Système endocrinien

Une pince arrache une petite touffe de poils à chaque animal, souriceau compris, pour vérifier que la modification génétique a bien pris. 1 225 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec un traitement d'induction administré dès l'âge de un à sept jours ou à des femelles gestantes et allaitantes, six prélèvements sanguins sur les jeunes, des immobilisations en tube de moins de trois minutes et deux injections dans la semaine précédant la mise à mort. Le porteur compare la douleur de l'arrachage de poils à "celle des interactions sociales entre deux souriceaux". Toutes seront tuées pour que leurs os soient examinés en histologie et que le taux d'inactivation du gène cible soit mesuré.

Objectifs

La croissance chez l’humain est un phénomène complexe, influencé à la fois par la génétique, l’épigénétique, l’environnement et les interactions entre ces facteurs. Les mécanismes régulant ce développement ne sont pas tous complètement connus notamment lorsque leurs dérégulations conduisent à des retards de croissance. Une meilleure compréhension des causes de déficits de croissance chez l’enfant en période périnatale permettrait à la médecine de mieux accompagner les familles concernées par ce problème chez leurs enfants et de leur proposer un traitement adapté le cas échéant. L’axe hormonal somatotrope coordonne la croissance fœtale, post-natale, le métabolisme, et le vieillissement chez les humains ainsi que chez les rongeurs. L’inactivation de cet axe hormonal impacte la durée de vie et affecte l’ossature globale des souris en conduisant à de petites tailles. La possibilité de provoquer un retard de croissance en période périnatale au sein d’un modèle animal permettra de mieux définir d’éventuelles pistes thérapeutiques dans le contexte de la croissance de l’enfant. Notre projet vise donc à contribuer à la compréhension de l’impact de l’axe hormonal somatotrope sur la croissance périnatale.

Bénéfices attendus

Cette étude renforcera les connaissances de bases sur les défauts de croissance osseuse observés chez les enfants qui ont un faible poids de naissance et conservent un retard de croissance. Dans la population, le petit poids de naissance représente 9 pourcents de l’ensemble des naissances. Leur croissance est le plus souvent rattrapée dans les deux premières années de vie, mais seulement 10 pourcents de ces enfants restent petits. Cette étude montrera le rôle essentiel des facteurs de croissance dans la croissance osseuse. Les connaissances acquises grâce à ces travaux seront utiles en clinique pour proposer de nouveaux traitements contre les retards persistants de croissance chez l’enfant.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement afin d’induire la modification génétique. Plusieurs modes d’administration et stades de développement au moment de l’administration seront possibles selon la question scientifique : par l’alimentation (prise spontanée durant 1 à 3 jours), par injection selon différentes voies (pendant 3 jours, 10 secondes sur animal vigile), par administration orale (1 fois par jour pendant 3 jours, 10 secondes sur animal vigile). Tous les animaux se verront prélever une petite touffe de poils pour la vérification de l’induction du modèle à l’aide d’une pince (animal vigile, quelques secondes par animal). Les animaux seront ensuite pesés/mesurés régulièrement pour suivre la croissance. Les animaux seront impliqués dans une détermination longitudinale de composition corporelle (masse grasse, masse maigre, eau) à l’aide d’un équipement d’imagerie en plaçant l’animal vigile dans un tube et en l’immobilisant durant moins de 3 minutes. Certains jeunes animaux subiront des prélèvements sanguins de faible quantités (6 fois, moins de 30 secondes, animal vigile). D’autres prélèvements sur adultes seront effectués sur 2 mois afin de réaliser des dosages hormonaux (4 fois, moins de 30 secondes, animal vigile - espacés de 2 semaines entre chaque prélèvement). Une semaine avant l’euthanasie, une partie des animaux recevront deux injections espacées d’une semaine nécessaire pour visualiser la croissance osseuse (animal vigile, quelques secondes par animal). Enfin, une partie des animaux subiront une injection unique au niveau de l’abdomen quelques minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

Le traitement nécessaire à l’induction du modèle implique l’administration d’une molécule aux animaux. Ainsi, une contention est nécessaire, ce qui peut entrainer un léger stress et une douleur/irritation de courte durée au site d’administration. En cas de répétition des injections, il y a un risque (rare) de péritonite. La prise d’aliments contenant cette molécule pourra aussi être source d’un léger stress lors du changement d’aliment car les souris sont de nature néophobe (peur de la nouveauté) et une perte de poids. Les prélèvements de sang nécessaires aux dosages d’hormones seront source d’un stress et d’une douleur de courte durée. Un risque de saignement ou d’hématome existe à l’issu du prélèvement. Le prélèvement de poils pour la vérification de l’induction du modèle sera effectué par prise de très petites touffes de poils. Ce type de prélèvement induit une légère douleur similaire à celle des interactions sociales entre deux souriceaux. Les animaux seront impliqués régulièrement dans un suivi impliquant une pesée, une mesure de la taille, une mesure de la composition corporelle, ce qui pourra induire un stress de courte durée lié à la contention manuelle ou dans un tube pour maintenir l’animal (inférieur à 3 minutes). Une semaine avant l’euthanasie, une partie des animaux recevront deux injections espacées d’une semaine nécessaire pour visualiser la croissance osseuse. Ces deux injections peuvent induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre. Enfin, l’anesthésie précédant certaines euthanasies implique une injection pouvant induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issue des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour l’étude histologique ou biochimique des tissus osseux. La récupération des tissus post-mortem permettra une analyse des taux d’inactivation du gène cible.

