Système endocrinien

Pour comparer un traitement continu à la cortisone et un traitement par cycles, 336 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles boivent de la corticostérone pendant deux à douze semaines et subissent un prélèvement sanguin par semaine sur animal éveillé, soit jusqu'à treize piqûres. À la fin du traitement, chacune est mise à jeun cinq heures, reçoit une charge de glucose ou d'insuline, puis cinq à sept prélèvements sanguins étalés sur deux heures. Le porteur indique que l'excès de sucre dans le sang peut faire uriner et boire davantage les souris et leur faire perdre du poids, et affirme qu'un "organisme vivant est nécessaire" pour attribuer à chaque organe sa part dans le dérèglement.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (GC) et leurs analogues de synthèse font partie des médicaments les plus prescrits en raison de leurs propriétés anti-inflammatoires et immunosuppressives. Cependant, à fortes doses, ils sont responsables d’une prise de poids associée à des troubles du métabolisme ainsi que d’une altération des fonctions digestives et de l’homéostasie glucido-lipidique, pouvant entraîner un diabète. Les traitements par GC sont en général initiés lors des crises inflammatoires puis arrêtés suite à la résolution de la crise et remis en place lors d’une nouvelle crise, engendrant des cycles de traitement. Tandis que les conséquences métaboliques du traitement chronique aux GC ont été bien documentées, les conséquences métaboliques des traitements intermittent par cycles ont été peu ou pas étudiées sur des modèles précliniques. Notre projet a donc pour objectifs de caractériser les conséquences sur le métabolisme et les organes impliqués d’un traitement intermittent aux GC.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance à l’insuline associée à une carence relative en insuline. En France, on dénombre 4,3 millions de personnes diabétiques. La prévalence augmente depuis des années et est passée de 5,6 pour cent en 2015 à 6,07 pour cent en 2021 (source Santé Publique France et Fédération Française des diabétiques). Si les tendances restent identiques, 520 000 personnes deviendront diabétiques d’ici 2027 en France. 90 pour cent des diabétiques sont atteints du diabète de type 2, maladie touchant préférentiellement les adultes et associée à l’obésité. Des traitements contre cette maladie existent avec notamment des antidiabétiques oraux pour le diabète de type 2. Il est bien connu qu’un des facteurs de risque du DT2 est le traitement chronique par les médicaments appelés glucocorticoïdes (GC). Les traitements par GC sont en général initiés lors des crises inflammatoires puis arrêtés suite à la résolution de la crise et remis en place lors d’une nouvelle crise, engendrant des cycles de traitement. Tandis que les conséquences métaboliques du traitement chronique aux GC ont été bien documentées, les conséquences métaboliques des traitements intermittent par cycles ont été peu ou pas étudiées. Notre projet permettra donc de documenter précisément les risques de développer un DT2 suite aux traitements par cycles aux GC et a donc pour objectifs de caractériser les conséquences sur le métabolisme et les organes impliqués d’un traitement intermittent aux GC et ainsi définir d’éventuelles pistes thérapeutiques pour mieux prendre en charge les patients atteints d’un DT déclenché par des traitements par cycle aux GC.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement via l’eau de boisson durant 2 à 12 semaines selon les groupes concernés. Nous réaliserons des prélèvements sanguins de faible volume effectués une fois par semaine pendant toute la durée du traitement pour contrôler la glycémie. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal soit 3 à 13 prélèvements selon la durée de traitement. A la fin des traitements, les souris seront soumises à l’un des deux tests pour évaluer soit la tolérance au glucose ou celle à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun courte (5h), les souris seront soumises à une administration (injection au niveau de l’abdomen ou administration orale) avec une solution et 5 à 7 prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Le jour de l’euthanasie, les animaux seront soumis à une injection unique au niveau de l’abdomen 7 minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

L’administration de corticostérone ou de la solution contrôle via l’eau de boisson pourrait induire un stress de courte durée lors de sa mise en place en raison de la peur de la nouveauté des souris (néophobie). Plusieurs semaines de traitement à la corticostérone, pourrait induire une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et éventuellement une perte de poids. De même, le suivi glycémique longitudinal des animaux pourra induire un stress et une douleur de courte durée. Les tests métaboliques, qui comprennent une injection ou une administration orale puis plusieurs prélèvements sanguins de faible volume afin de suivre la glycémie, peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Ils peuvent également induire un stress et une légère sensation de faim pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun.

