Oncologie

Déplacées d'un établissement utilisateur à un autre au cours du protocole, 2 914 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 2 458 d'entre elles et modéré pour 456, toutes tuées pour collecte d'organes. Les mâles sont rendus obèses par un régime riche en graisses, avec hyperglycémie à jeun et résistance à l'insuline, et subissent jusqu'à six prélèvements sanguins à la queue, un jeûne de vingt-quatre heures, des gavages de glucose et des injections d'insuline. Les femelles gestantes passent trois échographies sous anesthésie et sont contenues jusqu'à dix minutes chaque jour de leur gestation pour la mesure de la pression artérielle, les fœtus étant analysés en fin de gestation. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ni aucun organoïde ne permet d'étudier l'effet d'un régime alimentaire sur les spermatozoïdes, et qu'un mammifère est requis pour transposer les résultats à l'humain.

Objectifs

De récentes études indiquent que notre mode de vie et notamment un régime alimentaire entraînant une obésité peuvent modifier l’information non-génétique contenue dans les spermatozoïdes, appelée « épigénome ». Cette information peut être transmise à l’embryon lors de fécondations naturelles ou par assistance médicale à la procréation, en cas d’infertilité, et pourrait entraîner des complications pendant la grossesse et des maladies métaboliques chez la descendance. Le projet vise à étudier l’effet du statut nutritionnel et de différents régimes alimentaires en lien avec l’obésité sur le métabolisme des spermatozoïdes et la reproduction masculine chez la souris. Il permettra de mieux comprendre l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses, et le risque de transmission d’informations épigénétiques altérées à la descendance. Il se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre i) l'impact de l’état nutritionnel et du régime alimentaire sur les spermatozoïdes, ii) l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses et iii) l’impact de l’obésité paternelle sur le déroulé de la grossesse. Ceci aura des répercussions à moyen terme importantes d’un point de vue santé publique. Ce projet permettra peut-être d’identifier des biomarqueurs de qualité des spermatozoïdes.

Procédures

Interventions réalisées dans l'EU050: - Prélèvement d'un petit bout de queue sur animaux vigiles une seule fois (durée 10 secondes) - Prélèvements sanguins à la queue sur animaux vigiles 3 à 6 fois. Durée 10 secondes par prélèvement. - Gavage de glucose sur animaux vigiles, une à deux fois, durée 30 secondes. - Injection d’insuline sur animaux vigiles une ou deux fois, durée 30 secondes. - Deux injections d'hormones sur animaux vigiles. Chaque injection dure 30 secondes maximum. Interventions réalisées dans l'EU053: - Anesthésie pour suivi échographique des femelles gestantes. Durée 5 minutes. Fréquence : 3 fois sur toute la grossesse. - Contention d’animaux vigiles pour mesure de la pression artérielle (5 fois avant la gestation, puis tous les jours pendant la gestation). Durée 10 minutes maximum. - Contention d’animaux vigiles pour analyse par imagerie (1 fois, durée: 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les injections, les biopsies de l’extrémité de la queue pour le génotypage, l’administration orale de glucose, les prélèvements sanguins au niveau de la queue et l’anesthésie générale causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention lors de ces actes, lors de la mesure de la tension artérielle et lors de l'imagerie, ainsi que le transfert des animaux d’un établissement à l’autre causent un stress de courte durée. La mise à jeun pendant 24h entraîne un stress modéré sur la durée du jeûne. L’anesthésie générale peut causer une hypothermie et une désorientation au réveil de courte durée. La mise sous régime riche en lipides entraîne une obésité, une hyperglycémie à jeun, une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline entraînent respectivement une hyperglycémie et une hypoglycémie qui sont transitoires sur une période de 2h.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issu de chaque procédure pour collecte d'organes et analyses.

Remplacement

Pour certaines études biochimiques et moléculaires nous utilisons des lignées cellulaires exprimant nos gènes d’intérêt. Dans le cadre de ce projet, il n’est pas possible de contourner l’utilisation de modèles animaux par des méthodes alternatives car il n'existe pas à ce jour d’approches (culture cellulaire ou organoïdes) permettant d’étudier l’impact de l’état nutritionnel ou de régimes alimentaires sur la spermatogenèse et le métabolisme des spermatozoïdes. L’impact du régime alimentaire paternel sur la grossesse ne peut également se faire que grâce à l’utilisation d’un modèle animal mammifère, comme la souris, pour que les résultats soient transférables à l’espèce humaine.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux minimal afin d’obtenir des résultats fiables. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement élaborés afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. L'échographie sera réalisée sous anesthésie générale. Les femelles seront maintenues sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué aux responsables du projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la physiologie, grâce à sa population homogène et à ses similitudes avec la physiologie humaine, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus. Elle est largement utilisée pour simuler des pathologies humaines comme l’obésité et l’infertilité, et mener des études précliniques. La conservation génétique entre la souris et l’homme en fait un modèle privilégié pour étudier la reproduction et le métabolisme. Des souris de 4 à ~33 semaines, femelles et mâles ayant atteint la maturité sexuelle (et une durée maximale de régime alimentaire de 24 semaines) seront nécessaires pour cette étude. Des fœtus seront également analysés à la fin de la gestation.