Remplacement

Ce projet a pour but d’étudier comment les différents organes communiquent lors de la croissance d’un individu. Pour cela, il utilise un organisme vivant et complet, qui permet de modéliser la croissance humaine. En effet, aucun modèle cellulaire ne peut reproduire les interactions complexes entre les organes d’un corps entier. Les souris sont choisies pour ce projet car leur croissance est influencée par des facteurs hormonaux similaires à ceux des humains. Elles permettent donc de mieux comprendre la croissance, notamment en observant l’impact de l'arrêt de certains gènes dans un contexte hormonal. L’utilisation de modèles vivants (in vivo) est essentielle, car seule cette approche permet de suivre l’effet des hormones sur la croissance. En plus, les recherches sur les souris bénéficient d’outils et de protocoles bien établis. Les études faites sur ces animaux ont permis d’obtenir des informations cruciales sur le fonctionnement des organes, que l’on ne pourrait pas obtenir à partir de cellules seules, car elles manquent de régulation hormonale.

Réduction

Le projet impliquera un total de 1225 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte-tenu des données de la littérature et des effets espérés, un test de puissance statistique a été́ utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour cette étude. Des tests statistiques seront également utilisés pour les analyses des résultats. Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Les procédures expérimentales sont affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. L’utilisation de l’ensemble des animaux issu d’une portée qui inclue les mutants et les contrôles permet de réduire substantiellement le nombre de souris nécessaire pour l’étude proposée. Le nombre d’animaux par groupe testés dans chaque expérience nous permettra donc une comparaison statistique adaptée tout en tenant compte des impératifs de réduction.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi en continu à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures et nos gestes expérimentaux afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive des naissances et de la croissance post-natale. Les pesées seront réalisées dans les premiers jours de vie par préhension avec les mains en forme de coupelle pour minimiser le stress de l’animal. Nous avons inclus dans les protocoles de mesure de croissance une grille d’évaluation des animaux, incluant des observations cliniques et le suivi de poids des animaux. Nous prenons soin de constituer des groupes où des individus de petite taille sont accompagnés d’individus de taille normale afin d’assurer une bonne maintenance de leur température corporelle. Les animaux fragiles identifiés seront soumis à une vigilance accrue et des décisions appropriées seront prises afin de minimiser une éventuelle douleur de l’animal. Des soins adaptés quand cela est possible/nécessaire seront prodigués voire une euthanasie compassionnelle si cela est requis. Les administrations seront réalisées avec du matériel adapté à l’âge des animaux et par du personnel formé/compétent pour les actes mis en œuvre.

Choix des espèces

JJustification de l’espèce : Le récepteur aux facteurs de croissance est spécifique des mammifères et ne permet pas l’utilisation d’autres organismes plus simples. La régulation de la croissance chez la souris est similaire à celle de l’homme. Dans une étude intégrée des phénomènes de perturbation de la croissance, la souris représente un modèle idéal puisqu’elle est un des seuls mammifères qui permet assez facilement une approche par transgénèse avec élaboration de modèles génétiques complexes. Justification des stades de développement : Les traitements au tamoxifène seront initiés sur des animaux âgés de 1 à 7 jours, ou sur des femelles de 2 mois allaitantes ou gestantes. Nous analyserons les effets de ce traitement sur les premières phases de croissance pré-pubertaire. Le suivi des animaux sera poursuivi sur 6 mois au maximum. L’objectif du projet est d’étudier les répercussions sur la morphologie de la structure osseuse dès les premiers jours de vie et jusqu’à l’âge adulte.

304 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer de la glande surrénale vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 192 d'entre elles sont gavées tous les jours pendant deux mois, 144 reçoivent des injections dans l'abdomen deux jours par semaine sur la même durée, et les 304 sont rasées sur les flancs pour quatre échographies sous anesthésie gazeuse. Le porteur revendique une réduction du nombre d'animaux en exploitant les deux surrénales de chaque individu, l'une pour l'analyse moléculaire, l'autre pour l'histologie, et affirme qu'aucune nuisance n'est attendue de la tumeur puisque les souris seront tuées avant qu'elle ne les gêne. Le cancer visé frappe 0,5 à 2 personnes par million et par an, et le bénéfice annoncé se limite à démontrer, chez la souris, le potentiel de deux approches thérapeutiques.