Devenir

Notre étude nécessite le prélèvement d’organes afin de caractériser l’effet des traitements chroniques ou intermittents sur la fonction des organes qui régulent le métabolisme énergétique. Nous ne possédons pas de moyens techniques pour étudier ces fonctions par imagerie ou autre technique non invasive à ce jour. De plus, notre étude vise à définir le répertoire d’expression de gènes dans ces organes, technique qui nécessite le prélèvement de ces organes. Ainsi, l’euthanasie des animaux est strictement nécessaire afin de répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Le métabolisme glucido-lipidique implique différents organes permettant l’absorption des nutriments (par l’intestin grêle), l’utilisation et le stockage des glucides et lipides (dans les muscles squelettiques, le foie et les tissus adipeux) et le contrôle hormonal de ces processus (par le pancréas endocrine). Leur activité coordonnée permet donc la régulation fine de ce métabolisme et la perturbation de cette activité par les traitements aux glucocorticoïdes va impacter le fonctionnement de chacun de ces organes mais également les interactions entre ces organes. Un organisme vivant est donc nécessaire pour définir la contribution spécifique des organes. Il n’est pas possible de recréer en culture de cellules la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires rentrant en jeu.

Réduction

Un total de 336 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Après traitement des souris, nous analyserons sur chaque souris le métabolisme glucidique par des tests dynamiques (tests de tolérance au glucose, test de sensibilité à l’insuline) ainsi que les différents organes impliqués dans l’homéostasie glucidique en prélevant ces organes après euthanasie des souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe tout en nous assurant que nous obtiendrons des résultats statistiquement fiables. En effet, en raison des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (formation, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés. L’administration via l’eau de boisson de glucocorticoïdes (ou du diluant seul) sera surveillée et les biberons changés 3 fois par semaine afin de garantir une bonne qualité de l’eau de boisson. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids et de la glycémie sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous avons montré qu’il existait des conséquences métaboliques importantes lors d’un traitement chronique aux glucocorticoïdes (GR). Nous souhaitons maintenant étudier les conséquences métaboliques d’un traitement intermittent. Afin de pouvoir comparer le traitement intermittent au traitement chronique, nous souhaitons réaliser cette étude chez des souris de même origine et de même fond génétique. Stades de développement Les études se feront avec des animaux adultes (entre 8 et 20 semaines d’âge).. En effet, l’équipe de recherche s’intéresse aux adaptations métaboliques et pancréatiques en réponse à un traitement chronique aux glucocorticoïdes, ce qui nécessite de réaliser les expériences dont le métabolisme glucido-lipidique est fixe, c’est-à-dire chez des souris adultes, post-sevrage et post-puberté.

Un gavage oro-gastrique quotidien pendant quatre semaines et jusqu'à quatre prises de sang sous-mandibulaires attendent chaque souris de ce projet. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer l'effet de produits alimentaires d'origine végétale sur l'expression des gènes et le microbiote intestinal. Le porteur reconnaît que la répétition du gavage peut provoquer des irritations ou des lésions de l'œsophage, et annonce que les prises de sang seront évitées si des tests préalables sur cellules ne montrent aucune modification des hormones de satiété. 576 souris sont tuées à l'issue pour prélever foie, iléon et cæcum, les 144 restantes sont "relâchées de l'étude" et réutilisées dans un autre protocole.

Objectifs

L’objectif du projet est de tester l’effet de différents produits et denrées alimentaires issus de différentes plantes sur l’expression génique (approche nutrigénomique) et sur le microbiote intestinal (effet prébiotique) chez un modèle murin.

Bénéfices attendus

Un bénéfice majeur du projet sera la mise en évidence des modification dand l'expression de gènes impliqués dans des voies métaboliques clés (prolifération cellulaire, immunité, métabolisme), ce qui permettra d'estimer la valeur fonctionnelle du produit alimentaire testé. Un autre bénéfice très important sera la mise en évidence des changements dans la composition du microbiote intestinal, ce qui nous permettra d'évaluer l'effet prébiotique de l'aliment. Nous attendons aussi une confirmation des résultats obtenus in vitro sur les changements dans les dosage des hormones suite à l'ingestion des différents produits, ce qui s'associera aux effets métaboliques observés par les analyses sur l'expression des gènes.