1 408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 192 d'entre elles et modéré pour 1 216. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau ou dans le côlon sous anesthésie, jusqu'à cinq coloscopies, une dizaine de mesures de tumeur sous isoflurane, de l'oxaliplatine, et pour certaines une greffe de moelle osseuse par injection rétro-orbitale. Le but déclaré est de comprendre pourquoi cette chimiothérapie provoque chez les patients des douleurs des mains et des pieds assez fortes pour leur faire arrêter le traitement. Le porteur écrit surveiller quotidiennement la douleur des souris et exclut du protocole les anti-inflammatoires, la morphine, les gabapentinoïdes et les corticoïdes, ces molécules interférant avec les mécanismes qu'il étudie.

Objectifs

Le traitement de certains cancers, comme celui du côlon,repose en partie sur l’utilisation de chimiothérapie.. Ce traitement peut être efficace, mais il provoque fréquemment des douleurs aux mains et aux pieds, avec une sensibilité accrue au froid ou au toucher. Ces douleurs peuvent devenir très gênantes et forcer certains patients à arrêter leur traitement, même s’il est efficace. On pense que ces douleurs sont causées par une réaction du système immunitaire autour des nerfs. Certaines cellules immunitaires, appelées macrophages, pourraient jouer un rôle clé dans ce processus. Ce projet vise à mieux comprendre ce phénomène chez la souris, en identifiant les facteurs qui favorisent l'apparition ou le maintien de la douleur. Ce projet vise à mieux comprendre ce phénomène chez la souris, en identifiant les facteurs qui favorisent l'apparition ou le maintien de la douleur.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait aider à trouver de nouveaux traitements pour réduire les douleurs liées à la chimiothérapie. Les médicaments actuels sont souvent peu efficaces dans ce contexte. Mieux connaître les mécanismes en cause permettrait d'améliorer la qualité de vie des patients atteints de cancer.

Procédures

Les souris recevront des cellules qui provoqueront une tumeur, ce qui pourrait entraîner des douleurs abdominales modérées. Certaines recevront aussi un traitement anticancéreux pouvant provoquer temporairement une sensibilité accrue au toucher ou au froid. Dans d'autres expériences, certaines cellules du système immunitaire seront supprimées, ce qui peut entraîner une légère perte de poids. L'état de santé des animaux sera vérifié chaque jour pour détecter toute souffrance et intervenir si besoin. Les animaux seront soumis à diverses interventions expérimentales, avec les nombres et durées suivants : l'induction tumorale consiste en une injection unique : pour les tumeurs sous-cutanées (Procédures 1, 7) sous anesthésie (kétamine/xylazine) durant 10-20 minutes ; pour les tumeurs orthotopiques (Procédures 2, 8) sous anesthésie (kétamine/xylazine/atropine) durant 10-20 minutes incluant une endoscopie de 3 minutes. Le suivi tumoral comprend des mesures sous-cutanées (Procédures 1, 5, 7) sous isoflurane (

Impact sur les animaux

La formation de tumeurs peut provoquer des douleurs modérées, surtout au niveau de l’abdomen. Le traitement anticancéreux peut entraîner des douleurs passagères, comme une sensibilité accrue au toucher ou au froid. La perte de certaines cellules immunitaires peut aussi provoquer une perte de poids. Dans certains cas, un inconfort temporaire peut apparaître au niveau des zones d’injection. Cependant, les souris sont généralement euthanasiées 24 heures après l’injection d’oxaliplatine, ce qui limite la durée de ces effets. Le bien-être des animaux sera contrôlé chaque jour à l’aide d’une grille d’observation, et des mesures adaptées seront prises si un signe de souffrance est détecté.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérience pour réaliser les prélèvements de tissus nécessaires à l'étude des mécanismes inflammatoires et douloureux.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour ce projet, car les symptômes étudiés résultent d’interactions complexes entre les nerfs et certaines cellules immunitaires, qu’il n’est pas possible de reproduire en laboratoire sans organisme vivant. De plus, ces effets secondaires sont liés à des réactions physiques (comme une hypersensibilité au froid ou au toucher), qui ne peuvent être observées qu’à l’échelle de l’organisme. Le modèle inclut une induction tumorale afin de reproduire les conditions proches des patients atteints de cancer. Aucune méthode alternative actuelle ne permettrait de répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Le projet est conçu pour limiter le nombre d’animaux tout en assurant la validité statistique des résultats. Les groupes seront composés de 6 à 8 souris, sur la base de données préliminaires et de précédents résultats publiés. Deux types de modèles de tumeur seront utilisés, permettant d’ajuster les doses d’oxaliplatine au fur et à mesure. Dans la mesure du possible, les groupes “sans tumeur” seront mutualisés au sein d’une même expérience, c’est-à-dire utilisés comme contrôles communs pour plusieurs conditions testées simultanément. Cette approche expérimentale permettra de réduire d’environ 20 % le nombre total de souris prévues.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées par du personnel formé dans des conditions limitant le stress. Au maximum, deux manipulateurs différents s'occuperont des animaux tout au long du protocole. Afin de minimiser la douleur, la souffrance et le stress, les animaux seront surveillés quotidiennement selon plusieurs critères, tels que l’apparence physique, les changements comportementaux, la consommation d’eau et de nourriture, ainsi que l’apparition de signes cliniques mesurables. Si besoin, de la gelée nutritive et hydratante sera mise à disposition des animaux pour prévenir tout défaut d’alimentation ou d’hydratation.L’utilisation d’anti-inflammatoires non stéroïdiens ou d’antalgiques opioïdes comme la morphine est exclue, car ces molécules interfèrent directement avec les mécanismes étudiés. Les AINS modifient la neuroinflammation et les profils de cytokines, tandis que la morphine altère l’immunité innée, notamment l’activité macrophagique. D’autres agents à action centrale ou immunomodulatrice (ex : gabapentinoïdes, corticoïdes) sont également exclus pour les mêmes raisons. Les procédures invasives (injections tumorales, greffe de moelle, injections intraplantaires) seront réalisées sous anesthésie générale kétamine/xylazine pour minimiser la douleur via les propriétés analgésiques de la xylazine