Objectifs

Avec un dimorphisme sexuel présentant un ratio femmes/homme de 1.5 à 2.5 :1, et une incidence annuelle de seulement 0,5 à 2,0 cas par million d'individus, le carcinome corticosurrénalien est considéré comme un cancer agressif, environ 35 % des patients présentant des métastases lors du diagnostic initial. Le mauvais pronostic du carcinome corticosurrénalien peut être attribué au manque de thérapies efficaces. En effet, un traitement curatif n'existe que pour les patients porteurs de carcinome corticosurrénalien à faible agressivité qui subissent une résection chirurgicale complète. Par conséquent, les patients présentant une récidive ou une maladie métastatique, pour lesquels la chirurgie n’est pas une option, n’ont pratiquement aucune chance de survie à long terme. L'immunothérapie a sans aucun doute révolutionné le traitement du cancer au cours des années précédentes. Cependant, les résultats des essais d'immunothérapie pour le carcinome corticosurrénalien ont été modestes, probablement à cause de l’hyperactivité endrocrine trouvée dans 50 à 60% des carcinome corticosurrénalien qui induit une immunosuppression. Des approches alternatives visant à augmenter l’efficacité des immunothérapies doivent donc être envisagées. Une option c’est de lever cette immunosuppression en modulant l’activité endocrine, plus spécifiquement en inhibant les glucocorticoïdes, afin de pouvoir favoriser l’activité anti-tumorale de différents acteurs du système immunitaire, notament les lymphocytes T et les macrophages. En utilisant un modèle de souris génétiquement modifiée, reproduisant des altérations génétiques identifiées chez les patients poteurs de carcinome corticosurrénalien, nous allons donc évaluer le potentiel thérapeutique de l’inhibition des glucocorticoïdes sur des carcinomes corticosurrénaliens avancés, seule ou en co-thérapie avec les différentes immunothérapies afin de stimuler l’activation des différents acteurs anti-tumoraux du système immunitaire et augmenter l’efficacité du traitement. De même, l’échec des immunothérapies peut s’associer à la présence de macrophages pro-tumoraux, qui vont eux aussi induire une immunosuppression. Ainsi, ce projet vise aussi à évaluer l’impact de la déplétion des macrophages pro-tumoraux sur le système immunitaire et la progression tumorale, afin d’évaluer la possibilité de la combiner avec des immunothérapies.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de démontrer le potentiel thérapeutique de l’inhibition des glucocorticoïdes ou de la déplétion des macrophages pro-tumoraux dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien avancé, avec l’objectif d’améliorer le pronostic du carcinome corticosurrénalien.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes : - - Technique d’administration de médicaments guidée par micropipette (MDA) : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. 192 souris (mâles et femelles confondues, âgés de 4 mois), seront gavées au quotidien pendant 2 mois avec des inhibiteurs de glucocorticoïdes ou le solvant correspondant. Le geste sera réalisé une fois par jour et ne durera que quelques secondes. - Injections intrapéritoneales : cette technique ne nécessite pas d’anesthésie préalable. 144 souris (mâles et femelles confondues, âgées de 4 mois), seront injectées deux jours par semaine pendant 2 mois avec des anticorps communément utilisés en immunothérapie, soit seuls (48 souris) , soit en combinaison avec l’inhibition des glucocorticoïdes (réalisée par gavage, 96 souris). 32 souris (mâles et femelles confondues, âgées de 4 mois), seront injectées une fois par semaine pendant 2 mois avec un anticorps neutralisant ou son contrôle pour éliminer les macrophages pro-tumoraux. Le geste sera réalisé une fois par jour et ne durera que quelques secondes. - Alimentation supplementée avec ou sans inhibiteur des macrophages : 32 souris, mâles et femelles confondues, âgées de 4 mois, seront nourries pendant 2 mois avec de la nourriture standard ou formulée avec l’inhibiteur de macrophages. - Échographie : realisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane, 304 souris de 4 mois, mâles et femelles confondus, seront rasées sur les flancs et la taille de la tumeur sera mesurée à l’aide d’un échographe. Ce geste sera réalisé 4 fois par souris : une fois au début du traitement, une fois après un mois de traitement, et puis à 72 et 48h avant la mise à mort de la souris, et ne durera que 30 minutes à chaque fois.

Impact sur les animaux

L’administration de traitements par MDA (Administration de médicaments guidée par micropipette) est une technique de courte durée qui requiert seulement la contention des animaux. De même, les injections intrapéritoneales requierent seulement une brève contention des animaux (technique de courte durée). Pour cela, ces techniques réalisées de façon isolée n’induisent qu’un stress léger. Cependant, vu que les procédures décrites dans cette demande impliquent la répétition des MDAs tous les jours et des injections péritonéales plusieurs fois pas semaine pendant plusieurs semaines, ceci peut conduire à l’apparition d’un stress modéré et une douleur de faible intensité. Finalement, le modèle murin de CCS avancé (les souris dKO) présente un développement tumoral et éventuellement des métastases. Cependant, on n’attend pas de nuissances associés au dévelopement tumoral, puisque tous les animaux seront mis à mort avant que le développement tumoral n’induise une gêne.

Devenir

Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de réaliser les prélèvements nécessaires à la réalisation de différentes analyses ciblant le potentiel de l’inhibition des glucococorticoîdes ou l’élimination des macrophages pro-tumoraux comme nouvelles approches térapeutiques dans le traitement de corticosurrénalomes métastatiques.

Remplacement

Afin d’eviter la douleur et l’inconfort de l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux euthanasiés sans manipulation préalable. Cette technique est un bon modèle alternatif pour tester des facteurs clés ayant un potentiel comme agent antitumoral. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.

Réduction

Dans l’optique de réduire de nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées : par exemple l’une pour une extraction d’ARN pour une analyse moléculaire et l’autre pour des analyses d’immunohistochimie. De même, le sang des animaux euthanasiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales ou de detection de cellules tumorales circulants. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimun nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 8 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests adaptés.

Raffinement

L’administration répetée des différents traitements experimentaux peut entrainer une augmentation du stress chez les animaux. Afin de diminuer au maximum le stress de l’animal, on utilisera des techniques de manipulation non aversives, tels que la manipulation par tunnel, l’administration des médicaments par micropipette, ou la mise en place de procédures d’habituation à la contention nécessaire pour les injections intrapéritoneales. De même, nous donnerons un morceau de fromage à la fin de la manipulation en guise de récompense. En plus de la surveillance quotidienne par du personnel qualifié, une surveillance accrue sera réalisée pendant les 30 minutes suivant la manipulation des souris afin de vérifier l’absence de signes de douleur tels que comportements anormaux (léchage, grattage) ou altération des expressions faciales (changement dans la position du nez ou les oreilles), sur la base des points limites adaptés à la recherche animale en cancérologie. En cas des signes de douleur ou souffrance, des analgésiques seront administrés.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les corticosurrénalomes. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Afin d’évaluer le potentiel de l’inhibition de glucocorticoïdes et de l’élimination des macrophages pro-tumoraux, en combinaison avec des immunothérapies, comme nouvelles approches thérapeutiques pour les carcinomes corticosurrénaliens métastatiques, nous utiliserons un modèle murin tumoral à 4 mois, moment où les premiers signes de malignité ont été détectés.

Des souris construites pour porter l'anomalie d'empreinte parentale en cause dans le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin peuvent présenter un retard de croissance, un museau déformé, des troubles de l'alimentation et un tonus musculaire faible. 740 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont une lignée jamais étudiée pour laquelle 40 animaux font l'objet d'une surveillance renforcée. 240 sont pesées chaque semaine de 2 à 12 semaines, 120 embryons sont prélevés 14 jours et demi après la fécondation, 144 passent jusqu'à six tests moteurs et de mémoire, et 60 subissent deux prélèvements sanguins sans anesthésie. Toutes sont tuées à la fin du protocole, la majorité de leurs organes étant disséquée pour des analyses moléculaires et anatomopathologiques.