Procédures

Chaque animal fera l’objet d’un gavage oro-gastrique quotidien, d’une durée inférieure à 5 minutes. Les prélèvements sanguins seront effectués chez des animaux vigiles, au niveau sous-mandibulaire et sous anesthésie locale, pour une durée inférieure à 5 minutes par individu. Le nombre total de prélèvements par animal ne dépassera pas quatre.

Impact sur les animaux

La contention nécessaire aux prélèvements sanguins (moins de 5 minutes par session) ou aux gavages (également inférieurs à 5 minutes) engendre un certain inconfort et du stress chez les animaux, mais elle est indispensable pour recueillir des réponses individuelles. Bien que le gavage oro-gastrique ne soit pas douloureux en soi, sa répétition peut causer des irritations ou des lésions œsophagiennes, notamment lorsque le protocole impose une administration quotidienne pendant une période de quatre semaines.

Devenir

A la fin de la procédure, un total de 576 animaux seront euthanasiés afin de récupérer le fois, iléon et caecum. Les 144 animaux restants seront relâchés de l’étude et réutilisés dans un autre protocole.

Remplacement

Les prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux uniquement après que des expériences préalables aient été faites in vitro. Nous allons réaliser d’abord les expériences sur des cellules entéroendocrines avec des digestats des différents produits issus des differents produis alimentaires testés obtenus par digestion in vitro. Si aucune modification n’est constatée in vitro, nous allons conclure que le produit ne change pas le taux des hormones de satiété et nous n’allons pas réaliser les prélèvements de sang, évitant ainsi une procédure invasive. Si nous constatons une modification du niveau des hormones suite au contact avec les digestats de différents produits alimentaires testés, nous allons réaliser des prises de sang chez les souris pour doser ces hormones dans le plasma et si les résultats obtenus par les méthodes in vitro montrent une corrélation significative avec les dosages Luminex, nous allons remplacer complètement les dosages dans le serum par les dosages issus de la digestion in vitro, pour toutes nos futures analyses de ce type.

Réduction

Des études in vitro au laboratoire seront préalablement réalisées afin de sélectionner les produits alimentaires susceptibles d’induire un effet fonctionnel, ce qui permet de réduire le nombre de groupe par étude et donc le nombre d’animaux. Le principe de réduction se traduira aussi dans l’utilisation d’un nombre réduit à 6 animaux par groupe. Les analyses statistiques exigent un minimum de 5 individus et nous rajoutons seulement un individu de plus par groupe pour éviter des pertes imprévisibles durant l'expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et manipulés dans le calme, à distance des autres groupes, dans une salle indépendante (y compris pour les euthanasies). Si des prélèvements sanguins s’avèrent nécessaires, ils seront réalisés par ponction sous-mandibulaire, sous anesthésie locale à la lidocaïne, et espacés dans le temps (J0, J15, J30, J36). Un enrichissement de l’environnement est systématiquement assuré dans notre animalerie (maisons et carrés de cellulose dans toutes les cages). Pour évaluer l’effet du gavage et des prélèvements sanguins, une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place. Si une souris présente des signes de souffrance, elle sera euthanasiée afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix du fait de son utilisation majoritaire comme modèle d'étude dans la communauté scientifique: cela permet ainsi de comparer ses résultats avec ceux d'autres laboratoires, et échanger avec eux, idées et modèles, à un niveau international. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé dans la littérature pour les expérimentations sur transcriptomiques et les modifications du microbiote intestinal puisqu’elles présentent un génome très bien connu et annoté, un métabolisme proche de l’homme et un microbiote présentant de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. Le modèle animal souris présente l’avantage d’un gavage relativement facile, et des résultats extrapolable chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes de 6 à 9 semaines puisque ces stades de développement sont fréquemment utilisés dans la littérature sur le sujet.

Des souris sont rendues obèses, diabétiques et atteintes de stéatose du foie par des régimes riches en graisses et en sucre, pour que des chercheurs testent sur elles des candidats médicaments, dans une offre dont l'effectif suit un plan commercial. 990 souris, dont certaines dotées d'un système immunitaire ou d'un foie humanisés, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tuées en fin d'étude, aux points limites ou à la demande du vétérinaire, 30 d'entre elles étant déclarées réutilisables dans un projet de formation interne aux gestes techniques. Selon les études, elles subissent des tests de résistance à l'insuline et au glucose de 6 h 30 à 8 h 30 avec mise à jeun, des prises de sang répétées et des injections de plasmides qui peuvent provoquer des troubles cardio-respiratoires dans les minutes suivantes. Sous des signes "pouvant entraîner un inconfort", le porteur liste des accidents vasculaires cérébraux, des crises cardiaques, une encéphalopathie hépatique et des vomissements de sang. L'effectif couvre 33 études de quatre groupes de 5 à 10 souris, et selon lui "Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d'études ou pour le nombre total d'animaux dans le projet".