Choix des espèces

Les souris utilisées sont choisies pour leur large disponibilité en lignées transgéniques ainsi que pour leur utilisation courante en recherche sur la douleur et l’immunologie. Leur physiologie est bien connue, ce qui facilite l’interprétation et la comparaison des résultats. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8–12 semaines), âge auquel leur flore intestinale est stabilisée et leur système immunitaire mature. Les deux sexes seront utilisés au départ pour évaluer d’éventuelles différences entre mâles et femelles. Par la suite, le sexe retenu dépendra des résultats initiaux : si des différences importantes sont observées, les deux sexes seront maintenus ; sinon, le choix se fera selon la disponibilité des animaux produits et les contraintes expérimentales.

Comprendre pourquoi les hommes obèses sont moins fertiles, et ce que leurs spermatozoïdes transmettent à leur descendance, sert de cadre à ce projet. 2 914 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour collecte d'organes. Rendues obèses, hyperglycémiques et résistantes à l'insuline par un régime riche en lipides suivi jusqu'à vingt-quatre semaines, elles subissent des jeûnes de vingt-quatre heures, des gavages de glucose, des injections d'insuline et d'hormones, jusqu'à six prélèvements sanguins à la queue, et pour les femelles gestantes une mesure quotidienne de pression artérielle sous contention de dix minutes. Sur les effectifs, le porteur écrit s'assurer d'utiliser "le nombre d'animaux minimal", sans donner ni calcul ni détail des groupes derrière ces 2 914 souris.

Objectifs

De récentes études indiquent que notre mode de vie et notamment un régime alimentaire entraînant une obésité peuvent modifier l’information non-génétique contenue dans les spermatozoïdes, appelée « épigénome ». Cette information peut être transmise à l’embryon lors de fécondations naturelles ou par assistance médicale à la procréation, en cas d’infertilité, et pourrait entraîner des complications pendant la grossesse et des maladies métaboliques chez la descendance. Le projet vise à étudier l’effet du statut nutritionnel et de différents régimes alimentaires en lien avec l’obésité sur le métabolisme des spermatozoïdes et la reproduction masculine chez la souris. Il permettra de mieux comprendre l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses, et le risque de transmission d’informations épigénétiques altérées à la descendance. Il se déroulera dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre i) l'impact de l’état nutritionnel et du régime alimentaire sur les spermatozoïdes, ii) l’origine de la diminution de fertilité des hommes obèses et iii) l’impact de l’obésité paternelle sur le déroulé de la grossesse. Ceci aura des répercussions à moyen terme importantes d’un point de vue santé publique. Ce projet permettra peut-être d’identifier des biomarqueurs de qualité des spermatozoïdes.

Procédures

Interventions réalisées dans l'établissement 1 : - Prélèvement d'un petit bout de queue sur animaux vigiles une seule fois (durée 10 secondes) - Prélèvements sanguins à la queue sur animaux vigiles 3 à 6 fois. Durée 10 secondes par prélèvement. - Gavage de glucose sur animaux vigiles, une à deux fois, durée 30 secondes. - Injection d’insuline sur animaux vigiles une ou deux fois, durée 30 secondes. - Deux injections d'hormones sur animaux vigiles. Chaque injection dure 30 secondes maximum. Interventions réalisées dans l'etablissement 2: - Anesthésie pour suivi échographique des femelles gestantes. Durée 5 minutes. Fréquence : 3 fois sur toute la grossesse. - Contention d’animaux vigiles pour mesure de la pression artérielle (5 fois avant la gestation, puis tous les jours pendant la gestation). Durée 10 minutes maximum. - Contention d’animaux vigiles pour analyse par imagerie (1 fois, durée: 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les injections, les biopsies de l’extrémité de la queue pour le génotypage, l’administration orale de glucose, les prélèvements sanguins au niveau de la queue et l’anesthésie générale causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention lors de ces actes, lors de la mesure de la tension artérielle et lors de l'imagerie, ainsi que le transfert des animaux d’un établissement à l’autre causent un stress de courte durée. La mise à jeun pendant 24h entraîne un stress modéré sur la durée du jeûne. L’anesthésie générale peut causer une hypothermie et une désorientation au réveil de courte durée. La mise sous régime riche en lipides entraîne une obésité, une hyperglycémie à jeun, une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline entraînent respectivement une hyperglycémie et une hypoglycémie qui sont transitoires sur une période de 2h.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issu de chaque procédure pour collecte d'organes et analyses.