Objectifs

A la fécondation, nous héritons de deux copies de chaque gène, une de notre mère et une de notre père. Contrairement à la plupart des gènes qui sont activés de façon identique sur les deux copies, certains gènes sont activés différemment selon qu'ils proviennent du père ou de la mère. Ce phénomène, appelé "empreinte parentale", joue un rôle essentiel dans le bon déroulement de la croissance et du développement. Ainsi, lorsqu'une erreur survient dans ce mécanisme, cela peut entraîner des maladies rares. C’est le cas du syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin, qui se traduit par un retard de croissance, des difficultés pour s’alimenter et d’autres troubles du développement. Cette maladie est liée à une anomalie où un enfant reçoit deux copies d'un même chromosome uniquement de sa mère, au lieu d'une copie de chaque parent, ce qui perturbe l'équilibre nécessaire à une croissance normale. Afin de mieux comprendre les conséquences de ces erreurs d’empreinte, ce projet utilisera des lignées de cellules et de souris génétiquement modifiées. Plus précisément, les souris permettront d’étudier comment la transmission d’une modification génétique par la mère ou par le père influence la croissance, l’alimentation, le métabolisme et le développement général de l’animal. En comparant les effets selon l’origine maternelle ou paternelle, nous pourrons mieux cerner les mécanismes qui conduisent à l’apparition de troubles du développement. Ces recherches visent à améliorer la compréhension de ces maladies rares et pourraient, à long terme, aider à mettre en place de nouvelles stratégies de diagnostic et de traitement pour les patients.

Bénéfices attendus

Les maladies rares touchent environ 6 % de la population mondiale, ce qui constitue un enjeu important pour la santé humaine. La majorité d’entre elles sont dues à des anomalies génétiques et comprendre les causes de ces maladies est essentiel pour pouvoir mieux les diagnostiquer et, à terme, proposer des traitements plus adaptés. Ce projet s’intéresse à une maladie rare identifiée récemment, qui s’appelle le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin. Cette maladie provoque notamment des troubles de la croissance et du développement. Pour mieux comprendre ses origines, nous allons étudier une région de l’ADN, qui pourrait être impliquée dans son apparition. Grâce à des expériences menées chez la souris, nous allons analyser si des anomalies dans cette zone peuvent provoquer des symptômes similaires à ceux observés chez les patients. Si c’est le cas, cela permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de cette maladie. Cela pourrait aussi aider à identifier d'autres personnes atteintes de symptômes proches, mais dont la cause génétique n’a pas encore été trouvée. À terme, ce travail pourra contribuer à améliorer le diagnostic des maladies rares liées à la croissance et au développement, et ouvrir de nouvelles pistes pour aider les patients.

Procédures

Dans ce projet, plusieurs interventions seront réalisées afin d'étudier la croissance et le développement de différent modèle de souris. Pour l’une des lignées qui n’a jamais encore été étudiée, 40 animaux seront suivis de manière renforcée pour détecter tout signe de mal-être. Pour le suivi de la croissance après la naissance, 240 souris seront pesées une fois par semaine, de l’âge de 2 semaines à 12 semaines. Pour l’étude de la croissance embryonnaire, 120 embryons seront prélevés 14,5 jours après la fécondation (et 120 embryons à un autre stade si nécessaire) pour mesurer leur taille et leur poids. Parmi les souris dont la croissance aura été suivie, 144 seront soumises à des tests moteurs et neurodéveloppementaux, de difficulté légère à modérée, pour évaluer leurs capacités motrices, leur mémoire et leur niveau d'anxiété. Les nouveau-nés seront testés pour leur tonus musculaire entre 5 et 10 jours après la naissance. Ces manipulations seront brèves et limitées à 3 fois par animal. Chez les souris plus âgées, entre l’âge de 2 et 6 mois environ 144 souris seront observées pour évaluer leur activité motrice, leur équilibre, leur comportement face à des situations nouvelles ou légèrement stressantes, ainsi que leur capacité à mémoriser de simples trajets. Chaque animal réalisera jusqu’à 3 sessions d’observations espacées dans le temps (une toutes les 6 à 8 semaines environ), pour un total de 6 tests maximum par animal. Chaque session durera entre 5 et 30 minutes. Deux prélèvements sanguins (4 et 8 semaines) seront effectués sur 60 souris pour mesurer les hormones de croissance. Les prélèvements seront effectués sans anesthésie mais avec contention adaptée, par des personnes expérimentées.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés pourraient présenter certains signes observés dans une étude précédente, et proches de ceux décrits chez les personnes atteintes de la maladie étudiée. Cela peut inclure un retard de croissance, une augmentation du contenu minéral des os, une forme anormale du museau, des difficultés à bien réguler le taux de sucre après les repas, ainsi que des troubles de l’alimentation ou un tonus musculaire plus faible. Les interventions réalisées sur les animaux seront toutes effectués pour limiter l’inconfort des animaux. L’identification et le prélèvement pour analyse génétique seront réalisés une seule fois pour chaque animal. Cela pourra entraîner une gêne passagère et un stress très léger. Le suivi du poids, qui sera effectué chaque semaine, est une manipulation simple et rapide. Elle pourra générer un stress léger lié à la manipulation répétée. Les prélèvements sanguins, qui seront effectués au maximum deux fois dans la vie des animaux, pourra provoquer une gêne temporaire lors du prélèvement et un léger stress lié à la contention. Le test pour vérifier le tonus musculaire des nouveau-nés pourra entraîner un inconfort très bref dû à la manipulation. Les tests comportementaux réalisés sur les animaux plus âgés consisteront à observer leur activité, leur réaction à des environnements nouveaux ou leur capacité de mémoire. Ces observations, espacées dans le temps et limitées en nombre, pourront provoquer un stress passager lié à la nouveauté ou à une situation inhabituelle mais ne causeront pas de douleur.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés au cours des différentes procédures du projet décrit ici sera mis à mort à la fin du protocole. La majorité des organes sera disséquée et prélevée afin de poursuivre les études moléculaires et anatomo-pathologiques après avoir caractérisé le phénotype global des animaux.