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un modèle murin de syndrome métabolique, c'est-à-dire une association d'anomalies mêlant dans ce cas obésité, stéatose hépatique non alcoolique (NASH) qui est une pathologie caractérisée par un excès de graisses dans le foie qui n'est pas due à une consommation élevée d'alcool et le développement de diabète qui est donc une résistance à l’insuline. Ce syndrôme sera reproduit grâce à des régimes riche en graisse et en sucre mimant les régimes occidentaux et permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de cette pathologie et de tester de nouveaux candidats médicaments puisqu'aucune thérapie curative n'est approuvée.

Bénéfices attendus

En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire et/ou un foie humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier un syndrome métabolique (diabète, NASH, obésité) et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.

Procédures

Test de résistance à l’insuline et test de résistance au glucose comprenant une mise à jeun. Durée totale du test entre [MODIFICATION] 6h30 et 8h30. L’administration de traitements ou de cellules pourra être réalisée selon différentes voies. Une anesthésie gazeuse sera appliquée en fonction de la voie choisie. Les volumes administrés seront proportionnels au poids de l’animal avec un maximum défini. La durée sera généralement de 10-15 secondes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal, sans réveil de l’animal, sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux. [MODIFICATION] Un jeûne de nourriture pourra être effectué sans dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages.

Impact sur les animaux

Pour le développement de ce modèle pathologique divers signes cliniques pouvant entraîner un inconfort pourront être observés: en lien avec le développement d’un diabète de type II : polyphagie (besoin excessif de manger), polyurie (trouble urinaire) , polydipsie (sensation de soif exagérée), troubles de la vision, asthénie, pathologie cardio-vasculaires (accident vasculaire cérébral, crise cardiaques), néphropathie, neuropathie, rétinopathie; en lien avec l’obésité: accumulation de graisse viscérale et augmentation du poids pouvant entraîner une difficulté à se mouvoir, pathologie cardio-vasculaire; en lien avec une insuffisance hépatique : état général dégradé, encéphalopathie hépatique, ictère, asthénie, anorexie, ascite, troubles de la coagulation, vomissement (hématémèse), diarrhée (méléna ou hématochésie). -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le développement de populations immunitaires humaines d’intérêt) : hématome, troubles cardio-respiratoires, altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Administration de traitements ou de composés : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées). -Prélèvements sanguins : hématome, anémie, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. [MODIFICATION] Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.

Remplacement

Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement qui mimerait le développement d'un syndrôme métabolique (diabète, obésité, NASH) tout en objectivant l’efficacité de molécules agissant, entre autres, sur l’activité du système immunitaire, la mort cellulaire, le stress oxidatif ou les taux d’insuline et de lipides dans le sang. Les modèles murins en général, et plus particulièrement la souris avec un foie et/ou un système immunitaire humanisé(s), constituent donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre cette maladie.

Réduction

Un total de 990 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 33 études de 4 groupes (contrôle négatif, contrôle positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 a 10 animaux par groupe. Aucune approche statistique n'a été réalisée pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sans réveil sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites déclenchant l’euthanasie incluent : atteinte sévère de l’état général, douleur non contrôlée ou tout score clinique dépassant les seuils définis, perte de poids dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

L'utilisation de modèles murins dans les syndromes métaboliques a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Par ailleurs, nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire et du foie chez des lignées de souris spécifiques. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre sur cette espèce. [MODIFICATION] Pour les souris non humanisées et humanisées avec des cellules sanguines provenant du sang périphérique, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines. Pour les souris humanisées avec des cellules souches issues de cordons ombilicaux humains, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules humaines dans le sang. Pour les souris humanisées au niveau du foie ou double-humanisées (foie + système immunitaire), les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 13 semaines correspondant au délai nécessaire pour obtenir une prise de greffe hépatique suffisante dans la majorité des souris.

Deux injections dans le sinus situé derrière l'œil, dix prises de sang à la queue et une ponction cardiaque finale attendent chacune des 144 souris du projet, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et résistantes à l'insuline, elles reçoivent un virus qui modifie une enzyme du foie, pour faire monter leur cholestérol et favoriser des dépôts dans les artères. Le porteur affirme que ce changement reste "sans signes visibles ni douleur pour l'animal", tout en rangeant les injections rétro-orbitales et les prises de sang bimensuelles parmi les effets indésirables attendus. La mise à mort sert à prélever le foie et le tissu adipeux.

Objectifs

Nous allons étudier l'impact d'une modification d'une enzyme du foie sur des souris obèses et résistantes à l'insuline. Pour cela, nous utiliserons une version particulière de cette enzyme et rendrons les souris plus sensibles aux déséquilibres des graisses dans le sang en modifiant une autre protéine. Nous analyserons ensuite la quantité de graisses présentes dans le sang et vérifierons si ces changements favorisent la formation de plaques dans les artères, un facteur clé des maladies cardiovasculaires.

Bénéfices attendus

Nos recherches ont montré qu’une forme particulière de la lipase hépatique, plus active que la normale, permet de faire baisser le taux de cholestérol dans le sang, chez la souris comme chez l’homme. Or, le cholestérol LDL (souvent appelé "mauvais cholestérol") est l’un des principaux facteurs de risque des maladies cardiovasculaires. En s’accumulant dans les artères, il peut former des dépôts qui les rétrécissent et gênent la circulation du sang. Ce projet cherche à savoir si cette forme modifiée de la lipase hépatique peut protéger des souris obèses, avec un taux de sucre élevé dans le sang et une sensibilité réduite à l’insuline, contre ce type de problèmes dans les artères.

Procédures

Chaque souris recevra deux injections d’un virus (durée de 5/10 secondes), subira dix prises de sang (durée 5/15 secondes) et une ponction cardiaque avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les souris auront un taux de cholestérol élevé et seront plus susceptibles de développer des dépôts de graisses dans les artères. Cependant, ce changement reste sans signes visibles ni douleur pour l’animal. Contrairement à l’humain, les souris ne développent pas de maladies graves comme les crises cardiaques ou les accidents vasculaires cérébraux : les plaques qui se forment dans leurs artères restent stables. Les effets indésirables possibles concernent surtout les deux injections dans le sinus rétro-orbital et les prises de sang régulières réalisées au niveau de la queue toutes les deux semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, conformément aux objectifs expérimentaux. Cette mise à mort est nécessaire pour permettre le recueil des organes et tissus d’intérêt (par exemple le foie, le tissu adipeux ou d’autres prélèvements), indispensables aux analyses biologiques et histologiques prévues dans le protocole.

Remplacement

Ce projet comprend plusieurs volets : des analyses génétiques menées sur une cohorte humaine et des études en laboratoire sur des cellules hépatiques. Les données déjà obtenus ont confirmé l’intérêt de la cible étudiée. Les maladies cardio-métaboliques résultent de mécanismes complexes impliquant plusieurs organes qui communiquent entre eux. Actuellement, ces interactions ne peuvent pas être reproduites en laboratoire avec des modèles cellulaires. C’est pourquoi l’utilisation de modèles animaux reste essentielle.

Réduction

Ce projet a été conçu dans le respect de la règle des "3R" (Remplacement, Réduction, Raffinement). Seules les expériences strictement nécessaires à la réussite du projet seront réalisées.Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé avec rigueur, en s’appuyant à la fois sur notre expérience passée et sur un logiciel d’analyse statistique permettant d’optimiser la taille des échantillons. De plus, nous avons sélectionné les lignées de souris les plus adaptées afin de maximiser la pertinence des résultats tout en limitant le nombre d’animaux impliqués.

Raffinement

Nous avons pris en compte le bien-être animal en mettant en place une surveillance quotidienne assurée par des zootechniciens formés, afin de détecter tout signe de stress ou de souffrance. De plus, un examen clinique hebdomadaire sera réalisé par les responsables du protocole de recherche. Pour limiter la douleur et le stress des animaux, des mesures adaptées seront mises en place. Les injections dans le sinus rétro-orbital seront réalisées sous anesthésie gazeuse, avec l’application d’un collyre anesthésiant pour une analgésie locale. Une analgésie appropriée sera également administrée avant la mise à mort. Par ailleurs, une sédation légère sera utilisée lors des prises de sang au niveau de la queue pour réduire le stress des animaux . Des critères précis ont été établis pour définir des seuils au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal mis à mort, garantissant ainsi une prise en charge éthique et responsable. Enfin, les souris seront hébergées dans des conditions optimales : elles disposeront de cages équipées de litières et d’enrichissements (frisottis, igloo ou tube en polycarbonate). Elles seront également restreintes en nombre dans chaque cage en fonction de leur poids, afin d’assurer leur confort. Les animaux seront maintenus en groupes pour préserver leur bien-être social.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans l’étude des maladies cardiaques et métaboliques. Il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications associées à l’obésité et est largement reconnu pour sa pertinence dans la recherche biomédicale en raison de sa similitude génétique avec l'humain. Facile à manipuler et à reproduire, il offre une bonne reproductibilité des résultats, ce qui en fait un choix pour les études précliniques. Son utilisation permet ainsi d'obtenir des données fiables. Nous avons choisi des souris qui sont naturellement obèses et moins sensibles à l’insuline. Pour les rendre plus à risque de développer des plaques dans les artères (athérosclérose), nous modifions une protéine, ce qui augmente leur taux de cholestérol. Les animaux débuteront le protocole de recherche à 5 semaines d’âge (randomisation) car il est nécessaire de débuter avant la mise en place de l’insulino-résistance qui s’établit entre 6 et 12 semaines.

Des lignées de souris sont élevées pour développer avec l'âge une inflammation chronique, une hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmonaire : 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nuisances annoncées sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Le porteur écrit ensuite que les conditions d'élevage seront adaptées pour que les animaux ne développent pas de symptômes, alors que le phénotype dommageable est précisément ce que cet élevage produit, les souris atteintes n'étant pas gardées au-delà de vingt semaines. Une partie des petits sert au renouvellement des accouplements, les autres partent vers des expériences menées sur un autre site, et tous sont tués à terme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’élever des animaux spécialement conçus pour nos expériences scientifiques. Grâce à ces expériences, nous cherchons à comprendre comment le métabolisme des lipides influence certaines maladies inflammatoires chroniques (ici par exemple le syndrome d'Aicardi-Goutières).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de découvrir des solutions thérapeutiques pour alléger les symptômes présents chez les patients souffrant d’inflammation chronique.

Procédures

Ces animaux developperont une inflammation chronique avec l'âge. Ces lignées murines modèles de maladies inflammatoires developpent avec le temps un hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances liées à l'inflammation chronique dans ces modèles sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Les animaux ne seront pas maintenus plus de 20 semaines, les conditions d'élevage seront donc adaptées pour qu'ils ne dévellopent pas de symptômes.

Devenir

Les animaux issus de l'élevage seront soit utilisés pour renouveler les accouplements soit utilisés pour les expérimentations dans le cadre d'une utilisation continue sur un autre site. Les animaux ne présentant pas le phénotype dommageable seront intégrés dans les groupes "contrôles". Tous les animaux seront utilisés. A la fin, ils seront tous euthanasiés.

Remplacement

L'objectif du projet scientifique associé à ces élévages nécessite l'utilisation de modèles animaux. Les méthodes substitutives notamment l'utilisation de modèle in vitro ne permet pas d'étudier la communication inter-organes.

Réduction

Afin de réduire le biais associé au sexe, des groupes équivalents d’animaux des deux sexes seront utilisés dans les protocoles expérimentaux proposés. Tous les animaux issus des accouplements seront conservés pour l'expérimentation.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues à la délétion génétique dommageable. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. De plus les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. De fait, afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux, les animaux seront placés en cage 3 individus (trio d'accouplements) avec pour enrichissement une maisonnette en carton et du coton pour la nidification. Les animaux avec un phénotype dommageable ne seront pas gardés en vie au delà de 20 semaines d'âge.

Choix des espèces

Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expérimentales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les animaux seront utilisées pour l'élevage, les animaux seront donc mis en accouplement entre 7 et 8 semaines et les animaux à phénotype dommageable seront maintenus en accouplements pour une durée maximale de 12 à 13 semaines ( âge maximum des animaux 20 semaines).

Tuées en fin de procédure pour que leurs tissus et organes passent en analyse post-mortem, 1 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie du foie de deux heures sous anesthésie et analgésie, une autre un jeûne de douze heures en hébergement individuel, une autre vingt-quatre heures en cage métabolique sur grille, avec un risque de lésions aux pattes reconnu par le porteur. Des traitements antibiotiques ou des polyamines sont administrés dans l'eau de boisson pendant sept ou vingt-huit jours. L'hépatite ischémique visée touche entre 0,5 et 1,3 % des admissions hospitalières, et les molécules testées, censées reproduire les effets du jeûne, n'ont pour l'instant été sélectionnées qu'in vitro.

Objectifs

L’autophagie est un processus naturel essentiel, présent chez tous les êtres vivants, qui permet aux cellules de se nettoyer et de fonctionner correctement. Elle aide aussi les cellules à s’adapter en situation de stress. Lorsque l’autophagie ne fonctionne pas bien, cela peut contribuer au développement de maladies comme le diabète, certaines maladies neurologiques ou certains cancers. Le jeûne (ou restriction calorique) est un moyen naturel d’activer l’autophagie. Dans nos recherches, nous avons identifié des composés capables de reproduire les effets bénéfiques du jeûne, en particulier sur l’activation de ce mécanisme. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de ces composés, appelés polyamines, sur le foie, et de voir s’ils pourraient aider à prévenir une atteinte grave du foie appelée hépatite ischémique, en utilisant des modèles expérimentaux chez la souris.

Bénéfices attendus

L’hépatite ischémique est une maladie grave du foie causée par un manque d’oxygène ou de sang. Il s’agit d’une affection relativement rare (incidence entre 0.5 et 1.3 pourcent des admissions hospitalières), mais qui entraîne la mort des cellules du foie et peut avoir des conséquences très graves : plus d’un patient sur deux décède dans les six mois. Il s’agit donc d’un véritable enjeu de santé publique. Ce projet vise à étudier si certaines molécules naturelles, appelées polyamines, peuvent protéger le foie contre ce type de lésion. L’objectif est aussi d’identifier de nouvelles pistes pour mieux prévenir ou traiter cette maladie à l’avenir.

Procédures

Une partie des animaux sera soumise à un jeun non strict de 12 heures et hébergés seule mais sans isolement sensoriel (une seule fois). Une partie des animaux sera soumise à des traitements antibiotiques ou avec des polyamines via eau de boisson pendant 7 ou 28 jours. Une partie des animaux recevra une seule administration d’un traitement (moins de 1 minute par animal vigile). Une partie des animaux sera mise pour 24 heures (une seule fois) dans des cages métaboliques (sur grilles) afin de recueillir les urines produites. Une partie des animaux sera soumise (une seule fois) à une procédure de chirurgie au niveau du foie (animal sous anesthésie et analgésie, acte de 2 heures /animal).

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un certain stress. De plus, lors des injections une légère douleur (équivalente à une piqure) peut survenir, éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection. Les sites d’injections peuvent s’infecter. Les conditions d’hébergement des animaux seront modifiées ponctuellement lors des mises à jeun (pour 12 heures) nécessaires pour le déroulement des expériences. Le jeûne peut induire une sensation de faim, une perte de poids, l’affaiblissement de l’animal et parfois de l’hypothermie. La stabulation sur grille pourrait induire des lésions aux pattes. L’hébergement individuel peut induire du stress. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoire. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie. Les animaux seront euthanasiés, à la fin des procédures, par une méthode réglementaire en vue des prélèvements d’organes.

Devenir

Tous les animaux à la fin des procédures seront euthanasiés. A la fin des expériences, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Nos recherches ont permis d’identifier et de sélectionner in vitro des molécules (des polyamines naturelles), capables de mimer les effets biochimiques du jeûne et d’activer l’autophagie, un mécanisme physiologique essentiel, qui joue un rôle clé dans le maintien de l’équilibre cellulaire. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du métabolisme des polyamines sur le foie et la réponse à la modulation du microbiote intestinal. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, les conséquences et les effets sur l’organisme de la chirurgie hépatique ainsi que la modulation du microbiote intestinal vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1600 souris. Pour sa réalisation, des groupes homogènes d’animaux seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques pour comparer l’effet étudié entre les groupes. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. L’étude sera interrompue si les expériences initiales ne confirment pas l’hypothèse de travail. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux commerciaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, tunnels en carton, maisonnettes). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long des expériences. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de tapis chauffants). Lors de la chirurgie, l’asepsie et la stérilité du matériel seront respectés. Si les souris apparaissent affaiblies pendant les procédures, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés.

Choix des espèces

Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. La souris a une génétique bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront utilisés au stade adulte (à partir de 6 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire actif.