Remplacement

Pour certaines études biochimiques et moléculaires nous utilisons des lignées cellulaires exprimant nos gènes d’intérêt. Dans le cadre de ce projet, il n’est pas possible de contourner l’utilisation de modèles animaux par des méthodes alternatives car il n'existe pas à ce jour d’approches (culture cellulaire ou organoïdes) permettant d’étudier l’impact de l’état nutritionnel ou de régimes alimentaires sur la spermatogenèse et le métabolisme des spermatozoïdes. L’impact du régime alimentaire paternel sur la grossesse ne peut également se faire que grâce à l’utilisation d’un modèle animal mammifère, comme la souris, pour que les résultats soient transférables à l’espèce humaine.

Réduction

Nous nous assurons d'utiliser le nombre d'animaux minimal afin d’obtenir des résultats fiables. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement élaborés afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. L'échographie sera réalisée sous anesthésie générale. Les femelles seront maintenues sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué aux responsables du projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en œuvre. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour étudier la physiologie, grâce à sa population homogène et à ses similitudes avec la physiologie humaine, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus. Elle est largement utilisée pour simuler des pathologies humaines comme l’obésité et l’infertilité, et mener des études précliniques. La conservation génétique entre la souris et l’homme en fait un modèle privilégié pour étudier la reproduction et le métabolisme. Des souris de 4 à ~33 semaines, femelles et mâles ayant atteint la maturité sexuelle (et une durée maximale de régime alimentaire de 24 semaines) seront nécessaires pour cette étude. Des fœtus seront également analysés à la fin de la gestation.

Un animal qui suffoque, tremble ou présente des troubles respiratoires après l'injection du produit ototoxique est aussitôt anesthésié puis tué. 550 rats et 300 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus. Un composé chimique est injecté à travers le tympan sous anesthésie générale pour détruire les capteurs de l'équilibre, ce qui provoque vertiges, pertes d'équilibre, perte de poids et parfois ulcère de la cornée par lésion du nerf facial. Le porteur prévoit des tests comportementaux aux jours 1, 2, 3, 4, 7, 10, 15, 21 et 30 après la lésion, quinze minutes par séance, sans jamais préciser lesquels.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les conséquences d’une atteinte des capteurs vestibulaires de l’équilibre situés dans l’oreille interne. L’objectif est d’identifier les mécanismes responsables des troubles de l’équilibre et ceux qui permettent une récupération naturelle, appelée « compensation vestibulaire ». Les recherches s’organisent autour de plusieurs thématiques : • Comprendre comment les noyaux vestibulaires situés dans le tronc cérébral s’adaptent après une lésion vestibulaire. Tester si la restauration de l’équilibre après lésion vestibulaire peut être améliorée grâce à des médicaments ou des exercices de rééducation. • Étudier la capacité naturelle des capteurs vestibulaires de l’oreille interne à réparer leurs connexions après une atteinte. • Explorer l’impact du vieillissement sur ces capteurs et son lien avec les troubles de l’équilibre liés à l’âge. • Analyser les variations hormonales associées aux lésions vestibulaires afin de déterminer leur rôle dans l’apparition et l’évolution des symptômes vestibulaires. Ces travaux permettront de mieux cerner les mécanismes biologiques à l’origine des troubles de l’équilibre et d’ouvrir de nouvelles pistes pour améliorer leur traitement et leur prise en charge.

Bénéfices attendus

Utilisation du modèle animal de vestibulopathie pour mieux comprendre la physiopathologie vestibulaire. L’objectif étant d’améliorer les processus de rééducation et traitements pharmacologiques anti vertigineux de manière à les rendre plus efficace pour une meilleure prise en charge du patient vestibulaire.

Procédures

Injection d’une solution chimique à travers le tympan sous anesthésie générale pour induire le syndrome vestibulaire (vertige, déficits de la posture et de la marche) : de 5 à 10 min. Test comportementaux aux Jours 1, 2, 3, 4, 7, 10, 15, 21 et 30 après la lésion vestibulaire: 15 min par session. Chirurgie sans réveil (Perfusion intracardiaque) pour les prélèvement d’organes d'intérêts.

Impact sur les animaux

Souffrances inévitables : L’introduction d’un liquide dans l’oreille moyenne (composé ototoxique utilisé pour la lésion vestibulaire) peut être source d’inconfort. Les déficits vestibulaires conduisent à des effets indésirables tels que des problèmes de maintien de la posture, une perte d’équilibre et de la fatigue. Nuisances potentielles : Les animaux soumis à une lésion vestibulaire peuvent avoir un déficit d’hydratation dans les 24-48 heures après l’atteinte vestibulaire. Une perte de poids est attendue chez les animaux après la lésion vestibulaire en conséquence de la chirurgie et des problèmes d’équilibre majeurs présents les premiers jours. Les tests comportementaux peuvent être source de stress pour les animaux car ils sont séparés temporairement de leurs congénères (5 à 10min). Autres nuisances possibles : perte d’appétit, instabilité posturale, absorption possible des composés ototoxiques par voie orale (via la trompe d’Eustache), ulcère de la cornée en raison d’une possible lésion du nerf facial, saignement depuis la cavité tympanique ou apnée aiguë pendant l’administration des composés ototoxiques entraînant le décès de l’animal. Nuisances potentiellement générées par les prélèvements sanguins : œdème

Devenir

La totalité des animaux du projet (rat n=550 ; souris n=300) seront mis à mort afin de récupérer les tissus d’intérêts pour des analyses biologiques.