Remplacement

Ce projet a pour but de mieux comprendre la fonction d’une région particulière de l’ADN, afin de savoir si elle joue un rôle dans une maladie rare qui affecte la croissance et le développement. Cette maladie entraîne notamment un retard de croissance, des difficultés de développement, et des problèmes touchant les muscles et les os. Pour répondre à cette question, nous utiliserons comme modèle la souris. Ce choix est nécessaire, car certains signes de la maladie – comme les retards de croissance ou les effets sur le développement de l’embryon – ne peuvent être étudiés que dans un organisme complet, en développement. Par exemple, pour savoir si un retard de croissance est lié à un problème de placenta (organe qui nourrit le bébé pendant la grossesse), il faut observer l’embryon au cours de son développement dans l’utérus, ce qui n’est pas possible sans utiliser un animal entier. En parallèle, certaines analyses plus fines, qui concernent l’activité de cette région de l’ADN seront faites en laboratoire sur des cellules. Ces cellules sont soit déjà disponibles, soit seront prélevées sur les animaux pour être étudiées sans avoir besoin d’utiliser à nouveau un animal entier.

Réduction

Le projet a été conçu pour utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, tout en obtenant des résultats fiables et exploitables. Pour cela, les animaux sont élevés de manière optimisée : certaines portées contiendront à la fois les animaux à étudier ainsi que des contrôles, ce qui réduit le nombre total nécessaire. Les animaux participeront à plusieurs étapes de l’étude afin d’éviter les doublons : par exemple, les mêmes souris seront suivies pour leur croissance, soumises à des tests neuro développementaux simples, et recevront des prises de sang espacées. À la fin de l’étude, leurs organes seront conservés pour de futures analyses en laboratoire, ce qui permettra de continuer les recherches sans utiliser d'autres animaux.

Raffinement

Les animaux seront surveillés tous les jours par l’expérimentateur ou le personnel de l’animalerie afin de détecter rapidement tout signe de souffrance, et d’intervenir si nécessaire. Pour identifier les animaux, un prélèvement sera réalisé sur l’oreille. Cette procédure, effectuée par du personnel expérimenté, sera aussi rapide que possible pour limiter l’inconfort. La zone sera ensuite surveillée pendant deux jours afin de s’assurer qu’il n’y ait pas de complication. Certains animaux pourraient présenter des difficultés de croissance ou d’alimentation. Dans ce cas, un suivi renforcé sera mis en place, notamment par une surveillance régulière du poids. Si une perte de poids importante est constatée ou si l’animal montre des signes de difficulté à se nourrir, une alimentation spéciale et enrichie sera proposée. Pour l’un des modèles, pour lequel aucune donnée n’est disponible, une attention particulière sera portée sur deux générations. Des grilles d’observation standardisées permettront de décider si une surveillance renforcée est nécessaire ou, en cas de signes trop sévères, si l’animal doit être euthanasié. Enfin, tous les animaux vivront dans des cages spacieuses, en petits groupes, avec des éléments pour les stimuler et leur offrir du confort (abris en carton, papier pour faire des nids), conformément aux règles en vigueur.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle pour cette étude car elle partage avec l’être humain certains mécanismes importants (tel que celui étudié ici, l’empreinte parentale), ce qui permet d’étudier leur rôle dans des maladies humaines rares. Un modèle de souris spécialement conçu pour cette recherche existe déjà, ce qui permet de gagner du temps et d’utiliser des données déjà disponibles. La souris est aussi une espèce bien connue des chercheurs, pour laquelle de nombreux outils facilitent les analyses. Les souris utilisées seront âgées de quelques semaines à un an. Les études sur les jeunes souris commenceront à partir de 2 semaines après la naissance, pour suivre leur croissance et leurs comportements jusqu’à l’âge adulte. Pour comprendre les effets pendant la grossesse, certaines observations seront aussi faites sur les fœtus à différents moments de leur développement, en commençant par un stade précis et en adaptant ensuite si besoin.

530 souris juvéniles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont environ 280 qui subissent trente prélèvements de sang, un toutes les six minutes pendant trois heures, après une incision d'un millimètre à la queue. Nourries pendant cinq semaines d'un régime pauvre en protéines qui reproduit la malnutrition infantile, elles sont mesurées chaque semaine sous anesthésie, contentionnées chaque jour pour détecter la puberté, soumises à des frottis vaginaux quotidiens et à un jeûne de six heures. 48 femelles sont opérées des ovaires et d'autres reçoivent un régime qui provoque une hypothyroïdie, avec ralentissement de la croissance et baisse du tonus musculaire. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, y compris les mères, tuées au sevrage de leurs petits parce que leur exposition au régime interdit de les réutiliser.

