et qu'une hémorragie est possible lors de l'implantation. Trente-six heures au maximum séparent la capture du relâcher, et les poissons "en bon état sanitaire et en apparente bonne forme physique" retournent là où ils ont été pêchés.

Objectifs

En France, de nombreuses pressions pèsent sur les poissons migrateurs amphihalins (saumons, aloses, lamproies, anguilles) et engendrent leur déclin, à tel point que tous sont menacés voire en danger d’extinction. Atténuer les pressions qui s’exercent sur ces espèces migratrices constitue donc un enjeu de conservation majeur. Afin de rétablir la continuité au niveau des barrages, des ouvrages de franchissement (passes et ascenseurs à poissons) sont construits pour permettre la libre circulation des espèces. Ces sites constituent cependant des goulets d’étranglement fréquentés par de nombreux silures Silurus glanis ; le silure est une espèce exotique qui, par sa taille imposante, est la seule capable de prédater ces espèces migratrices au stade adulte en rivières. Sur plusieurs grands fleuves, il a été estimé que le silure pouvait localement prédater jusqu’à 80% des migrateurs lors de leur montaison vers les sites de reproduction, réduisant ainsi considérablement l’efficacité de ces ouvrages de franchissement. Parmi les poissons, le silure possède d’excellentes capacités auditives, illustrées par la technique de pêche au clonk qui consiste à attirer les silures en émettant un bruit caractéristique à la surface de l’eau. Cependant, dans les zones de pêche intensive, il a été rapporté que le clonk, au contraire, les faisait fuir, ce qui souligne les capacités d’apprentissage de cette espèce. Le présent travail vise à tester les possibilités de contrôler le comportement du silure par conditionnement à l'aide de dispositifs sonores et à l’appliquer à sa gestion locale.

Bénéfices attendus

Face à la pression de prédation du silure sur les poissons migrateurs amphihalins, actuellement différentes méthodes d’intervention directe, principalement basées sur le prélèvement d’individus, sont testées ; elles s’avèrent cependant chronophages, coûteuses et d’une efficacité limitée. Elles sont aussi parfois sources de conflit entre gestionnaires et acteurs favorables aux silures en tant que poissons trophées « no kill ». Elargir le panel de mesures à disposition des gestionnaires apparaît donc crucial. Une fois notre outil acoustique d’effarouchement calibré sur un étang constituant un laboratoire à ciel ouvert, il sera testé sur une rivière, aux abords d’un ouvrage de franchissement, en situation réelle avec la présence de silures et de poissons migrateurs. La méthode sera peaufinée pour élaborer un outil destiné aux gestionnaires, ciblant spécifiquement le silure et limitant son impact sur les poissons migrateurs au niveau des sites à enjeux. Les bénéfices sont l’effarouchement du silure dans des zones où il pose problème, ceci sans manutention des individus. Potentiellement, l’outil peut intéresser de nombreux sites en France. Par ailleurs, le projet éclairera également la communauté scientifique et des gestionnaires sur la capacité des prélèvements de mucus à diagnostiquer l’état sanitaire d’une population.

Procédures

1. Capture (temps maximum entre capture et relâcher : 36h) 2. Anesthésie générale (temps total du début à la fin de la procédure : 15 mn) 3. Mesure taille et poids (1mn) 4. Prélèvement mucus (1ml pour des individus d'1m; 1 mn) 5. insertion puce d'identification électronique (1mn) 6. intervention chirurgicale pour implantation émetteur acoustique (5 mn).

Impact sur les animaux

La capture et la manipulation génèrent un stress. Le prélèvement non invasif de mucus enlève temporairement la première barrière immunitaire. Une douleur pourrait être ressentie en lien avec l’opération, que ce soit pendant l’acte chirurgical ou au réveil ; une hémorragie pourrait également être possible en lien avec cet acte chirurgical. L’anesthésie pourrait causer une désorientation et une perte de repères. La diffusion de sons peut potentiellement engendrer une angoisse chez certaines espèces. Le stimulus électrique dissuasif associé aux sons attractifs pour le silure est également une source de stress, potentiellement pour tous les individus, silures ou non, se trouvant dans le champ d’action du champ électrique.