Remplacement

Il existe des alternatives n’utilisant pas de modèles animaux telles que la méthode in silico ou encore in vitro. La méthode in silico utilise des modèles informatiques dans le but de prédire ce qui se passerait dans la réalité. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle informatique mimant de manière aussi complexe la physiologie et la physiopathologie du syndrome vestibulaire. Un autre modèle serait le modèle in vitro qui consiste en l’étude d’éléments hors de leur environnement en conditions définies et contrôlées. Puisque nous avons besoin de l’individu dans son ensemble, autant au niveau cérébral qu’au niveau périphérique (informations quant à la posture, au barycentre et concernant l’état d’anxiété de l’animal), nous ne pouvons pas substituer le modèle animal par ces modèles.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été fixé avec l’aide d’un statisticien du laboratoire. Nous avons utilisé un logiciel approprié nous permettant de calculer la puissance statistique pour atteindre les résultats escomptés, tout en maintenant un nombre d’animaux le plus faible possible. Dans une approche de réduction, les mêmes animaux serviront à la fois pour les tests comportementaux, les prélèvements sanguins et l’analyse des tissus vestibulaires.

Raffinement

Avant l’administration d’une solution chimique à travers le tympan pour induire les déficits vestibulaires, les animaux sont sous anesthésie générale. La température de l’animal est maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée, et une solution d'hydrogel est appliquée sur les yeux pour l’hydratation oculaire. Avant le réveil de l’animal, une solution sera injectée pour sa réhydratation et ainsi compenser les pertes liquidiennes liées à la chirurgie. Les biberons des cages des animaux seront équipés d’une pipette allongée et une solution nutritionnelle complète sera fournie dans la cage des animaux pour faciliter l’hydratation et l’alimentation durant la première semaine post-lésion. La douleur et l’état de santé des animaux seront évalués grâce à une grille d’observation qui prend en compte leur apparence, leur comportement, leur hydratation et d’éventuels signes cliniques. • Si l’animal présente un comportement normal, il poursuit l’expérience. • En cas de signes légers, une surveillance renforcée est mise en place et un traitement contre la douleur peut être donné. • Si des signes de souffrance apparaissent, un traitement contre la douleur adapté est administré et un avis extérieur est demandé pour décider de la suite de l’expérimentation. • En cas de souffrance sévère, l’expérience est immédiatement arrêtée et l’animal est endormi puis mis à mort. Certains signes graves entraînent aussi un arrêt immédiat, comme une perte de poids importante, de fortes difficultés motrices ou respiratoires, ou encore des complications liées à la lésion. Par exemple, si des substances utilisées lors de la lésion vestibulaire provoquent une réaction aiguë (suffocation, tremblements, troubles respiratoires), l’animal est aussitôt anesthésié et mis à mort pour éviter toute souffrance. Les animaux sont habitués à l’expérimentateur et à la salle d’expérimentation pendant 1 à 2 semaines pour limiter le stress. Une récompense (riz soufflé chocolaté) est donnée aux animaux après les tests comportementaux avant leur retour dans l’animalerie. L’hébergement des animaux se fait en groupe pour limiter le stress. Nous vérifierons après chaque prélèvement sanguin si un œdème se présente. Une pression sur la queue de l'animal sera réalisée après chaque prélèvement pour faciliter la coagulation et éviter un saignement. L'animal sera surveillé pendant 5min avant de le remettre dans sa cage et du riz soufflé chocolaté lui sera donné en récompense.

Choix des espèces

Le modèle rat présente de nombreux avantages en termes de manipulation et de coût et il reproduit le syndrome vestibulaire rencontré chez l’homme. Le choix de ce modèle pour les expérimentations sur l’axe Compensation et Hormones relève du souhait de bénéficier des expérimentations réalisées et validées précédemment dans l’équipe. Le modèle souris de déafférentation du vestibule a été précédement développé par notre équipe. Le choix du modèle souris a été priorisé avec l’objectif d’utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées. Le modèle TTK souris a permis d’identifier les acteurs impliqués dans le processus de réparation des synases vestibulaires endommagées et dans les processus de restauration fonctionnelle qui en résultent. Nous souhaitons poursuivre les études sur ce même modèle afin de bénéficier des avancées initialement publiées. Le choix du modèle souris pour les expérimentations sur le vieillissement relève du même souhait de bénéficier des expérimentations réalisées sur la souris adulte. Pour étudier la plasticité post-lésionnelle du système nerveux, les rats et les souris utilisés seront âgés d'au moins 3 mois (jeunes adultes), âge auquel le système nerveux est considéré comme mature. Selon les courbes de poids, le poids des rats mâles sera compris entre 300 et 350g, tandis que celui des femelles sera compris entre 200 et 250 g au début des expérimentations. Pour les souris le poids sera compris entre 15 et 35g. Pour l’Axe « AGING », des souris de différents âges seront utilisées (3-6-18-24 mois) afin de suivre l’expression âge-dépendante du BDNF dans le cerveau.

142 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées par prélèvement terminal sous anesthésie sans réveil. Des souriceaux au microbiote défini reçoivent jusqu'à six administrations orales, jusqu'à cinq administrations rectales sous anesthésie et jusqu'à cinq injections dans l'abdomen, parfois précédées d'un traitement antibiotique. Cinq stratégies de colonisation par des archées méthanogènes sont mises en concurrence, la plus efficace étant ensuite reproduite deux fois pour en mesurer la variance, ce qui revient à mettre au point un modèle avant toute question biologique. Le porteur reconnaît utiliser des lignées cellulaires et des organoïdes pour explorer le même sujet, et conclut malgré tout qu'il n'existe "pas de méthodologie alternative".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle de colonisation des archées dans le tractus intestinal de souris au microbiote défini Oligo-MM12 (OMM12). Ce modèle va permettre l’étude de l’impact de la colonisation sur la physiologie intestinal et immunitaire de l’hôte. De plus, grâce à la grande stabilité intrinsèque du microbiote OMM-12, nous pourrons examiner quels sont les conséquences des archées sur la communauté microbienne tant en termes de stabilité, d’abondance ainsi que des modifications du métabolisme lié à l’hydrogène. Afin d’atteindre cet objectif, nous allons tester 5 stratégies de colonisation des souris avec les archées intestinales : 1.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux OMM-12 2.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux axéniques 3.Etude de la colonisation chez les souriceaux OMM-12 par des archées et une bactérie syntrophique 4.Etude de la colonisation chez les souriceaux OMM-12 par des archées et une bactérie syntrophique avec l’aide d’un traitement antibiotique 5.Etude de la colonisation des archées chez les souriceaux OMM-12 avec 5 gavages Enfin, après avoir sélectionné l’approche la plus efficace pour la colonisation des archées, nous la reproduirons deux fois indépendamment afin d’en évaluer la reproductibilité et la variance (Etude 6).

Bénéfices attendus

Les données obtenues permettront d’établir un modèle murin de colonisation avec des archées méthanogènes dans un microbiote définit. Ces études permettront de mieux comprendre les déterminant de la colonisation des archées intestinales chez la souris et par extension chez l’humain (dynamique temporelle, impact des bactéries, régime alimentaire). A ce jour, différentes publications montrent des corrélations entre la présence des archées et différentes pathologies chez l’humain mais il n’existe pas de modèle permettant d’étudier les interactions archées-microbiote-hôte. Grâce à ce modèle nous pourrons étudier par la suite le rôle de ces micro-organismes, uniques en termes de structures et de métabolisme, dans le contexte de maladies inflammatoires de l’intestin et d’allergie.

Procédures

- Administrations orales : 1 à 6 fois par une solution non-irritante, chaque administration durant moins d’une minute. - Administrations rectales : 1 à 5 fois par une solution non-irritante, chaque administration durant moins d’une minute. - Injection par voie intrapéritonéale : 1 à 5 lors des administrations rectales, quelques secondes

Impact sur les animaux

Un premier essai de colonisation dans les souris OMM-12 adultes a montré que le gavage par des archées méthanogènes n’induit pas d’effet indésirable comme la perte de poids ou une augmentation du stress des animaux. L’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires pour les administrations et les prélèvements induisent une douleur et un inconfort de courte durée. Le gavage effectué conformément aux bonnes pratiques de gestion des animaux, peut causer un inconfort léger de courte durée. Les administrations rectales seront réalisées sous anesthésie ce qui limitera le stress des animaux et ne devrait pas induire d’effet indésirable au-delà de l’anesthésie elle-même.

Devenir

Les souris seront mises à mort en fin de procédure afin de procéder aux prélèvements terminaux, effectués en fin de procédures et sous anesthésie, ne permettant pas leur réveil. Ces prélèvements sont nécessaires pour évaluer la colonisation des bactéries étudiées et analyser l’impact sur la physiologie de l’hôte.

Remplacement

Nous utilisons des stratégies de remplacements in vitro en utilisant des lignées cellulaires et des organoïdes afin d’explorer le rôle des archées intestinales sur l’inflammation et la barrière intestinale. Cependant ces modèles de remplacement son limité et ne permettent pas d’étudier les interactions complexes entre le microbiote et l’hôte. Toutefois, l’utilisation d’un modèle murin est nécessaire pour tester notre hypothèse car il n’existe pas de méthodologie alternative permettant d’analyser les interactions hôtes-microbiotes dans le contexte intestinal.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux dans les différentes études, nous n’entreprendrons certaines études du projet uniquement si elles sont pertinentes scientifiquement. Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’outil de modélisation statistique (Shade) et les conseils d’une statisticienne. Le nombre d’animaux est limité au stricte nécessaire et suffisant pour déterminer si la colonisation des archées est réussie. Des tests statistiques seront menés afin de valider l’impact sur le poids des souris, la stabilité de la colonisation, de quantifier les potentielles modifications du microbiote et de déterminer la variance du modèle. Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à pris en compte grâce à des modèles emboîtés (modèles mixtes) tels que l’effet portée, microbiote, cage et répétition de l'expérience.

Raffinement

Les procédures expérimentales de ce projet sont légères ou modérées du fait de la répétition des injections. Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une évaluation régulière des animaux et à la mise en place de points limites pertinents. Le gavage et l’administration rectale seront pratiqués avec du matériel adapté : sondes de gavage souples adaptées à l’âge de souris et à usage unique. Cela permettra de réduire significativement les nuisances liées aux gestes techniques eux-mêmes. De plus, si la colonisation fonctionne avec une seule administration, les autres administrations ne seront pas pratiquées. Pour certains gestes, l’anesthésie sera aussi utilisée D’après les données provenant d’expériences précédentes, l’administration des antibiotiques dans l’eau de boisson ne provoque pas de nuisances chez les animaux.

Choix des espèces

L'utilisation d'un modèle murin nous permet d'analyser l'interaction des trois composants : le microbiote, les archées et la réponse de l’hôte. Il n’est pas possible de mener cette étude en utilisant les poissons zèbres ou des invertébrés car ceux-ci ne possèdent pas de microbiote anaérobie similaire aux humains et ni les conditions physico-chimiques nécessaires à la vie des archées méthanogènes. Les souris auxquelles nous allons recourir seront des souriceaux à la naissance que nous suivrons entre la période postnatale et la période adulte (6-10 semaines) ainsi que des adultes.

Tuées pour la plupart afin de prélever pancréas, foie, muscles et tissu adipeux, 885 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une centaine devant être réutilisées ailleurs ou cédées à d'autres équipes. Elles sont obèses et diabétiques, par lignée, par régime gras ou par destruction chimique de leurs cellules pancréatiques, et reçoivent jusqu'à une injection intrapéritonéale par jour pendant trois semaines. La mesure de la glycémie exige une petite incision de la veine caudale tous les deux jours, plusieurs fois par heure les jours de test de tolérance, et le porteur décrit une polydipsie qui peut multiplier par dix la prise de boisson. Il conclut qu'il n'existe "aucun modèle non animal utilisable" pour ces études, les inconnues étant selon lui trop nombreuses pour bâtir un modèle informatique fiable.

Objectifs

Le diabète et ses conséquences métaboliques sont de plus en plus répandus, touchant des millions de personnes dans le monde, et souffrent encore d’un manque de traitements pharmacologiques efficaces. Un diabète non maîtrisé, peut, au fil du temps, provoquer de graves lésions cardiaques, vasculaires, oculaires, rénales et nerveuses. Les cellules béta-pancréatiques sont au cœur du problème, car elles ne fournissent pas suffisamment d’insuline aux organes pour éviter la maladie, en raison de leur défaillance, mais aussi de leur destruction. Malgré les efforts de recherches, peu d’options thérapeutiques sur le traitement des cellules Bêta sont disponibles. Récemment, 2 composés peptidiques biomimétiques (1 et 2) développés par notre laboratoire, et visant à protéger les cellules bêta et à maintenir leur fonctionnement, ont démontré leur efficacité et leur non-toxicité à travers plusieurs approches in vitro. Ainsi, notre objectif est de tester l’efficacité in vivo de ces 2 composés peptidiques chez 4 modèles d’animaux diabétiques différents. Procédure 1 : test du composé 1 chez un modèle de souris obèse et diabétique de type 2. Procédure 2 : test du composé 2 chez deux modèles de souris diabétiques (type 1 pour l’un et type 2 pour l’autre), procédure 3 : test des 2 composés chez un modèle de souris rendues obèses et diabétiques suite à une alimentation riche en graisse, procédure 4 : test du composé 2 dans un modèle de souris rendue diabétique de type 1 suite à la destruction des cellules bêta pancréatiques. Aussi, pour améliorer l’adhésion au traitement, nous prévoyons de formuler ces nouvelles molécules pour pouvoir les administrer par voie orale. Pour ce faire, nous utiliserons les propriétés d’un polysaccharide issu d’une algue brune, l’alginate, que nous réduirons sous la forme de nanoparticule, une taille permettant de mieux encapsuler les molécules. Notre maitrise dans ce domaine, confirme que les nanoparticules d’alginate sont un adjuvant efficace pour encapsuler les substances et les délivrer à leur organes cibles. L’objectif de cette demande est de déterminer l’effet de ces deux composés associés ou pas avec l’alginate sur l’amélioration de l’état diabétique de modèles murins diabétiques et obèses. Cette étude sera réalisée sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Le diabète et l’obésité représentent un véritable enjeu de santé publique, ces pathologies étant classées parmi les urgences sanitaires actuelles du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. À ce jour, peu d’options thérapeutiques restent disponibles pour traiter ou ralentir l’évolution de ces pathologies et de leurs complications. L’étude, le développement et la caractérisation de nouvelles cibles et de nouveaux agents pharmacologiques apparaît donc primordial afin de remédier à ce besoin médical non satisfait. L’exploitation de molécules protégeant les cellules bêta pancréatiques et potentialisant leur fonctionnement est prometteuse dans le développement d’un traitement anti-diabétique. Grâce aux nanotechnologies, et dans une vision de gestion durable et biologique, dont les avancées permettent d’améliorer et d’optimiser la délivrance des médicaments (peptide/nanoparticule), nous utiliserons l’alginate, un polysaccharide naturel provenant d’une algue brune comme nanoparticule. L’alginate est déjà utilisé dans le milieu industriel comme adjuvant et comme excipient de médicaments.

Procédures

Le type d'intervention se limite à des injections intra-péritonéales, et des prélèvements sanguins au niveau de la queue pour mesurer la glycémie. La mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre nécessite une petite incision au niveau de la veine caudale pour prélever une quantité de sang d’environ de 2 à 2,5 μL. Ce type de prélèvement dure 3-4 secondes. Les injections s'effectueront sur une durée de 3 semaines, selon une fréquence pouvant aller au maximum jusqu'à 1 fois/jour. Pour chaque injection, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes. La mesure de la glycémie se fera à une fréquence une fois tous les 2 jours sauf lors des tests de tolérance au glucose ou les tests de tolérance à l'insuline, où dans ce cas s'effectueront à plusieurs reprises dans un temps limité de 2h ou 1h30 respectivement. Il est également prévu de mesurer l'insuline et les triglycérides en prélevant 20 μl et 50μl de sang, respectivement de la queue, une fois par semaine et lors des tests de tolérance.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses et des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que ces pathologies ne soient pas des points limites, les conséquences qu’elles engendrent peuvent être une source de dérèglements internes, tels que une hyperphagie, polydipsie, un problème de thermorégulation, une hyperlipémie et une augmentation des productions hormonales de la glande hypophyse et des glandes surrénales. Ces désordres métaboliques entrainent une polyurie et une activité physique amoindrie. Ainsi les risques de déshydratation sont très importants chez les animaux diabétiques et nécessite une attention particulière. Pour le modèle d’obésité, une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peut également entraîner le développement passager de dermatite. Enfin, pour les souris dont le diabète de type 1 est induit (procédure 4), un état d’inconfort et de douleur peut être identifié suite au développement de la maladie et de l’hyperglycémie. Il peut s’ensuivre un arrêt de la croissance pondérale, voire une perte de poids, une hypoinsulinémie, une polydipsie (la prise de boisson pouvant être multipliée par 10), une polyurie et une hyperphagie.

Devenir

Tous les animaux diabétiques et certains de leur contrôles seront utilisés dans les procédures et seront pour la majorité mis à mort pour le prélevement d'organes (pancréas, foie, muscles; tissu adipeux). Les animaux non euthanasiés pourront éventuellement être réutilisés dans d'autres procédures. Par exemple, pour les groupes contrôles, ils pourront être communs à plusieurs études non refaites, voire si possibilité, être donnés à d'autres groupes.

Remplacement

Ce projet propose des substances novatrices pour lesquelles les informations ne sont pas encore disponibles dans la littérature. Bien que le remplacement par des alternatives non animales, telles que les lignées cellulaires ou organoïdes, soient un atout précieux pour la recherche, ces dernières ne peuvent reproduire la physiologie intégrative complexe présente chez la souris, qui est étroitement liée à celle de l'homme. En raison de la grande complexité des troubles physiopathologiques du diabète et de l’obésité et de leur intégration complexe dans l’organisme, les inconnues sont trop nombreuses pour créer des modèles informatiques fiables. Par conséquent, il n'existe aucun modèle non animal utilisable pour ces études.

Réduction

Des expériences in vitro préalables ont été effectuées dans le but de déterminer les conditions optimales de délivrance des molécules, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, 5 animaux par groupe expérimental sont nécessaires. Une réduction de ce nombre pourrait être problématique car quelques animaux peuvent être perdus au cours des expériences (pour cause de mort naturelle). Des études précédentes sur les souris spontanément diabétiques montrent que l’utilisation d’un minimum de 14 à 16 animaux (soit un triplicat d’expériences avec 5 souris/groupe) par groupe de traitement est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des effets significatifs sur la glycémie. Le nombre de souris sera également limité puisque l’établissement d’un profil métabolique et l’isolement post-mortem des organes cibles s’effectuera sur un même individu. Enfin, dès que possible, le groupe contrôle sera commun à plusieurs études non refaites.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures de raffinement seront mises en œuvre pour minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par l’utilisation systématique d’analgésiques et d’anesthésiques adaptés, la surveillance accrue des animaux avec des points limites spécifiques, ainsi que par l’enrichissement de leur environnement pour favoriser leur bien-être physique et social. Les animaux seront hébergés par groupe de 5, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de tunnels et de matériaux de nidification. Un suivi quotidien sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Les animaux étant diabétiques, leurs cages seront changées tous les jours afin d'éviter les désagréments causés par le syndrome polyuro-poydipsique. Les nids préalablement construits par les animaux seront éventuellement remis dans leur nouvelle cage pour plus de confort et de sentiment de sécurité. Les points limites sont les suivants : troubles du comportement ; signes d’absence de toilettage (poil hirsute, pelage sale) ; perte de poids de 15 % à 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.

Choix des espèces

Les caractéristiques morphologiques, physiologiques, endocriniens et inflammatoires de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de la conception d’un dispositif de délivrance de molécules à visée thérapeutique. Les animaux atteints du diabète de type 2 ou diabète de type 1 utilisés dans le projet (souris db/db, souris sauvages soumises à un régime HFD, souris NOD souris sauvages traitées par la Streptozotocine) sont les modèles standards couramment employés pour étudier l’efficacité thérapeutique de la méthode (baisse de la glycémie recherchée). Il est important de travailler avec des animaux dont le stade de développement est terminé, sans pour autant travailler avec des animaux trop âgés pour ne pas biaiser les résultats. Ainsi, les protocoles démarreront avec des souris âgées d’au moins 5-6 semaines pour les souris db/db et les souris C57Bl6N. Pour le modèle des NOD, il sera préférable de travailler avec des souris agées de 12 semaines minimum.