Objectifs

La malnutrition infantile constitue un problème de santé publique majeur à l’échelle mondiale. Elle entraîne des altérations durables de la croissance, du métabolisme et de la maturation sexuelle. Des études récentes suggèrent que cette réponse à la malnutrition est modulée par le sexe, les garçons étant globalement plus affectés que les filles. De précédentes études ont confirmé ces observations dans un modèle murin : un régime déficitaire en protéines perturbe davantage la croissance et le métabolisme des mâles juvéniles, tandis qu’il retarde significativement la puberté chez les femelles. Ces observations suggèrent l’existence de compromis physiologiques différents entre les mâles et les femelles, coordonnés par des facteurs endocriniens. Plusieurs hormones candidates sont impliquées : les hormones sexuelles, les hormones thyroïdiennes, ainsi qu'un signal provenant du foie, induit en réponse à la restriction protéique. Ce dernier module trois processus clés pendant la période juvénile : la croissance, le métabolisme et la reproduction en fonction du statut nutritionnel. L’objectif général de ce projet est d’explorer comment l’ensemble de ces signaux module la réponse à la malnutrition juvénile, et dans quelle mesure ils participent à la différence de réponse entre les mâles et les femelles. Chaque signal indépendant permettant d’expliquer une partie de cette réponse, l’analyse de tous ces signaux donnera un point de vue global sur le contrôle de l’adaptation à la malnutrition protéique en fonction du sexe. À travers une série de sept procédures combinant approches génétiques, pharmacologiques et chirurgicales, nous chercherons à identifier le rôle causal de ces signaux dans trois processus physiologiques majeurs : croissance, reproduction et métabolisme. Ce projet contribuera à mieux comprendre l'origine de pathologies métaboliques et reproductives, en tenant compte du sexe et de la nutrition.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment différents signaux coordonnent les réponses physiologiques à la malnutrition protéique juvénile, en tenant compte du sexe. Ces connaissances contribueront à améliorer notre compréhension de la physiologie juvénile en contexte de malnutrition et pourraient, à terme, éclairer de nouvelles pistes de prévention ou d’intervention en santé humaine. Notamment, ce projet participe à comprendre les bases de la réponse différente entre le sexe à un même régime alimentaire, et pourrait donc permettre l'adaptation de la prise en charge de la malnutrition au sexe des enfants et individus concernés.

Procédures

530 souris seront utilisées dans le projet. Tous les animaux seront nourris soit avec un régime contrôle, soit avec un régime pauvre en protéines (modèle de malnutrition infantile) pendant 5 semaines. Toutes les souris seront mesurées chaque semaine sous anesthésie générale (3 minutes) puis pesées (< 1 min) entre 21 et 56 jours. Certaines souris subiront des contentions manuelles, tous les jours à partir de 21 jours (< 1 min par contention) pour détecter la puberté. Chez certaines femelles, un frottis vaginal sera réalisé quotidiennement à partir de cette détection et jusqu’à 56 jours (15 sec de contention). Pour étudier les hormones circulant dans le sang, environ 280 souris subiront une unique incision à la queue (1 seconde) puis 30 prélèvements d’une petite goutte de sang toutes les 6 minutes pendant 3 heures (≈ 5 secondes par prélèvement) sur animal vigile dans sa cage. Afin d’étudier l’effet d’une hormone, celle-ci sera injectée en sous-cutanée (10 sec), puis suivie de 3 prélèvements d’une petite goutte de sang à 0, 10 et 30 min. À 56 jours, un prélèvement final de 200 μL de sang sera effectué sous anesthésie générale (3 minutes). Dans les procédures chirurgicales, 48 femelles subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (20 minutes d’intervention), précédée d’une injection d’analgésiques et d’une anesthésie locale (10 sec). La couverture analgésique (par injections) sera maintenue le jour de l’intervention et le lendemain. Environ 320 souris subiront un test permettant d’évaluer la réponse de chaque individu à un sucre (glucose), et seront donc soumises à : 6 heures de jeûne, introduction orale de glucose (10 sec), incision à la queue (1 sec), 7 prélèvements d’une petite goutte de sang et 3 prélèvements supplémentaires de quelques gouttes (durée totale de prélèvement < 10 minutes). 52 souris de 0 à 21 jours et 10 souris adultes en lactation seront nourries avec un régime pauvre en iode et contenant un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne, induisant un manque d’hormone thyroïdienne.

Impact sur les animaux

Les pesées, mesures et frottis vaginaux hebdomadaires induisent un stress modéré lié à la contention, ainsi qu’un inconfort de courte durée. La caractérisation de la puberté nécessite de manipuler les animaux, ce qui peut occasionner un stress de courte durée. Les prélèvements de petites gouttes de sang à la queue impliquent une incision d’environ 1 mm et un recueil répété des gouttes, provoquant une douleur légère à chaque point temporel. Le jeûne de 6 heures induit un stress modéré. Le gavage est source d’inconfort et peut entraîner un risque de fausse route ou d’irritation oesophagienne. Les injections sous-cutanées peuvent causer une douleur brève au point d’injection. Les chirurgies ovariennes induisent une douleur modérée de moyenne durée au réveil, limitée grâce à la prise en charge. Les hypothyroïdies induites, bien que transitoires, peuvent entraîner un ralentissement de la croissance, une altération du tonus musculaire, de la température corporelle ou du rythme cardiaque. Ces effets sont surveillés et réversibles après sevrage.

Devenir

L'ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d'intérêt. Les mères qui auront eu accès à un régime hypothyroïdien pendant la lactation seront mises à mort au sevrage de leurs petits, à cause de leur exposition temporaire au régime qui affecte leur physiologie et ne permet donc pas leur réutilisation.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal. De plus, ce projet vise notamment à comprendre des mécanismes systémiques et moléculaires (en utilisant des traitements et modèles génétiques), et ne peut donc pas être réalisée en clinique humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en préservant la robustesse statistique des résultats. Ayant déjà des données solides et reproductibles sur l’effet de la malnutrition protéique chez les juvéniles, la procédure pilote ne comporte qu’un seul groupe, qui sera comparé aux données précédemment acquises. Pour les procédures complètes, le nombre de 14 mâles et 12 femelles a été déterminé à partir d’un calcul statistique. Nos études précédentes nous permettent de déterminer le nombre minimal d'animaux à utiliser pour détecter un changement, notamment sur nos critères d'évaluation de la puberté. Sur le plan statistique, la prise en compte simultanée de plusieurs facteurs (régime alimentaire, sexe, etc.) permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour pouvoir conclure sur le mécanisme biologique impliqué. Afin de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de futures expériences, tous les organes d’intérêt potentiels (muscle, tissu adipeux, etc.) seront prélevés à la fin des procédures et conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures.