Devenir

Tous les animaux en bon état sanitaire et en apparente bonne forme physique seront relâchés sur leur lieu de capture

Remplacement

Il est nécessaire d’avoir recours à des animaux car il s’agit d’étudier leur comportement en réaction à des stimuli sonores en milieu naturel et également d’évaluer leurs capacités d’apprentissage et la durée de leur mémorisation (au bout de combien de temps les silures associent-ils le signal répulsif au stimulus initialement attractif ? au bout de combien de temps ne font-ils plus cette association ? quelle est la variabilité entre les individus ? Concernant les deux autres espèces qui seront marquées mais qui ne sont pas les cibles directes du dispositif de conditionnement se pose a minima la question de l’influence des émissions sonores sur leur comportement). Il n’existe, à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.

Réduction

De manière générale, le choix du nombre d’individus est guidé par des besoins de représentativité statistique. Sur la base de notre expérience précédente, le suivi des poissons par télémétrie acoustique est loin d’atteindre 100% : des individus peuvent être pêchés, mourir ou ne plus être suivis sans raison évidente. Parmi les individus suivis, les périodes lors desquelles les marques sont entendues peuvent être éparses car il est difficile de couvrir intégralement un système d’une centaine d’hectares et il y a forcément des zones d’ombre ; par ailleurs, les individus peuvent aussi simplement être masqués du système de réception par des obstacles physiques, l’un des plus problématiques étant la végétation aquatique les années où celle-ci se développe densément. A l'issue de la capture, certains individus peuvent également ne pas être en état d'intégrer la procédure. Une simulation statistique par test de puissance montre qu’un échantillon initial de 55 individus par espèce cible, incluant les différents aléas cités ci-dessus, permettrait de tirer des conclusions robustes.

Raffinement

Les opérations se dérouleront en automne pour éviter une température de l’eau trop élevée ce qui augmenterait les risques d’infections. Les bacs de stabulations et d’anesthésie seront à l’ombre, oxygénés par un bulleur et suffisamment grands pour assurer une aisance de mouvement des poissons. Les bacs seront régulièrement contrôlés (oxygène, température, pH) pour limiter un écart de température maximum de 2°C avec l’eau de l’étang. La propreté de l’eau sera contrôlée visuellement pour s’assurer de l’absence de fécès, mucus, particules, sang (bain de secours à proximité). Un même bain ne pourra pas servir à deux espèces différentes. L’eau sera changée si un de ces paramètres était anormal et au moins toutes les cinq opérations ou toutes les heures. Le personnel manipulant les individus portera des gants humides et utilisera des épuisettes et des housses de transport spécifiques pour les plus gros individus. Une fois anesthésiés, les individus seront pesés dans un bac ou à l'aide d'un filet avec un peson, puis mesurés sur un tapis de réception humide pour limiter l’écrasement des organes et la dessication cutanée. Le mucus sera prélevé par raclement très doux du dos avec un grattoir en silicone souple ; la zone grattée sera ensuite rincée avec du liquide physiologique stérile et un pansement hydrorésistant sera appliqué pour éviter toute infection. Le poisson sera ensuite immergé dans une solution d'anesthésiant et maintenu sur le ventre par une épaisseur en mousse. La zone d'insertion de la puce est préalablement rincée avec du liquide physiologique puis une injection locale d'analgésique est réalisée pour atténuer la douleur et éviter que les individus ne se grattent et perdent leur puce. Un pansement antiseptique sera appliqué à l’emplacement de la piqûre. L’émetteur pèsera moins de 2% du poids de l'animal pour limiter toute gêne. Il sera légèrement poussé au-dessus de la ceinture pelvienne pour reposer sur celle-ci plutôt que sur les parties molles plus fragiles et désinfecté préalablement à son insertion. L’individu est placé en observation pendant plusieurs heures dans un bac aéré, contrôlé. Du matériel stérile à usage unique (champ de travail, gants, lames, fils, aiguilles) ou désinfecté (pinces) sera utilisé. Des points limites ont été mis en place pour chacune des interventions auxquelles les poissons seront soumis.

Choix des espèces

Seuls des silures (Silurus glanis) longs d'un mètre au minimum sont capables de prédater les poissons migrateurs amphihalins adultes. Les silures entrant dans cette procédure seront donc adultes et il est indispensable de travailler sur l’espèce même pour étudier son comportement finement. Pour cibler spécifiquement le silure, nous avons opté pour des stimuli attractifs, que nous pensons plus spécifiques, non délétères pour les autres espèces et pour lesquels nous avons des candidats prometteurs (sons de congénères, clonk). Il est très difficile de travailler directement aux abords des ouvrages de franchissement ou même dans des milieux aussi ouverts que les grandes rivières fréquentées par les migrateurs pour étudier le comportement des silures. Le travail sur des individus de pisciculture n’est pas simple non plus (individus de taille conséquente capables d’effectuer de très grands déplacements et nécessitant donc de très grands bassins pour étudier leur comportement vis à vis de stimuli sonores) et amènerait à des conclusions difficilement extrapolables au milieu naturel bien plus vaste. D’ailleurs, les principaux enseignements tirés des études de laboratoire concernant leur réaction comportementale à des stimuli sonores sont l’obtention d’audiogrammes donnant les seuils de fréquences et d’intensités auxquels les espèces sont sensibles. C’est un premier pas mais il est nécessaire d’aller plus loin et notamment de mesurer la variabilité inter-individuelle et de quantifier l’influence potentielle de ces stimuli sur d’autres espèces. A cette fin, la carpe (Cyprinus carpio), espèce possédant comme le silure un appareil de Weber lui conférant d’excellentes capacités auditives, et le brochet (Esox lucius), prédateur emblématique de nos milieux aquatiques continentaux ne disposant pas de telles capacités, ont été choisis ; ces deux espèces sont par ailleurs communes dans le site d'étude. Les carpes et brochets entrant dans cette procédure auront un stade de subadulte à adulte (poids supérieur à 600g pour éviter toute gêne occasionnée par la marque acoustique). Des échantillons de mucus seront prélevés uniquement sur les silures. À l'heure actuelle, l'état de santé des populations de poissons sauvages, et en particulier des silures, espèce en pleine expansion en France, n'est pas connu. Ces prélèvements non invasifs permettront de connaître l’état de santé des individus relâchés et de le relier à leurs capacités de mouvement.

Tester les molécules candidates de clients contre l'inflammation liée à l'obésité : un laboratoire de recherche contractuelle va utiliser 600 souris et 300 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont d'abord rendus obèses par un régime hypercalorique prolongé, puis soumis à un à six jeûnes de deux à douze heures, jusqu'à six tests de tolérance au glucose ou à l'insuline de deux heures trente, des séjours de 72 à 120 heures seuls en cage de calorimétrie, des injections répétées du composé du client et des prélèvements sanguins. Le porteur ramène les nuisances de la surcharge pondérale à un "léger inconfort" pour la mobilité dans la cage, et indique que l'enrichissement peut varier "en concertation avec le souhait du client". Tous les animaux sont tués en fin de procédure pour prélever leurs organes et caractériser leur statut inflammatoire et métabolique terminal.

Objectifs

Le surpoids est défini comme une accumulation excessive de masse grasse dans l’organisme. L’obésité est une maladie chronique complexe définie comme une accumulation excessive de masse grasse pouvant altérer l’état de santé d’un individu. Actuellement, 2,5 milliards de personnes dans le monde sont atteintes de surpoids, dont plus de 800 millions sont obèses (OMS, 2022). La prévalence du surpoids ne cesse de croître depuis les dernières décennies et l’un des facteurs prépondérants de cette évolution est la surconsommation de régimes déséquilibrés, riches en graisses et en sucres. L’obésité s’accompagne d’une inflammation systémique constante et d’intensité faible voire modérée, dite de bas-bruit. Cet état inflammatoire chronique contribue à développer d’autres maladies, telles que le diabète, la stéatose hépatique et bien d’autres, et cause ainsi quelques millions de morts chaque année. Dans ce contexte, l’importance de contenir ce statut inflammatoire et surtout, de stimuler sa résolution, est capitale. L’administration prolongée de régime hypercalorique chez le rongeur est l’un des moyens les plus simples et les plus couramment utilisés pour modéliser le surpoids et l’obésité chez l’animal. En faisant varier la durée du régime ainsi que sa valeur calorique, ce modèle permettra de collecter et d’étayer des données cruciales sur les mécanismes inflammatoires cellulaires et moléculaires impliqués. Le premier objectif consiste donc à détenir au sein de notre laboratoire le modèle de surpoids/obésité induit par un régime hypercalorique. Notre laboratoire étant un organisme de recherche contractuelle, notre activité consiste à étudier le potentiel résolutif de molécules candidates dans différents contextes inflammatoires, ici dans l’obésité. Ainsi, l’objectif final de ce projet est de tester l’administration conjointe de molécules candidates dans la résolution de l’inflammation induite par le surpoids ; et ainsi contribuer à terme à réduire voire supprimer l’impact délétère de l’obésité à tous les niveaux ; humains, sociaux, sociétaux et économiques. De plus, l'ajout d'une méthode d’analyse métabolique nécessite une modification du projet initial autorisé sans ajout d’animaux, faite dans un 2eme EU. Le projet devient multisite : Cette APAFIS est une modification d’un projet autorisé.

Bénéfices attendus

Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des altérations induites par le surpoids/obésité. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour réduire les altérations multiples dues au surpoids et à l’obésité.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à : 1. 1 à 6 cessions de jeûne d’une durée de 2h à 12h sur la période diurne ou nocturne, espacées d’une semaine minimum. (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2) 2. Au maximum, 6 tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline (durée 2h30 environ). (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2) 3. Des mesures de composition corporelle, l’acquisition dure au maximum 2 minutes et cette mesure sera effectuée 1 à 5 fois au cours du protocole. (EU0549_EU 2/2) 4. Des expériences de calorimétrie : les souris seront isolées en cage individuelles entre 72h et 120h. Chaque animal sera soumis une seule fois à ce genre de procédure. (EU0549_EU 2/2) 5. Des administrations répétées du composé-client selon les modalités suivantes : Les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéales, sous- cutanées, intravasculaires, intradermiques. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront moins d’une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2) 6. Un prélèvement sanguin unique ou répété, précédé ou non d’un jeûne de 2 à 6h, suivi d’une semaine de récupération minimum sur souris vigile ou anesthésiée et sur rats anesthésiés, selon le volume prélevé. La durée d’un prélèvement sera de l’ordre d’une minute par animal; (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2)

Impact sur les animaux

Les trois principales nuisances attendues concernent la surcharge pondérale des animaux, la réalisation de prélèvements sanguins répétés sur la durée du protocole expérimental, l’administration répétée des molécules- clients à tester. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les types d’injection (intrapéritonéale, sous-cutanée, gavage, intradermique, intravasculaire). La surcharge pondérale pourra induire un léger inconfort chez les animaux, en comparaison avec des souris de poids normal, notamment pour leur mobilité au sein de la cage.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire et métabolique terminal.

Remplacement

Lorsque ce sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement ou en complément des tests animaux afin de remplacer le nombre d'animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement complet de l'expérimentation animale par des essais in vitro n'est pas envisageable pour une étude portant sur le surpoids. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires et cellulaires de la physiopathologie d'un animal entier. De plus, les étapes de validation d'une molécule thérapeutique nécessite qu'elle soit testée chez l'animal avant de pouvoir passer à l'étape de validation suivante : l'Homme.

Réduction

La problématique de ce projet faisant intervenir la régulation métabolique et inflammatoire sur du moyen/long terme (semaines, mois), induit intrinsèquement une variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes (n=12 souris / groupe expérimentaux). Le nombre de rats et de souris nécessaires a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples, en particulier sur des protocoles de plus courte durée. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. D’autre part, si plusieurs prélèvements sanguins sont à réaliser, nous les réaliserions sur des animaux dédiés (6 et 6 au sein d’un même groupe) afin de respecter les volumes, les délais de récupération et limiter le nombre de gestes invasifs sur un même animal. Enfin, nous utiliserons en priorité (sauf exigence spécifique de la part de nos clients) des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. C’est la conjonction de tous ces éléments qui nous a conduit à considérer des groupes de 12 animaux maximum.

Raffinement

Leur environnement sera enrichi (igloo, carré de coton et buchette de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole. Une boule en bois et/ou tunnel pourront être ajoutés, en concertation avec le souhait du client) afin de leur permettre de se distraire, d’éveiller leur curiosité et de réaliser un peu d’activité physique. Les animaux seront vus quotidiennement. En cas de signe de mal-être (défini dans la procédure), un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Enfin, l'utilisation de rats et de souris comme modèle de surpoids/obésité est très largement documentée dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), car toutes leurs fonctions biologiques sont alors matures. L'âge des animaux pourra exceptionnellement être inférieur à 7 semaines, si le client souhaite étudier les conséquences du surpoids/obésité juvénile sur l'âge adulte. Dans ce cas, le régime hypercalorique pourra débuter au plus tôt à l'âge de 3 semaines.

