Système endocrinien

Une chirurgie stéréotaxique du cerveau pouvant durer une heure trente, puis sept prélèvements de sang à la queue en deux heures pour une partie des animaux : 1 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélèvement du cerveau. Le porteur, qui cherche à savoir comment les odeurs de nourriture modulent deux populations de neurones de l'hypothalamus, résume les nuisances attendues en une phrase et affirme que toutes les précautions seront prises. Sa grille de points limites décrit pourtant des souris prostrées, au poil hérissé, présentant des signes neurologiques ou perdant jusqu'à 20 % de leur poids, mises à mort par dislocation cervicale si le score persiste plus de quarante-huit heures. Il indique aussi s'entraîner aux gestes chirurgicaux sur des souris nées de croisements sans le génotype recherché, qu'il désigne comme des animaux "produits mais non utilisés".

Objectifs

Dans ce projet nous nous intéressons à la modulation de la régulation de la prise alimentaire par les odeurs. Cette régulation implique notamment un réseau de neurones situé dans le noyau arqué de l’hypothalamus. Les expériences menées dans ce projet porteront sur 2 populations de neurones, les neurones sécrétant la pro-opiomélanocortine (POMC) ayant pour action supposée de limiter la prise alimentaire et les neurones exprimant la protéine liée à l'agouti (AgRP) ayant une action opposée. Les premiers s’activent au cours des repas et diminuent leur activité lorsque les réserves énergétiques baissent. Les neurones AgRp auraient une réponse opposée. De précédentes études réalisées sur des souris ont révélé la capacité de ces neurones à répondre non seulement lorsque le cerveau détecte la présence de nutriments en quantité mais également à des signaux sensoriels associés à la présence de nourriture. Ainsi les neurones de ce réseau peuvent être modulés par l’odeur de nourriture avant même qu’un aliment ne soit ingéré. Le présent projet propose de caractériser les mécanismes à l’origine de cette modulation par les odeurs de nourriture chez la souris. Différentes odeurs présentes dans des nourritures palatables seront utilisées pour tester leur capacité à moduler la physiologie des neurones POMC et AgRP. Des aires cérébrales impliquées dans le traitement des informations olfactives, l’amygdale médiale et le cortex piriforme postérieur seront inactivées par une approche chémogénétique pour étudier leur rôle dans cette modulation olfactive de l’hypothalamus.

Bénéfices attendus

Les expériences proposées permettront une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques de la régulation de la prise alimentaire. Dans le contexte de l’augmentation forte du nombre de personnes en surpoids ou obèses dans le monde, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour le contrôle de la prise alimentaire par le système olfactif.

Procédures

Une partie des animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une durée maximale de 1h et 7 prélèvements sanguins seront réalisés à la queue en 2h en fin de procédure. Une autre partie des animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une durée maximale de 1h30.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront principalement dues à la chirurgie stéréotaxique mais toutes les précautions seront prises pour réduire la douleur ou les infections.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvement des cerveaux dans le but soit de réaliser les expériences d'électrophysiologie ex vivo soit de vérifier la bonne implantation des fibres optiques.

Remplacement

L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal l’effet d’odeurs sur le réseau de neurones hypothalamiques impliqués dans le contrôle de la prise alimentaire. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude du comportement de recherche de nourriture et de prise alimentaire reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. Pour les chirurgies, nous nous entrainons sur des animaux produits mais non utilisés (par exemple souris récupérées de croisements de souris transgéniques n'ayant pas le génotype désiré) afin de parfaire les gestes chirurgicaux et réduire les pertes pour la réalisation des expérimentations. Aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes (Analyses de Variance et test posthocs paramétriques).

Raffinement

En accord avec la structure chargée du bien-être animal au sein du laboratoire, nous avons défini les meilleures conditions d'hébergement possibles ainsi que les points limites. Dans ce projet, nous avons 5 à 10 souris par cage (excepté après chirurgie où les souris implantées sont 2 à 3 par cage pour diminuer le risque d'arrachement des implantations par bagarre), présence de différents enrichissements (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier), surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Nous rédigeons un protocole pour chaque expérimentation, soumis à l'équipe animalerie qui doit le valider avant de démarrer afin d'assurer de bonnes conditions d'expérimentation. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage: - Perte de poids anormale (15% score 1, 15-20% score 2) -Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...) score 3 - Signes neurologiques score 2. Si un score entre 9 et 12 persiste pendant plus de 48h, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.