Raffinement

La procédure expérimentale ne sera initiée que chez des animaux avec un poids suffisant au moment du sevrage. La croissance sera mesurée individuellement chaque semaine. Pour les jeunes récemment sevrés, la nourriture sera placée directement dans la litière afin qu'ils puissent manger facilement. La prise alimentaire sera également suivie pour s’assurer que les animaux mangent. Le régime faible en protéine et le test métabolique sont déjà utilisés au laboratoire et n’induisent pas de souffrance manifeste. L’utilisation d’anesthésie gazeuse permet une induction rapide, un bon contrôle de la profondeur d’anesthésie pendant la chirurgie, et un réveil plus rapide. La température corporelle sera contrôlée pendant et après l’anesthésie. Après chirurgie, les animaux seront placés en cage propre et chauffée. Une grille d’évaluation de leur bien-être permettra d’adapter les doses d'analgésiques individuellement pendant 48 h. Toutes les mesures visent à limiter le stress et la douleur tout en assurant la robustesse scientifique des données. Des points limites précis et prédictifs ont été définis spécifiquement pour ce projet.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet des régulations endocrines dans une étude nutritionnelle. Les animaux utilisés seront suivis pendant les 5 semaines après le sevrage (procédure commencée à 3 semaines), jusqu’à 8 semaines. L'objectif du projet est d'étudier les effets de différentes hormones sur le métabolisme et la croissance pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour les 3 paramètres d'intérêt : la croissance, la puberté, le métabolisme.

Un morceau d'oreille prélevé sur des nouveau-nés de sept à dix jours, un rein retiré par chirurgie à deux ou trois mois pour accélérer la maladie, puis quinze mois de suivi : 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent six recueils d'urine et quatre prises de sang en tube de contention, sur animal éveillé, avant un jeûne de six heures le dernier jour. Le porteur décrit une maladie rénale qui reste silencieuse jusqu'à un stade très avancé, autour de quinze mois, où les souris commencent à perdre du poids, à se toiletter moins, à se prostrer et à moins se déplacer. Toutes sont tuées pour qu'on prélève leurs reins, leur intestin, leur foie, leur hypophyse, leur hypothalamus et leurs gonades.

Objectifs

La glycogénose de type 1 est une maladie génétique rare caractérisée par une incapacité de l’organisme à produire du sucre en dehors des repas. La maladie se caractérise par des chutes des taux de sucre dans le sang (hypoglycémies) sévères, rapidement entre les repas. A l’âge adulte, la plupart des patients développent une maladie rénale, qui reste longtemps silencieuse mais détectable par mesure de marqueurs urinaires (présence d’albumine dans les urines ; albuminurie). En progressant lentement, elle évolue vers une insuffisance rénale caractérisée par une perte de la fonction du rein et l’accumulation de déchets dans le sang. A ce stade, les patients présentant aussi des kystes (formation d’un « sac » rempli de liquide) sur la surface des reins ou dans les reins. Des études récentes ont montré que dans cette maladie les cellules du rein ont la capacité de se multiplier de façon anormale ce qui favorise le développement de kystes et possiblement de cancers (2 cas décrits chez des patients atteints de glycogénose de type 1. A l’exception d’un contrôle nutritionnel, il n’existe actuellement aucun traitement curatif pour limiter l’avancée de la maladie rénale. La dialyse puis la transplantation rénale sont les seules solutions lorsque l’insuffisance rénale est atteinte. Le développement de cette maladie a été reproduit chez la souris en ciblant la mutation génétique de la glycogénose de type 1 uniquement dans les reins, ce qui permet d’éviter les épisodes d’hypoglycémie car le foie peut produire du sucre dans ce modèle animal. Comme chez l’homme, l’évolution de la maladie rénale est lente et silencieuse mais irréversible et mène à une insuffisance rénale au bout de 15 mois environ, avec l’apparition de kystes. Les premiers signes cliniques (albuminurie) apparaissent entre 6 et 9 mois, et la maladie peut être suivie par le dosage des mêmes marqueurs biologiques que chez les patients. Le but de ce projet est d’identifier les cellules et les mécanismes impliqués dans le développement des kystes, voire des cancers rénaux. Pour accélérer le développement de la maladie rénale, un rein sera enlevé au cours d’une chirurgie peu invasive. Dès les premiers signes d’insuffisance rénale, les reins seront prélevés pour des études moléculaires. Cette étude sera réalisée chez des animaux des deux sexes et devrait également permettre de comprendre les mécanismes à l’origine du retard d’apparition de la maladie chez les femelles par rapport aux mâles.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe pas de traitement curatif qui permette d’endiguer la mise en place de l’insuffisance rénale sévère sur le long-terme. Cette complication est pourtant importante chez les patients atteints de glycogénose de type 1 puisque plus de 70-80% développent une maladie chronique rénale. Du fait du faible nombre de patients, nous n’avons pas le recul nécessaire pour évaluer les risques associés à l’apparition de kystes chez les patients, ni l’incidence de cancers rénaux. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l’évolution de la maladie à long-terme, permettant ainsi une meilleure prise en charge des patients. Plus précisément, identifier d’éventuelles nouvelles cibles thérapeutiques est primordial pour développer des thérapies efficaces

Procédures

Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Les animaux subiront une intervention chirurgicale courte (durée d’environ 15 minutes) à l’âge de 2/3 mois permettant l’ablation d’un des deux reins, sous anesthésie générale (maximum 30 minutes d’anesthésie) et après injection d’analgésiques (2 injections le jour de la chirurgie et 1 injection/jour pendant les 2 jours post-chirurgie, nécessitant quelques secondes/injection). Au cours du temps, les souris vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les 3 mois à partir de 6 mois. L’animal peut subir un léger stress (qui entraine le déclenchement de la production d’urine), même si ce geste ne nécessite pas forcément la contention de l’animal. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 12 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine. La piqûre peut engendrer une faible douleur et un stress lié à l’immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, 6 prélèvements d’urine et 4 prélèvements de sang seront réalisés. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Même si la glycémie reste constante, les animaux peuvent subir un léger stress. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.