Jusqu'à vingt-deux semaines en cage individuelle pour mesurer la consommation de sucre de chaque animal, une chirurgie cérébrale de quarante-cinq minutes, quatre à huit semaines d'antibiotiques puis sept jours de gavage : 3 804 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse post-mortem. Elles ont chaque jour le choix entre de l'eau et une boisson sucrée, quatre ou vingt-quatre heures selon le groupe, et subissent trois prélèvements sanguins. L'objet déclaré est de comprendre l'hyperphagie boulimique en passant par le microbiote intestinal, transféré par gavage d'une souris à l'autre. Le porteur écrit que l'isolement "n'interfère pas avec le bien-être des animaux" dans ses conditions, et annonce dans le même texte des troubles de l'humeur et de la motivation chez les souris consommatrices de boisson sucrée, qu'il compte justement mettre en évidence.

Objectifs

Les troubles du comportement alimentaire se définissent par une relation dysfonctionnelle avec l’alimentation, souvent orientée vers la consommation excessive d’aliments, riches en graisses et en sucres. Ces comportements, au-delà de leur dimension psychologique et comportementale, sont associés à des conséquences sanitaires majeures telles que les maladies cardiovasculaires, l’obésité et le diabète. L’hyperphagie boulimique est le plus prévalent de ces troubles et se caractérise par des épisodes récurrents de perte de contrôle sur la prise alimentaire, mais les mécanismes biologiques sous-jacents demeurent en grande partie méconnus. Des travaux récents mettent en lumière l’importance du microbiote intestinal dans l’émergence et/ou le maintien des troubles alimentaires. Le projet souhaite caractériser les altérations comportementales, cérébrales et du microbiote induites par une consommation excessive de saccharose ; examiner l’impact d’une manipulation ciblée du microbiote sur les comportements alimentaires ; et explorer les interactions entre le microbiote et le cerveau. Ces investigations seront menées sur des souris des deux sexes, afin d’identifier d’éventuelles différences intersexuelles, déjà décrites chez l’humain.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre, au niveau préclinique, comment un régime riche en saccharose altère la physiologie animale, en tenant compte des interactions intestin-cerveau. Les résultats attendus permettront d’approfondir la compréhension des mécanismes biologiques sous-jacents à ce trouble alimentaire. En outre, à long terme, ces travaux précliniques fourniront une base scientifique pour le développement de stratégies hygiéno-diététiques innovantes et mieux adaptées à la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à une chirurgie et des injections pour l'anesthésie (1 chirurgie par animal, durée 45 min; une injection intrapéritonéale d’une durée d’environ 20 secondes). Ils seront également soumis à des traitements chroniques d’antibiotiques (sur 4 ou 8 semaines maximum) et un transfert de leur microbiote intestinal (gavage, 1/jour sur 7 jours, d’une durée d’environ 30 sec). Il y aura des prélèvements de sang à 3 reprises lors du protocole (durée environ 30 sec).

Impact sur les animaux

Consommation excessive de saccharose : les animaux ont le choix entre de l’eau et du sucre tous les jours, pendant 4h ou 24h selon le groupe expérimental. Nous devons évaluer précisément la consommation individuelle de saccharose des souris et nous avons montré que l’isolement nécessaire (au maximum 22 semaines en cage ouverte permettant un contact auditif et olfactif) n’interfère pas avec le bien-être des animaux dans nos conditions. Nous n’avons à ce jour pas mis en évidence de pathologies chroniques dans notre modèle, mais justement, nous poursuivons notre caractérisation et le suivi de différents paramètres afin de suivre l’évolution chez les souris. Nous n’avons pas identifié d’effets sur les seuils nociceptifs. De plus, des troubles de l'humeur et de la motivation sont envisageables chez les animaux consommateurs de boisson sucrée (le but de l'étude est de les mettre en évidence). Lors de l’utilisation de traitement antibiotique, une attention particulière sera portée sur les potentielles pertes de poids et diarrhées. Le gavage intra-gastrique répété (1x/J, 7j) peut conduire à un inconfort léger lié au stress de la contention au moment de l’administration. La chirurgie sur animal anesthésié (1 heure maximum/animal) peut induire de la douleur et une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. Le prélèvement de sang lors du protocole de consommation de saccharose peut induire une douleur légère de courte durée et une inflammation. L’injection d’anesthésique avant la perfusion peut engendrer une douleur aigüe.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

La compréhension des mécanismes de mises en place et des conséquences des troubles du comportement alimentaire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal entier, vigile. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus neuronaux mis en jeu. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines. Il nous est donc impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d'animaux pour permettre des analyses statistiques pour les analyses comportementales et moléculaires et les analyses de l'activité cérébrale. Les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation de tests longitudinaux permettra d’obtenir des informations concernant l’activité des circuits cérébraux lors de l’ensemble de l’exposition au saccharose. De même, les prélèvements d’organes après perfusions permettront de décrire les altérations provoquées par le régime alimentaire autant au niveau cérébral que périphérique.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris sera assurée. De plus, une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (nourriture/saccharose/eau), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours accès à de l’eau. Les souris seront habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire et les souris seront placées sur des tapis chauffants, permettant de maintenir la température corporelle de l’animal durant la procédure en plus de monitorer cette donnée physiologique. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel formé, avec une attention particulière la première semaine post-chirurgicale. L’état de santé des animaux est évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale (ciblant notamment les risques d’inflammation au niveau de la zone opérée et la reprise de poids de l’animal). Des points limites spécifiques ont été définis pour l'état général, la prise alimentaire.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (au moins 8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages ou des injections sous-cutanées, intrapéritonéales ou intramusculaires jusqu'à sept jours par semaine pendant quatre semaines, et un prélèvement sanguin sous anesthésie tous les quinze jours. Le porteur annonce des tests moteurs et comportementaux susceptibles de provoquer un stress léger à modéré et une fatigue passagère, sans préciser lesquels. L'objet réel du projet reste l'évaluation préclinique de quinze produits en cinq ans pour l'industrie agroalimentaire ou pharmaceutique, un passage chez la souris que le porteur qualifie d'"indispensable" pour mesurer les effets sur "l'ensemble de l'organisme".

Objectifs

Les muscles squelettiques assurent de nombreuses fonctions au sein de l’organisme. Aussi, leurs altérations peuvent avoir des répercussions sur la fonction motrice et la qualité de vie des patients. L’industrie du secteur agroalimentaire ou pharmacologique s’oriente vers le développement de produits qui visent à diminuer les états de fatigue ou de faiblesse musculaire. Notre équipe développe un ensemble d’approches expérimentales afin d’évaluer au niveau pré-clinique l’efficacité de nouveaux produits, alimentaire ou pharmacologique, pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. Ainsi, nous envisageons de tester 15 produits en 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à évaluer les effets d’approches thérapeutiques innovantes sur la fonction musculaire chez la souris, dans un objectif de transfert vers des populations humaines souffrant de troubles musculaires, notamment les patients atteints de pathologies neuromusculaires et les personnes âgées présentant une perte de la fonction musculaire. L'utilisation du modèle murin permettra également de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dégradation de la fonction musculaire. Les connaissances acquises contribueront à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et à l'élaboration de stratégies innovantes pour préserver ou restaurer la masse et la fonction musculaire. À terme, les résultats obtenus pourront ainsi déboucher sur le développement de traitements efficaces, améliorant significativement la qualité de vie des patients concernés.

Procédures

(1) Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse - Fréquence maximale : 1 prélèvement tous les 15 jours ; durée : 5 min maximum (pous tous les animaux) (2) Gavage - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par gavage) (3) Injection sous-cutanée - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection sous-cutanée) (4) Injection intrapéritonéale - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection intrapéritonéale) (5) Iinjection intramusculaire sous anesthésie gazeuse : fréquence maximale : 5/7j sur une semaine, 1/7j sur 4 semaines ;- durée : 10 min maximum (pour les animaux traités par injection intramusculaire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus aux modalités d’administration retenues ou aux prélèvements de sang réalisés au cours du protocole. Les nuisances attendues sur les animaux sont : (1) inflammation transitoire au niveau du site d’injection (2) fausse-route ou blessure du tractus digestif dans le cas d’administration par gavage (3) traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang (4) risque infectieux liés à la réalisation de gestes invasifs. Les tests moteurs et comportementaux peuvent induire un stress léger à modéré du fait de la manipulation des animaux et leur isolement temporaire, ainsi qu'un fatigue passagère du fait de la répétition des mesures.

Devenir

A la fin de la durée du traitement, les animaux seront euthanasiés. Plusieurs muscles squelettiques seront ensuite rapidement prélevés pour étudier leur fonctionnalité.

Remplacement

Dans le cadre d’évaluation préclinique d’une nouvelle approche thérapeutique, le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est limité autant que possible, tout en garantissant des résultats fiables. En raison de la variabilité attendue des réponses aux traitements testés, 15 souris par groupe ont été prévues. Ce nombre permet de détecter des différences significatives entre groupes tout en respectant le bien-être animal et en limitant le nombre d'animaux. Il est basé sur nos expériences passées, où des différences de 20 à 30 % entre groupes ont pu être observées avec ce type d’effectif. Plusieurs mesures sont mises en place pour limiter encore le nombre d’animaux : (1) Utilisation de produits déjà connus comme sûrs (2) Choix réfléchi des groupes de comparaison (3) Suivi répété des mêmes paramètres chez chaque animal (4) Réalisation de tests multiples sur les mêmes animaux, sans nuire à leur bien-être (5) Combinaison de tests in vivo et in vitro sur les mêmes animaux (6) Réutilisation des données de groupes témoins dans des expériences similaires (7) Mutualisation des données issues de groupes recevant un produit de référence.

Raffinement

Les nuisances ou effets indésirables attendus étants principalement dus aux modalités d’administration des produits à tester, des méthodes moins stressantes et moins invasives seront utilisées, tout en tenant compte des contraintes liées au composé à tester (solubilité, stabilité, dose/volume…), les objectifs de l’étude et la pharmacocinétique souhaitée : Liste des actions pour réduire la douleur et le stress des animaux liées au traitement : - Conditionnement positif des animaux à la manipulation/méthode d’administration - Utilisation préférentielle des voies orales volontaires (eau de boisson/alimentation) - Remplacement du gavage par la technique d'administration guidée par micropipette dès que possible - Remplacement des injections intrapéritonéales par des injections sous-cutanés, sans contention. Les méthodes utilisées pour étudier la fonction musculaire des animaux sont validées et non invasives, des périodes d’acclimatation et d’habituation sont systématiquement effectuées. Lors de la réalisation des tests, un renforcement positif par récompense est mis en place pour limiter le stress des animaux. Liste des actions pour réduire la douleur et souffrance des animaux liées aux tests d’exploration de la fonction musculaire - Choix de tests non invasifs pour analyse in vivo de la fonction musculaire, - Prélèvement de sang effectué sous anesthésie générale, - Observation quotidienne des animaux : définition de points d’arrêts anticipés pour identification des souris souffrantes (aspect et comportement général, poids…), exclusion du protocole et euthanasie des animaux ayant atteints ces points d’arrêt. Liste des actions pour réduire l’angoisse des animaux tout au long du protocole - condition d’hébergement selon réglementation, - réalisation des tests fonctionnels et prélèvements dans une salle d’expérimentation différente de la salle d’hébergement, - familiarisation des animaux avec dispositifs expérimentaux avant les essais, - renforcement positif : récompense de l’animale suite à la réalisation des essais, - un expérimentateur et un soigneur dédiés.

Choix des espèces

Le modèle animal est le seul permettant une évaluation de la fonction motrice dans sa globalité. Au stade préclinique, ce modèle permet également de voir non seulement les effets d’un composé sur le système ou une fonction d’intérêt mais également les effets sur l’ensemble de l’organisme. La souris est également un bon modèle pour ce type d’étude incluant de nombreux tests in vivo d’exploration fonctionnelle du fait de sa docilité et de son aptitude à effectuer les différents exercices. Aussi, sa longévité en fait un modèle de choix pour l’analyse des conséquences du vieillissement, modèle validé par des études antérieures. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté en fonction de la nature du projet : Souris de 5-6 semaines pour les souris adultes Souris âgées de de 18 à 24 mois d’âge, pour le modèle d’altération lié à l’âge avec une fonte importante de la masse musculaire (degrés d’atteinte en fonction de l’âge retenu).