Choix des espèces

Le projet proposé porte sur l’étude de 2 populations particulières de neurones hypothalamiques ayant un rôle clé dans le contrôle de la prise alimentaire. Les expérimentations seront réalisées sur des souris transgéniques nous permettant de cibler ces populations neuronales afin d’en comprendre le fonctionnement. La souris est le seul modèle animal permettant les modifications transgéniques nécessaires à la transformation ou à la visualisation des populations neuronales étudiées dans ce projet. D’autre part, la souris est un animal à l’odorat très développé qui utilise les odeurs dans son comportement alimentaire (comme l’humain). Enfin, sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues servent les explorations thérapeutiques chez l’humain. Le présent projet s'intéresse aux effets des odeurs sur le cerveau mature. Néanmoins, les expériences d'électrophysiologie fonctionnent mieux avec des souris jeunes. Les procédures expérimentales débuteront donc à l’âge de 5 semaines (mise sous régime gras sucré). Les mesures neurophysiologiques et comportementales seront réalisées chez l'adulte après la 13ème semaine de vie (pour tenir compte des 8 semaines d'exposition au régime alimentaire hypercalorique).

Tuées à dix semaines de vie, avant que leur état général ne se dégrade, pour analyse du sang, des urines et des organes, 208 souris porteuses d'une mutation qui provoque une insuffisance rénale spontanée vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À quatre semaines, elles subissent une castration chirurgicale, ovariectomie ou orchidectomie, puis reçoivent un gavage cinq jours par semaine et deux implantations sous-cutanées de capsules d'hormones. S'y ajoutent des prises de sang et une mesure de la filtration rénale par injection rétro-orbitaire, capteur fixé sur le dos pendant quarante-cinq minutes. Le porteur écrit avoir retenu la souris parce que la littérature en fait l'espèce "la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse" dans les conditions de la procédure.

Objectifs

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle souvent associée à l’hypertension artérielle et au diabète. Si elle n’est pas correctement traitée, l’IRC peut conduire à la dialyse ou la greffe rénale. Le traitement de l’IRC doit être adapté en fonction du sexe car son incidence et sa gravité sont différents entre les femmes et les hommes. L’objectif du projet est d’étudier l’influence du sexe sur le développement et le traitement de l’IRC. L’IRC mettant en jeux l’interaction croisée de plusieurs organes, son étude nécessite des études précliniques sur des modèles animaux adaptés. Le projet sera mené chez des souris Alport chez qui l’IRC se développe spontanément et rapidement (quelques semaines) en raison d’une mutation homozygote (KO) dans un gène essentiel pour la fonction rénale. Des expériences menées au laboratoire ont montré que chez ces souris, l’IRC était plus fort chez les femelles que chez les mâles au même âge. De plus, seules les femelles étaient sensibles à l’effet protecteur contre l’IRC d’un agent pharmacologique : l’AP#1. Dans le present projet, nous souhaitons tester l’hypothèse de l’implication des hormones sexuelles dans ces dimorphismes sexuels. A cette fin, nous étudierons l’impact de la castration [ovariectomie (OVX) ou orquiectomie (ORX)] et des hormones sexuelles exogènes sur le développement de l’IRC et de son traitement par l’AP#1. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des mécanismes responsables du dimorphisme sexuel dans l'installation et le traitement de l’insuffisance rénale chronique chez les souris Alport.

Procédures

Les souris femelles et males seront soumises à une castration (sous anesthésie gazeuse et analgésie, durée maximale d’environ 10 minutes) à l’âge de 4 semaines, puis traitées à un agent pharmacologique par gavage (5 fois par semaine) combiné ou non à des hormones sexuelle (estradiol ou dihydrotestostérone sous forme de capsules implantés sous la peau 2 fois au cours du protocole). Tous les animaux seront soumis à des prises de sang (sous anesthésie gazeuse) et à une mesures de leur fonction rénale (sous anesthésie gazeuse, un capteur est fixé sur le dos de l’animal pendant 45 minutes et une molécule est injectée). Toutes les procédures non terminales et la mise à mort des animaux seront sont réalisées dans l’EU1. Dans le cas où le matériel nécessaire et/ou des salles de sacrifice seraient indisponibles à l’EU1, la mise à mort des animaux sera réalisée à l’EU2.

Impact sur les animaux

- Castration chirurgicale (OVX, ORX) et implantation de capsules en sous-cutanée: ces interventions peuvent provoquer de la douleur (administration d’anti-douleur) et du stress et des complications sont possibles (saignement, complications au niveau de la cicatrice). Les problèmes de cicatrisation sont des risques faibles- Gavage et collecte d’urine peuvent induire un léger stress - Prise de sang : les prélèvements de sang seront faits sous anesthésie - Evaluation du débit de filtration glomérulaire: légère douleur liée à l’injection rétro-orbitaire

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans l'installation de l’insuffisance rénale chronique. Ces mécanismes restent à l’heure acutelle impossibles à modéliser in vitro. Toutefois, une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives.

Réduction

Les modèles expérimentaux utilisés sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, limitant les étapes de mise au point couteuses en animaux. D’après notre connaissance du modèle utilisé, le nombre d’animaux est calculé au plus juste pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes interprétables pour chaque paramètre mesuré. Il est prévu d’utiliser 208 souris. La comparaison entre 2 groupes sera réalisée en utilisant un test statistique non paramétrique ou paramétrique (en fonction de la taille des groupes et de leurs distributions). La comparaison entre plusieurs groupes sera réalisée en utilisant un autres test statistique.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés (service de zootechnie agréé par le ministère) par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie et les points limites seront soit l’atteinte du score 3 sur l’un des critères, soit l’atteinte du score 2 sans amélioration après 48h de surveillance. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux. Si les animaux sont transportés dans l’EU 2/2, il le seront en respectant la charte de transport.

Choix des espèces

L’espèce choisie permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Les chirurgies seront effectuées avant la puberté à l’âge de 4 semaines. A cet âge, les reins sont pleinement développés et les souris ne présentent pas encore d’altération détectable de protéinurie ou d’urémie (critères de détérioration de la fonction rénale). Quel que soit le génotype, les traitements pharmacologiques débuteront à 5 semaines et seront poursuivis jusqu’à 10 semaines (avant détérioration de leur état général), et les animaux seront alors mis à mort.

Organisme de recherche contractuelle, ce laboratoire teste ce qu'il appelle des "molécules-clients" sur des rongeurs engraissés par un régime hypercalorique, dès l'âge de 3 semaines si le client le demande. 900 rongeurs, 600 souris et 300 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des jeûnes de trois à six heures, jusqu'à trois tests de tolérance au glucose ou à l'insuline, des gavages ou des injections répétés et jusqu'à une prise de sang par semaine. Leurs organes, prélevés après la mise à mort, servent à caractériser l'inflammation. Le bénéfice annoncé, réduire l'impact de l'obésité "à tous les niveaux", reste renvoyé "à terme".

Objectifs

Le surpoids est défini comme une accumulation excessive de masse grasse dans l’organisme. L’obésité est une maladie chronique complexe définie comme une accumulation excessive de masse grasse pouvant altérer l’état de santé d’un individu. Actuellement, 2,5 milliards de personnes dans le monde sont atteintes de surpoids, dont plus de 800 millions sont obèses. La prévalence du surpoids ne cesse de croître depuis les dernières décennies et l’un des facteurs prépondérants de cette évolution est la surconsommation de régimes déséquilibrés, riches en graisses et en sucres. L’obésité s’accompagne d’une inflammation systémique constante et d’intensité faible voire modérée, dite de bas-bruit. Cet état inflammatoire chronique contribue à développer d’autres maladies, telles que le diabète, la stéatose hépatique et bien d’autres, et cause ainsi quelques millions de morts chaque année. Dans ce contexte, l’importance de contenir ce statut inflammatoire et surtout, de stimuler sa résolution, est capitale. L’administration prolongée de régime hypercalorique chez le rongeur est l’un des moyens les plus simples et les plus couramment utilisés pour modéliser le surpoids et l’obésité chez l’animal. En faisant varier la durée du régime ainsi que sa valeur calorique, ce modèle permettra de collecter et d’étayer des données cruciales sur les mécanismes inflammatoires cellulaires et moléculaires impliqués, tels que la synthèse de médiateurs cytokiniques et lipidiques clés. Le premier objectif consiste donc à détenir au sein de notre laboratoire le modèle de surpoids/obésité induit par un régime hypercalorique. Notre laboratoire étant un organisme de recherche contractuelle, notre activité consiste à étudier le potentiel résolutif de molécules candidates dans différents contextes inflammatoires, ici dans l’obésité. Ainsi, l’objectif final de ce projet est de tester l’administration conjointe de molécules candidates dans la résolution de l’inflammation induite par le surpoids ; et ainsi contribuer à terme à réduire voire supprimer l’impact délétère de l’obésité à tous les niveaux ; humains, sociaux, sociétaux et économiques.

Bénéfices attendus

Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des altérations induites par le surpoids/obésité. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour réduire les altérations multiples dues au surpoids et à l’obésité.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à : 1) Deux sessions de jeûne de 3 à 6h, espacées de 48h minimum, dans le cas de la réalisation de tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline (d'une durée de 4h maxiumum chacun). Les animaux ont accès à l’eau mais pas à la nourriture. Au maximum, 3 tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline pourront être réalisés au cours d’une étude. 2) Des administrations répétées du composé-client selon les modalités suivantes : Les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage (sonde en acier inoxydable réutilisable), les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront moins d’une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). 3) Un prélèvement sanguin unique ou répété, précédé ou non d’un jeûne de 3 à 6h, suivi d’une semaine de récupération minimum sur souris vigile ou anesthésiée et sur rats anesthésiés, selon le volume prélevé. La durée d’un prélèvement sera de l’ordre d’une minute par animal. Le nombre maximum de prélèvements sanguins sera de 1 par semaine.

Impact sur les animaux

Les trois principales nuisances attendues concernent (1) la surcharge pondérale des animaux, (2) la réalisation de prélèvements sanguins répétés sur la durée du protocole expérimental, (3) l’administration répétée des molécules-clients à tester. La surcharge pondérale pourra induire un léger inconfort chez les animaux, en comparaison avec des souris de poids normal, notamment pour leur mobilité au sein de la cage. La réalisation de prélèvements et d’administrations répétés pourra générer un stress chez l’animal, ainsi qu’une douleur au point de piqure.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire et métabolique terminal.

Remplacement

Lorsque ce sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement ou en complément des tests animaux afin de remplacer le nombre d'animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement complet de l'expérimentation animale par des essais in vitro n'est pas envisageable pour une étude portat sur le surpoids. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires et cellulaires de la physiopathologie d'un animal entier. De plus, les étapes de validation d'une molécule thérapeutique nécessite qu'elle soit testée chez l'animal avant de pouvoir passer à l'étape de validation suivante : l'Homme.

Réduction

La problématique de ce projet faisant intervenir la régulation métabolique et inflammatoire sur du moyen/long terme (semaines, mois), induit intrinsèquement une variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes (n=12 souris / groupe expérimental). Le nombre de rats et de souris nécessaire a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples, en particulier sur des protocoles de plus courte durée. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. D’autre part, si plusieurs prélèvements sanguins sont à réaliser, nous les réaliserions sur des animaux dédiés (6 et 6 au sein d’un même groupe) afin de respecter les volumes, les délais de récupération et limiter le nombre de gestes invasifs sur un même animal. Enfin, nous utiliserons en priorité des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. C’est la conjonction de tous ces éléments qui nous a conduit à considérer des groupes de 12 animaux maximum.

Raffinement

Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétences mis à jour régulièrement. Les souris et les rats seront hébergés selon les conditions de la directive 2010/63/UE. Chaque fois que cela sera nécessaire, une analgésie et/ou une anesthésie seront administrées aux animaux. Leur environnement sera enrichi de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole, afin de leur permettre de se distraire et de réaliser un peu d’activité physique. Les animaux seront vus quotidiennement. En cas de signe de mal-être, un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Enfin, l'utilisation de rats et de souris comme modèle de surpoids/obésité est très largement documentée dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), car toutes leurs fonctions biologiques sont alors matures. L'âge des animaux pourra exceptionnellement être inférieur à 7 semaines, si le client souhaite étudier les conséquences du surpoids/obésité juvénile sur l'âge adulte. Dans ce cas, le régime hypercalorique pourra débuter au plus tôt à l'âge de 3 semaines.

80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune isolée en cage individuelle jusqu'à vingt-quatre jours, toutes tuées à l'issue pour prélèvement. Une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue ouvre le protocole, suivie de quatre séances d'imagerie, de quatre prélèvements de sang à la queue et de deux périodes de quatre jours en cage de mesure de la dépense énergétique. L'objet est de relier la croissance d'une tumeur à l'hypermétabolisme observé chez les patients, et de tester une molécule qui réduit la dépense énergétique. Le poids et la prise alimentaire sont surveillés chaque jour pour que la perte de poids n'excède pas 20 % du poids initial, le protocole devant être arrêté dès qu'une dégradation apparaît.

Objectifs

La perte de masse est une cause majeure de décès en cancérologie et aggrave la toxicité des traitements. Elle résulte de la fonte des graisses et des muscles, d’une augmentation de la dépense énergétique au repos et d’une plus grande fatigabilité, entraînant un déficit énergétique appelé hypermétabolisme. Ce phénomène apparaît avant les premiers signes visibles de perte de masse chez les patients atteints de tumeurs. L’étude de la dépense énergétique et des marqueurs cliniques et biologiques des patients montre un impact négatif et une moindre réponse aux traitements. Pourtant, le lien entre le développement tumoral et l’hypermétabolisme reste inexploré. Cette étude chez l’animal vise à : -caractériser les paramètres métaboliques liés à l’hypermétabolisme à différents stades du développement tumoral grâce à des cages d'enregistrement de la dépense énergétique ; -évaluer ces paramètres chez des souris atteintes de tumeurs en présence d’une molécule réduisant la dépense énergétique. L’objectif est de mieux comprendre le lien entre hypermétabolisme et cancer et d’explorer une nouvelle piste thérapeutique.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre les mécanismes responsables de l’hypermétabolisme, c’est-à-dire l’augmentation de la dépense énergétique au repos, chez les animaux porteurs d’une tumeur. L’objectif est d’identifier les principaux facteurs impliqués, comme la dépense d'énergie au repos et ou issue de l’activité physique afin de mieux expliquer ce phénomène chez les patients. En analysant le métabolisme des animaux atteints de tumeurs et en testant un médicament qui réduit la dépense énergétique, nous pourrons évaluer le lien entre l’hypermétabolisme et la progression du cancer observée chez les patients.

Procédures

Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée dans la veine caudale (moins d'une minute). Les mesures par imagerie se feront 4 fois, chaque mesure ne dépassant pas 10 minutes, cela inclut également un prélèvement sanguin (donc 4 prélèvements de 50 microlitres) chaque prélèvement prenant 2 minutes. La mesure de la dépense énergétique sera effectuée 2 fois, sur une période de 4 jours à chaque fois.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré susceptible d'apparaitre durant la totalité de l'expérimentation. La durée maximum de l'isolement des animaux est de 24 jours. Les prélèvements à la queue induisent une douleur légére. Le poids et la prise alimentaire de ces animaux seront surveillé quotidiennement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. La croissance tumorale peut induire un dysconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire, car il est impossible de reproduire sans animaux les interactions entre la croissance d’une tumeur, le système immunitaire et l’équilibre énergétique de l’organisme. L’étude de la dépense énergétique et des comportements associés doit se faire sur un organisme entier, car les tissus impliqués fonctionnent ensemble. La souris est un modèle adapté, car ses mécanismes de régulation énergétique sont similaires à ceux de l’Homme, ce qui permet d’extrapoler les résultats.

Réduction

Dans les procédures 1 et 2, nous utiliserons 10 souris par groupe, un nombre suffisant pour détecter des différences significatives de perte de poids liée à la tumeur. Le suivi du poids, de la composition corporelle et de la croissance tumorale par imagerie permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires aux analyses de l’équilibre énergétique. Pour réduire encore leur utilisation, nous étudierons l’alimentation, la dépense énergétique et la composition corporelle sur les mêmes animaux. Les données issues d’études précédentes indiquent que 10 souris par groupe sont suffisantes malgré la variabilité des mesures. L’évaluation métabolique sur 4 jours aidera à réduire cette variabilité, optimisant ainsi le nombre d’animaux requis. Enfin, des outils statistiques adaptés permettront d’analyser l’impact de la tumeur, du traitement et du sexe sur ces paramètres.

Raffinement

Les interventions (imagerie, injections et échocardiographies) seront réalisées sous anesthésie générale afin d’éviter toute douleur. Une technique d’imagerie non invasive sera utilisée pour suivre l’évolution de la tumeur au fil du temps et la mettre en relation avec la balance énergétique, le poids et la composition corporelle. Pendant la phase d’individualisation, le poids et la consommation alimentaire seront enregistrés. Les analyses de la balance énergétique et de la composition corporelle, totalement non invasives, se dérouleront dans des cages classiques équipées de capteurs intégrés, sans perturber les animaux. L’hébergement inclura un enrichissement avec un abri en plastique rouge, du coton et une nacelle pour favoriser le bien-être des souris. Les mesures de la dépense énergétique seront automatisées, effectuées en continu de jour comme de nuit, sans intervention humaine. Une surveillance quotidienne permettra de détecter tout changement de comportement ou de santé (observation, suivi du poids et de la prise alimentaire et hydrique). Des points limites stricts ont été définis : en cas de signe de souffrance ou de dégradation de l’état des souris, le protocole sera immédiatement arrêté.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Elle est particulièrement adaptée à l'étude des dysfonctionnements métaboliques, car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre la souris et l'Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la souris est le modèle de référence pour l'étude du développement tumoral, de la réponse immunitaire et du métabolisme énergétique. Pour les deux procédures, les souris seront utilisées à l’âge adulte (12 semaines). Ce choix est justifié par plusieurs facteurs : (1) l’âge adulte garantit que toutes les structures cérébrales sont stabilisées, ce qui évite d'impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au fil du temps; (2) le poids de l’animal est plus stable à cet âge, permettant une analyse fiable et robuste durant toute la durée de l’expérimentation.

Un rat dont la température corporelle chute durablement sous 33,5 °C sort du protocole, et peut y être réintroduit après avoir été réchauffé. 580 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolés en cage individuelle pendant 19 à 26 jours, ils subissent une prise de température rectale chaque jour, et 204 d'entre eux vivent à 4-6 °C jour et nuit durant deux à trois semaines, avec des frissons possibles les premiers jours. L'objectif est de comprendre comment le tissu adipeux brun produit de la chaleur. Le bénéfice reste au conditionnel, un système qui "pourrait être une cible thérapeutique potentielle" contre l'obésité, alors que l'isolement touche tous les rats dès le premier jour.

Objectifs

La progression de l'obésité dans le monde est une préoccupation cruciale de la recherche médicale. L’une des stratégies envisagées pour lutter contre ce fléau consisterait à stimuler la thermogenèse, en particulier par le tissu adipeux brun et beige, qui ont la capacité de produire une grande quantité de chaleur à partir de la graisse qu’ils brûlent. La caractérisation des mécanismes de thermogenèse constitue donc une piste de recherche prometteuse pour la prévention et le traitement des maladies métaboliques. Le projet présenté ici permettra d'identifier précisément le rôle du système Créatine-Kinase / Phosphocréatine, dans le processus de production de chaleur par les tissus adipeux brun / beige et de déterminer si ce système pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans la lutte contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Le système Créatine-Kinase / Phosphocréatine (système CK / PCr) est connu depuis des années pour jouer un rôle majeur dans le transfert d’énergie (réserve et navette énergétique) au sein des cellules musculaires et nerveuses. Des travaux récents montrent une nouvelle fonction de ce système dans la thermorégulation par le tissu adipeux, et également dans la prévention des maladies métaboliques, Cependant, les mécanismes impliqués restent à être élucidés. Notre projet vise à caractériser pour la première fois le rôle du système CK / PCr dans la bioénergétique des tissus adipeux et de déterminer par quel(s) mécanisme(s) et à quelle ampleur, le système CK / PCr participe à la production de chaleur par les tissus adipeux brun/beige. Cette étude pourrait apporter une connaissance primordiale concernant la bioénergétique des tissus adipeux et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention et le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

Les 3 groupes d’animaux seront exposés aux différentes températures (respectivement à 4-6°C, 22-23°C ou 28°), 24h/24, 7J/7 durant 14 ou 21 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire), en armoire ventilée et en cage individuelle. La prise de température corporelle (sonde rectale) sera prise quotidiennement durant toute la période de stabulation (phase d’habituation de 5 jours avant le début de l’exposition aux différentes températures et pendant toute la durée de l’exposition jusqu’au jour de l’euthanasie de l’animal, soit durant 19 ou 26 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire). La prise de la température corporelle aura lieu 1 fois par jour pour tous les groupes, à l’exception des 5 premiers jours concernant les animaux du groupe exposé au froid (4-6°C), pour lesquels la température corporelle sera prise 2 fois par jour (début de matinée vers 9h et milieu d’après-midi vers 15h). Cette prise de température, qui nécessite une légère contention, ne dure pas plus d’une minute.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de pouvoir suivre précisément leur prise alimentaire. L'isolement constituera donc un inconfort pour l'ensemble des animaux. La seconde source d'inconfort sera liée à l'exposition au froid (4-6°C), 24h/24, durant 2-3 semaines. Elle concerne 204 animaux. Les études utilisant de tels protocoles d'exposition au froid, ne décrivent ni de chute drastique de la température corporelle, ni d'inconfort majeur. Après quelques jours d'acclimatation, durant lesquels les animaux peuvent frissonner et présenter une légère baisse de leur température corporelle, les animaux retrouvent une activité normale. L'inconfort lié à l'exposition au froid est d'autant moindre que, la température de thermoneutralité des rats étant autour de 28°C, lorsque ces derniers sont hébergés à 22°C, ils présentent déjà une certaine adaptation (présence marquée de tissu adipeux brun interscapulaire).

Devenir

A l'issue de l'unique procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui auraient éventuellement été exclus de la procédure seront également euthanasiés dès la sortie du protocole. Des tissus pourront éventuellement être prélevés après euthanasie et congelés en vue d’une utilisation ultérieure en TP pour des dosages biochimiques.

Remplacement

Au vu de sa complexité, le phénomène de brunissement induit naturellement en réponse à l'exposition au froid, ne peut pas être entièrement reproduit in vitro. En effet, les tissus adipeux sont constitués de cellules de différents types qui interagissent entre elles et il est difficile de reproduire cette hétérogénéité et ce dialogue in vitro. De plus, l’étude des modifications adaptatives des tissus adipeux en réponse au froid nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme, qui préserve la communication nerveuse et hormonale, entre les différents types de tissus adipeux d’une part, et entre ces tissus et les organes impliqués dans le métabolisme, comme le foie et le pancréas, d’autre part. L'exposition au froid de l'animal, constitue donc une approche indispensable à l'étude du phénomène de brunissement et aucun modèle alternatif ne peut remplacer le modèle animal. Cependant, en parallèle de ces travaux à l'échelle de l'animal, l'utilisation de modèles cellulaires issus de tissus adipeux humains permettra de voir si certains mécanismes observés sur les adipocytes de rat acclimatés au froid sont retrouvés/ transposables chez l'Homme.

Réduction

Le choix du modèle animal, le rat plutôt que la souris, permet de limiter le nombre d'animaux à utiliser. En effet, les tissus adipeux brun et beige sont des tissus peu abondants et certains des protocoles de l’étude nécessiteraient, chez la souris, de grouper les TAB provenant de 3 à 4 animaux pour une seule expérimentation. Chez le rat, 2 animaux seulement devraient suffire pour obtenir la même quantité d’informations. Par ailleurs, le choix d'une exposition prolongée au froid (2-3 semaines) afin d'obtenir une adaptation maximale de l’animal, permettra d’atteindre les objectifs de l’étude tout en limitant le nombre d’animaux nécessaire. Grâce à l'utilisation d'appareillage de précision, une précision maximale des mesures pourra être obtenue avec très peu de matériel biologique. Pour finir, le niveau de dispersion des données attendues a été pris en compte, afin de calculer le nombre d'animaux au plus juste sans risquer pour autant de compromettre l'interprétation statistique des résultats. De plus, si les données issues de la série préliminaire pour la condition choisie sont exploitables, elles pourront être intégrées à l'étude principale, ce qui réduira le nombre total d'animaux de 8 individus.

Raffinement

Un suivi attentif des animaux, par un personnel formé, sera opéré chaque jour durant la période de stabulation avant et pendant l'exposition aux températures étudiées, afin d'évaluer l'inconfort subi (isolement, effet de la température ambiante) et leurs éventuelles conséquences sur le bien-être animal. Des critères comportementaux visant à évaluer l'état général de l'animal et la mesure de variables physiologiques concrètes (masse corporelle, température rectale) de façon journalière et la prise de nourriture (2 fois par semaine) seront mis en place. Afin de limiter leur stress, les rats seront placés en armoire ventilée 5 jours avant le début de l'exposition au froid ou à la neutralité thermique). Ils seront en cage individuelle, mais ils pourront se voir et se sentir. Puis après 5 jours d'habituation aux conditions de stabulation en armoire ventilée, les rats seront exposés à la température étudiée (4-6°C ou 28°C). Durant la phase d'adaptation au froid, décrite pour durer quelques jours, une surveillance rapprochée (2 fois par jour) des animaux est prévue. Des points limites seront définis et permettront de mener des actions visant à réduire l'inconfort, pouvant aller jusqu'à la sortie du protocole si les signes de souffrance dépassent certaines limites fixées ou si la température corporelle chute durablement en dessous de 33,5°C. L'animal pourra être réchauffé et réintroduit ou pas dans le protocole selon sa récupération. Si l'acclimatation au froid s'avérait trop difficile, la mise en place d'un protocole d'exposition progressif au froid serait envisagée. Cela ne sera très probablement pas nécessaire car des études similaires ne décrivent pas d'inconfort majeur lié à l'exposition au froid. En effet, les rats, dont la neutralité thermique est autour de 28°C, présentent déjà une certaine adaptation de leur tissu adipeux brun au froid, lorsqu'ils sont hébergés à 22°C. Afin de limiter l'impact de l'isolement et du froid et d'améliorer le bien-être des animaux, leur milieu de vie sera enrichi durant toute la période de stabulation, et, notamment les 4 premiers jours d'exposition, par du matériel de nidation limitant l'impact du froid. En plus des expériences prévues dans le projet ANR (sur les tissus adipeux), il est prévu de prélever d'autres organes (foie, coeur, cerveau, muscle, vaisseaux sanguins) afin de recueillir un maximum de données sur les effets du froid et sur l'impact de la température de stabulation (22-23°C versus 28°C neutralité thermique).

Choix des espèces

La plupart des études sur les mécanismes de thermorégulation ont été menées sur les modèles rat ou souris. Plus récemment, le cycle futile de la créatine a été décrit chez la souris. Le choix de focaliser l'étude sur le modèle rat a été motivé principalement par le fait que la taille de l'animal étant supérieure, la quantité de tissu adipeux brun est considérablement plus importante et que par conséquent le nombre d'animaux nécessaire pour une même expérience pourra être réduit par rapport au modèle souris. Par ailleurs, le rat est considéré comme étant un modèle plus proche de l'humain, ce modèle est couramment utilisé et de nombreuses données existent. Les animaux mâles et femelles seront utilisés à l'âge jeune adulte, environ 8-10 semaines. Chez l'adulte tous les mécanismes de thermorégulation sont établis et l'influence hormonale est stabilisée.