Impact sur les animaux

A l’âge de 7-10 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie au bord de l’oreille afin d’analyser leurs gènes. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. À l’âge de 2 ou 3 mois, les souris subiront l’ablation d’un rein sous anesthésie générale. Après l’opération, elles peuvent ressentir un peu de douleur et d’inflammation. Dès 6 mois, les souris peuvent développer une maladie rénale sans impact sur le bien-être animal jusqu’au stade très avancé de la maladie caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois). A ce stade, les animaux commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Pour suivre le développement de la maladie, des prélèvements urinaires spontanés seront effectués, ce qui peut provoquer un très léger stress. Les animaux subiront aussi des prises de sang après leur immobilisation dans un tube de contention. Ces gestes peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. Enfin, en fin de protocole, les animaux sont mis à jeun pendant 6h ce qui peut entrainer un léger stress. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. La piqure entraine une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin, du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et des testicules ou ovaires afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires

Remplacement

Aujourd’hui, il est possible de fabriquer en laboratoire de petits modèles de reins (appelés organoïdes) qui reproduisent les différents types de cellules présentes dans cet organe. Mais ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution de la maladie rénale ni le développement de tumeurs sur une longue période. Pour cela, il est indispensable d’avoir recours à des études chez l’animal, sur plusieurs mois. Le modèle de souris utilisé dans ce projet est le seul à reproduire fidèlement tous les problèmes rénaux observés dans la glycogénose de type 1. Ce modèle a été créé grâce à une méthode spécifique à la souris. De plus, le métabolisme de la souris est très proche de celui de l’être humain. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale été faite chez la souris. Il existe donc beaucoup de données scientifiques et d’outils disponibles pour poursuivre ces recherches dans ce modèle. Enfin, il est très difficile de mener ce type d’étude chez l’humain, car la glycogénose de type 1 est une maladie très rare (environ 1 naissance sur 100 000), ce qui rend les recherches sur des patients très limitées.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 24 souris, permettront de réaliser à la fois les études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, les souris « contrôles » qui ne présenteront pas la perte du gène ciblé dans les reins seront issues des mêmes reproductions. Les expériences que nous prévoyons exigent de petites quantités de tissu rénal pour différentes analyses en laboratoire. Comme les échantillons disponibles sont très limités, nous devons organiser les prélèvements de manière à pouvoir réaliser toutes les analyses prévues sans gaspillage. Le protocole durera 15 mois, donc nous devons aussi anticiper la possibilité que certaines souris ne puissent aller jusqu’au bout de l’étude, en prévoyant une marge de sécurité (une souris en plus par groupe). En tout, nous aurons 4 groupes expérimentaux, chacun composé de 6 souris, soit 24 souris par série d’expérience. L’étude sera réalisée sur des souris des 2 sexes car des résultats précédents suggèrent une progression plus lente de la maladie rénale chez les femelles ; nous doublerons ces groupes, ce qui portera le nombre total de souris à 96 : 48 souris malades et 48 souris saines servant de témoins. Enfin, nous veillerons à limiter la production d’animaux en n’utilisant que les souris nécessaires, et en utilisant les animaux surnuméraires uniquement pour maintenir nos lignées. Une fois le nombre requis atteint, les reproductions seront arrêtées. Nos lignées de souris sont d’ailleurs conservées à long terme par congélation, ce qui nous évite d’avoir à produire des animaux en continu. Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera au maximum 96 souris, incluant l’obtention de 48 souris transgéniques atteintes de la maladie rénale de la glycogénose de type 1 et de 48 souris contrôles, sans signes de maladie.

Raffinement

Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10 jours après la naissance, un âge où les nerfs ne sont pas encore complètement développés. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et au contact avant le début des procédures. Un petit tunnel sera aussi utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. La glycogénose de type 1 sera déclenchée uniquement dans les reins, ce qui permet aux souris de continuer de produire du sucre normalement grâce au foie, et ainsi d’éviter de baisses de sucre dans le sang. Lors du retrait d’un rein, les souris recevront un médicament contre la douleur avant et après l’opération. Une crème analgésiante sera aussi appliquée sur la peau, et la température corporelle sera maintenue pendant la chirurgie grâce à une plaque chauffante. Les interventions se feront dans des conditions stériles pour éviter les infections. Après l’opération, les souris seront isolées au chaud et surveillées pour s’assurer qu’elles se réveillent bien et sans souffrance. Elles retrouveront leur groupe au réveil. Pour les prises de sang, la veine sera dilatée par le chaud pour faciliter le prélèvement. Le volume de sang prélevé sera très limité selon les recommandations. Les souris seront habituées aux tubes dans lesquels elles seront placées pendant ces prélèvements, pour réduire leur stress. Les analyses d’urine se feront sans manipulation forcée : nous attendrons que les souris urinent spontanément, ce qui évite de les isoler dans des cages spéciales. Concernant la maladie elle-même : Les premiers signes ne provoquent pas de souffrance visible (c’est une maladie dite « silencieuse »). Les symptômes graves, comme une forte perte de poids ou une dégradation de l’état général, apparaissent tardivement, et indiquent la fin du protocole. La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet. Les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude, ou plus tôt si leur état de santé se détériore, afin de prélever les différents organes dont les reins.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans le corps. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, ce modèle de souris est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatale. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement puisque la perte de la fonction rénale qui est progressive. Voici comment se dérouleront les principales étapes du suivi : • Un prélèvement de tissu sera réalisé entre 7 et 10 jours après la naissance pour sélectionner les souris porteuses de la maladie. • À l’âge de 2 à 3 mois, une intervention chirurgicale peu invasive (le retrait d’un rein) sera réalisée. • Ensuite, nous effectuerons des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole.